Stoll, Christian: Phänotypische Untersuchungen zur prognostischen Bedeutung Proliferations- und Apoptose-assoziierter Faktoren sowie der Expression von Adhäsionsmolekülen in Plattenepithelkarzinomen der Mundhöhle und des Oropharynx

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Kapitel 1. Einleitung

1.1 Tumorinzidenz und Mortalität

Im Jahre 1997 wurden in der Bundesrepublik Deutschland 860389 Sterbefälle (398317 Männer, 462072 Frauen) in die Todesursachenstatistik aufgenommen [ 249 ]. Die häufigsten Todesursachen waren Erkrankungen des Kreislaufsystems (415892 Todesfälle = 48,3%), wobei die Mehrzahl der betroffenen Menschen älter als 75 Jahre war (295083 Todesfälle = 71,0%). An zweiter Stelle rangierten die bösartigen Neubildungen (210090 Todesfälle = 24,4%, 107618 Männer = 27,0%, 102472 Frauen = 22,2%). Der Anteil von über 75 jährigen Patienten bei den an bösartigen Neubildungen Verstorbenen war dabei deutlich geringer (87649 Todesfälle = 41,7%) als bei den Erkrankungen des Kreislaufsystems.

Unter den häufigsten Krebsneuerkrankungen nahmen nach einer Schätzung des Robert-Koch-Instituts im Jahre 1997 die Tumoren der Mundhöhle und des Rachens (ICD-9 140-149) [ 29 ] mit einem Anteil von 2,9% zwar nur den neunten Rang ein [ 217 ], die Inzidenz zeigte aber zumindest bis 1993 einen stetigen Anstieg [ 15 , 70 ]. Männer sind häufiger betroffen als Frauen (Verhältnis 2,9:1) [ 217 ]. Das Plattenepithelkarzinom (ICD-O 8070/3 und 8071/3) [ 296 ] ist hier die am häufigsten diagnostizierte Tumorentität ( Abb. 1 ) [ 20 , 174 , 210 ], wobei sich der Altersgipfel mit steigender Inzidenz von der 7. in die 6. Lebensaltersdekade vorverschoben hat. Trotz weiterentwickelter diagnostischer und therapeutischer Möglichkeiten konnte die Überlebensrate der davon betroffenen Patienten bisher nicht entscheidend verlängert werden [ 20 ]. Die relative 5-Jahres-Überlebensrate beträgt bei Männern in der Bundesrepublik Deutschland derzeit 43%, bei Frauen 56% [ 217 ]. Gemessen an der Lebenserwartung gehen in Deutschland jährlich durch den Tod an bösartigen Tumoren der Mundhöhle und des Oropharynx bei Männern insgesamt etwa 72200 und bei Frauen etwa 17500 Lebensjahre verloren. Der durchschnittliche Verlust an Lebenserwartung beläuft sich für Männer dabei auf 10-15 Jahre und für Frauen auf 10-11 Jahre. Das Wissen um die biologischen Veränderungen und prognostischen Faktoren während der Tumorentstehung und -progression stellt letztlich die Basis für eine gezielte Prävention, Entwicklung und Auswahl adäquater Therapiestrategien und Voraussage der Prognose für den Patienten dar.

Abb. 1: Plattenepithelkarzinom im Mundbodenbereich. Neben dem teilweise exophytischen, exulzerierten Tumor (Grüner Pfeil) erkennt man ein leukoplakisches Areal in unmittelbarer Nähe dazu (Gelber Pfeil).


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1.2 Biologische Grundlagen der Kanzerogenese

1.2.1 Regulation des Zellzyklus

Neoplastische Erkrankungen sind durch eine Störung des Gleichgewichts zwischen der Zellvermehrung durch Zellteilung und dem natürlichen Absterben von Zellen, der Apoptose oder dem programmierten Zelltod, charakterisiert [ 130 , 215 , 292 ]. Dabei kann Tumorwachstum aus abnorm gesteigerter, autonomer Proliferation und/oder Inhibition des normalen Zellverlustes durch Apoptose resultieren. Die zelluläre Proliferation folgt den einzelnen Schritten des Zellzyklus ( Abb. 2 ), der bei somatischen Zellen zunächst in die Mitose und die Interphase eingeteilt werden kann [ 66 ]. Die Mitose ist dabei in den einzelnen Schritten der Prophase, Metaphase, Anaphase und Telophase am besten morphologisch zu beurteilen, stellt aber mit einer Dauer von etwa 30 min den kürzesten Abschnitt im Zellzyklus dar [ 44 ]. Die Zählung der Mitoserate ist der „klassische“ Ansatz zur Bestimmung der Proliferationsaktivität in Tumoren und spielt neben strukturellen und zytologischen Parametern auch für das Tumor-Grading eine Rolle [ 156 , 210 ].

Abb. 2: Der Zellzyklus wird in den einzelnen Phasen der Mitose (M) und Interphase (G1, S, G2) durch Cycline und Cyclin-abhängige-Kinasen (CDK) gesteuert. Im Verlauf der Interphase wird das Retinoblastoma-Gen-Protein (pRB) durch die CDK phosphoryliert (P). Als Alternative zum Verbleib im Zellzyklus können die Zellen in die G0-Phase und weiter in die Phase der terminalen Differenzierung (GT) eintreten, aus der ein Wiedereintritt in den Zellzyklus nicht möglich ist. Am Ende der G1-Phase vor Eintritt in die S-Phase befindet sich der Kontrollpunkt von p53, wo bei im Genom geschädigten Zellen der Zellzyklus solange gestoppt wird, bis der genetische Schaden repariert ist oder die Zellen der Apoptose anheimfallen.

In der postmitotischen G1-Phase (gap1-phase) vollziehen sich nach der Zellteilung zunächst die Rekonstruktion der Zellproteine für das Wiedererreichen der ursprünglichen Zellgröße und -funktion sowie die Vermehrung der Zellorganellen [ 66 ]. Die Dauer der G1-Phase variiert bei verschiedenen Zellarten beträchtlich und beträgt im Stratum basale des Mundschleimhautepithels etwa 10 bis 13 Tage, was durch tierexperimentelle Untersuchungen mit Tritium-markiertem 3H-Thymidin radioautographisch bestimmt werden konnte [ 257 ]. In der ungefähr 6 h dauernden S-Phase (Synthese-Phase) findet anschließend die Synthese der Desoxyribonukleinsäuren (DNA) statt. Es folgt die etwa 6 h lange prämitotische Ruhephase G2 (gap2-phase). Nicht-neoplastische Zellen weisen in der G1-Phase einen diploiden DNA-Gehalt auf. In der S-Phase nimmt der DNA-Gehalt bis zur Tetraploidie zu, die in der G2-Phase erreicht ist und während der Mitose bis zur Zytokinese erhalten bleibt. Dies bildet die Grundlage der DNA-zytometrischen Analyse des


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Zellzyklus [ 6 , 8 , 92 , 172 ]. Alternativ können die Zellen nach der Mitose in die G0-Phase eintreten ( Abb. 2 ), in der keine Zellteilungsvorgänge stattfinden, aus der heraus jedoch eine Rückkehr in den Zellzyklus möglich ist. Nach Eintritt in die terminale Differenzierungsphase GT ist eine weitere Zellteilung nicht mehr möglich [ 66 ].

Eine andere Möglichkeit zur Beurteilung der Proliferationsaktivität neben der Zählung der Mitoserate beruht auf der Bestimmung von Antigenen, die nur in bestimmten Phasen innerhalb des Zellzyklus exprimiert werden. So ist das nukleäre Antigen Ki-67, das in zwei Formen mit 395 kD und 345 kD vorkommt, nur während der G1-, S- und G2-Phase des Zellzyklus, nicht aber während der G0- und GT-Phase nachweisbar [ 74 ]. Für die Beurteilung der Proliferationsaktivität von Plattenepithelkarzinomen der Mundhöhle hatte es sich in früheren Untersuchungen als zuverlässigerer Parameter im Vergleich zum PCNA (proliferating cell nuclear antigen), einer Untereinheit der DNA-Polymerase delta, erwiesen [ 197 ].

