Steinhoff, Ulrich Johannes: Von Toleranz zur Autoimmunität. In vivo Analysen über die Funktion und die Bedeutung autoreaktiver CD4+ und CD8+ T-Zellen

Kapitel 5. Hitzeschockprotein-kreuzreaktive CD8+ T-Zellen und Auto-immunität

Hitzeschockproteine (Hsp) sind hochkonservierte und ubiquitär vorkommende Proteine, die wichtige Funktionen bei der Proteinfaltung, dem Zusammenbau von makromolekularen Komplexen und der Translokation von Proteinen in verschiedene Zellkompartimente übernehmen. Gleichzeitig sind Hsp aber auch dominante Antigene bei vielen Infektions- und Autoimmunerkrankungen, die humorale und zelluläre Immunantworten hervorrufen. Dabei fördert die häufig beobachtete Sequenzähnlichkeit von Hsp verschiedener Spezies die Bildung von kreuzreaktiven T-und B-Zellen. In diesem Abschnitt widmen wir uns der Frage, welche immunpathologischen Konsequenzen eine Hsp60-kreuzreaktive CD8+ T-Zellantwort haben kann.

5.1 Bakterien Hsp60 induzierte CD8+ T-Zellen reagieren mit murinem Homolog (5,6)

Hsp60 kreuzreaktive CD8+ T-Zellen wurden in vitro durch Stimulation von naiven Milzzellen mit tryptisch verdautem mykobakteriellen Hsp60 generiert. Diese CD8+ T-Zellen lysierten Interferon-gamma (IFN-gamma) stimulierte Zielzellen auch in Abwesenheit von mykobakteriellen Hsp60 Peptiden. Dabei war unklar, ob die Stimulation mit IFN-gamma zu einer erhöhten Synthese und Präsentation von endogenem Hsp60 führte, oder ob durch die pleiotrope Wirkung von IFN-gamma Proteine induziert werden, mit denen Hsp60-spezifische CD8+ T-Zellen kreuzreagieren. Um diese Frage zu beantworten, wurde zunächst auf Proteinebene gezeigt, daß eine Stimulation von


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Knochenmarksmakrophagen mit 500U/ml rekombinanten IFN-gamma genauso wie eine Hitzebehandlung mit 42°C bzw. 44°C zu einer verstärkten Hsp60 Synthese führt. Um zu zeigen, daß Hsp60 das Zielantigen der kreuzreaktiven CD8+ T-Zellen ist, entwickelten wir ein Hsp60-spezifisches, mit Schwefelphosphat modifiziertes Antisense-Oligonukleotid (A-ODN). Dieses wurde von eukaryotischen Zellen (Schwann-Zellen und Makrophagen) effizient aufgenommen und blockierte die Neusynthese von Hsp60. Im Funktionstest (51Cr-Freisetzungsversuch) konnte schließlich gezeigt werden, daß IFN-gamma stimulierte Knochenmarksmakrophagen, die zuvor mit A-ODN behandelt wurden, nur noch marginal von den Hsp60-spezifischen CD8+ T-Zellen lysiert werden. Zur Vergewisserung, daß die A-ODN-Behandlung keine unspezifischen Effekte hat, wurden diese zusammnen mit Hsp60-spezifischen Sense-Oligonukleotiden (S-ODN) zusätzlich noch in einem Virus-spezifischen (MCMV) Zytotoxizitätsassay kontrolliert. In beiden Fällen waren keine unerwünschten Nebeneffekte durch die A-ODN zu beobachten. Diese Versuche zeigten deutlich, daß mykobakterien-Hsp60 induzierte CD8+ T-Zellen mit dem eukaryotischen Homolog kreuzreagieren und somit von diesen Zellen die Gefahr einer Autoimmunpathologie ausgeht.

5.2 Immunpathologie durch Hsp60 reaktive CD8+ T-Zellen (7)

Eine Reihe von Untersuchungen deuten darauf hin, daß Hsp-spezifische Immunreaktionen Auslöser von Autoimmunerkrankungen sein können (Review Kaufmann). Obwohl bei diesen Erkrankungen häufig eine hohe Frequenz von Hsp-reaktiven T-und B-Zellen nachgewiesen werden kann, ist in den meisten Fällen jedoch unklar, ob sie durch eine unkontrollierte Hsp-Reaktivität ausgelöst wurden, oder ob sie


