Stoll, Christian: Phänotypische Untersuchungen zur prognostischen Bedeutung Proliferations- und Apoptose-assoziierter Faktoren sowie der Expression von Adhäsionsmolekülen in Plattenepithelkarzinomen der Mundhöhle und des Oropharynx

42

Kapitel 4. Ergebnisse

4.1 Immunhistologische Nachweismethoden

4.1.1 P53

Abb. 26: Der immunhistologische Nachweis von p53 war im Epithel außerhalb des invasiv wachsenden Tumorgewebes vorwiegend im dysplastischen Epithel zu finden und beschränkte sich bevorzugt auf das Stratum basale (Gelber Pfeil). Wenn nur ein Teil der Zellkerne im Tumorgewebe positiv reagierte, waren es immer die in den äußeren, weniger ausdifferenzierten Zellagen, während die inneren, reiferen Zellen negativ waren (Grüner Pfeil). Immunhistologische Färbung (Primärantikörper: p53, Ab-6, OP43, Klon DO-1 / Chromogen: Fast-Red / Gegenfärbung: Hämalaun); Originalvergrößerung: 100x.

Abb. 27: Zwischen dem höchsten Dysplasiegrad (Cis = Carcinoma in situ) und dem immunhistologischen Nachweis von p53 gab es im Epithel außerhalb des invasiv wachsenden Tumorgewebes einen signifikant positiven Zusammenhang (Mann-Whitney U-Test: p<0,01).

Im Epithel außerhalb des invasiv wachsenden Tumorgewebes wurden beim immunhistologischen Nachweis von p53 bevorzugt die Zellkerne im Stratum basale positiv angefärbt, während die höheren, weiter ausdifferenzierten Zellagen meistens negativ waren ( Abb. 26 ). In den Fällen, in denen keine Dysplasien in diesem Epithel erkennbar waren, war p53 in 30,2%, bei einer geringen oder mäßigen Dysplasie in 51,7% und bei einer schweren Dysplasie oder einem Carcinoma in situ in 72,7% der Fälle immunhistologisch im Epithel nachweisbar ( Abb. 27 ). Folglich


43

besteht eine signifikant positive Korrelation zwischen dem Dysplasiegrad und dem immunhistologischen Nachweis von p53 im Epithel (Mann-Whitney U-Test: p<0,01) [ 163 ]. Eine Abhängigkeit zwischen dem Nachweis von p53 und dem Alkohol- oder Tabakabusus der Patienten ergab sich dagegen hier nicht.

Abb. 28: Der immunhistologische Nachweis von p53 im Tumorgewebe war in 48,6% der Fälle komplett negativ und in 44,9% der Fälle in mindestens zwei Drittel der Tumorzellkerne positiv. Bei 6,5% der Tumoren gab es eine partielle Färbung der Tumorzellkerne.

In etwa der Hälfte der Plattenepithelkarzinome (51,4%) konnte p53 immunhistologisch nachgewiesen werden, wobei meistens alle untersuchten Tumorzellen entweder negativ oder positiv waren ( Abb. 28 ). In den wenigen Fällen (6,5%), in denen p53 nur in einem Teil der Tumorzellen nachweisbar war, war dies gehäuft in den äußeren, weniger ausdifferenzierten Zellagen der Fall, wogegen die inneren, reiferen Zellen der Tumorzellnester negativ waren ( Abb. 26 ). In 4 von 31 Fällen (12,9%), in denen mehrere Blöcke von einzelnen Primärtumoren untersucht werden konnten, gab es Unterschiede von mehr als einer Eingruppierung der immunhistologischen Ergebnisse zwischen den Blöcken als Zeichen einer intratumoralen Heterogenität. Zwischen Primärtumoren und zugehörigen Lymphknotenmetastasen war in 9 Fällen ein Vergleich möglich, wobei nur in einem Fall (11,1%) ein negatives Ergebnis im Primärtumor einem positiven Ergebnis in mindestens einem Drittel, aber weniger als zwei Drittel der Tumorzellkerne im Lymphknoten gegenüberstand. Zwischen verschiedenen Lymphknotenmetastasen ein und desselben Primärtumors gab es in keinem Fall Unterschiede.