Der Ablauf des Zellzyklus wird durch Proteinkomplexe kontrolliert, die aus Cyclinen und Cyclin-abhängigen-Kinasen (CDK = cyclin dependent kinase) bestehen [ 66 ]. Diese Komplexe üben ihre regulatorische Funktion aus, indem sie weitere Schlüsselproteine wie das durch das Retinoblastoma-Gen kodierte Phosphoprotein (pRB) phosphorylieren, die in den weiteren Fortgang des Zellzyklus involviert sind ( Abb. 2 ) [ 27 , 36 , 44 , 50 , 88 , 92 , 195 , 234 ].

1.2.2 P53 als „Wächter des Genoms“

Am Ende der G1-Phase vor Eintritt in die S-Phase befindet sich ein Kontrollpunkt des Tumorsuppressors p53, wo der Zellzyklus von im Genom geschädigten Zellen solange gestoppt wird, bis der Schaden repariert ist oder die Apoptose der Zelle eingeleitet wird ( Abb. 2 ) [ 44 , 62 , 125 , 143 , 230 ]. P53 ist auch an einem weiteren Kontrollpunkt am Ende der G2-Phase vor Eintritt in die Mitose beteiligt [ 30 ]. Das p53 scheint im Zellzyklus von ungeschädigten Zellen keine lebensnotwendige Funktion zu besitzen, da Mäuse, die aufgrund eines genetischen Defektes kein funktionsfähiges p53 in ihren Zellen ausbilden, zunächst keine Entwicklungsstörungen zeigen [ 54 ]. Im Laufe ihres Lebens entwickeln sie aber gehäuft verschiedene Tumoren, wie das auch beim Menschen im Rahmen des seltenen, autosomal dominant vererbten Li-Fraumeni-Syndroms, einem Syndrom mit hereditären p53-Mutationen, zu beobachten ist [ 155 , 162 ]. Das Wildtyp-p53 übt somit offenbar die Funktion eines „Wächters des Genoms“ aus [ 143 ]. Es sichert die Integrität des Genoms, indem ein genetischer Schaden nicht durch Zellteilung auf Tochterzellen weitergegeben werden kann.

P53 ist ein unter physiologischen Bedingungen aufgrund seiner kurzen Halbwertszeit von maximal 20 Minuten in nur geringer Konzentration im Zellkern lokalisiertes Phosphoprotein mit einer Molekülmasse von 53 kD und besteht aus 393 Aminosäuren ( Abb. 3 ) [ 154 ]. Das 20303 Basenpaare große TP53-Gen befindet sich auf dem kurzen Arm des Chromosoms 17 bei 17p13.1 und setzt sich aus 11 Exons, von denen das erste gar nicht und das zweite und elfte nur teilweise kodieren, und den entsprechenden Introns zusammen [ 44 , 133 , 154 ]. Es sind zwei Promotoren für das TP53-Gen bekannt: Der erste befindet sich vor dem ersten, nicht kodierenden Exon; der zweite, wirkungsvollere ist etwa 1000 Basenpaare hinter dem ersten Exon im ersten, 10738 Basenpaare großen Intron lokalisiert [ 216 ]. Das p53 formt über seine C-terminal gelegene Oligomerisierungsdomäne stabile Tetramere [ 116 , 251 ] und aktiviert durch Bindung seiner spezifischen DNA-Bindungsstelle an die entsprechenden DNA-Abschnitte durch seine N-terminale Transaktivierungsdomäne die Transkription von Zielgenen ( Abb. 3 und Abb. 4 ) [ 38 , 281 ]. Lineare DNA-Einzel- oder Doppelstränge und zirkuläre DNA-Einzelstränge sowie zirkuläre Doppelstränge mit einer Lücke von mindestens 2900 Basen in einem Strang binden direkt an die C-terminale unspezifische DNA-Bindungsdomäne [ 107 ]. Nach Einwirkung von genotoxischen Einflüssen auf die Zelle steigt die Konzentration von p53 im Zellkern durch Stabilisierung der Tetramere an [ 125 ]. Diese Stabilisierung ist auf eine Konformationsänderung zurückzuführen, die durch posttranslatorische Einflüsse wie die Phosphorylierung von Serinresten im p53-Phosphoprotein ausgelöst wird ( Abb. 3 ) [ 236 ].

In der Aminosäurensequenz von p53 finden sich fünf im Verlauf der Vertebraten-Evolution hochkonservierte Abschnitte ( Abb. 3 ) [ 133 , 203 ]. Die Abschnitte II bis V (Aminosäuren 129-146, 171-179, 234-260 und 270-287) liegen in der spezifischen DNA-Bindungsdomäne. Mutationen, die in menschlichen Tumoren gefunden werden, betreffen fast ausschließlich diese Region [ 82 , 100 , 154 , 203 , 282 ]. Die Struktur des Aminosäurenabschnitts V, die einem Faltblatt-Schleifen-Helix-Motiv entspricht, bindet an Basen in der großen Furche der DNA [ 38 ]. Die Struktur der Abschnitte II und III entspricht jeweils einer Schleifenform, die durch ein Zink-Atom stabilisiert wird.


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Ein Aminosäurerest im Abschnitt III hat Kontakt mit der kleinen Furche der DNA [ 38 ]. Einige Aminosäuren in Positionen, die in p53 besonders häufig mutiert sind wie in Position 248 und 273, haben direkten Kontakt mit der DNA, während Aminosäuren in anderen häufig mutierten Positionen wie 175 und 249 für die Gesamtstruktur der Bindungsdomäne essentiell sind [ 133 ].

Abb. 3: Das 20303 Basenpaare große Gen TP53 befindet sich auf dem kurzen Arm von Chromosom 17 und besteht aus 11 Exons (E1-E11) getrennt durch die entsprechenden Introns (I1-I10), von denen das erste Exon gar nicht und das zweite und elfte nur teilweise für das aus 393 Aminosäuren bestehende Phosphoprotein p53 mit einer Molekülmasse von 53 kD kodieren. Es gibt fünf im Verlauf der Vertebraten-Evolution hochkonservierte Abschnitte (I-V) im p53, von denen vier (II-V) im Bereich der sequenzspezifischen DNA-Bindungsdomäne liegen. In diesen sogenannten „hotspots“ treten am häufigsten Missense-Mutationen auf. Gekennzeichnet sind die verschiedenen Phosphorylierungsstellen (P) durch DNA-Proteinkinasen (DNA-PK), Caseinkinasen I und II (CKI und CKII), Cyclin-abhängige-Kinasen (CDK) und Proteinkinase C (PKC), funktionelle Domänen und Proteinbindungsstellen durch p90MDM2 sowie die viralen Proteine E1B des Adenovirus, Typ 5, großes T-Antigen des SV40-Papovavirus und E6 der humanen Papillomaviren 16 und 18.

1.2.3 Inaktivierungsmechanismen von p53

Es sind mehrere Mechanismen bekannt, die zu einem Funktionsverlust von p53 führen können ( Abb. 4 ) [ 281 ]. Die Deletion eines oder beider TP53-Allele führt zu einer verminderten oder aufgehobenen p53-Synthese mit entsprechend verminderter p53-Konzentration und Funktion. Eine Nonsense- oder Frameshift-Mutation bewirkt die Bildung von trunkierten Proteinen, die aufgrund ihrer fehlenden Oligomerisierungsdomäne nicht in der Lage sind, die für die spezifische DNA-Bindung und Transaktivierung notwendigen Tetramere zu bilden. Die häufigsten Veränderungen des TP53-Gens in menschlichen Tumoren sind jedoch Missense-Mutationen innerhalb der sogenannten „hotspots“ der DNA-Bindungsdomäne [ 91 , 203 ]. Die resultierenden mutierten p53-Monomere sind durchaus in der Lage sowohl miteinander als auch mit Wildtyp-p53-Monomeren Tetramere zu bilden, wobei aufgrund einer veränderten Gesamtkonformation dieser Tetramere eine spezifische DNA-Bindung und Transaktivierung gehemmt wird [ 281 ]. Dies erklärt, warum bei einer Missense-Mutation eines TP53-Allels das Produkt des nicht-mutierten Allels ausgeschaltet wird. Eine solche Mutation wird daher als dominant-negativ bezeichnet. Die Halbwertszeit des veränderten p53 ist durch die Konformationsänderung analog zur Stabilisierung durch Phosphorylierung von Serinresten im p53-Phosphoprotein auf mehrere Stunden wesentlich verlängert, so daß es dann immunhistologisch im Zellkern in der 10- bis 100-fachen Menge gegenüber physiologischen Bedingungen nachweisbar wird [ 11 , 87 , 154 ].