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die Folgeerscheinung einer vorangegangenen Gewebezerstörung sind, bei der es zu einer erhöhten Synthese bzw. Freisetzung von Hsp kam. Dieser Frage sind wir in einem Tiermodell wie folgt nachgegangen:

Ein Hsp60-kreuzreaktiver CD8+ T-Zellklon (UZ3/4), der in vitro mit definierten Peptiden des mykobakteriellen und murinen Hsp60 reagierte, wurde in alpha/beta T-zelldefiziente (beta-TZR-/-) Tiere adoptiv transferiert. Dieses Tiermodell ermöglichte somit die Migration und Expansion des kreuzreaktiven T-Zellklons in-vivo direkt zu verfolgen. Ungefähr 2-5 Wochen nach T-Zelltransfer erkrankten die Tiere sichtbar an einer schwere Entzündung des Dünndarms. Der Dickdarm hingegen blieb stets unauffällig. Immunhistologische Untersuchungen zeigten, daß die erkrankten Tiere massive Infiltrationen von Hsp60-spezifischen T-Zellen in der Lamina propria und dem Darmepithel aufweisen, die zu einer progredienten Zerstörung der mukosalen Barriere führte. Die Entzündungsreaktion war antigenspezifisch und MHC- Klasse I restringiert, da ein Influenzanukleoprotein-reaktiver CD8+ T-Zellklon mit einer identischer MHC-Restriktion (H-2Db) und einem Typ I Zytokinmuster (IFN-gamma und TNF-alpha) keine immunpathologischen Veränderungen in beta-TZR-/- Tieren verursachte. Wie im Modell der durch CD4+ T-Zellen induzierten Colitis scheint TNF-alpha auch hier eine essentielle Rolle beim Entzündungsgeschehen zu spielen . Im Gegensatz zu den bisher beschriebenen Colitis-Tiermodellen, ist die Entstehung der Dünndarmpathologie in unserem Modell unabhängig von der bakteriellen Flora, da auch keimfreie Tiere eine Entzündung des Dünndarms entwickelten. Somit konnten wir klar demonstrieren, daß Hsp60-kreuzreaktive CD8+ T-Zellen murines Hsp60 auch in-vivo erkennen. Interessanterweise zeigten Westernblotanalysen, daß im Dünndarm wesentlich weniger endogenes Hsp60 exprimiert wird als im Dickdarm, einem Gewebe wo keine immunpathologischen Veränderungen auftraten. Da die Dünndarmpathologie weder


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durch eine spezielle Gewebeaffinität (Homing) noch durch eine erhöhte Expression von MHC-Klasse I Molekülen im Dünndarm erklärt werden konnte, stellten wir die Hypothese auf, daß die proteasomale Prozessierung von MHC-Klasse I Antigenen gewebetypische Unterschiede aufweist.

5.3 Untersuchungen zur Expression und Funktion des Hsp60-spezifischen TZR (8)

Durch die Klonierung des TZR von UZ3/4 wurden zwei im Leseraster rearrangierte TZR alpha Gene und ein TZR beta Gen identifiziert. Das beta-Ketten Rearrangement war Vbeta8.1-Dbeta1-Jbeta1.1 und das Rerrangement für den alpha-Lokus war Valpha8.2-J42 und Valpha7.2-J18. Da in der Literatur ein Zuammenhang zwischen der Expression eines dualen T-Zellrezeptors und der Autoreaktivität von T-Zellen diskutiert wird, sind wir der Frage nachgegangen, ob die Kreuzreaktivität von UZ3/4 durch die Expression eines dualen TZR bedingt ist. Um beide TZR-Kombinationen (Valpha8/Vbeta8 und Valpha7/Vbeta8) einzeln analysieren zu können, wurden Transfektanten hergestellt, die entweder die TZR-Kombination Valpha8/Vbeta8 oder Valpha7/Vbeta8 exprimierten. Hierzu wurde die cDNA der TZR in einen retroviralen Vektor kloniert, der grünfluoreszierendes Protein (GFP) als Markerprotein enthält. Die Expression von GFP ist somit ein direktes Maß für die Transduktionseffizienz, die für beide TZR-Kombinantionen bei ca. 30-45% lag. Da es für Valpha7 keinen TZR-spezifischen Antikörper gab, konnte die Oberflächenexpression des TZR Valpha7/Vbeta8 nur indirekt über die Expression von Vbeta8 gemessen werden. Im Gegensatz zu den TZR Valpha8/Vbeta8-Transfektanten, konnte trotz hoher GFP-Expression bei den TZR Valpha7/Vbeta8 Transfektanten keine Oberflächenexpression nachgewiesen werden. Westernblotanalysen, die mit Antikörpern gegen den konstanten Teil der alpha-


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Kette durchgeführt wurden, zeigten jedoch bei beiden Transfektanten ein klares Signal, was auf eine ausschließlich intrazytoplasmatische Expression und Lokalisation der Valpha7 Kette schließen läßt. Ob die Valpha7 Kette generell, oder nur spezifisch mit der TZR Vbeta8.1 Kette nicht paaren kann, ist zur Zeit noch unbekannt.