44

Abb. 29: Das p53 war bei männlichen Patienten signifikant häufiger im Tumorgewebe nachweisbar als bei weiblichen (Mann-Whitney U-Test: p<0,05). Eine tendenziell erkennbare positive Korrelation zwischen dem Nachweis von p53 im Tumorgewebe und dem Alkohol- und Tabakabusus war dagegen statistisch nicht signifikant (Mann-Whitney U-Test).

Die Ergebnisse des p53-Nachweises waren unabhängig von der Tumorlokalisation (Kruskal-Wallis-ANOVA) [ 139 ], dem Alter der Patienten, der Tumorgröße pT, der Lymphknotenmetastasierung pN, dem Tumorstadium und dem histopathologischen Grading G (Gamma-Test) [ 76 ]. Dagegen ergab sich eine Abhängigkeit vom Geschlecht der Patienten, wobei p53 bei männlichen Patienten signifikant häufiger im Tumorgewebe nachweisbar war als bei weiblichen ( Abb. 29 , Mann-Whitney U-Test: p<0,05). Eine tendenziell erkennbare positive Korrelation zwischen dem Nachweis von p53 im Tumorgewebe und dem Alkohol- und Tabakabusus war dagegen statistisch nicht signifikant ( Abb. 29 , Mann-Whitney U-Test). Auch ein Einfluß des immunhistologischen Nachweises von p53 im Tumorgewebe auf das Überleben und Rezidiv-freie Überleben der Patienten nach Kaplan und Meier war nicht nachweisbar ( Abb. 30 ).


45

Abb. 30: Der immunhistologische Nachweis von p53 im Tumorgewebe zeigte weder einen signifikanten Einfluß auf das Überleben noch auf das Rezidiv-freie Überleben der Patienten (Kaplan-Meier).


46

4.1.2 P90MDM2

Abb. 31: Beim immunhistologischen Nachweis im hier gezeigten dysplastischen und auch im dysplasiefreien Epithel außerhalb des invasiv wachsenden Tumorgewebes war p90MDM2 bevorzugt in den höheren Zellagen wie dem Stratum spinosum und granulosum, aber nicht im Stratum basale zu finden (Gelber Pfeil). Wenn nur ein Teil der Zellkerne im Tumorgewebe positiv reagierte, waren es immer die der inneren, reiferen Zellen, während die äußeren, weniger ausdifferenzierten Zellagen negativ waren (Grüner Pfeil). Immunhistologische Färbung (Primärantikörper: MDM2, Ab-1, OP46, Klon IF2 / Chromogen: Fast-Red / Gegenfärbung: Hämalaun); Originalvergrößerung: 100x.

Abb. 32: Beim immunhistologischen Nachweis von p90MDM2 gab es im Epithel außerhalb des invasiv wachsenden Tumorgewebes keinen signifikanten Zusammenhang zum Dysplasiegrad (Mann-Whitney U-Test).

Im Epithel außerhalb des invasiv wachsenden Tumorgewebes blieb bei der immunhistologischen Färbung für p90MDM2 regelmäßig das Stratum basale ausgespart und wurden bevorzugt die Zellkerne im Stratum spinosum und granulosum angefärbt ( Abb. 31 ). In den Fällen ohne Dysplasie war in 67,9%, bei einer geringen oder mäßigen Dysplasie in 75,9% und bei einer schweren Dysplasie oder einem Carcinoma in situ in 81,8% der Fälle p90MDM2 immunhistologisch im Epithel nachweisbar ( Abb. 32 ). Es ergab sich damit zum Dysplasiegrad ebensowenig ein signifikanter Zusammenhang wie zum Alkohol- und Tabakabusus (Mann-Whitney U-Test). Aber sowohl im Epithel ohne Dysplasien (Chi-Quadrat-Test: p<0,05) als auch im dysplastischen


47

Epithel (Chi-Quadrat-Test: p<0,02) war eine positive Korrelation zwischen den immunhistologischen Nachweisen von p53 und p90MDM2 erkennbar ( Tab. 3 ).