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Abb. 4: Das p53 formt über seine Oligomerisierungs-domäne stabile Tetramere und aktiviert durch Bindung seiner sequenzspezifischen DNA-Bindungsdomäne an die entsprechenden DNA-Abschnitte (Promotor) die Transkription von Zielgenen. Bei Verlust von p53-Allelen oder Nonsense-Mutationen, die ein trunkiertes p53-Phosphoprotein zur Folge haben, das nicht in der Lage zur Tetramerisierung und Transaktivierung ist, kommt es zu einer verminderten oder fehlenden Transkription der Zielgene. Eine Missense-Mutation führt über den Einbau von veränderten p53-Monomeren in die dann in der Gesamtkonformation veränderten Tetramere ebenfalls zu einer fehlenden Transkriptionsaktivierung. Auch eine Bindung von zellulären Proteinen wie p90MDM2 und viralen Proteinen wie E6 aus den humanen Papillomaviren 16 und 18 hemmt die Transaktivierungsfunktion.

Darüber hinaus kann p53 durch Bildung von Komplexen mit Proteinen wie dem zellulären Phosphoprotein p90MDM2, das im Bereich der Transaktivierungsdomäne bindet, funktionell inaktiviert werden ( Abb. 3 und Abb. 4 ) [ 7 , 181 , 198 , 281 ]. Ferner vermittelt p90MDM2 die Proteolyse von p53 durch Proteasen des Ubiquitin-Systems. Insgesamt ergibt sich durch den negativen Rückkopplungsmechanismus, in dem p53 einerseits die Synthese von p90MDM2 induziert [ 7 ], andererseits nach Bindung von p90MDM2 abgebaut wird ( Abb. 5 ), unter physiologischen Bedingungen eine niedrige zelluläre p53-Konzentration [ 154 , 297 ]. P90MDM2 ist ein Phosphoprotein mit einem Zink-Finger-Motiv und einer Molekülmasse von etwa 90 kD aus bis zu 491 Aminosäuren und kommt in mindestens vier verschiedenen Formen vor [ 7 , 181 , 198 , 230 ]. Das kodierende Gen ist auf dem langen Arm des Chromosoms 12 auf dem Locus 12q14.3-q15 lokalisiert [ 178 ] und erstmals im Mausmodell (BALB/c) als ein mehr als 50-fach amplifiziertes Onkogen in einer tumorinduzierenden Fibroblasten-Zellinie (3T3DM), die ein doppeltes Chromatidfragment (minute) als zytogenetisches Zeichen einer Genamplifikation enthält, entdeckt und als murine-double-minute-2-Gen (MDM2) bezeichnet worden [ 63 ].

Virale Proteine wie das E6-Protein (early 6) der humanen Papilloma-Viren 16 und 18 [ 177 , 288 ], das E1B-55-kD-Protein (early region 1B) des Adenovirus, Typ 5 [ 222 ] und das große T-Antigen (large tumor antigen) des SV40-Papovavirus (simian virus 40) mit seinen Aminosäuren 400-650 [ 144 , 222 ] haben ebenfalls spezifische Bindungsstellen im p53-Phosphoprotein ( Abb. 3 ), wobei


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die Bindung des E6-Proteins an die C-terminale Domäne eine Ubiquitin-abhängige Degradation des Moleküls induziert [ 224 ]. Dagegen führt eine Bindung des E1B-55-kD-Proteins und des großen T-Antigens zu einer Stabilisierung des p53-Moleküls bei gleichzeitigem Funktionsverlust durch Blockierung der jeweiligen Domänen ( Abb. 4 ) [ 79 , 87 , 233 , 281 ].

1.2.4 Regulation der Cyclin-abhängigen-Kinasen

Das physiologische Effektormolekül des Wildtyp-p53 in der Kaskade des Zellzyklus ist das p21CIP ( Abb. 5 ), ein Protein mit einer Molekülmasse von 21 kD aus 164 Aminosäuren, das auf dem kurzen Arm des Chromosoms 6 auf dem Locus 6p21.2 kodiert ist [ 30 , 44 , 59 , 230 ]. 2400 Basenpaare vor diesem Gen befindet sich der zugehörige Promotor, der eine Bindungsstelle für p53 enthält ( Abb. 4 ). Mutationen treten im p21CIP extrem selten auf [ 44 , 230 ]. Das p21CIP wird gemäß seiner Funktionen neben WAF1 (wild-type p53 activated fragment 1) [ 59 ] und SDI1 (senescent cell derived inhibitor 1) [ 193 ] als auch als CIP1 (CDK interacting protein 1) [ 90 ] bezeichnet. Das p21CIP übt nämlich einen inhibierenden Einfluß auf Cyclin-abhängige-Kinasen aus ( Abb. 5 ) [ 30 , 90 , 301 , 306 ].

Abb. 5: Das p53 bildet mit dem p90MDM2 einen negativen Rückkopplungsmechanismus, in dem p53 einerseits die Synthese von p90MDM2 induziert, andererseits nach Bindung an p90MDM2 Ubiquitin-abhängig abgebaut wird. Durch Induktion von p21CIP werden die Cyclin-abhängigen-Kinasen 2, 4 und 6 (CDK2/4/6) inhibiert, die durch Cycline gesteuert über eine Phosphorylierung (P) des Retinoblastoma-Gen-Phosphoproteins pRB für eine Aktivierung des Transkriptionsfaktors E2F sorgen. Weitere Inhibitoren für CDK2/4/6 sind p27CIP und für CDK4/6 p16INK4a und p15INK4b. P53 induziert weiterhin BAX, das die Apoptose fördert, und hemmt indirekt die Synthese von BCL-2, das die p53-abhängige Apoptose verhindert.

Ein weiterer Inhibitor der Cyclin-abhängigen-Kinasen 4 und 6 ist das p16INK4a (polypeptide inhibitor of CDK4 and CDK6) ( Abb. 5 ), das durch ein Gen auf dem kurzen Arm von Chromosom 9 auf dem Locus 9p21 mit zwei alternativen Leserahmen kodiert wird [ 122 , 231 , 307 ]. Das zweite Genprodukt p14ARF (alternate reading frame, p19ARF im Mausmodell) besitzt keine strukturelle Ähnlichkeit zu p16INK4a und blockiert die Wirkung von p90MDM2 [ 256 , 308 ]. Gesteuert von zwei unterschiedlichen Promotoren werden auf dem INK4a/ARF-Locus zwei verschiedene Exons 1-alpha (125 Basenpaare) für p16INK4a und 1-beta für p14ARF gefolgt von den beiden gemeinsamen Exons


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transkribiert und verspleißt [ 212 ]. Die Translation der genetischen Sequenz der beiden gemeinsamen Exons 2 (307 Basenpaare) und 3 (12 Basenpaare) erfolgt anschließend in zwei zueinander verschobenen Leserahmen [ 213 ]. Im INK4a/ARF-Locus wurden bei menschlichen Tumoren je nach Tumorentität Deletionen oder Punktmutationen beschrieben [ 122 , 192 ]. Eine Hemmung der Transkription durch Methylierung des Promotors von p16INK4a stellt bei fehlenden Mutationen jedoch häufig das pathogene Prinzip dar [ 32 , 157 , 173 ].