Dieser Befund deutete darauf hin, daß für die Kreuzreaktivität von UZ3/4 die Expression eines TZR ausreichend ist. Dies wurde experimentell auch bestätigt, da eine Stimulation der TZR Valpha8/Vbeta8 Transfektanten mit mykobakteriellen und murinen Hsp60 Peptiden zu einer Expression des frühen T-Zellaktivierungsmarkers, CD69, führte. Entsprechend war auch die Inkubation mit Antikörpern gegen Valpha8.2 ausreichend, um im Zytolyseassay die Erkennung beider Peptide durch UZ3/4 zu blockieren.

Das bereits schon früher beschriebene Phänomen der promisken Peptiderkennung macht deutlich, daß auch der TZR Valpha8.2/Vbeta8.1 in der Lage ist, in-vitro mit Peptiden von nur sehr geringer Homologie zu reagieren und in vivo Autoimmunpathologie zu erzeugen.

5.4 Gewebetypische Antigenprozessierung durch 20S-Proteasomen (9)

Die meisten auf MHC-Klasse I Molekülen präsentierten Peptide werden durch das 26S-Proteasomensystem generiert. Die proteolytisch aktiven Zentren befinden sich dabei im 20S-Kernkomplex, den wir in dieser Arbeit genauer analysiert haben.

20S Proteasomen wurden aus verschiedenen Geweben isoliert und mittels der 2D-Gelelektrophorese in die verschiedenen Untereinheiten aufgetrennt und massenspektrometrisch analysiert. Die Resultate demonstrierten, daß verschiedene Gewebe sich nicht nur im Gehalt der Immunoproteasomenuntereinheiten ibeta1 (LMP2),


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ibeta2 (MECL-1) und ibeta5 (LMP7) unterscheiden, sondern auch ein distinktes Muster der alpha-Untereinheiten, besonders jedoch der alpha4 und alpha6 Untereinheiten, aufweisen. Die genauen Muster der 20S- Proteasomen sind der Publikation zu entnehmen.

Von großem Interesse war die Frage, welchen Einfluß die gewebetypischen Unterschiede der 20S-Proteasomen auf die Prozessierung von Peptiden bzw. T-Zellepitope haben. Hierzu wurden verschiedene 25-30 Aminosäuren umfassende Modellsubstrate in vitro durch 20S-Proteasomen verdaut und die entstandenen Spaltprodukte massenspektrometrisch analysiert. Die mehrfach durchgeführten Analysen demonstrierten, daß die aus verschiedenen Organen stammenden 20S-Proteasomen ein quantitativ und qualitativ unterschiedliches Peptidmuster generierten. Mit der in 5.2 beobachteten Immunpathologie des Dünndarms korrelierend, zeigten in vitro Verdaus, daß das murine Hsp60 T-Zellepitop (KDIGNIISDA) am effizientesten von 20S-Proteasomen aus dem Dünndarm gespalten wurde. Im Gegensatz dazu generierten 20S Proteasomen des Colons das T-Zellepitop nur sehr marginal. Da die massenspektrometrisch ermittelten Mengen an Spaltprodukten nur von relativer Aussagekraft sind, haben wir die in vitro generierten Peptide des murinen Hsp60 auch funktionell in einem 51Cr-Freisetzungsassay mit dem Hsp60-spezifischen T-Zellklon getestet. Die Ergebnisse machten deutlich, daß nur die Proteasomen des Dünndarms in der Lage sind das Hsp60 T-Zellepitop in einer Menge zu generieren, die für eine spezifische Erkennung durch die Hsp60-spezifischen T-Zellen notwendig ist. Dieser Befund legt nahe, daß die organspezifischen Unterschiede von 20S Proteasomen auch von biologischer Bedeutung sind.


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Thu Feb 20 11:23:24 2003