Stoll, Christian: Phänotypische Untersuchungen zur prognostischen Bedeutung Proliferations- und Apoptose-assoziierter Faktoren sowie der Expression von Adhäsionsmolekülen in Plattenepithelkarzinomen der Mundhöhle und des Oropharynx

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Kapitel 3. Material und Methoden

3.1 Histologische Präparate

Alle Schritte der nachfolgend beschriebenen Methoden wurden, wenn nicht anders angegeben, bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Puffer- und Substratlösungen wurden unmittelbar vor ihrem Einsatz bei Raumtemperatur hergestellt und aufbewahrt. Vor Auffüllung auf das Gesamtvolumen mit Aqua destillata wurde der pH-Wert mit 1 M Natronlauge oder Salzsäure (Merck, Darmstadt) auf den jeweils angegebenen Wert eingestellt. Zur Kontrolle der Reliabilität der Methoden wurden in jedem Testansatz 5 Gewebsschnitte von Paraffinblöcken mitgeführt, die bereits vorher getestet worden waren, und auf Gleichheit überprüft.

Das hier untersuchte Gewebe war direkt postoperativ routinemäßig in Formalinlösung fixiert und in Paraffin eingebettet worden. Analysiert wurde insgesamt Gewebe aus 156 Paraffinblöcken von 107 Patienten ( Tab. 2 ). Nach Aufsuchen des Tumorgewebes in den Primärtumorresektaten sowie in den suprahyoidalen und infrahyoidalen Blockresektaten mit Hilfe der vorhandenen, routinemäßig angefertigten, mit Haematoxylin und Eosin gefärbten Schnitte wurden von den entsprechenden auf 4°C gekühlten Paraffinblöcken 4 µm dicke Schnitte angefertigt. Diese wurden nach Streckung auf der Oberfläche von 50°C warmem, destilliertem Wasser auf SuperFrost/Plus Objektträger (Menzel, Braunschweig) aufgezogen. Es schlossen sich eine Trocknung der Schnitte für 2 h bei Raumtemperatur und eine Inkubation für wiederum 2 h bei 56°C in vertikaler Lage an, um das überschüssige Paraffin zu entfernen. Das restliche Paraffin wurde durch Inkubation der Schnitte in Xylol für zweimal 15 min herausgelöst. Es folgte eine Rehydrierung für jeweils 5 min in Isopropanol, 100% Äthanol, 96% Äthanol, 70% Äthanol und Aqua destillata.

Tab. 2: Verteilung der in unterschiedlicher Anzahl vorhandenen, insgesamt 156 Paraffinblöcke von Primärtumoren und zugehörigen Lymphknotenmetastasen von 107 Patienten.

Fallzahl/Anzahl der vorhandenen Paraffinblöcke:

Lymphknoten-metastasen

Primärtumoren

1

2

3

 

Summe

0

68

23

7

 

98

1

7

0

0

 

7

2

1

1

0

 

2

Summe

76

24

7

 

107


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3.2 Immunhistologische Nachweismethoden

3.2.1 P53

Abb. 23: Immunhistologischer Nachweis eines Antigens im histologischen Gewebspräparat nach der Biotin-Streptavidin-Amplified-Methode (BSA). Nach Freilegung der antigenen Determinanten des nachzuweisenden Antigens erfolgt zuerst die Bindung eines Primärantikörpers an das Antigen. Der Nachweis dieses Antikörpers wird mit einem weiteren, gegen den Primärantikörper gerichteten biotinylierten Antikörper durchgeführt. An das Biotin bindet sich Streptavidin, das vier hochaffine Bindungsstellen für Biotin besitzt (Dissoziationskonstante = 10-15 M) und mit einem Enzym konjugiert ist. Durch dieses Enzym wird abschließend ein farbloses, wasserlösliches Chromogen und Substrat in einen wasserunlöslichen Farbstoff umgesetzt.