Die katalytischen Einheiten der Cyclin-abhängigen-Kinasen sind nur dann aktiv, wenn sie mit regulatorischen Untereinheiten, den Cyclinen, assoziiert sind ( Abb. 2 und Abb. 5 ) [ 44 , 66 , 92 ]. Die Cyclin-abhängigen-Kinasen 4 und 6 werden durch die Cycline D1, D2 und D3 aktiviert. Mit Ausnahme dieser Cycline sind Cycline nur in bestimmten Phasen des Zellzyklus vorhanden und werden im weiteren Verlauf durch Ubiquitin-vermittelte Proteolyse rasch abgebaut ( Abb. 2 ); die regulatorische Bedeutung von Cyclin D ist aber auf die G1-Phase beschränkt. Eine Überexpression des 36 kD Proteins Cyclin D1 wurde in Adenomen der Parathyroidea gefunden, wobei das für Cyclin D1 kodierende und auf dem Locus 11q13 gelegene, hier zunächst als PRAD-1 bezeichnete Gen CCND1 infolge einer Inversion in Chromosom 11 (p15;q13) durch den Parathormon-Gen-Promotor aktiviert wird [ 4 ]. Die Überexpression von Cyclin D1 in zentrozytischen B-Zell-Lymphomen ist auf eine Translokation t(11;14)(q13;q32) zurückzuführen, durch welche das CCND1- oder hier zunächst als BCL-1 (B-cell lymphoma-1) bezeichnete Gen unter den Einfluß des Immunglobulin-Schwerketten-Enhancers kommt [ 17 , 37 ]. In verschiedenen weiteren Tumoren ist die Cyclin D1-Expression durch Amplifikation der 11q13-Region verstärkt [ 218 ].

1.2.5 Das Retinoblastoma-Gen

Durch die Cyclin-abhängigen-Kinasen wird im Verlauf der Interphase des Zellzyklus ein nukleäres Phosphoprotein (pRB) aus 928 Aminosäuren mit der Molekülmasse von 105 kD an Serin- und Threoninresten phosphoryliert ( Abb. 2 und Abb. 5 ) [ 27 , 36 , 44 , 50 , 88 , 92 , 195 , 234 ], für das das etwa 200000 Basenpaare große Retinoblastoma-Gen auf dem langen Arm von Chromosom 13 auf dem Locus 13q14.1-q14.2 mit seinen 27 Exons kodiert [ 68 , 101 , 149 , 284 , 287 ]. Das Retinoblastoma-Gen ist das erste Tumorsuppressorgen, welches beim Menschen beschrieben wurde [ 132 ]. Neben dem 105-kD-Phosphoprotein sind noch Varianten mit Molekülmassen von 107 kD und 130 kD bekannt. Das pRB besitzt verschiedene, funktionell bedeutende Domänen. Die N-terminale Domäne vermittelt eine Oligomerisation von pRB. Weiter C-terminal folgt die sogenannte pRB-Tasche, die aus zwei durch eine kurze Aminosäurensequenz getrennten A- und B-Subdomänen besteht. Weiter C-terminal ist die C-Domäne lokalisiert, an die sich eine nukleäre Lokalisationssequenz anschließt. Am C-Terminus findet sich eine Konsensussequenz zur Spaltung von Caspasen [ 284 ]. Ein Teil der Phosphorylierungsstellen des pRB liegt in Motiven, die für Substrate von Cyclin-abhängigen-Kinasen typisch sind. Die Phosphorylierung von pRB wird vom Ende der Interphase bis zur Mitose beibehalten, in deren Verlauf pRB dann durch eine Phosphatase dephosphoryliert wird. In der G0- und zu Beginn der G1-Phase liegt pRB dann in seiner hypophosphorylierten Form vor ( Abb. 2 ) [ 27 , 36 , 50 ].

Die Transaktivierung von Genen, die von den Transkriptionsfaktoren E2F1-3 abhängen, wird blockiert, wenn die Faktoren im Komplex mit der gering phosphorylierten Form des pRB vorliegen ( Abb. 5 ) [ 159 , 307 ]. Durch Phosphorylierung wird die Interaktion von pRB mit zellulären Bindungsproteinen wie E2F aufgehoben, das erstmals als Transkriptionsfaktor mit einer Molekülmasse von 60 kD durch seine transaktivierende Funktion am E2-Promotor bei Adenoviren identifiziert wurde [ 137 ]. Als mögliche Mechanismen der Transkriptionshemmung werden eine Maskierung der Transaktivierungsdomäne von E2F und die Deacetylierung von Histonen diskutiert [ 25 , 51 , 161 ]. Durch Acetylierung und Deacetylierung von Histonen wird die Struktur des Chromatins reguliert. Die negativ geladenen Acetylreste der Histone lockern die Chromatinstruktur auf, wodurch der Zugang von Transkriptionsfaktoren zu den entsprechenden Bindungssequenzen der DNA erleichtert wird. Eine Deacetylierung führt umgekehrt zu einer engeren Assoziation von DNA und Nukleosomen und damit zu einer Behinderung des Zugangs von Transkriptionsfaktoren. Weiterhin wird diskutiert, daß die Aktivität von Transkriptionsfaktoren durch Acetylierung direkt beeinflußt werden kann [ 51 ]. E2F-gebundenes pRB assoziiert mit einer Histon-Deacetylase (HDAC1), die im Komplex mit pRB und E2F enzymatisch aktiv ist [ 159 ]. Auf diese Weise könnte die Bindung von kooperierenden Transkriptionsfaktoren an benachbarte DNA-Bindungselemente und damit die transaktivierende Wirkung von E2F blockiert werden. Durch Bindung der HDAC1 an pRB wird außerdem der Promotor des Cyclin-E-Gens reprimiert [ 51 ].


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Eine Deletion von Retinoblastoma-Genen und eine damit verbundene verminderte oder fehlende Expression des Genprodukts pRB wurde außer beim Retinoblastom [ 42 , 68 , 303 ] auch in Weichteil- und Knochensarkomen [ 68 ], im kleinzelligen Bronchialkarzinom [ 303 ] und in Blasenkarzinomen [ 103 ] in mehr als einem Drittel aller Tumoren gefunden. Weiterhin kann die Expression durch Mutation und Hypermethylierung in der Promotorregion gestört sein [ 24 , 158 ]. Analog zu p53 kann das pRB durch Bindung des zellulären Phosphoproteins p90MDM2 an dessen C-terminale Domäne, wodurch die Konformation im Bereich der pRB-Tasche geändert wird [ 299 ], und von viralen Proteinen wie dem E7-Protein (early 7) der humanen Papilloma-Viren 16 und 18 [ 57 , 104 ], dem E1A-Protein (early region 1A) des Adenovirus, Typ 5 [ 290 ] und dem großen T-Antigen (large tumor antigen) des SV40-Papovavirus mit seinen Aminosäuren 105-114 [ 49 ] funktionell inaktiviert werden [ 44 , 294 ].

1.2.6 Regulation der Apoptose

Abb. 6: Morphologische Veränderungen im Verlauf der Apoptose: blasige Veränderung der Plasma- und Kernmembran, Schrumpfung der Zelle, Kondensierung und Fragmentierung des Chromatins, Entstehung von Apoptosekörpern, die von Makrophagen und benachbarten Zellen ohne Entzündungsreaktion phagozytiert werden.

Im Verlauf von Morphogenese und Differenzierung sowie zur Abwehr schädigender Einflüsse und zur Aufrechterhaltung der Gewebshomöostase im Organismus müssen in bestimmten Situationen körpereigene Zellen entfernt werden [ 35 , 80 , 252 ]. Um die Integrität des Gesamtorganismus nicht zu gefährden, ist die Eliminierung der Zellen einer genauen Regulation unterworfen, deren Programm und biochemischer Apparat Bestandteil jeder Körperzelle ist [ 80 ]. Ein solcher geregelter physiologischer Zelluntergang wird als Apoptose bezeichnet, der sich in grundlegender Weise von der ungeregelten Nekrose unterscheidet [ 81 ]. Die Apoptose ist durch charakteristische morphologische Veränderungen gekennzeichnet ( Abb. 6 ) [ 111 , 131 ]: eine blasige Veränderung der Plasma- und Kernmembran, Schrumpfung der Zelle sowie Fragmentierung und Kondensierung des Chromatins. Die Zellorganellen werden nicht geschädigt und der Zellinhalt tritt nicht in die Umgebung aus. Der physiologische Zelltod mündet in sogenannten Apoptose-Körpern, die von Makrophagen und benachbarten Zellen ohne Entzündungszeichen phagozytiert werden. Im Gegensatz hierzu geht die Nekrose mit einer Schwellung der Zellen und


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Schädigung der Organellen einher. Der Zellinhalt tritt in die Umgebung aus, und die nachfolgende Phagozytose der Zellreste ist mit einer Entzündungsreaktion verbunden. Biochemisch läßt sich bei der Apoptose eine Aktivierung von Proteinasen und endogenen Nukleasen nachweisen [ 131 ]. Der Abbau der DNA führt zunächst zu großen DNA-Fragmenten von 50-300 Kilobasen, die in der Folge weiter bis zu Fragmenten von 180 Basenpaaren abgebaut werden und sich elektrophoretisch als charakteristische Leitern darstellen. Weiterhin findet man eine erhöhte Glutaminase-Aktivität. Bei der Aktivierung der Apoptose-Enzyme spielen Ca++- und Mg++-Ionen eine zentrale Rolle.

