Steinhoff, Ulrich Johannes: Von Toleranz zur Autoimmunität. In vivo Analysen über die Funktion und die Bedeutung autoreaktiver CD4+ und CD8+ T-Zellen

Kapitel 3. Methodische Grundlagen und Neuentwicklungen

3.1 Die VSV-Glykoprotein (VSV-G) spezifische Immunantwort

Im Modell der Infektion mit dem Vesikulären Stomatitis Virus (VSV) wurde untersucht, welchen Einfluß die Struktur, die Lokalisation und die Expression eines Antigens auf die Toleranzinduktion von CD4+ T-Zellen hat.

Im Glykoprotein von VSV befinden sich die biologisch relevanten Epitope, die von neutralisierenden Antikörpern und CD4+ T-Zellen erkannt werden. Letztere werden für den Klassenwechsel der B-Zellen von IgM nach IgG benötigt. Die protektive Immunantwort gegen eine VSV Infektion ist biphasisch, d.h. sie besteht aus einer frühen IgM Antikörperantwort, die von CD4+ T-Zellen unabhängig ist und einer darauf folgenden Antikörperantwort des IgG Typs, die jedoch strikt von CD4+ T-Zellen abhängt ().

Die VSV-G spezifische B-und T-Zellantwort wurde in verschiedenen transgenen Tieren


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analysiert, die VSV-G als Neoselbstantigen in unterschiedlichen Formen (löslich oder membranständig), zu verschiedenen Zeitpunkten und in unterschiedlichen Organen exprimieren. Die VSV-G spezifische CD4+ T-Zellaktivität wurde entweder indirekt über den spezifischen IgG Antikörpertiter oder direkt durch die Analyse von TZR transgenen Tieren bestimmt. Hierzu wurden die Tiere entweder mit VSV Serotyp Indiana, VSV-G rekombinanten Vaccinia Viren, oder mit VSV-G, das an Myoglobin gekoppelt war, immunisiert.

3.2 Die Hsp60-spezifische Immunantwort

Es ist bekannt, daß Infektionen mit unterschiedlichen Erregern Hsp60-spezifische T-und B-Zellimmunantworten induzieren (). Gleichzeitig mehrt sich der Verdacht, daß Hsp60-spezifische Immunantworten nicht nur schützende, sondern auch schädigende Auswirkungen haben. Es ist bis heute jedoch unklar, ob Erkrankungen bei denen sich eine signifikant erhöhte Reaktivität gegen Hsp60 nachweisen läßt, direkt durch die Hsp-spezifische Immunantwort ausgelöst wurde, oder diese nur als Begleiterscheinung einer anderweitig verursachten Gewebeschädigung auftritt. Um dieser Frage nachzugehen, haben wir CD8+ T-Zellen, die durch bakterielles Hsp60 induziert wurden, in-vitro und in-vivo auf Kreuzreaktivität mit dem eukaryotischen Homolog untersucht. So konnte neben der Feinspezifität auch das pathologische Potential dieser Zellen untersucht werden. Durch adoptiven Transfer von Hsp60-kreuzreaktiven CD8+ T-Zellen in alpha/beta T-zelldefiziente Tiere wurde das Verhalten der T-Zellen und die Entstehung der Immunpathologie direkt im lebenden Organismus verfolgt. Da die Hsp60-reaktiven CD8+ T-Zellen eine gewebespezifische Entzündungsreaktion im Dünndarm verursachten, wurden anschließend verschiedene Gewebe hinsichtlich der


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Prozessierungsfähigkeit von MHC-Klasse I Antigenen untersucht. An dieser Stelle sei auf die in den Originalarbeiten beschriebenen neuen Systeme zur Analyse einer gewebespezifischen Entzündungsreaktion und Antigenprozessierung verwiesen.