Zur Demaskierung der antigenen Determinanten wurden die Gewebsschnitte für 20 min bei 120°C und 1,5 bar Überdruck in 10 mM Citrat-Puffer (2,1 g Zitronensäure-Monohydrat, Merck, Darmstadt; 26 ml 1 M Natronlauge, Merck, Darmstadt; ad 1000 ml; pH=6,0) autoklaviert (Autoklav, Webeco, Bad Schwartau) [ 208 ]. Nach Abkühlung der Schnitte auf Raumtemperatur erfolgte eine dreimalige Spülung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS: 8,5 g Natriumchlorid, Merck, Darmstadt; 1,27 g Dinatriumhydrogenphosphat-Dihydrat, Merck, Darmstadt; 0,39 g Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat, Merck, Darmstadt; ad 1000 ml; pH=7,6) für je 5 min. Der verwendete Primärantikörper p53 (Ab-6), OP43, Klon DO-1 war ein muriner monoklonaler IgG2a-Antikörper von der Firma Oncogene Science, Cambridge, USA, der die Aminosäuren 21-25 in der aminoterminalen Region von p53 detektiert, und wurde in einer Verdünnung von 1:10 in PBS unter Zusatz von 1% Rinderserum-Albumin (Sigma, St. Louis, USA) eingesetzt [ 282 ]. Je 100 µl dieser Antikörper-Verdünnung wurden auf die Gewebsschnitte aufgebracht und für 30 min in einer dunklen, feuchten Kammer inkubiert ( Abb. 23 ). Negativkontrollen erhielten nur PBS mit 1% Rinderserum-Albumin ohne Antikörper. Es folgte eine dreimalige Spülung der Objektträger in PBS für je 5 min. Anschließend wurden je 100 µl MultiLink aus dem Super Sensitive MultiLink Immunodetection System (BioGenex, San Ramon, USA), das einen biotinylierten anti-Maus-IgG-Antikörper enthält, auf die Gewebsschnitte aufgebracht und für 30 min in einer dunklen, feuchten Kammer inkubiert. Nach dreimaliger Spülung der Objektträger in PBS für je 5 min wurden je 100 µl Label aus dem Super Sensitive MultiLink Immunodetection System (BioGenex, San Ramon, USA), das an Streptavidin gebundene alkalische Phosphatase enthält, auf die Gewebsschnitte aufgebracht und für 30 min in einer dunklen, feuchten Kammer inkubiert. Es folgte wiederum eine dreimalige Spülung der Objektträger in PBS für je 5 min. Anschließend wurden je 200 µl Substrat und Chromogen (1 Tablette Tris-Puffer, Sigma, St. Louis, USA; 1 Tablette Fast Red TR/Naphtol AS-MX Phosphate, Sigma, St. Louis, USA; ad 10 ml; Filtrieren durch ein 0,22 µm Filter, Millex-GV 25 mm, Millipore, Eschborn) über die Gewebsschnitte geschichtet und für 25 min in einer dunklen, feuchten Kammer inkubiert. Die Objektträger wurden nachfolgend für 10 min unter fließendem Leitungswasser gespült, 3 min in Mayers Hämalaun (1,0 g Hämatoxylin, Merck, Darmstadt; 0,2 g Natriumjodat, Merck, Darmstadt; 50,0 g Kaliumalaun, Merck, Darmstadt; 50,0 g Chloralhydrat, Merck, Darmstadt; 1,0 g Zitronensäure-Monohydrat, Merck, Darmstadt; ad 1000 ml) gegengefärbt und wiederum für 10 min unter fließendem Leitungswasser gespült. Abschließend wurden jeweils etwa 200 µl Kaisers Glyceringelatine für


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die Mikroskopie (Merck, Darmstadt), die im Mikrowellenherd auf 50°C erwärmt worden war, über die Gewebsschnitte geschichtet und je ein Deckglas (Menzel, Braunschweig) aufgebracht.

Die Auswertung der immunhistologisch gefärbten Schnitte erfolgte unter dem Lichtmikroskop (Leitz Laborlux 12, Leitz, Wetzlar). Zunächst wurde bei Lupenvergrößerung (25x) das Tumorgewebe aufgesucht, das den höchsten Anteil an rot gefärbten Zellkernen enthielt. Anschließend wurde in diesem Areal ausgehend von der Tumorfront bei höherer Vergrößerung (100x) der Anteil der rot angefärbten Zellkerne relativ zur Gesamtzahl von 500 Zellkernen ausgezählt. Die Bewertung der immunhistologischen Reaktion war negativ, wenn keine Zellkerne rot angefärbt waren, und wurde im übrigen in drei weitere Gruppen eingeteilt: In der ersten waren weniger als ein Drittel, in der zweiten mindestens ein Drittel, aber weniger als zwei Drittel und in der dritten mindestens zwei Drittel der Zellkerne positiv. Eine intraindividuelle Heterogenität wurde dann angenommen, wenn sich die Bewertung der immunhistologischen Reaktion in den vorhandenen Gewebsschnitten von unterschiedlichen Paraffinblöcken eines Patienten um mindestens zwei Eingruppierungen unterschied.

Die immunhistologische Reaktion im epithelialen Gewebe außerhalb des infiltrierenden Tumors wurde bestimmt, indem der Teil des auf den Schnitten miterfaßten Epithels außerhalb des infiltrierend wachsenden Tumors aufgesucht wurde, der den höchsten Dysplasiegrad aufwies. Als negativ wurde die immunhistologische Reaktion bei fehlender roter Anfärbung und als positiv bei roter Anfärbung der Zellkerne in dem umschriebenen Areal, das den höchsten Dysplasiegrad aufwies, bewertet.

3.2.2 P90MDM2

Sowohl der immunhistologische Nachweis von p90MDM2 im Tumorgewebe und Epithel als auch die Auswertung der Präparate wurden in identischer Weise wie bei dem Nachweis von p53 (Abschnitt 3.2.1 ) durchgeführt. Als Primärantikörper diente hier allerdings der murine monoklonale IgG2b-Antikörper MDM2 (Ab-1), OP46, Klon IF2 der Firma Oncogene Science, Cambridge, USA, der ein Epitop in der aminoterminalen Region um die Aminosäure 491 von p90MDM2 detektiert, in einer Verdünnung von 1:10 in PBS unter Zusatz von 1% Rinderserum-Albumin.