In Zellen, die einen genetischen Schaden tragen, ist die Initiation der Apoptose in erster Linie von der Funktion des Wildtyp-p53-Phosphoproteins abhängig, das für eine Unterbrechung in der späten G1-Phase des Zellzyklus verantwortlich ist, bis eine Reparatur des genetischen Schadens stattgefunden hat oder die Apoptose der Zelle eingeleitet wird [ 44 , 143 ]. Aber ein weiteres Protein mit einer Molekülmasse von 25 kD, das als BCL-2 (B-cell lymphoma-2) bezeichnet wurde, ist in die Regulation des programmierten Zelltods involviert, indem es die Apoptose in vielen Zellsystemen sowohl unter physiologischen Bedingungen als auch im Tumorgewebe inhibiert und wahrscheinlich durch Blockierung des programmierten Zelltods zu einem Wachstumsvorteil für Zellen führt [ 35 , 97 , 136 , 201 , 215 ]. Die Bedeutung dieses Onkogens war primär bei follikulären B-Zell-Lymphomen entdeckt worden [ 274 , 275 ]. Das BCL-2 Gen, das normalerweise bei 18q21.3 lokalisiert ist, befindet sich bei dieser Tumorerkrankung in Juxtaposition mit starker Überexpression auf dem Locus der schweren Immunglobulin-Ketten 14q32. Hierbei werden vermehrt BCL-2-mRNA und das von ihr kodierte Protein produziert [ 171 ]. Aber eine erhöhte BCL-2-Expression wurde ebenfalls bei epithelialen Malignomen wie Karzinomen der Bronchien [ 77 , 207 ], Schilddrüse [ 209 ], Brust [ 53 ], Niere [ 35 ], Ovarien [ 142 ] und des Magens [ 147 ] genauso wie bei kolorektalen Adenokarzinomen [ 5 ] gefunden [ 206 ].

1.2.7 Die BCL-2 Familie

Abb. 7: Die wichtigsten Mitglieder der BCL-2 Familie, die mindestens 15 strukturell verwandte Proteine umfaßt, die zum Teil die Apoptose hemmen, zum Teil fördern. Alle Mitglieder dieser Familie besitzen mindestens eine von vier im Laufe der Vertebraten-Evolution konservierten BCL-2-Homologiedomänen (BH1-BH4).

BCL-2 ist der Namensgeber für eine Familie von mindestens 15 strukturell verwandten Proteinen ( Abb. 7 ) [ 1 , 129 , 190 ]. Alle Mitglieder dieser Familie besitzen zumindest eine von vier konservierten Domänen, die als BCL-2-Homologiedomänen bezeichnet und mit nachgestellten Ziffern unterschieden werden (BH1-BH4), und können die Apoptose entweder fördern oder hemmen. Mitglieder der anti-apoptotischen Gruppe wie BCL-2 besitzen mindestens eine BH1- und BH2-Domäne, wobei am häufigsten alle vier Domänen vorhanden sind [ 1 ]. In der pro-apoptoti


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schen Gruppe gibt es zwei Untergruppen: Mitglieder der einen Untergruppe wie BAX (BCL-2 associated X protein) mit einer Molekülmasse von 21 kD und kodiert auf dem Locus 19q13.3-q13.4 besitzen drei Domänen (BH1-BH3), Mitglieder der zweiten Untergruppe nur die BH3-Domäne. Die BH3-Domäne ist für die „Killer“-Funktion von den Mitgliedern der zweiten Untergruppe essentiell [ 1 , 129 ].

Während die Transkription von BAX durch Wildtyp-p53 stimuliert wird [ 180 ], wird durch Überexpression von Wildtyp-p53 zugleich über die Interaktion von p53 mit Proteinen, die an die TATA-Box, eine bedeutende Konsensussequenz der Promotorregion vieler Gene, binden, die Transkription von BCL-2 gehemmt ( Abb. 5 ) [ 133 ]. Entscheidend für die Regulation der Apoptose ist das Gleichgewicht zwischen Apoptosehemmern wie BCL-2 und Apoptoseförderern wie BAX, wobei sich bei Überwiegen von BCL-2 BCL-2-Homodimere bilden können [ 200 ]. Im Gleichgewichtszustand lagern sich in vitro BCL-2 und BAX zu Heterodimeren zusammen [ 200 ], wobei es Kontroversen gibt, ob es zu dieser Assoziation auch in vivo kommt [ 105 , 106 ]. Bei einem Überschuß von BAX ist die Bildung von Homodimeren aus BAX möglich [ 1 ].

BCL-2 ist mit seinem C-terminalen, hydrophoben Membrananker an der zytoplasmatischen Seite der Membranen von Mitochondrien, endoplasmatischem Retikulum und des Zellkerns lokalisiert [ 1 , 97 ]. Die Assoziation von BCL-2 mit Mitochondrien ist von besonderer funktioneller Bedeutung [ 81 ]. Im Verlauf der Apoptose gelangt Cytochrom c aus den Mitochondrien ins Zytoplasma [ 1 , 80 , 238 ]. Im Zytoplasma assoziiert Cytochrom c mit einem Protein, welches als APAF-1 (apoptosis activating factor 1) bezeichnet wird. Durch Bindung von Cytochrom c ändert sich die Konformation von APAF-1. Hierdurch wird eine Domäne aktiviert, die auch in verschiedenen Caspasen, einer Gruppe von Cystein-Proteinasen, die Peptide ausschließlich hinter Aspartatresten spaltet, vorkommt (CARD = caspase recruiting domain). Die aktivierte Domäne bindet und aktiviert die Procaspase-9. Die aktivierte Caspase-9 setzt eine Caspase-Kaskade in Gang [ 270 ]. BCL-2 verhindert direkt oder indirekt die Freisetzung von Cytochrom c aus den Mitochondrien und hemmt auf diese Weise eine Aktivierung der Caspase-Kaskade [ 1 , 80 ].

1.2.8 Maligne Progression

Abb. 8: Formaler Ablauf der Kanzerogenese in ihren drei Phasen.

Die Kanzerogenese ist ein Prozeß, der über sehr unterschiedlich lange Zeiträume ablaufen kann und in dem drei Abschnitte zu unterscheiden sind ( Abb. 8 ) [ 189 ]. In der ersten Phase kommt es zur Initiation, bei der im Falle einer chemisch induzierten Kanzerogenese ein primä


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res Kanzerogen oder ein sekundäres Kanzerogen nach metabolischer Aktivierung mit der DNA als ultimales Kanzerogen reagiert. Kokanzerogene können die Kanzerogenese etwa durch Bahnung des Zugangs von Kanzerogenen zum Genom fördern. In der ersten Phase der Initiation besteht die Möglichkeit einer Inaktivierung oder Ausgrenzung des Kanzerogens als Abwehrmechanismus durch den Organismus, bevor eine Reaktion mit der DNA stattfindet. Wenn ein Schaden im Genom aufgetreten ist, kann die Entstehung eines Karzinoms durch Reparatur des genetischen Schadens oder Einleitung der Apoptose der im Genom geschädigten Zelle verhindert werden, woran die in den Abschnitten 1.2.2 bis 1.2.7 genannten Faktoren beteiligt sein können. In dieser Phase der Kanzerogenese sind die veränderten Zellen zunächst als solche nicht erkennbar.