3.3 Organspezifische Antigenprozessierung durch das 20S Proteasom

Man geht heute davon aus, daß der größte Teil der auf MHC Klasse I präsentierten Peptide durch das proteasomale System entstanden sind. Da diese Untersuchungen meist mit Zelllinien durchgeführt wurden, gibt es bisher keine Kenntnisse über die proteasomalen Prozessierungseigenschaften, komplexer Gewebe bzw. Organe. Da das physiologische Milieu im Gewebe einen starken Einfluß auf die Proteasomenzusammensetzung und somit auch auf die Prozessierungseigenschaften einzelner Zellen hat, interessierte uns die Frage, in wie weit sich verschiedene Gewebe bzw. Organe in ihrem Prozessierungverhalten unterscheiden. Hierzu wurden 20S Proteasomen aus verschiedenen Organen isoliert und mit Hilfe der 2D-Gelelektrophorese in die einzelnen Untereinheiten aufgetrennt. Dabei wurde deutlich, daß jedes Organ ein ganz spezifisches Proteinmuster von alpha- und beta Untereinheiten der 20S Proteasomen aufweist. Unabhängige Versuche zeigten, daß das 2D-Proteinmuster organspezifisch reproduzierbar ist. Die Proteine wurden massenspektrometrisch (MALDI-MS) analysiert und mit Hilfe von Datenbanken identifiziert. Diese

Untersuchungen zeigten, daß proteosomale Untereinheiten in verschiedenen Isoformen vorkommen, die wahrscheinlich durch posttranslationale Modifikationen entstanden sind. Die Prozessierungseigenschaften isolierter 20S-Proteasomen wurden in einem In-vitro-Verdausystem mit verschiedenen Modellsubstraten (30mer Polypeptide) getestet. Die dabei entstandenen Spaltprodukte wurden mit Hilfe der MALDI-MS identifiziert.


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Die Ergebnisse machen deutlich, daß 20S Proteasomen verschiedener Organe unterschiedliche Spaltprodukte erzeugen.

3.4 Die T-Zellrezeptoranalyse

Die Klonierung des T-Zellrezeptors (TZR) der Hsp60 kreuzreaktiven CD8+ T-Zellen ergab zwei Transkripte für den alpha-TZR (Valpha8, Valpha7) und ein Transkript für die beta-Kette (Vbeta8). Die Kombination und Expression von zwei verschiedenen TZR-alpha Ketten mit einer TZR-beta Kette wird als dualer TZR bezeichnet. Zur Klärung, ob die Expression eines dualen TZR für die Kreuzreaktivität der Hsp60-spezifischen T-Zellen verantwortlich gemacht werden können, wurden TZR-Transfektanten mit beiden TZR Kombinationsmöglichkeiten, Valpha8/Vbeta8 und Valpha7/Vbeta8 hergestellt. Die Transfektanten wurden dann auf die Oberflächenexpression der TZR und die spezifische Peptiderkennung analysiert. Hierzu wurden die Valpha7, Valpha8 und Vbeta8 Ketten in retrovirale Vektoren (pMSCV-IRES-GFP) kloniert, die grünfluoreszierendes Protein (GFP) als Reportergen beherbergen. Eine TZR negative Thymomazelllinie (54zeta17-CD8) wurde dann mit den Vektoren der jeweiligen TZR-Kombinationen (Valpha8/Vbeta8 und Valpha7/Vbeta8) transduziert, um so die Expression und Reaktivität der einzelnen TZR analysieren zu können. Die Transduktion, die für alle drei TZR-Vektoren sehr effizient war, konnte direkt über die GFP-Expression mit dem fluoreszensaktivierten Zellsorter (FACS) gemessen werden. Analysen der TZR-Expression mittels FACS und Westernblot zeigten, daß die Valpha7 TZR-Kette im Zytoplasma, nicht aber an der Zelloberfläche exprimiert wird. Die Spezifität der Peptiderkenung der Transfektanten wurde über die Sekretion von IL-2 und die Expression von CD69, einem frühen Aktivierungsmarker, gemessen.


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Thu Feb 20 11:23:24 2003