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4  Diskussion

4.1 Evaluierung von resorbierbaren Polymergerüsten für das „Tissue Engineering“ von Herzklappen

In unserem Experiment wurden drei unterschiedliche Polymere für das Tissue Engineering von Herzklappen evaluiert. Aufgrund der thermoplastischen Eigenschaften von PHA und P4HB war es mit diesen Materialien möglich ein dreisegliges Herzklappengerüst zu modellieren, welches sich in einem pulsatilen Flußsystem synchron öffnen und schließen kann. In diesem Experiment war es aufgrund der mangelnden mechanischen Eigenschaften nicht möglich ein funktionsfähiges Herzklappengerüst aus PGA herzustellen.

Weiterhin zeigte sich in der mechanischen Testung, daß PHA und P4HB ausreichende Eigenschaften für eine chirurgische Anwendung haben. Im Gegensatz dazu war es nicht möglich, das besiedelte und acht Tage inkubierte PGA-Konstrukt zu nähen (Prolene 5x0).

Wie bereits von anderen Forschungsgruppen erwähnt, besteht allerdings die Möglichkeit die extrazelluläre Matrixbildung und damit die mechanische Belastbarkeit durch dynamische Zellkulturbedingungen („Shearstress“ und Wachstumsfaktoren) signifikant zu steigern (57, 58). Dies ist eine Möglichkeit, die wir in den nachfolgend beschriebenen Experimenten ebenfalls genutzt und weiterentwickelt haben.

In der biochemischen Untersuchung der besiedelten Polymere fanden sich signifikant mehr Zellen und auch eine höhere Kollagensynthese in den PGA-Konstrukten im Vergleich zu PHA- und P4HB-Konstrukten. Eine Erklärung für dieses Ergebnis könnte die deutlich höhere Porosität (> 90%) und die damit verbunden größere Oberfläche des Polymers sein, welches mit dementsprechend mehr Zellen besiedelt werden kann.

Die Ergebnisse der Elektronenmikroskopie sind in Übereinkunft mit den biochemischen Untersuchungen zu sehen. Auf den elektronenmikroskopischen Aufnahmen erkennt man, daß die Zellen an allen Polymergerüsten anhaften und beginnen, extrazelluläre Matrix zu bilden. Sowohl bei den PHA- als auch bei den P4HB-Konstrukten zeigt sich eine konfluente und glatte Gewebsschicht an der Oberfläche der Konstrukte. Bei den PGA-Konstrukten unterschied sich die Oberfläche in sofern, daß die Zellen an den einzelnen Fasern anhaften [Seite 32↓]und beginnen, die Faserzwischenräume mit extrazellulärer Matrix auszufüllen. Hier bedarf es unter Umständen einer längeren Inkubationszeit, bis die komplette Oberfläche als konfluentes Gewebe zu erkennen ist. Diese elektronenmikroskopische Beobachtung könnte auch den signifikant höheren Kollagengehalt der PGA-Konstrukte erklären.

Zusammenfassend lassen die Ergebnisse dieses Experimentes den Schluß zu, daß PGA-Konstrukte zwar eine signifikant höhere Gewebebildung aufwiesen, allerdings war ebenfalls sowohl bei PHA- als auch P4HB-Konstrukten eine beträchtliche Zellzahl als auch Kollagensynthese nachweisbar. Ein entscheidender Vorteil für das Tissue Engineering von Herzklappen ist allerdings, daß sich aus PHA und P4HB Herzklappengerüste herstellen ließen, die physiologischen Fluß- und Druckverhältnissen standhalten können und somit für eine potentielle Implantation in Frage kommen könnten.

