Steinhoff, Ulrich Johannes: Von Toleranz zur Autoimmunität. In vivo Analysen über die Funktion und die Bedeutung autoreaktiver CD4+ und CD8+ T-Zellen

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Kapitel 4. Analyse autoreaktiver CD4+ T-Zellen in VSV-G transgenen Tieren

Das Glykoprotein des Vesikulären Stomatis Virus enthält die biologisch relevanten Determinanten für die virusneutralisierenden Antikörper und für die VSV-G spezifischen CD4+ T-Zellen. VSV-G ist somit ein Antigen, mit dem B-und Helfer T-Zellantworten gleichermaßen untersucht werden können. Während Toleranzmechanismen bei CD8+ T-Zellen relativ gut untersucht sind, sind die der CD4+ T-Zellen noch schlecht charakterisiert. Deshalb führten wir hierzu Untersuchungen an verschiedenen VSV-G transgenen Tieren durch, die das virale Neoantigen in unterschiedlicher Stärke und in verschiedenen Organen exprimieren.

4.1 Toleranzinduktion und Reaktivierung von VSV-G spezifischen CD4+ T-Zellen (1,2,3)

Die schützende, adaptive Imunantwort gegen eine Infektion mit VSV besteht aus neutralisierenden Antikörpern gegen das membranassozierte Glykoprotein des Virus. Die biphasische, VSV-G spezifische Antikörperantwort umfaßt frühe, von CD4+ T-Zellen unabhängige IgM Antikörper, auf die eine langlebige IgG Antikörperantwort folgt. Im Gegensatz zu IgM Antikörpern ist letztere strikt von CD4+ T-Zellen abhängig. Die VSV-G spezifische CD4+ T-Zellantwort wurde in verschiedenen VSV-G transgenen Mauslinien (Linie 207 und 163), die das Glykoprotein in verschiedenen Organen exprimieren, untersucht. Während eine Immunisierung der transgenen Tiere mit gereinigtem VSV-G oder VSV-G rekombinanten Vakziniavirus (Vacc-G) keine spezifische IgG Antwort induzierte, wurden nach VSV-Infektion spezifische Autoantikörper des IgG Isotyps gebildet. Offensichtlich wird die Toleranz der VSV-G


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spezifischen Helfer T-Zellen durch eine Infektion mit dem Wildtyp-VSV umgangen. Deshalb untersuchten wir mit Hilfe transgener Tiere die Frage, ob durch kovalente Kopplung neuer CD4+ T-Zelldeterminanten an VSV-G die spezifische T-Zelltoleranz umgangen werden kann und somit Autoantikörper vom IgG-Typ gebildet werden. Hierzu wurde rekombinant hergestelltes VSV-G kovalent an Spermwal-Myoglobin gekoppelt (VSV-G-SWM). Die Immunisierung von naiven C57BL/6 Mäusen ergab, daß freies VSV-G und VSV-G-SWM vergleichbare Immunogenität besitzen. Im nächsten Schritt wurden VSV-G transgene Tiere mit VSV-G-SWM oder dem Gemisch aus VSV-G und Myoglobin in Adjuvanz (CFA) immunisiert und anschließend die Antikörpertiter gemessen. VSV-G spezifisches IgG wurde in den transgenen Tieren nur nach Immunisierung mit kovalent gekoppeltem VSV-G-SWM aber nicht durch Koinjektion ungekoppelter Antigene induziert. Im Gegensatz zur VSV Infektion, konnte VSV-G spezifisches IgG erst 20 Tage nach VSV-G-SWM Immunisierung nachgewiesen werden. Der maximale Antikörpertiter war aber bei beiden Immunisierungsformen gleich. Wie zu erwarten, konnte durch die Primärimmunisierung mit freiem SWM und nachfolgender Immunisierung mit dem VSV-G-SWM Komplex der spezifische IgG Titer nicht erhöht werden.

Diese Experimente zeigen, daß die Aktivität autoreaktiver B-Zellen auf mehreren Ebenen kontrolliert wird. Ist ein Selbstantigen ubiquitär und in großen Mengen vorhanden, wird Toleranz durch klonale Eliminierung autoreaktiver B-Zellen gewährleistet (). Ist das Antigen jedoch nur in geringeren Mengen vorhanden, so können B-Zellen anergisiert werden, d.h. trotz physischer Präsenz reagieren sie nicht mehr auf das entsprechende Autoantigen. Handelt es sich um ein seltenes Autoantigen, kann die Aktivität autoreaktiver B-Zellen auch durch fehlende T-Zellhilfe kontrolliert werden (). Solche autoreaktiven B-Zellen lassen sich wieder aktivieren, wenn an das


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Selbstantigen (hier:VSV-G) neue CD4+ T-Zelldeterminanten (hier: SWM) gekoppelt werden. Damit ist die Aktivität von CD4+ T-Zellen auch für die Kontrolle von autoreaktiven B-Zellen entscheidend.

In weiteren Versuchen wurde der Frage nachgegangen, welcher Art die Toleranz der VSV-G spezifischen CD4+ T-Zellen in den transgenen Tieren ist. Für diese Untersuchungen wurden VSV-G transgene Tiere (Linie: Monitor) verwendet, die das Neoselbstantigen in löslicher Form in der Leber, Niere und Lunge, nicht aber im Thymus exprimierten. Verschiedene Immunisierungsprotokolle (siehe oben) ergaben, daß auch in diesen transgenen Tieren die VSV-G-spezifischen B-Zellen normal und die CD4+ T-Zellen tolerant sind. Deshalb wurde untersucht, ob die Toleranz der CD4+ T-Zellen durch klonale Deletion oder durch Anergie verursacht wird. Hierzu wurden Milzzellen aus VSV-G transgenen Mäusen in immundefiziente Scid-Mäuse adoptiv transferiert und die Tiere sieben Tage später mit Vacc-G immunisiert. Es zeigte sich, daß diese Tiere eine normale VSV-G spezifische Immunantwort bildeten, die in Kinetik und im Titer mit der normaler C57BL/6 Mäusen vergleichbar war. Durch die letale Bestrahlung der Scid-Mäuse konnte ausgeschlossen werden, daß VSV-G spezifische Vorläuferzellen in einem antigenfreien Thymus heranreifen und als immunkompetente Zellen die Peripherie repopulieren. Weitere Transferexperimente verdeutlichten, daß die Toleranzinduktion von VSV-G spezifischen CD4+ T-Zellen in der Peripherie entsteht und es sich bei diesen Zellen um keine intermediäre Population handelt, die vor der klonalen Deletion steht.