Kommt es aber zur Fixierung des Schadens, kann die initiierte Zelle unter dem Einfluß von Promotoren einen präneoplastischen Herd und weiter ein Carcinoma in situ bilden. In der dann folgenden Phase der Manifestation und Progression zum infiltrierenden, destruierenden und letztlich metastasierenden Karzinom bestimmen dann aber andere Faktoren den Fortgang der Kanzerogenese als bei der Initiation. Denn ein autonomes Wachstum der Tumorzellen ist für ein invasives Wachstum und eine spätere Metastasierung allein nicht ausreichend. Ein verdrängendes Tumorwachstum, wie es bei vielen gutartigen Tumoren zu beobachten ist, ist zwar durch Zellteilung und das Wiedererreichen der ursprünglichen Zellgröße nach der Zellteilung erklärbar, die Invasivität beim Wachstum von malignen Tumoren jedoch nicht. Hier spielen Faktoren eine Rolle, die die Kohäsion der Tumorzellen untereinander und die Adhäsion an andere Strukturen regulieren und die zur Auflösung von den Tumorzellen benachbarten Strukturen führen. Die Grenze des invasiven Wachstums liegt bei den Plattenepithelkarzinomen der Mundhöhle und des Oropharynx zwischen dem Carcinoma in situ und dem manifesten Plattenepithelkarzinom, das sich vom Carcinoma in situ zunächst nur durch die infiltrierte und destruierte Basalmembran unterscheidet. Ohne Überschreiten der Basalmembran ist kein weiteres Vordringen des Tumors in den Organismus vorstellbar. Ebenso besteht auch kein Kontakt zum Lymph- oder Blutgefäßsystem, der für eine Metastasierung Voraussetzung ist.

Abb. 9: Formaler Ablauf der Infiltration, Destruktion und Metastasierung von malignen Tumoren.

Im Verlauf der Progression ( Abb. 9 ) durchdringen die Tumorzellen die Basalmembran und erfüllen damit ein wesentliches Definitionskriterium maligner Tumoren [ 55 , 289 ]. Die Tumorzellen wandern in das subepitheliale Bindegewebe ein, bewegen sich in Lymphspalten und Bindegewebe weiter (Invasion) und können aktiv Bestandteile des Bindegewebes abbauen (Destruktion). Tumorzellen oder Tumorzellnester lösen sich dabei aus dem Zellverband. Voraussetzung dafür ist der Verlust der Zell-Zell-Adhäsion, die für den normalen Zusammenhalt des Epithels verantwortlich ist. Der Einbruch von Tumorzellen in die Lymph- und/oder Blutgefäße ist der erste Schritt zur Metastasierung. Zellen, denen es gelingt das intravasale Milieu zu überstehen, können das Endothel mit der endothelialen Basalmembran durchdringen und das subendotheliale bindegewebige Stroma invadieren. Hier bilden sich schließlich solide Metastasen heran, die durch neu gebildete Kapillaren aus vorhandenen Blutgefäßen (Neoangiogenese) versorgt werden.


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Neben anderen Faktoren sind Zelladhäsionsmoleküle an allen Schritten der malignen Progression beteiligt [ 102 , 305 ]. Durch Verlust und Dysregulation von Zelladhäsionsmolekülen geht die geordnete Gewebsstruktur verloren und Tumorzellen können sich aus dem Gewebsverband lösen [ 86 ]. Voraussetzung für die Infiltration bindegewebiger Strukturen ist die Expression von Adhäsionsmolekülen, die an Bestandteile der extrazellulären Matrix binden. Die Adhäsion von Zellmembranrezeptoren lymphogen metastasierender Tumorzellen an Liganden der Lymphgefäße in Lymphknoten ist eine wichtige Vorbedingung für die Ausbildung von Lymphknotenmetastasen. Hämatogen metastasierende Tumorzellen können über Zelladhäsionsmoleküle an Endothelzellen und die endotheliale Basalmembran binden und damit die Ausbildung von Fernmetastasen induzieren [ 86 , 102 ].

1.2.9 E-Cadherin

Der Name Cadherin leitet sich aus dem Begriff Calcium-abhängiges Adherin ab. Zur Cadherin-Familie zählen verschiedene Moleküle wie epitheliales (E-Cadherin), neuronales (N-Cadherin), plazentäres (P-Cadherin) und osteoblastäres bzw. mesenchymales (OB-Cadherin) Cadherin [ 183 ] sowie die Cadherine 6 und 11 [ 237 ]. Cadherine spielen eine fundamentale Rolle in der Embryonalentwicklung, da sie für die Segregation unterschiedlicher Gewebe während der Ontogenese verantwortlich sind [ 86 , 185 ].

Abb. 10: Schematischer Aufbau von E-Cadherin, das durch ein 16 Exons (E1-E16) umfassendes Gen auf dem langen Arm von Chromosom 16 kodiert wird. Der extrazelluläre Anteil ist in fünf repetitive Domänen untergliedert, deren N-terminale das für alle klassischen Cadherine gemeinsame Bindungsmotiv aus den drei Aminosäuren Histidin (His), Alanin (Ala) und Valin (Val) enthält. Die Zusammenlagerung von E-Cadherin-Monomeren zu Dimeren setzt die Bindung von Ca++-Ionen voraus. Die zytoplasmatische Domäne geht eine direkte Bindung mit beta-Catenin oder Plakoglobin (gamma-Catenin) ein, alpha-Catenin bildet die Brücke zu intrazellulären Aktinfilamenten des Zytoskeletts.

E-Cadherin ist ein Glykoprotein mit einer Molekülmasse von 120 kD. Funktionell handelt es sich um ein Zell-Zell-Adhäsionsmolekül, das Epithelzellen über Calcium-abhängige, homotypische Interaktionen verbindet ( Abb. 10 ) [ 263 , 264 ]. Seine Expression wird während der Embryonalentwicklung reguliert und korreliert mit verschiedenen morphogenetischen Vorgängen, bei denen Zellaggregation und -disaggregation eine Rolle spielen [ 86 ]. E-Cadherin ist der wichtigste Mediator der interzellulären Adhäsion von Epithelzellen; seine Funktion ist außerdem entscheidend für die Induktion und Aufrechterhaltung der Zellpolarität und Differenzierung in vitro und in reifen epithelialen Geweben [ 86 ]. E-Cadherin wird jedoch nicht nur auf epithelialen Zellen exprimiert, sondern auch auf erythropoetischen Zellen verschiedener definierter Reifestadien [ 28 ].

Das kodierende Gen konnte auf dem langen Arm von Chromosom 16 (16q22.1) lokalisiert werden [ 40 ] und umfaßt 16 Exons, die sich über etwa 100000 Basenpaare erstrecken [ 18 ]. Der mo