4.2 Herstellung eines Herzklappengerüst für das „Tissue Engineering“

Im Vergleich zu den vorangegangenen Versuchen mit PGA von Shinoka et al. (59) wies zu diesem Zeitpunkt (1998) PHA einige entscheidende Vorteile für das Tissue Engineering von Herzklappen auf. Ein Vorteil war, daß aufgrund der thermoplastischen Eigenschaften des Materials, ein komplettes dreisegliges Herzklappengerüst aus lediglich einem Material hergestellt werden konnte. Hierfür wurde kein Nahtmaterial oder weitere Polymere gebraucht, welche in parallel durchgeführten Versuchen zu thromboembolischen Komplikationen geführt haben (60). Weiterhin handelte es sich bei den Gerüsten um funktionsfähige Herzklappen, die bei physiologischen Flüssen synchron öffnen und schließen, wie sich im pulsatilen Bioreaktorsystem nachweisen ließ. In unserem Experiment konnte gezeigt werden, daß vaskuläre Zellen auf dem Polymer anhaften, in die poröse Struktur einwachsen und nach kurzer Inkubationszeit nahezu konfluente Gewebe bilden können.

Zusammenfassend läßt sich daher sagen, daß es mit dieser Herstellungstechnik und dem verwendeten porösen PHA möglich sein könnte, ein funktionsfähiges, dreisegliges Herzklappengerüst für das Tissue Engineering von Herzklappen zu fertigen.


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4.3  Bioreaktorsystem für die Herstellung von „tissue engineerten“ Herzklappen

Bis zum heutigen Tage sind die Bedingungen, unter denen in vitro eine tissue engineerte Herzklappe hergestellt wird, unklar. Bei der Entwicklung des neuartigen Bioreaktorsystems sind wir davon ausgegangen, daß pulsatile Flußverhältnisse unter Umständen einen positiven Effekt auf die Ausbildung von Herzklappengewebe haben könnten (61). Zu diesem Zeitpunkt war in der Literatur keine Arbeit beschrieben, die für das Tissue Engineering von Herzklappen ein pulsatiles Flußsystem verwendet. Allerdings wurde in einigen bereits publizierten Arbeiten der positive Effekt einer dynamischen Zellkultur für das Tissue Engineering von vaskulären Geweben dokumentiert (62, 63, 64). Es existierte somit kein kommerziell erhältliches System und wir waren daher gezwungen, einen ersten Prototypen selbst zu entwerfen. Dabei bestand die Hauptidee darin, einen Bioreaktor zu entwickeln, in dem es möglich ist, funktionelle Gewebe zu generieren während sich das Polymergerüst kontinuierlich resorbiert. Dieses System war nach unserer Arbeitshypothese die Grundvoraussetzung um Herzklappengewebe in-vitro herstellen zu können.

In unserer Arbeit wird erstmals eine technische Beschreibung geliefert wie ein solcher Herzklappen-Bioreaktor aussehen könnte. Das System besteht aus Plexiglas (Kammern), Silikon (Membran) sowie aus Edelstahl (Schrauben und Fixationsringe) und ist einfach zusammenzubauen. Der gesamte Bioreaktor-Aufbau ist komplett sterilisierbar um eine kontaminatiosfreie Konditionierung des Gewebes zu ermöglichen. Das gesamte System passt in einen handelsüblichen Inkubator und aufgrund der Plexiglaskammern ist es möglich während der gesamten Konditionierungsphase die Gewebeentwicklung oder eine eventuelle Kontamination zu beobachten. Weiterhin sind die Fluß- und Druckverhältnisse in sub- und supraphysiologischen Bereichen einzustellen und somit Gewebekonstrukte nicht nur zu konditionieren sondern auch unter definierten Bedingungen zu testen. Dieses in der Publikation vorgestellte Bioreaktordesign hat sich auch in den Folgeexperimenten bewährt und wird bis zum jetzigen Zeitpunkt regelmäßig angewendet (65, 66, 67, 68, 69).


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4.4  In-vitro-Herstellung von „tissue engineerten“ Herzklappen

In diesen Experimenten konnte gezeigt werden, daß es möglich ist ein dreisegliges Herzklappengerüst aus porösem und elastischen PHA herzustellen. Dieses konnte mit vaskulären Zellen besiedelt werden und anschließend in einem pulsatilen Flußsystem zu einem vaskulären Gefäß-Polymer-Konstrukt konditioniert werden. Alle Herzklappengerüste zeigten eine gute Funktion bei sub- und supraphysiologischen Fluß- und Druckverhältnissen.