Die Experimente mit VSV-G transgenen Tieren konnten zeigten:

  1. Die Expression eines löslichen Neoselbstantigens (VSV-G) führt bei geringer Konzentration (100-1000 ng/ml) zur Toleranz von CD4+ T-Zellen, aber nicht der B-Zellen.

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  2. Autoreaktive B-Zellen können durch Präsentation neuer CD4+ T-Zelldeterminanten, die mit dem B-Zellantigen direkt gekoppelt sind, zur Sekretion von IgG aktiviert werden.
  3. VSV-G spezifische CD4+ T-Zellen sind in den transgenen Tieren (Linie 163 und Monitor) anerg und können in antigenfreier Umgebung wieder reaktiviert werden.
  4. Anerge, VSV-G spezifische CD4+ T-Zellen weisen gegenüber normalen T-Zellen keine verkürzte Lebensspanne auf.

4.2 Variierende Toleranz bei entwicklungsabhängiger Expression von VSV-G (4)

Transgene Tiermodelle haben sehr viel zum Verständnis der Mechanismen von B-und T-Zelltoleranz beigetragen. Dabei wurde deutlich, daß die Form des Antigens (löslich vs. membrangebunden), die Antigenstruktur, Expressionstärke und der Expressionsort zentralen Einfluß auf die Art und den Mechanismus der Toleranzinduktion haben (). Diese Untersuchungen wurden meist mit Modellantigenen durchgeführt, die eine entwicklungsunabhängige und gleichförmige Expression aufweisen. Da der Beginn einiger Autoimmunerkrankungen jedoch häufig mit hormonellen Umstellungen wie Pubertät, Schwangerschaft oder Menopause korreliert, sind Untersuchungen über Toleranzmechanismen bei hormonell bzw. entwicklungsregulierten Selbstantigenen von großer Bedeutung ().

Um Toleranz bzw. Immunreaktivität gegen ein hormonell geregeltes Selbstantigen untersuchen zu können, wurde eine transgene Mauslinie (Linie 23) etabliert, die lösliches VSV-G unter der Kontrolle des hormonell induzierbaren ?-Lactoglobulin-promoters exprimiert. Die Analyse dieser Tiere ergab, daß VSV-G in verschiedenen


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Organen wie Brustdrüse, Milz, Lunge und Thymus sezerniert wird. Dabei stellte sich heraus, daß die VSV-G Expression im Thymus mit dem Alter variiert, d.h. kurz nach der Geburt sehr hoch ist und danach mit zunehmendem Lebensalter abnimmt. Entsprechend zeigte die Immunisierung der Linie 23 mit Vacc-G eine in den ersten 4 Lebenswochen deutlich reduzierte CD4+ T-Zellantwort, die sich bis zum Alter von 17 Wochen normalisierte und im fortgeschrittenen Alter (Woche 50) wieder drastisch verringert war. Es konnte ausgeschlossen werden, daß die Aufnahme von VSV-G-haltiger Milch in der Frühphase der Tiere zu oraler Toleranz führt, da auch Jungtiere der Linie 23, die von nicht-transgenen Mäusen gesäugt wurden, tolerant waren. Um den Toleranzmechanismus besser zu verstehen, wurde die Linie 23 mit Tieren gekreuzt, die einen VSV-G transgenen T-Zellrezeptor (V?4/V?2) exprimieren (Linie 7). Vergleicht man den Prozentsatz der TZR-transgenen,V?2 positiven CD4+ T-Zellen der Linie 7 mit dem der doppeltransgenen Linie 23x7, so fällt auf, daß bei gleichzeitiger Expression des Antigens und des spezifischen TZR´s die VSV-G spezifischen CD4+ T-Zellen deutlich verringert sind. Interessanterweise nimmt der Anteil der TZR-transgenen T-Zellen mit zunehmendem Alter der Tiere wieder zu und bleibt dann ab der 15. Woche über den ganzen Analysezeitraum konstant. Dieser Befund macht deutlich, daß unterschiedliche Toleranzmechanismen die entwicklungsabhängige, VSV-G spezifische T-Zellaktivität kontrollieren. Während die frühe Toleranzphase durch klonale Deletion selbstreaktiver CD4+ T-Zellen im Thymus erfolgt, muß ein zusätzlicher, peripherer Mechanismus die Aktivität dieser T-Zellen im fortgeschrittenen Lebensalter kontrollieren. Obwohl Akkaraju et al. in einem Hühnereilysozym-transgenen Tiermodell bereits zeigen konnte, daß selbstreaktive CD4+ T-Zellen durch ein ganzes Spektrum von Toleranzmechanismen kontrolliert werden können (), handelt es sich hier um eine entwicklungsabhängige Toleranzentstehung, bei der durch hormonelle Regulation eines

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Selbstantigens die Aktivität von CD4+ T-Zellen durch unterschiedliche Mechanismen kontrolliert wird.

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Thu Feb 20 11:23:24 2003