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lekulare Aufbau des E-Cadherin-Proteins weist 5 Tandem-repetitive extrazelluläre Domänen, ein einzelnes transmembranöses Segment und eine zytoplasmatische Region auf ( Abb. 10 ) [ 86 , 185 ]. Es wird zunächst als Precursor-Polypeptid mit einer Molekülmasse von 135 kD synthetisiert und nach Addition von komplexen Kohlenhydrat-Gruppen im Golgi-Apparat und Umwandlung in das fertige 120-kD-Glykoprotein an der Zelloberfläche exprimiert. Es hat dort eine Halbwertszeit von etwa 5 h [ 118 ]. Die N-terminale extrazelluläre Domäne vermittelt den Zell-Zell-Kontakt; die zytoplasmatische Region interagiert über die Catenine (alpha-, beta- und gamma-Catenin) mit dem Zytoskelett [ 86 , 242 , 272 ]. Das alpha-Catenin hat eine Molekülmasse von 102 kD und wird auf dem Chromosom 5 bei 5q21-22 kodiert. Es besitzt eine strukturelle Ähnlichkeit zu Vinculin, einem Zytoskelett-Protein, welches in zellulären Kontaktstellen zur extrazellulären Matrix eine bedeutende regulatorische Funktion erfüllt und den Kontakt mit Aktinfilamenten herstellt [ 184 ]. Wie Vinculin ist auch alpha-Catenin ein Aktin-bindendes Protein, das E-Cadherin mit dem Zytoskelett verbindet. Das beta-Catenin mit einer Molekülmasse von 88 kD wird auf dem Locus 3p21 kodiert und bindet direkt an E-Cadherin [ 272 ]. Da es auch mit alpha-Catenin assoziieren kann, bildet es eine Brücke zwischen E-Cadherin und alpha-Catenin. Das gamma-Catenin mit einer Molekülmasse von 82 kD ist identisch mit Plakoglobin, einem Protein, welches zuerst auf Desmosomen isoliert wurde. Plakoglobin und beta-Catenin sind strukturell verwandt. Wie beta-Catenin bindet auch Plakoglobin sowohl an E-Cadherin als auch an alpha-Catenin. Man nimmt an, daß neben beta-Catenin auch Plakoglobin die Brücke zwischen E-Cadherin und dem Zytoskelett herstellen kann [ 118 ]. Biochemische Veränderungen, wie eine Tyrosin-Phosphorylierung von beta-Catenin, können die Funktion des Cadherin-vermittelten Zelladhäsionssystems unter physiologischen wie auch unter pathologischen Bedingungen modulieren oder supprimieren. Dabei kann die Tyrosin-Phosphorylierung auch durch Onkogene und Wachstumsfaktoren, wie zum Beispiel EGF (epidermal growth factor) und HGF (hepatocyte growth factor), vermittelt werden [ 241 ].

Außer dem E-Cadherin ist auch der EGF-Rezeptor (EGF-R) im Bereich der interzellulären Zonulae adhaerentes lokalisiert. Durch Stimulation mit EGF kommt es zu einer starken Autophosphorylierung des EGF-R sowie zur Phosphorylierung verschiedener Zytoskelett-assoziierter Proteine, wie zum Beispiel Ezrin, Vinculin und Spectrin [ 95 ]. EGF vermittelt vielfältige biologische Prozesse, einschließlich Veränderungen der Zellmorphologie und Induktion des Zelltods. Wenn EGF oder TGF-alpha (transforming growth factor alpha) an den EGF-R binden, überträgt der EGF-R durch seine Tyrosin-Kinase einen mitogenen Stimulus [ 241 ]. Die enge Ko-Lokalisation des EGF-R mit dem E-Cadherin-Catenin-Komplex läßt dabei an die Möglichkeit von gemeinsamen physiologischen Funktionen denken.

Die Cadherin-Funktion ist Calcium-abhängig [ 263 ]: Die gebundenen Ca++-Ionen linearisieren und versteifen das Molekül nicht nur, sondern fördern auch die Dimerisierung der extrazellulären Domäne. Ca++-Ionen-Entzug hebt die Zell-Adhäsionsaktivität des Cadherins auf, macht Cadherine abbaubar für Proteasen und induziert beim E-Cadherin eine dramatische, reversible Konformationsänderung der gesamten extrazellulären Region [ 185 ].

Da eine reduzierte interzelluläre Adhäsion von Karzinomzellen häufig mit einer Reduktion bzw. einem Verlust der E-Cadherin-Expression einhergeht, wird postuliert, daß dem funktionellen Verlust von E-Cadherin eine Bedeutung bei der Tumorausbreitung zukommt [ 23 , 265 , 118 ]. Die Karzinomzellen konvertieren dabei in eine Art „mesenchymalen Zustand“, wie während der normalen Embryonalentwicklung [ 23 ]. Dabei sind Tumor-Promotoren wie Phorbolester und Benzoyl-Peroxid im Zellkulturmodell in der Lage, die Expression und membranöse Lokalisation von E-Cadherin bei verschiedenen Zelltypen zu vermindern [ 115 ], während der Differenzierungsinduktor all-trans-Retinolsäure die Funktion des E-Cadherin/Catenin-Komplexes in der menschlichen Mammakarzinom-Zellinie MCF-7 hochzuregulieren vermag [ 280 ]. Ein Verlust der E-Cadherin-Expression wird dabei von einem deutlichen Anstieg des Plasminogen-Aktivators vom Urokinase-Typ (uPA) begleitet, der die Invasion fördert [ 69 ]. E-Cadherin ist auch an der Steuerung der uPA-Verteilung beteiligt: Eine erhöhte Ca++-Konzentration zusammen mit einem funktionsfähigen E-Cadherin kann die uPA-Verteilung von der perinukleären Region zur Zelloberfläche hin verschieben [ 117 ].

1.2.10 CD44

CD44 bezeichnet eine Gruppe von heterogenen Glykoproteinen, die in unterschiedlichen Formen in den verschiedensten Zellen und Geweben gebildet werden. Strukturell und funktionell gehört CD44 zur Familie der Hyaluronsäure-bindenden Hyaladherine. Weitere Mitglieder dieser Familie sind das Link-Protein des Knorpels sowie die Proteoglykane Aggrecan und Versican


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[ 186 ]. CD44 wurde primär in seiner 85 kD-Variante, der sog. hämatopoetischen- (CD44h) oder Standardform (CD44s), auf Lymphozyten nachgewiesen [ 85 , 99 ]. Bald schon zeigte sich, daß das CD44 auch auf anderen Zelltypen wie Epithelien, mesenchymalen Zellen und Endothelien vorkommt und dabei keineswegs immer in der gleichen Molekülgröße vorliegt [ 152 , 153 ]. Vielmehr weisen die CD44 Moleküle eine enorme Heterogenität auf. Diese Heterogenität der CD44-Familie ist auf sogenanntes alternatives Spleißen [ 84 , 153 , 226 ] des auf dem kurzen Arm von Chromosom 11 bei 11pter-p13 lokalisierten CD44-Gens zurückzuführen ( Abb. 11 ) [ 235 ]. Die genetische Analyse ergab, daß dieses Gen aus 20 Exons besteht, die sich über etwa 60000 Basenpaare erstrecken [ 226 , 227 ]. Die N-terminalen fünf Exons (S1-S5) und die C-terminalen fünf Exons (S6-S10) kodieren für die CD44-Standard- bzw. hämatopoetische Form, die eine N-terminale Domäne (248 Aminosäuren: Exons S1-S7) mit einer spezifischen Affinität zur Hyaluronsäure, einem wichtigen Bestandteil der extrazellulären Matrix, eine transmembranöse Region (23 Aminosäuren: Exon S8) und einen zytoplasmatischen Anteil, der durch alternatives Spleißen entweder kürzer (3 Aminosäuren: Exon S9) oder länger (70 Aminosäuren: Exon S10) ist, aufweist. Die zehn dazwischen liegenden Exons werden in der Standardform nicht exprimiert. Nur durch alternatives Spleißen, das heißt durch post-transkriptionelle Modifikationen der prä-mRNA können Transkripte dieser varianten Exons (V1-V10) entstehen. Aufgrund eines Stop-Codons wird Exon V1 jedoch nicht transkribiert. Die variablen Molekülanteile werden in die extrazelluläre Region des Moleküls distal der Zellmembran eingebaut und inserieren dort zwischen den Standard-Exons S5 und S6 ( Abb. 11 ). Dies führt zu den varianten CD44-Isoformen (CD44v). Obwohl multiple Kombinationen von varianten Exons beschrieben sind, werden einige dieser Kombinationen bevorzugt auf bestimmten Gewebstypen exprimiert, wie zum Beispiel die sogenannte epitheliale Form (Exon V8-V10), der Keratinozyten-Typ (V3-V10) sowie die sogenannten metastasierungsassoziierten Typen (V4-V7 und V6-V7) [ 26 , 310 ]. Man geht davon aus, daß die Translation der varianten Exons der Regel der 3’-5’-Verknüpfung folgt. Es gibt jedoch insofern Ausnahmen von dieser Regel als individuelle Zellen eine Vielzahl von Kombinationen der Spleiß-Varianten exprimieren können, wobei die individuellen Kombinationen nicht unbedingt sequentielle Exons enthalten müssen [ 227 ]. Schließlich können die Zellen auch in Abhängigkeit vom Aktivierungszustand wiederholt ihr Spleiß-Verhalten ändern. Die Mechanismen, die das alternative Spleißen des CD44 regulieren, sind noch weitgehend unbekannt.