Bei diesen Experimenten wurden poröse Polymere verwendet, um die Oberfläche des Gerüstes zu erhöhen, damit die maximale Anzahl an Zellen auf dem Herzklappengerüst anhaften kann. Weiterhin ist die poröse Struktur des Polymers von großer Bedeutung, da die Zellen in das Gerüst einwachsen, dieses dann komplett zellulär durchbauen und eine Vaskularisierung in-vivo ermöglichen.

Beim ersten Experiment konnte gezeigt werden, daß sich vaskuläre Zellen bei kontinuierlicher Flußexposition ausrichten und vermehrt extrazelluläre Matrix bilden. Parallel zu unseren Experimenten konnten Niklason et al ebenfalls den positiven Effekt von kontinuierlichem, pulsatilen Fluß auf die Ausbildung einer extrazellulären Matrix in-vitro nachweisen (70). Diese Beobachtungen unterstützen die Annahme, daß kontrollierte, dynamische Zellkulturbedingungen von entscheidender Bedeutung für eine kontrollierte Gewebeentwicklung außerhalb des menschlichen Körpers sind.

Unsere Ergebnisse des zweiten Experimentes zeigten außerdem, daß vaskuläre Zellen an dem porösen PHA-Gerüst anhaften und nach entsprechender Flußexposition eine konfluente, in Flußrichtung ausgerichtete Gewebeschicht ausbilden. Weiterhin konnten wir das einwachsen der Zellen in das Polymer und die gesteigerte Proliferation der Zellen (DNA–Assay) demonstrieren. Die eingewachsenen und proliferierenden vaskulären Zellen waren darüber hinaus in der Lage extrazelluläre Matrixproteine wie Kollagen (4-Hydroxyprolin-Assay, Movat-Staining) und Glycosaminoglykane (Movat-Staining) zu bilden. Eine mögliche Limitation der Methode könnte die fehlende Elastinbildung sein, die in unseren Proben nicht nachgewiesen werden konnte.

Zusammenfassend kann man sagen, daß wir ein erstes vitales Herzklappenkonstrukt in-vitro hergestellt haben, welches unter physiologischen Fluß- und Druckverhältnissen funktionsfähig ist.


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4.5  In-vivo-Ergebnisse von „tissue engineerten“ Herzklappen

Nachdem wir in zahlreichen Vorversuchen ein geeignetes Polymer für die Herstellung eines Herzklappengerüstes evaluiert haben und zusätzlich die Bildung von vaskulärem Gewebe in-vitro nachweisen konnten, haben wir in diesen Experimenten die in-vivo–Eigenschaften der Konstrukte untersucht.

Im ersten Experiment wurde ein poröser Film eines Polyhydroxalkanoids als Polymer für das Herzklappengerüst verwendet und mit einer eigens entwickelten Technik zu einem klappentragenden Konduit modelliert. Die porösen Herzklappengerüste wurden mit vaskulären Zellen von ca. 6 Wochen alten Schafen besiedelt und in das gleiche Tier von dem die Zellen abstammen in supravalvulärer Pulmonalisposition implantiert. In dieser Studie überlebten alle Tiere das Experiment ohne Komplikationen und entwickelten sich wie gleichaltrige Tiere. In unserem Experiment zeigt sich parallel zum Wachstum der Tiere auch eine Zunahme der Länge und des inneren Durchmessers der "tissue engineerten“ Herzklappen. Allerdings konnten man hierbei nicht mit Sicherheit sagen, ob es sich um einen altersentsprechenden Wachstumsprozess handelt oder um eine geringgradige Dilatation bzw. Elongation der Konstrukte. Um diese Frage zuverlässig beantworten zu können wäre eine größere Anzahl von Experimenten und ein längerer Nachbeobachtungszeitraum notwendig.