Tab. 3: Sowohl im dysplasiefreien Epithel (Chi-Quadrat-Test: p<0,05) und dysplastischen Epithel (Chi-Quadrat-Test: p<0,02) außerhalb der invasiv wachsenden Tumoren als auch im Tumorgewebe (Gamma-Test: p<0,001) war eine signifikant positive Korrelation zwischen dem immunhistologischen Nachweis von p53 und p90MDM2 nachweisbar.

dysplasiefreies Epithel

p53

p90

negativ

positiv

 

 

Summe

negativ

 

15

22

 

 

37

positiv

 

2

14

 

 

16

Summe

 

17

36

 

 

53

 

 

 

 

 

 

 

 

dysplastisches Epithel

p53

p90

negativ

positiv

 

 

Summe

negativ

 

7

10

 

 

17

positiv

 

2

21

 

 

23

Summe

 

9

31

 

 

40

 

 

 

 

 

 

 

 

Tumorgewebe

p53

negativ

p90<33%<p90<66%<p90

 

Summe

negativ

20

20

6

6

 

52

p53<33%

0

1

1

1

 

3

33%<p53<66%

0

3

0

1

 

4

66%<p53

9

19

9

11

 

48

Summe

29

43

16

19

 

107

Abb. 33: Der immunhistologische Nachweis von p90MDM2 im Tumorgewebe war in 27,1% der Fälle komplett negativ und in 17,8% der Fälle in mindestens zwei Drittel der Tumorzellkerne positiv. Bei 55,1% der Tumoren gab es eine partielle Färbung der Tumorzellkerne.

Beim immunhistologischen Nachweis von p90MDM2 im Tumorgewebe resultierten nicht so scharfe Trennungen in positive und negative Fälle wie für p53 ( Abb. 33 ). Bei Färbung von nur


48

einem Teil der Zellkerne war eine immunhistologische Anfärbung für p90MDM2 im Gegensatz zu p53 bevorzugt in den Zentren von umschriebenen Tumorarealen erkennbar, wo die am weitesten ausdifferenzierten Zellen des Tumorgewebes lokalisiert sind. Die äußeren Zellagen waren dagegen regelmäßig negativ ( Abb. 31 ). Bei den 31 Patienten, bei denen mehrere verschiedene Paraffinblöcke der Primärtumoren vorlagen, gab es Unterschiede in den immunhistologischen Färbungen für das p90MDM2 zwischen verschiedenen Gewebsschnitten von identischen Primärtumoren als Zeichen einer intratumoralen Heterogenität in 6 Fällen (19,4%). In den 9 Fällen, in denen die immunhistologische Färbung im Gewebe des Primärtumors mit der in den Lymphknotenmetastasen verglichen werden konnte, wurde je einmal der Primärtumor für das p90MDM2 als negativ und die zugehörige Lymphknotenmetastase mit einer positiven Reaktion in mehr als zwei Drittel der Tumorzellkerne sowie umgekehrt der Primärtumor mit einer positiven Reaktion in mindestens einem Drittel, aber weniger als zwei Drittel der Tumorzellkerne und die entsprechende Lymphknotenmetastase als negativ eingestuft. Ansonsten ergaben sich hier und auch in den beiden Fällen, in denen jeweils zwei verschiedene Lymphknotenmetastasen verglichen werden konnten, keine Unterschiede.