3.2.3 P21CIP

Auch für den immunhistologischen Nachweis von p21CIP im Tumorgewebe und im Epithel wie auch für die Auswertung der Präparate war die Methodik identisch zum Nachweis von p53 (Abschnitt 3.2.1 ). Als Primärantikörper diente hier der murine monoklonale IgG1-Antikörper WAF1 (Ab-1), OP64, Klon EA10 der Firma Oncogene Science, Cambridge, USA, der in einer Verdünnung von 1:20 in PBS unter Zusatz von 1% Rinderserum-Albumin eingesetzt wurde.

3.2.4 P16INK4a

Beim immunhistologischen Nachweis von p16INK4a wurden die Gewebsschnitte nach Entparaffinierung zunächst für 10 min in Tris-Puffer (8,78 g Natriumchlorid, Merck, Darmstadt; 6,85 g Tris HCl, Merck, Darmstadt; 0,9 g Tris Base, Merck, Darmstadt; ad 1000 ml; pH=7,4) und anschließend für 20 min in 3,5% Wasserstoffperoxid (Merck, Darmstadt) in Tris-Puffer zur Blockierung von endogener Peroxidase sowie für 40 min in 20% normalem Ziegenserum (Seromed, Biochrom, Berlin) in Tris-Puffer zur Blockierung von unspezifischen Reaktionen inkubiert. Als Primärantikörper für den immunhistologischen Nachweis von p16INK4a diente der murine monoklonale IgG1-Antikörper 13521A, Klon G175-405 der Firma PharMingen, San Diego, USA in einer Verdünnung von 1:30 in 20% normalem Ziegenserum in Tris-Puffer und als Negativkontrolle 20% normales Ziegenserum in Tris-Puffer ohne Antikörper. Nach Inkubation der Gewebsschnitte mit dieser Primärantikörper-Lösung für 22 h bei 4°C und für 1 h bei Raumtemperatur in einer dunklen feuchten Kammer erfolgte eine zweimalige Spülung für 5 min mit Tris-Puffer. Anschließend wurden je 100 µl MultiLink aus dem Universal-LSAB-Plus-HRP-Kit (DAKO, Glostrup, Dänemark), das einen biotinylierten anti-Maus-IgG-Antikörper enthält, auf die Gewebsschnitte aufgebracht und für 30 min in einer dunklen, feuchten Kammer inkubiert. Nach zweimaliger Spülung der Objektträger in Tris-Puffer für je 5 min wurden je 100 µl Streptavidin-Komplex aus dem Universal-LSAB-Plus-HRP-Kit (DAKO, Glostrup, Dänemark), das an Streptavidin gebundene Peroxidase enthält, auf die Gewebsschnitte aufgebracht und für 30 min in einer dunklen, feuchten Kammer inkubiert. Nach weiteren zwei Waschschritten mit Tris-Puffer für je 5 min wurden je 200 µl von einer 0,05% Diaminobenzidin-Lösung (Sigma, St. Louis, USA) versetzt mit 0,02% Wasserstoffperoxid über jeden Gewebsschnitt geschichtet. Nach 6 min wurden die Gewebsschnitte in destilliertes Wasser transferiert, dreimal gewaschen, mit Mayers Hämalaun für


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3 min gegengefärbt und mit Kaisers Glyceringelatine eingedeckt (Abschnitt 3.2.1 ). Die Auswertung der Ergebnisse der immunhistologischen Färbungen im Tumorgewebe entsprach dem Vorgehen beim Nachweis von p53 (Abschnitt 3.2.1 ) mit dem Unterschied, daß die positiven Zellkerne hier braun angefärbt waren.