Die Funktion der "tissue engineerten“ Herzklappen wurde mittels Echokardiographie und direkter Druckmessung distal und proximal der Konstrukte vor der Explantation ermittelt. Zum ersten Mal zeigten sich funktionsfähige, tissue engineerte Herzklappen mit einem minimalen Gradienten. Obwohl die Tiere nicht antikoaguliert waren, wurde keinerlei Thrombusbildung an allen Herzklappen (sowohl zellbesiedelt als auch unbesiedelt) oder gar andere thromboembolischen Komplikationen nachgewiesen. Diese Erkenntnis zeigt, daß es sich bei dem Gerüstmaterial um ein biokompatibles Polymer handelt und daß das Design der Herzklappe es ermöglichte, ein funktiosfähiges, tissue engineertes Herzklappenkonstrukt herzustellen. Eine Limitation des Materials war die schlechte Schallbarkeit über eine transthorakale Echokardiographie während des Nachbeobachtungszeitraums.

Alle zellbesiedelten Klappenkonstrukte wiesen neuentstandenes Gewebe auf, welches sowohl makroskopisch, histologisch, elektronenmikroskopisch als auch biochemisch demonstriert werden konnte. Im Gegensatz dazu wurde bei der unbesiedelten Kontrollklappe lediglich einige adhärente Blutzellen gefunden, jedoch keinerlei Gewebe. Aus diesem Grunde erscheint die Besiedlung mit vaskulären Zellen unerläßlich für die Herstellung eines funktionsfähigen klappentragenden Konduits. Eine sogenannte Autobesiedlung des Polymers mit entweder [Seite 36↓]zirkulierenden Zellen oder einer Migration der Zellen von den Anastomosenrändern konnte im Gegensatz zu anderen Autoren in unserem Experiment nicht beobachtet werden ( 73, 74, 75 ).

Weiterhin konnte mit diesem Ansatz gezeigt werden, daß es sich bei den explantierten Konstrukten tatsächlich um vitales, vaskularisiertes Gewebe handelt, welches das Polymer komplett bedeckt und in das angrenzende Pulmonalarteriengewebe integriert war. Das Polymer war bereits teilweise resorbiert und in der biomechanischen Testung konnte gezeigt werden, daß das neuentstandene Gewebe die mechanischen Eigenschaften eines nativen Pulmonalgefäßes übernommen hat. Dies war in unserem Experiment eine unerwartete Entwicklung und zeigt die wichtige Bedeutung eines suffizienten „in-vivo-Remodelling“ der implantierten Konstrukte.

Obwohl die „tissue engineerten“ Herzklappen eine gute Funktion und auch eine fortgeschrittene Gewebeentwicklung zeigten, konnte keine konfluente Endothelzellschicht in der histologischen Untersuchung der Explantate gefunden werden. Dies könnte eine bedeutende Limitation des Konzeptes sein und die längerfristige Haltbarkeit der „tissue engineerten“ Konstrukte negativ beeinflussen. Ein möglicher Grund für dieses Ergebnis könnte die unter Umständen geringe Anzahl der besiedelten Endothelzellen (2x106 Zellen) oder die relativ kurze Inkubationszeit nach der Endothezellbesiedlung (1 Tag) sein. Dies herauszufinden und zu verbessern sollte in späteren Experimenten untersucht werden.

Zusammenfassend läßt sich aufgrund dieser Ergebnisse sagen, daß es möglich war, eine funktionsfähige, „tissue engineerte“ Herzklappe in Pulmonalisposition eines jungen Schafes zu implantieren. Darüber hinaus konnte in den Nachbeobachtungszeiträumen eine gute Gewebeentwicklung beobachtet werden, die morphologisch, biochemisch und biomechanisch einer nativen Pulmonalarterie sehr nah kam.