Abb. 11: Das Gen für die als CD44 bezeichnete Gruppe heterogener Glykoproteine befindet sich auf dem kurzen Arm von Chromosom 11 und besteht aus 20 Exons. Die Heterogenität der Gruppe ist durch alternatives Spleißen der prä-mRNA bedingt. Die extrazelluläre Region umfaßt die Standard-Exons S1-S7 und verschiedene Anteile der varianten Exons V2-V10, die transmembranöse Domäne das Standard-Exon S8 und die zytoplasmatische Region entweder das für 3 Aminosäuren kodierende Standard-Exon S9 oder das für 70 Aminosäuren kodierende Standard-Exon S10. Aufgrund eines Stop-Codons wird das variante Exon V1 beim Menschen nicht transkribiert.


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Die extrazelluläre Region des CD44s wird posttranslatorisch ausgiebig glykosyliert [ 186 ]. Sie enthält sechs N- und sieben O-glykosidische Glykosylierungsstellen, an die Oligosaccharide gekoppelt sind. Überdies finden sich auch vier Serin-Glycin-Motive, an die Chondroitinsulfat- oder Heparansulfat-Glykosaminoglykane, die das Molekül als Mitglied der Proteoglykane identifizieren, gebunden sein können [ 89 ]. Durch das alternative Spleißen können zusätzlich bis zu 420 Aminosäuren extrazellulär eingebaut werden. Diese varianten Exons statten die kodierte Region zum einen mit weiteren Aminosäure-Resten für posttranslatorische Glykosylierungen und Chondroitinsulfat-Seitenketten aus, zum andern ist diese Region äußerst hydrophil und könnte so den varianten CD44-Isoformen zusätzliche Bindungseigenschaften verleihen [ 84 ]. Als Liganden für die Standardregion sind extrazelluläre Matrixkomponenten beschrieben worden, insbesondere Hyaluronsäure [ 146 , 278 ], aber auch Kollagen Typ IV, Laminin und Fibronektin [ 114 , 202 ] sowie sulfatierte Proteoglykane [ 271 ]. Die Bindung an Hyaluronsäure wird von zwei Regionen vermittelt, die von Exon S2 und S5 kodiert werden [ 204 , 304 ]. Mit aktivierenden Antikörpern konnte gezeigt werden, daß diese Bindung nicht konstitutiv ist, sondern moduliert werden kann [ 151 ]. Die meisten Zellen, die CD44s und CD44v exprimieren, binden nämlich dennoch nicht an Hyaluronsäure. Wahrscheinlich wird die Hyaluronsäure-Bindungsfähigkeit nicht allein durch die An- oder Abwesenheit der varianten Region [ 248 ] reguliert, sondern durch Konformationsänderungen in der extrazellulären Region oder durch Umverteilung auf der Zelloberfläche. Der zytoplasmatische Molekülanteil scheint in diese Modulation involviert zu sein [ 113 ]. Einen potentiellen Regulationsmechanismus für das Bindungsverhalten stellt auch die Glykosylierung des CD44 dar [ 10 , 150 ]. Schließlich wird auch einem Cystein-Rest in der transmembranösen Region des Moleküls Bedeutung für die Hyaluronsäure-Bindung zugeschrieben. Andererseits kann CD44 auch am Abbau von Hyaluronsäure beteiligt sein [ 46 , 279 ].

Es wird vermutet, daß der intrazytoplasmatische Anteil des CD44 an der Signal-Transduktion [ 260 ] und Interaktion mit dem Zytoskelett beteiligt ist, um die Migration und/oder Zellteilung zu regulieren; überdies scheint die transmembranöse Domäne des CD44 für die Signalübertragung von außen nach innen wichtig zu sein [ 113 , 153 ]. Die zytoplasmatische Region ist an zwei Serin-Resten phosphoryliert, jedoch regelt die Phosphorylierung nicht die Membranlokalisation und die Beziehungen zum Zytoskelett [ 187 ]. Für einige Funktionen des CD44 ist die Bindung an das Zytoskelett über das zytoskelettale Protein Ankyrin essentiell, für das mindestens eine spezifische Bindungsstelle in der intrazytoplasmatischen CD44s-Domäne nachgewiesen werden konnte [ 309 ]. Die Hyaluronsäure-Bindung induziert dabei eine Bildung von Plaque-artigen Adhäsionsstrukturen und intrazellulären Ankyrin-Akkumulationen direkt unterhalb des CD44s. Die epitheliale 140 kD-Isoform (CD44e bzw. CD44v8-v10) scheint dagegen bevorzugt über Mitglieder der sog. ERM-Familie (Ezrin, Radixin, Moesin) mit dem zytoskelettalen Aktin zu interagieren [ 276 ], während dies für die Standardform nicht zutrifft. Die genannte Gruppe geht dabei von einem größeren Membrankomplex aus, an dem auch das CD43 via ERM-Gruppe beteiligt ist und in dessen Zentrum sich das CD44e befindet.

Funktionell ist die kleinste Spleiß-Variante CD44s an der Bindung der Lymphozyten an das „hohe“ Endothel epitheloider Venolen und am „Lymphozyten-Homing“ beteiligt [ 52 ]. Das CD44s wird jedoch physiologischerweise nicht nur auf Lymphozyten exprimiert, sondern auch auf den meisten mesenchymalen Zellen, neuroektodermalen Zellen und bestimmten Epithelien [ 160 , 268 ]. Dagegen finden sich physiologischerweise CD44-Varianten (CD44v) weit weniger häufig. Obwohl die meisten Epithelien und hämatopoetischen Organe während der Embryonalentwicklung CD44v-positiv sind, beschränkt sich die CD44v-Expression im adulten Organismus vorwiegend auf die Haut, das Darmepithel und verschiedene Drüsen [ 268 ]. Dabei korreliert die CD44v-Expression stets mit einer hohen Zellproliferationsrate. Bemerkenswert ist überdies, daß auch innerhalb der CD44v-positiven Gewebe verschiedene Zellschichten nur ganz bestimmte CD44v-Isoformen exprimieren, was auf strikte Regulationsmechanismen des alternativen Spleißens und auf divergente Funktionen dieser Isoformen hinweist [ 310 ].

Die CD44s-Form wird überdies unabhängig von deren Fähigkeit zur Metastasierung auch auf der Oberfläche vieler Tumorzellen gefunden. Einige experimentelle Befunde zeigten aber, daß bei manchen Tumorzellen das Wachstum in vivo offenbar durch Interaktion von CD44 mit bestimmten Liganden wie der Hyaluronsäure durch Transfektion mit CD44s-cDNA gefördert werden kann. Bessere Einblicke in die Funktion des CD44 bei der Metastasierung wurden durch Verwendung eines Antikörpers erzielt, der ein Epitop innerhalb der von Exon V6 kodierten Sequenz erkennt. Dieser Antikörper (1.1ASML) war ursprünglich durch Immunisierung mit metastasierenden Tumorzellen eines Pankreaskarzinoms der Ratte gewonnen worden [ 85 , 99 ]. Diese Ziellinie exprimiert bevorzugt die varianten Exons V4-V7. Mit dem genannten Antikörper


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konnte gezeigt werden, daß Spleiß-Varianten, die dieses Epitop enthalten, die (lymphogene) metastatische Tumorausbreitung im Tierversuch steigern können. Durch Einsatz monoklonaler Antikörper oder F(ab‘)2-Fragmente gegen das V6-Epitop ließ sich dagegen das Anwachsen von CD44v6 transfizierten Tumorzellen in den regionären Lymphknoten sowie eine hämatogene Metastasierung in die Lunge bei den Versuchstieren verhindern [ 228 ]. Dies führte zu der Hypothese, daß CD44v6-Varianten für die initiale Phase der lymphogenen Metastasierung notwendig sind.

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