3.2.5 Cyclin D1

Beim immunhistologischen Nachweis von Cyclin D1 wurden die Gewebsschnitte zur Demaskierung der antigenen Determinanten dreimal für 5 min bei 600 W im Mikrowellenherd (Panasonic, Berlin) in Target Retrieval Solution 9 (TRS 9, DAKO, Glostrup, Dänemark) inkubiert. Nach einer Abkühlungsphase für 20 min folgten Inkubationen für 10 min in 3,0% Wasserstoffperoxid (Merck, Darmstadt) in Tris-Puffer zur Blockierung von endogener Peroxidase und nach zwei je 5 min dauernden Waschgängen mit Tris-Puffer für 10 min in Blocking-Reagent aus dem Universal-LSAB-Peroxidase-Kit (DAKO, Glostrup, Dänemark) zur Blockierung von unspezifischen Reaktionen. Als Primärantikörper für den immunhistologischen Nachweis von Cyclin D1 wurde der murine monoklonale IgG2a-Antikörper 18-0220, Klon Am29, der von der Firma Zymed, San Francisco, USA bezogen wurde, in einer Verdünnung von 1:80 in DAKO Antibody Dilutent with Background Reducing Components (DAKO, Glostrup, Dänemark) und als Negativkontrolle diese Antikörper-Verdünnungslösung ohne Antikörperzusatz verwendet. Nach Inkubation der Gewebsschnitte mit dieser Primärantikörper-Lösung für 1 h in einer dunklen feuchten Kammer erfolgte eine zweimalige Spülung für 5 min mit Tris-Puffer. Anschließend wurden je 100 µl Link aus dem Universal-LSAB-Peroxidase-Kit (DAKO, Glostrup, Dänemark), das einen biotinylierten anti-Maus-IgG-Antikörper enthält, auf die Gewebsschnitte aufgebracht und für 30 min in einer dunklen, feuchten Kammer inkubiert. Nach zweimaliger Spülung der Objektträger in Tris-Puffer für je 5 min wurden je 100 µl Streptavidin-Peroxidase-Komplex aus dem Universal-LSAB-Peroxidase-Kit (DAKO, Glostrup, Dänemark), das an Streptavidin gebundene Peroxidase enthält, auf die Gewebsschnitte aufgebracht und für 30 min in einer dunklen, feuchten Kammer inkubiert. Nach weiteren zwei Waschschritten mit Tris-Puffer für je 5 min wurden je 200 µl von einer 3-Amino-9-äthylcarbazol-Lösung (AEC-Lösung: 20 mg AEC, Sigma, St. Louis, USA; 12 ml Dimethylsulfoxid, Sigma, St. Louis, USA; ad 100 ml mit PBS, pH=5,3; ad 200 ml mit Aqua destillata) versetzt mit 0,02% Wasserstoffperoxid über jeden Gewebsschnitt geschichtet. Nach 10 min wurden die Gewebsschnitte in destilliertes Wasser transferiert, dreimal gewaschen, mit Mayers Hämalaun für 3 min gegengefärbt und mit Kaisers Glyceringelatine eingedeckt (Abschnitt 3.2.1 ). Die Auswertung der Ergebnisse der immunhistologischen Färbungen im Tumorgewebe entsprach dem Vorgehen beim Nachweis von p53 (Abschnitt 3.2.1 ).

3.2.6 PRB

Der immunhistologische Nachweis von pRB im Tumorgewebe und die Auswertung der Präparate wurden wiederum in identischer Weise wie der Nachweis von p53 (Abschnitt 3.2.1 ) durchgeführt. Als Primärantikörper wurde der murine monoklonale IgG1-Antikörper MU2900396, Klon G3-245 der Firma BioGenex, San Ramon, USA, der ein Epitop in der Region der Aminosäuren 300 bis 380 von pRB erkennt, in einer Verdünnung von 1:20 in PBS unter Zusatz von 1% Rinderserum-Albumin verwendet. Vor Einsatz dieser Antikörper-Verdünnung erfolgte eine Blockierung unspezifischer Reaktionen durch Inkubation der Gewebsschnitte in Power Block Universal Blocking Reagent (BioGenex, San Ramon, USA) für 20 min.

3.2.7 BCL-2

Auch das immunhistologische Nachweisverfahren von BCL-2 im Tumorgewebe war identisch zum Nachweis von p53 (Abschnitt 3.2.1 ). Als Primärantikörper diente hier der murine monoklonale IgG1-Antikörper M 887, Klon 124 der Firma DAKO, Glostrup, Dänemark in einer Verdünnung von 1:10 in PBS unter Zusatz von 1% Rinderserum-Albumin [ 206 ]. Bei der Auswertung der immunhistologischen Färbungen wurde ausgehend von der Tumorfront bei einer 100x-Vergrößerung der Anteil der im Zytoplasma rot angefärbten Zellen relativ zur Gesamtzahl von 500 Zellen ausgezählt. Dabei dienten Lymphozyten als interne positive Kontrolle, die ausnahmslos auf allen Gewebsschnitten vorhanden waren. Tumorzellen, deren zytoplasmatische Rotfärbung wenigstens die Hälfte der Intensität der Rotfärbung der Lymphozyten aufwies, wurden hierbei als positiv, die anderen als negativ angesehen. Letztlich wurden die Anteile der positiven Zellen wiederum in drei Gruppen zusätzlich zu einem komplett negativen Ergebnis eingeteilt: In der ersten waren weniger als ein Drittel, in der zweiten mindestens ein Drittel, aber weniger als zwei Drittel und in der dritten mindestens zwei Drittel der Zellen im Zytoplasma positiv.