Im Folgeexperiment wurden die Herzklappengerüste aus einer Kombination aus PGA und P4HB hergestellt und vor der Implantation in unserem Bioreaktorsystem konditioniert. Das Ergebnis dieses Experimentes zeigt eine Weiterentwicklung des ersten Experimentes und dokumentiert erstmals den positiven Einfluß der präoperativen Gewebekonditionierung für das Tissue Engineering von Herzklappen. Neuartig an diesen Ergebnissen war, daß das Polymergerüst sich vollständig aufgelöst hat und sich statt dessen ein voll funktionsfähiges, autologes Gewebe ausbilden konnte.


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4.6  Anwendung von stereolithographischen Techniken für die Herstellung von Herzklappengerüsten

In meinem Forschungsprojekt werden Polymergerüste als dreidimensionale Matrix für die Herstellung von autologen, kardiovaskulären Geweben verwendet. Beim Tissue Engineering von Herzklappen und Gefäßen kommt dem physiologischen Design der Gerüste aus folgendem Grunde eine besondere Bedeutung zu. Durch die Polymergerüste wird die spätere Form des neugebildeten Gewebes z.B. einer Herzklappe vorgeben und das „tissue engineerte“ Konstrukt sollte auch in dieser Form verbleiben, wenn das Polymer sich resorbiert hat. Dies ist besonders wichtig beim Tissue Engineering von Herzklappen da hier die „Sinus of Valsalva“ eine äußerst wichtige Rolle spielen für die hämodynamische Funktion der Klappe (76, 77). Aus diesem Grund wurde in diesem Experiment versucht, eine Methode zu entwickeln mit der man weitgehend authentische Herzklappengerüste für das Tissue Engineering herstellen kann. Eine Möglichkeit dies zu erreichen war die exakte Rekonstruktion einer humanen Herzklappe mittels „rapid prototyping“ Techniken und speziell entwickelten Fabrikations- bzw. Testungsmethoden.

In unserem Experiment war es möglich, mit einem CT eine Bilddatei zu erstellen, die im Verlauf mit einer speziellen Software dreidimensional rekonstruiert werden konnte, um anschließend ein naturgetreues Stereolithographie-Modell herzustellen. Das entstandene Modell entsprach der komplexen Anatomie eines Homografts und eignete sich zur Herstellung eines Herzklapengerüstes.

Weiterhin wurde eine neuartige Methode beschrieben, wie ein Herzklappengerüst aus lediglich einem resorbierbaren Polymer hergestellt werden kann, ohne Nahtmaterial oder andere Polymere zu verwenden. Die so hergestellten Klappengerüste zeigten eine gute Funktion in der funktionellen Testungsserie unter sub- und supraphysiologischen Bedingungen.

Mit diesem Experiment konnten wir eine wichtige Modifikation des Konzeptes erreichen, indem wir statt zylindrischen Konduits (wie in den zuvor beschriebenen in-vitro und in-vivo Versuchen) jetzt Herzklappengerüste verwenden können, die der anatomischen Struktur von humanen Herzklappen exakt nachempfunden sind. Wie sich diese Konstrukte in Zukunft in-vitro und in-vivo verhalten, bleibt abzuwarten, und ist zur Zeit Gegenstand der Forschung in unserer Arbeitsgruppe.


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4.7  Modifiziertes Bioreaktorsystem ( Konduits )

Vor dem Hintergrund der ersten Ergebnisse mit den Bioreaktoren, wurde versucht das Prinzip der dynamischen Zellkonditionierung auf Gefäße und klappentragende Konduits zu übertragen (78, 79, 80, 81). Zum Zeitpunkt des Projektbeginns bestand kein etabliertes Verfahren zur Zellbesiedlung und in-vitro Konditionierung von Herzklappen oder klappentragenden Konduits. Aus diesem Mangel heraus haben wir ein komplett neues in-vitro Verfahren entwickelt, mit dem es möglich ist, tissue engineerte Herzklappen oder Konduits in-vitro herzustellen. Hierbei werden die Polymer-Klappengerüste in der dafür vorgesehenen Kammer eingespannt und zusammen sterilisiert. Anschließend wird die Zellsuspension in die Klappenkammer injeziert und über den Antriebsmechanismus kontinuierlich gedreht. Dadurch wird eine gleichmäßige Verteilung der Zellen als Grundlage für eine kontrollierte Gewebeentwicklung erreicht. Dieses neuartig entwickelte Besiedlungs- und Konditionierungssystem paßt ebenfalls in einen Standardinkubator und kann mit Ethylenoxid sterilisiert werden. Es ist jederzeit einsehbar damit eine kontrollierte Gewebeentwicklung regelmäßig beobachtet werden kann. Die weitere Besonderheit des Systems besteht darin, daß die Polymergerüste unter sterilen Bedingungen besiedelt werden können und anschließend mühelos in das pulsatile Flußsystem integriert werden können, ohne zuvor das neu entstandene Zell-Polymer-Konstrukt einer unsterilen Umgebung auszusetzen.