Tab. 4: Das p90MDM2 war in höher differenzierten Tumoren (G1) signifikant häufiger nachweisbar als in geringer differenzierten (G3, Gamma-Test: p<0,005).

histopathologisches Grading

p90

G1

G2

G3

 

Summe

negativ

1

21

7

 

29

p90<33%

4

30

9

 

43

33%<p90<66%

3

12

1

 

16

66%<p90

6

9

4

 

19

Summe

14

72

21

 

107

Die Ergebnisse des p90MDM2-Nachweises waren unabhängig von der Tumorlokalisation (Kruskal-Wallis-ANOVA), dem Alkohol- und Tabakabusus, dem Geschlecht (Mann-Whitney U-Test) und Alter der Patienten, der Tumorgröße pT, der Lymphknotenmetastasierung pN und dem Tumorstadium (Gamma-Test). Es gab allerdings eine signifikante Korrelation zum histopathologischen Grading: P90MDM2 war in höher differenzierten Tumoren signifikant häufiger nachweisbar als in geringer differenzierten ( Tab. 4 , Gamma-Test: p<0,005). Außerdem waren die immunhistologischen Nachweise von p53 und p90MDM2 im Tumorgewebe positiv miteinander korreliert ( Tab. 3 , Gamma-Test: p<0,001). Der immunhistologische Nachweis von p90MDM2 im Tumorgewebe hatte keinen Einfluß auf das Überleben und Rezidiv-freie Überleben der Patienten nach Kaplan und Meier ( Abb. 34 ).


49

Abb. 34: Der immunhistologische Nachweis von p90MDM2 im Tumorgewebe zeigte weder einen signifikanten Einfluß auf das Überleben noch auf das Rezidiv-freie Überleben der Patienten (Kaplan-Meier).


50

4.1.3 P21CIP

Abb. 35: Im Epithel außerhalb des invasiv wachsenden Tumorgewebes war p21CIP bevorzugt im Stratum spinosum und granulosum unter Aussparung des Stratum basale nachweisbar. Immunhistologische Färbung (Primärantikörper: WAF1, Ab-1, OP64, Klon EA10 / Chromogen: Fast-Red / Gegenfärbung: Hämalaun); Originalvergrößerung: 200x.

Abb. 36: Beim immunhistologischen Nachweis von p21CIP im Epithel außerhalb des invasiv wachsenden Tumorgewebes gab es keinen Zusammenhang mit dem Dysplasiegrad (Mann-Whitney U-Test).

Im Stratum basale des Epithels außerhalb des invasiv wachsenden Tumorgewebes war p21CIP wie p90MDM2 regelmäßig nicht immunhistologisch nachweisbar. Dagegen wurden bevorzugt die Zellkerne im Stratum spinosum und granulosum angefärbt ( Abb. 35 ), und zwar in 79,2% der Fälle, in denen keine Dysplasie im Epithel außerhalb des invasiv wachsenden Tumors erkennbar war, in 75,9% der Fälle mit einer geringen oder mäßigen Dysplasie und in 90,9% der Fälle mit einer schweren Dysplasie oder einem Carcinoma in situ ( Abb. 36 ). Ein Zusammenhang zwischen dem p21CIP-Nachweis im Epithel und dem Dysplasiegrad sowie dem Alkohol- und Tabakabusus der Patienten bestand nicht (Mann-Whitney U-Test). Eine positive Korrelation zur immunhistologischen Färbung für p53 war nur im dysplastischen Epithel (Mann-Whitney U-Test: p<0,05), dagegen nicht im dysplasiefreien Epithel nachweisbar (Mann-Whitney U-Test, Tab. 5 ).


51

Tab. 5: Zwischen dem immunhistologischen Nachweis von p53 und p21CIP ergab sich nur im dysplastischen Epithel (Chi-Quadrat-Test: p<0,05), nicht dagegen im dysplasiefreien Epithel (Chi-Quadrat-Test) und im Tumorgewebe (Gamma-Test) ein signifikant positiver Zusammenhang.

dysplasiefreies Epithel

p53

p21

negativ

positiv

 

 

Summe

negativ

 

9

28

 

 

37

positiv

 

2

14

 

 

16

Summe

 

11

42

 

 

53

 

 

 

 

 

 

 

 

dysplastisches Epithel

p53

p21

negativ

positiv

 