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3.2.8 BAX

Beim immunhistologischen Nachweis von BAX wurden die Gewebsschnitte zur Demaskierung der antigenen Determinanten dreimal für 10 min bei 600 W im Mikrowellenherd in TRS 9 (DAKO, Glostrup, Dänemark) inkubiert. Nach einer Abkühlungsphase für 20 min folgten Inkubationen für 10 min in 3,0% Wasserstoffperoxid (Merck, Darmstadt) in Tris-Puffer zur Blockierung von endogener Peroxidase und nach zwei je 5 min dauernden Waschgängen mit Tris-Puffer für 20 min in Power Block Universal Blocking Reagent (BioGenex, San Ramon, USA) zur Blockierung von unspezifischen Reaktionen. Als Primärantikörper für den immunhistologischen Nachweis von BAX wurde der murine monoklonale IgG1-Antikörper 18-0218, Klon 2D2 von der Firma Zymed, San Francisco, USA in einer Verdünnung von 1:150 in DAKO Antibody Dilutent with Background Reducing Components (DAKO, Glostrup, Dänemark) und als Negativkontrolle diese Antikörper-Verdünnungslösung ohne Antikörperzusatz verwendet. Nach Inkubation der Gewebsschnitte mit dieser Primärantikörper-Lösung für 1 h in einer dunklen feuchten Kammer erfolgte eine zweimalige Spülung für 5 min mit Tris-Puffer. Anschließend wurden je 100 µl biotinylated secondary antibody solution aus dem Vectastain Universal Elite ABC-Kit (Vector, Burlingame, USA), das einen biotinylierten anti-Maus-IgG-Antikörper enthält, auf die Gewebsschnitte aufgebracht und für 30 min in einer dunklen, feuchten Kammer inkubiert. Nach zweimaliger Spülung der Objektträger in Tris-Puffer für je 5 min wurden je 100 µl Vectastain Elite ABC Reagent aus dem Vectastain Universal Elite ABC-Kit (Vector, Burlingame, USA), das an Avidin gebundene Peroxidase enthält, auf die Gewebsschnitte aufgebracht und für 30 min in einer dunklen, feuchten Kammer inkubiert. Nach weiteren zwei Waschschritten mit Tris-Puffer für je 5 min wurden je 200 µl von einer 3-Amino-9-äthylcarbazol-Lösung (AEC-Lösung: 20 mg AEC, Sigma, St. Louis, USA; 12 ml Dimethylsulfoxid, Sigma, St. Louis, USA; ad 100 ml mit PBS, pH=5,3; ad 200 ml mit Aqua destillata) versetzt mit 0,02% Wasserstoffperoxid über jeden Gewebsschnitt geschichtet. Nach 10 min wurden die Gewebsschnitte in destilliertes Wasser transferiert, dreimal gewaschen, mit Mayers Hämalaun für 3 min gegengefärbt und mit Kaisers Glyceringelatine eingedeckt (Abschnitt 3.2.1 ). Die Auswertung der Ergebnisse der immunhistologischen Färbungen im Tumorgewebe entsprach dem Vorgehen beim Nachweis von BCL-2 (Abschnitt 3.2.7 ).

3.2.9 E-Cadherin

Die Demaskierung von antigenen Determinanten zum Nachweis von E-Cadherin erfolgte durch dreimalige Inkubation der Gewebsschnitte für 10 min bei 600 W in Urea-Puffer (240,2 g Urea, Sigma, St. Louis, USA; ad 1000 ml mit PBS; pH=7,6) im Mikrowellenherd. Nach Abkühlung der Schnitte auf Raumtemperatur schloß sich eine dreimalige Spülung in Tris-Puffer für je 5 min, Blockierung von endogener Peroxidase durch Inkubation in 3,0% Wasserstoffperoxid (Merck, Darmstadt) in Tris-Puffer für 10 min gefolgt von zwei weiteren Waschschritten mit Tris-Puffer an. Als Primärantikörper wurde der murine monoklonale IgG1-Antikörper PC10028, Klon 5H9 von der Firma Progen Biotechnik, Heidelberg in einer Verdünnung von 1:5 in Tris-Puffer eingesetzt. Je 100 µl dieser Antikörper-Verdünnung wurden auf die Gewebsschnitte aufgebracht und für 22 h in einer dunklen, feuchten Kammer bei 4°C inkubiert. Negativkontrollen erhielten nur Tris-Puffer ohne Antikörper. Es folgte eine dreimalige Spülung der Objektträger mit Tris-Brij-Lösung (1,25 ml Brij 35 Solution 30%, Sigma, St. Louis, USA; ad 1000 ml mit Tris-Puffer; pH=7,4) für je 5 min. Anschließend wurden je 100 µl MultiLink aus dem Universal-LSAB-Plus-HRP-Kit (DAKO, Glostrup, Dänemark), das einen biotinylierten anti-Maus-IgG-Antikörper enthält, auf die Gewebsschnitte aufgebracht und für 30 min in einer dunklen, feuchten Kammer inkubiert. Nach dreimaliger Spülung der Objektträger in Tris-Brij-Lösung für je 5 min wurden je 100 µl Streptavidin-Komplex aus dem Universal-LSAB-Plus-HRP-Kit (DAKO, Glostrup, Dänemark), das an Streptavidin gebundene Peroxidase enthält, auf die Gewebsschnitte aufgebracht und für 30 min in einer dunklen, feuchten Kammer inkubiert. Nach weiteren drei Waschschritten mit Tris-Brij-Lösung für je 5 min wurden je 200 µl von einer 0,05% Diaminobenzidin-Lösung (Sigma, St. Louis, USA) versetzt mit 0,02% Wasserstoffperoxid über jeden Gewebsschnitt geschichtet. Nach 6 min wurden die Gewebsschnitte in destilliertes Wasser transferiert, dreimal gewaschen, mit Mayers Hämalaun für 3 min gegengefärbt und mit Kaisers Glyceringelatine eingedeckt (Abschnitt 3.2.1 ).