Somit haben wir ein kombiniertes System für die Zellbesiedlung und Gewebekonditionierung entwickelt, welches unterschiedliche Flußprofile und damit verschiedene physikalische Signale induzieren kann, um eine adäquate extrazelluläre Matrixbildung zu gewährleisten.


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4.8  Bioreaktorsystem zur Herstellung eines „Patches“

Im Rahmen der Entwicklungen von speziellen Flußsystemen wurde eine weitere Idee verfolgt, die einen Bioreaktor für sogenannte Patches beschreibt. Die Verwendung von Patches in der Gefäßchirurgie ist eine weit verbreitete Methode zur Therapie von Gefäßdefekten. Speziell in der Therapie von kongenitalen Herz- und Gefäßfehlbildungen findet diese Methode häüfig Anwendung (siehe Abbildung 3).

Abbildung 3 ) Verwendung eines Patch bei der operativen Therapie einer Aortenisthmusstenose. Aus: J Card Surg 2000;15:373

Die momentan verwendeten Materialien, die bei der Therapie durch die Implantation von Patches verwendet werden können, haben verschiedene Limitationen (82, 83). Eine Verbesserung auf diesem Gebiet könnte durch die Verwendung von tissue-engieerten Konstrukten erreicht werden. Bisher stand kein Verfahren zur Verfügung, welches die Herstellung eines in-vitro konditionierten, autologen Patches mittels Tissue Engineering ermöglicht.


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In dieser Arbeit wird ein neues Verfahren zum Tissue Engineering von Patch-Konstrukten beschrieben. Der angesprochene Bioreaktor läßt sich unter Laborbedingungen problemlos bedienen. Eine Sterilisation ist mit Ethylenoxid möglich und kann somit in vielen Kliniken mit herkömmlichen Gerätschaften gewährleistet werden. Durch die Verwendung von P4HB-Gerüstpolymeren und vaskulären Zellen (Schaf) konnten tissue-engnieerte Patch-Konstrukte durch dynamische Konditionierung im Bioreaktor hergestellt werden. Wir konnten zeigen, daß vaskuläre Zellen dem porösen Gerüstpolymer anhafteten und lebende organoide Strukturen bildeten. Dies erfolgte ohne Zeichen einer bakteriellen Kontamination in unserem Patch-Bioreaktor-System. Wir konnten weiter zeigen, dass Zellen von der Oberfläche in das Innere des Patches migrierten und zum Teil komplexe Zell-Polymer-Konstrukte bildeten.