Zur Auswertung der immunhistologischen Färbungen wurden die Tumorzellen bei einer 100x-Vergrößerung beurteilt, wobei das Epithelgewebe außerhalb des invasiv wachsenden Tumorgewebes als interne positive Kontrolle diente. Fälle, bei denen auf den Gewebsschnitten der Primärtumoren kein solches Epithelgewebe vorhanden war, wurden von dieser Untersuchung ausgeschlossen. Beurteilt wurde, ob die Tumorzellen dabei entweder eine ausschließlich oder


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zumindest überwiegend (Mindestverhältnis der Färbungsintensitäten = 2:1) membranöse Färbung, eine ausschließlich oder zumindest überwiegend (Mindestverhältnis der Färbungsintensitäten = 2:1) zytoplasmatische Färbung oder eine positive Färbung ohne diese Intensitätsunterschiede im Membranbereich und im Zytoplasma zeigten oder komplett negativ waren.

3.2.10 CD44

Zur Detektion von Spleiß-Varianten des CD44, die die durch die varianten Exons V4, V5, V6 und V7 kodierten Epitope enthalten, wurde das immunhistologische Nachweisverfahren wie zum Nachweis von p53 (Abschnitt 3.2.1 ) eingesetzt. Als Primärantikörper dienten hier murine monoklonale IgG1-Antikörper der Firma Bender MedSystems, Wien, Österreich in PBS unter Zusatz von 1% Rinderserum-Albumin: Antikörper gegen CD44v4, BMS114, Klon VFF-11 in einer Verdünnung von 1:40, Antikörper gegen CD44v5, BMS115, Klon VFF-8 in einer Verdünnung von 1:80, Antikörper gegen CD44v6, BMS125, Klon VFF-18 in einer Verdünnung von 1:100 und Antikörper gegen CD44v7, BMS117, Klon VFF-9 in einer Verdünnung von 1:20.

Abb. 24: Immunhistologischer Nachweis eines Antigens im histologischen Gewebspräparat nach der alkalische-Phosphatase-anti-alkalische-Phosphatase-Methode (APAAP). Nach Freilegung der antigenen Determinanten des nachzuweisenden Antigens erfolgt zuerst die Bindung eines murinen Primärantikörpers an das Antigen. Ein gegen murine Antikörper gerichteter Brückenantikörper bildet die Verbindung zu einem murinen anti-alkalische-Phosphatase-Antikörper, der wiederum an die alkalische Phosphatase bindet (APAAP-Komplex). Es folgt ein weiterer anti-alkalische-Phosphatase-Antikörper, ein Brückenantikörper und ein weiterer APAAP-Komplex. Durch die alkalische Phosphatase wird abschließend ein farbloses, wasserlösliches Chromogen und Substrat in einen wasserunlöslichen Farbstoff umgesetzt.

Der Nachweis der Isoform CD44v9 erfolgte mit Hilfe einer doppelten alkalische-Phosphatase-anti-alkalische-Phosphatase-Technik (APAAP, Abb. 24 ) [ 43 ]: Zur Demaskierung der antigenen Determinanten wurden die Gewebsschnitte für 10 min bei 120°C und 1,5 bar Überdruck in 10 mM Citrat-Puffer autoklaviert (Abschnitt 3.2.1 ) [ 208 ]. Nach Abkühlung der Schnitte auf Raumtemperatur erfolgte eine dreimalige Spülung in PBS für je 5 min. Der verwendete Primärantikörper wurde freundlicherweise von Herrn PD Dr. H.-J. Terpe, Gerhard-Domagk-Institut für Pathologie, Westfälische-Wilhelms-Universität Münster zur Verfügung gestellt. Je 100 µl einer Lösung dieses murinen monoklonalen Antikörpers in einer Verdünnung von 1:80 in RPMI-1640-Medium (100 ml RPMI-1640-Konzentrat, Seromed, Biochrom, Berlin; 1 g Natriumazid, Merck, Darmstadt; ad 1000 ml; pH=7,4) versetzt mit 10% inaktiviertem Rinderserum (Seromed, Biochrom, Berlin) wurden über die Gewebsschnitte geschichtet und für 1 h in einer dunklen, feuchten Kammer inkubiert. Nach dreimaliger Spülung in Tris-Puffer für je 5 min wurden die Gewebsschnitte mit je 100 µl einer Lösung aus anti-Maus-Immunglobulin-Antikörpern vom Kaninchen (Z 259, DAKO, Glostrup, Dänemark) in einer Verdünnung von 1:25 in RPMI-Medium mit 10% inaktiviertem Rinderserum als Brückenantikörper für 30 min inkubiert. Nach erneuter dreimaliger Spülung in Tris Puffer für je 5 min folgte eine Inkubation der Gewebsschnitte für 30 min mit je 100 µl einer Lösung aus APAAP-Komplexen (D 651, DAKO, Glostrup, Dänemark), die aus murinen