4.9 Erste Ergebnisse mit humanen Zellquellen für das „Tissue Engineering“ von kardiovaskulären Geweben

Nachdem das grundsätzliche Prinzip des „Tissue Engineerings“ im Tierexperiment gezeigt werden konnte, haben wir uns in dieser Untersuchung erstmals mit humanen Zellquellen zur in-vitro Herstellung von kardiovaskulärem Gewebe beschäftigt. Bei allen Tissue Engineering Konzepten spielt die ausreichende Bildung von extrazellulären Matrixproteinen und einer adäquaten Zellproliferation eine entscheidende Rolle. In den vorbeschriebenen Experimenten haben sich dynamische Zellkulturbedingungen (Bioreaktoren) als günstiger mechanischer Stimulus für die in-vitro Gewebeentwicklung erwiesen. Damit dies funktioniert, ist es wichtig, daß die Zellen zunächst an dem Polymer adherieren und damit beginnen, eine erste extrazelluläre Matrix zu bilden. Um diesen Effekt zu erreichen, wurde bereits von anderen Forschergruppen die Möglichkeit eines chemischen Stimulus mit Wachstumsfaktoren (z.B. FGF, VEGF, TGF usw.) beschrieben (84, 85). Diese Erkenntnisse beruhen teilweise auf Tierexperimenten oder Versuchen mit nicht-vaskulären Zellen. In unserem Versuch lag der Schwerpunkt auf dem chemischen Stimulus für die Zellproliferation und der Ausbildung von humaner, extrazellulärer Matrix innerhalb der Polymergerüste.


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Um die Matrixbildung des humanen Zell-Polymer-Konstruktes anzuregen, wurde dem normalen Zellkulturmedium bei allen Experimenten Vitamin-C (L-ascorbic acid 2-phosphate) beigemischt, da es einen stimulierenden Effekt auf die Kollagen-Synthese hat (86). Zusätzlich wurden zwei weitere Wchstumsfaktoren, nämlich bFGF und TGF, in den Versuchen verwendet.

Beim bFGF (basic fibroblast growth factor) handelt es sich um ein heparinbindendes Polypeptid, welches sowohl von Endothel- als auch von glatten Muskelzellen synthetisiert wird (87). Dieser Wachstumsfaktor erhöht signifikant die Teilungsrate von glatten Muskelzellen und damit die Kollagen-Konzentration des „tissue engineerten“ Konstruktes.

Der zweite verwendete Wachstumsfaktor (TGF, transforming growth factor) ist ebenfalls ein Polypeptid und hat einen großen Einfluß auf die Ausbildung der Gefäßwand. So hat TGF-β-1 einen positiven Einfluß auf die Synthese von Fibronektin, Proteoglykan, Kollagen Typ I und Kollagen Typ III in der vaskulären Zellkultur (87).

Aufgrund der zuvor beschriebenen Eigenschaften von bFGF und TGF, wurde in unserem Experiment ihr Einfluß auf pädiatrische, vaskuläre Zellen, welche auf Polymergerüste besiedelt waren, evaluiert. Wir konnten beobachten, daß alle verwendeten Wachstumsfaktoren (bFGF, TGF oder L-ascorbic acid-2-phosphate) einen positiven Effekt auf die Zellproliferation haben. Parallel zur gesteigerten Zellproliferation konnte man in Versuchen, bei denen bFGF dem Zellkulturmedium hinzu gegeben wurde, ebenfalls eine gesteigerte Synthese von Kollagen nachweisen. Hingegen zeigten Zellkulturmedien, die mit TGF vermischt wurden, keine gesteigerte Matrixproduktion, sondern lediglich einen positiven Einfluß auf die Zellproliferation. Den deutlichsten Effekt bezüglich der Zelldichte und extrzellulärer Matrixsynthese fand sich bei einem Zellkulturmedium, dem sowohl bFGF als auch Vitamin-C zugesetzt wurde. Neben den biochemischen Untersuchungen, zeigte sich auch in den histologischen bzw. immunhistologischen Untersuchungen eine fortgeschrittene in-vitro-Gewebebildung.

Dieses Erkenntnis war für unsere Arbeit von großer Bedeutung, da sie einerseits zeigte, daß das Konzept des Tissue Engineerings auch auf humane, vaskuläre Zellen angewendet werden kann und andererseits der Gebrauch von Wachstumsfaktoren einen positiven Effekt auf die Ausbildung von humanen Gewebekonstrukten in-vitro hat. Diese Publikation stellte somit


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eine wichtige Grundlage für die zukünftige Arbeit mit humanen Zellkulturen und der Herstellung von humanen Herzklappen und Gefäßen dar, die letztendlich in der menschlichen Herzchirurgie angewendet werden sollen.


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13.06.2005