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monoklonalen Antikörpern gegen alkalische Phosphatase (Klon AP7/6/7) und alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm bestehen, in einer Verdünnung von 1:50 in RPMI-Medium mit 10% inaktiviertem Rinderserum. Die Inkubationsschritte mit dem Brückenantikörper und den APAAP-Komplexen wurden anschließend einmal wiederholt. Es folgte wiederum eine dreimalige Spülung der Objektträger in Tris-Puffer für je 5 min. Anschließend wurden je 200 µl Substrat und Chromogen (1 Tablette Tris-Puffer, Sigma, St. Louis, USA; 1 Tablette Fast Red TR/Naphtol AS-MX Phosphate, Sigma, St. Louis, USA; ad 10 ml; Filtrieren durch ein 0,22 µm Filter, Millex-GV 25 mm, Millipore, Eschborn) auf die Gewebsschnitte aufgebracht und für 25 min in einer dunklen, feuchten Kammer inkubiert. Die Objektträger wurden nachfolgend für 10 min unter fließendem Leitungswasser gespült, 3 min in Mayers Hämalaun gegengefärbt und mit Kaisers Glyceringelatine eingedeckt (Abschnitt 3.2.1 ).

Zur Auswertung der immunhistologischen Färbungen wurden die Tumorzellen bei einer 100x-Vergrößerung beurteilt, wobei das Epithelgewebe außerhalb des invasiv wachsenden Tumorgewebes als interne positive Kontrolle diente. Fälle, bei denen auf den Gewebsschnitten der Primärtumoren kein solches Epithelgewebe vorhanden war, wurden von dieser Untersuchung ausgeschlossen. Der Anteil der Zellen mit rot angefärbten Zellmembranen wurde ausgehend von der Tumorfront durch Auswertung von jeweils 500 Zellen bestimmt. Die Ergebnisse wurden in vier Gruppen eingeteilt: In der ersten betrug der Anteil der positiven Zellen unter 25%, in der zweiten mindestens 25%, aber weniger als 50%, in der dritten mindestens 50%, aber weniger als 75% und in der vierten mindestens 75%. Eine intraindividuelle Heterogenität wurde dann angenommen, wenn sich die Ergebnisse in den vorhandenen Gewebsschnitten von unterschiedlichen Paraffinblöcken eines Patienten um mindestens zwei Eingruppierungen unterschieden. Zur Überlebensstatistik wurden nochmals die ersten beiden und die letzten beiden Gruppen zusammengefaßt, so daß hierbei zwei Gruppen resultierten: In die erste Gruppe wurden Fälle mit einem Anteil von weniger als 50% positiver Zellen, das heißt einer verminderten CD44-Expression, und in die zweite dementsprechend Fälle mit 50% oder mehr positiven Zellen, was als positive CD44-Expression angesehen wurde, eingeordnet.

3.2.11 Ki-67

Auch für den immunhistologischen Nachweis des Proliferations-assoziierten nukleären Antigens Ki-67 im Tumorgewebe war die Methodik identisch zum Nachweis von p53 (Abschnitt 3.2.1 ). Als Primärantikörper diente hier der murine monoklonale IgG1-Antikörper dia 505, Klon MIB 1 der Firma Dianova, Hamburg in einer Verdünnung von 1:10 in PBS unter Zusatz von 1% Rinderserum-Albumin [ 74 ]. Der Anteil der Zellen mit rot angefärbten Zellkernen wurde ausgehend von der Tumorfront durch Auswertung von jeweils 500 Zellen bestimmt und als Ki-67-Index angegeben, der den prozentualen Anteil an positiven Zellen widerspiegelt. Die Ergebnisse wurden in vier Gruppen eingeteilt: In der ersten betrug der Ki-67-Index unter 25%, in der zweiten mindestens 25%, aber weniger als 50%, in der dritten mindestens 50%, aber weniger als 75% und in der vierten mindestens 75%. Eine intraindividuelle Heterogenität wurde dann angenommen, wenn sich der Ki-67-Index in den vorhandenen Gewebsschnitten von unterschiedlichen Paraffinblöcken eines Patienten um mindestens zwei Eingruppierungen unterschied.


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3.3 Apoptosenachweis

DNA-Fragmente in apoptotischen Zellen wurden mit Hilfe einer enzymatischen Reaktion unter Verwendung des ApopTag-Kit von Oncor, Gaithersburg, USA [ 3 , 72 ] markiert ( Abb. 25 ): Nach Entparaffinierung und Rehydrierung (Abschnitt 3.1 ) wurden die Gewebsschnitte für 30 min bei Raumtemperatur in einer 20 mg/l Proteinase-K-Lösung (Sigma, Deisenhofen) in PBS bei pH 7,6 zur Proteinaufschließung inkubiert. Nach drei Waschschritten mit PBS und Blockierung endogener Peroxidase durch Inkubation in 3,0% Wasserstoffperoxid (Merck, Darmstadt) in PBS für 5 min gefolgt von zwei weiteren Waschschritten mit PBS wurden die Schnitte mit Equilibration-Puffer aus dem ApopTag-Kit für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden jeweils 25 µl einer Mischung aus terminaler Transferase-Lösung und Reaktionspuffer aus dem ApopTag-Kit über die Gewebsschnitte geschichtet und diese bei 37°C unter Deckgläsern inkubiert. Negativkontrollen erhielten nur Reaktionspuffer mit destilliertem Wasser anstelle von terminaler Transferase-Lösung. Nach 60 min wurde die enzymatische Reaktion durch Einbringen der Gewebsschnitte in die Blockierungslösung aus dem ApopTag-Kit für 30 min bei 37°C gestoppt. Anschließend wurden die Gewebsschnitte wiederum dreimal mit PBS gewaschen und in einer Lösung aus Peroxidase-konjugierter muriner anti-Digoxigenin-Antikörper-Lösung aus dem ApopTag-Kit für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach weiteren drei Waschschritten mit PBS wurden je 200 µl von einer 0,05% Diaminobenzidin Lösung (Sigma, St. Louis, USA) versetzt mit 0,02% Wasserstoffperoxid über jeden Gewebsschnitt geschichtet. Nach 6 min wurden die Gewebsschnitte in destilliertes Wasser transferiert, dreimal gewaschen, mit 0,5% Methylgrün (Merck, Darmstadt) gegengefärbt und mit Kaisers Glyceringelatine eingedeckt (Abschnitt 3.2.1 ).

Abb. 25: Die Endprodukte des DNA-Abbaus im Rahmen der Apoptose sind nukleosomale DNA-Fragmente in der Größe von etwa 180 Basenpaaren. Zum Nachweis werden an diese DNA-Fragmente Digoxigenin-markierte Nukleotide enzymatisch mit Hilfe einer terminalen Desoxynukleotidyl-Transferase-Reaktion, die sequenzunabhängig die Polymerisation von Desoxyribonukleotidtriphosphaten an 3‘-OH-Enden von doppel- und einzelsträngiger DNA katalysiert, polymerisiert. Die hier verwendeten Nukleotide bilden ein Heteropolymer aus Digoxigenin-markiertem Desoxyuridintriphosphat (dUTP) und Desoxyadenosin-triphosphat in einer Konformation, die eine Erkennung des Digoxigenins durch anti-Digoxigenin-Antikörper besonders gut zuläßt. Diese Antikörper sind mit Peroxidase konjugiert, durch die abschließend ein farbloses, wasserlösliches Chromogen und Substrat in einen wasserunlöslichen Farbstoff umgesetzt wird.

Der Anteil der apoptotischen Zellen wurde ausgehend von der Tumorfront durch Zählung der braun gefärbten Zellkerne von jeweils 4000 Zellen bestimmt, wobei zusätzlich noch bei höherer Vergrößerung die exakte Morphologie der positiv gefärbten Zellen berücksichtigt wurde ( Abb. 6 ) [ 111 , 131 ], um falsch positiv gefärbte Zellkerne, Zelltrümmer und Artefakte auszuschließen. Die Apoptoserate wurden als Index angegeben, der den prozentualen Anteil an positiven Zellen widerspiegelt (Apoptose-Index). Die Ergebnisse wurden in vier Gruppen eingeteilt: In der ersten betrug der Apoptose-Index unter 0,5%, in der zweiten mindestens 0,5%, aber weniger als 1,5%, in der dritten mindestens 1,5%, aber weniger als 2,5% und in der vierten mindestens 2,5%. Eine intraindividuelle Heterogenität wurde dann angenommen, wenn sich der Apoptose-Index in den vorhandenen Gewebsschnitten von unterschiedlichen Paraffinblöcken eines Patienten um mindestens zwei Eingruppierungen unterschied.


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3.4 Statistische Methoden

Die statistischen Auswertungen wurden computergestützt mit Hilfe des Programms Statistica für Windows 5.1H (StatSoft, Tulsa, USA) unter dem Betriebssystem Windows NT 4.0 (Microsoft, München) auf einem IBM-kompatiblen Personalcomputer mit Intel Pentium-Prozessor durchgeführt. Die Auswertung des Überlebens und Rezidiv-freien Überlebens der Patienten erfolgte univariat nach der Methode von Kaplan und Meier [ 124 ]. Zum Vergleich der Überlebenskurven wurde eine Erweiterung von Gehans verallgemeinertem Wilcoxon Test [ 73 ] verwendet, wobei zuerst Werte für jede Überlebenszeit nach Mantels Prozedur berechnet [ 164 ] und nachfolgend ein Chi-Quadrat-Test mit den Summen aller Werte jeder zu vergleichenden Gruppe durchgeführt wurden. Zur multivariaten Analyse wurde das Proportional-Hazard-Modell nach Cox [ 45 ] eingesetzt. Als statistisch signifikant wurden Ergebnisse in allen Testverfahren bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p<0,05 angesehen.


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Tue Apr 3 17:33:46 2001