 

Summe

negativ

 

6

11

 

 

17

positiv

 

2

21

 

 

23

Summe

 

8

32

 

 

40

 

 

 

 

 

 

 

 

Tumorgewebe

p53

negativ

p21<33%<p21<66%<p21

 

Summe

negativ

6

17

15

14

 

52

p53<33%

0

0

2

1

 

3

33%<p53<66%

0

1

2

1

 

4

66%<p53

1

12

24

11

 

48

Summe

7

30

43

27

 

107

Abb. 37: Der immunhistologische Nachweis von p21CIP im Tumorgewebe war in 6,5% der Fälle komplett negativ, in 68,2% partiell und in 25,2% in mehr als zwei Drittel der Zellkerne positiv.

Für p21CIP ergaben sich ebenso wie für p90MDM2 nicht so scharfe Trennungen in positive und negative Fälle wie für p53 ( Abb. 37 ). Bei nur partiell positiven Ergebnissen war eine immunhistologische Anfärbung der Zellkerne für p21CIP ähnlich wie bei p90MDM2 bevorzugt im Inneren der Tumorareale erkennbar, wo die am weitesten ausdifferenzierten Zellen des Tumorgewebes lokalisiert sind, wogegen die äußeren Zellagen regelmäßig negativ waren ( Abb. 38 ). Bei den 31


52

Patienten, bei denen mehrere verschiedene Paraffinblöcke der Primärtumoren vorlagen, gab es Unterschiede in der immunhistologischen Färbung für p21CIP zwischen den verschiedenen Gewebsschnitten des Primärtumors als Zeichen einer intratumoralen Heterogenität in 6 Fällen (19,4%). Bei den 9 Fällen, in denen die immunhistologische Färbung im Gewebe der Primärtumoren mit der in den Lymphknotenmetastasen verglichen werden konnte, wurde zweimal im Primärtumor p21CIP in mindestens einem Drittel, aber weniger als zwei Drittel der Zellkerne gefunden, während die korrespondierenden Lymphknotenmetastasen negativ waren. Umgekehrt war einmal der Primärtumor negativ und die zugehörige Lymphknotenmetastase in mindestens einem Drittel, aber weniger als zwei Drittel der Zellkerne positiv und einmal der Primärtumor in weniger als einem Drittel und die entsprechende Lymphknotenmetastase in mindestens zwei Drittel der Zellkerne positiv. In den beiden Fällen, in denen jeweils zwei verschiedene Lymphknotenmetastasen untersucht werden konnten, ergaben sich keine Differenzen.

Abb. 38: Der immunhistologische Nachweis von p21CIP war überwiegend in den im Zentrum von umschriebenen Tumorarealen gelegenen Zellkernen positiv, in den äußeren Zellagen dagegen regelmäßig negativ. Immunhistologische Färbung (Primärantikörper: WAF1, Ab-1, OP64, Klon EA10 / Chromogen: Fast-Red / Gegenfärbung: Hämalaun); Originalvergrößerung: 150x.

Die Ergebnisse des p21CIP-Nachweises im Tumorgewebe waren unabhängig von der Tumorlokalisation (Kruskal-Wallis-ANOVA), dem Alkohol- und Tabakabusus, dem Geschlecht (Mann-Whitney U-Test) und Alter der Patienten, der Tumorgröße pT, der Lymphknotenmetastasierung pN, dem histopathologischen Grading, dem Tumorstadium, dem immunhistologischen Nachweis von p53 ( Tab. 5 , Gamma-Test) und dem Überleben und Rezidiv-freien Überleben der Patienten nach Kaplan und Meier ( Abb. 39 ).


53

Abb. 39: Der immunhistologische Nachweis von p21CIP im Tumorgewebe zeigte keinen Einfluß auf das Überleben und Rezidiv-freie Überleben der Patienten nach Kaplan und Meier.


54

4.1.4 P16INK4a

Abb. 40: Im Tumorgewebe ergab sich keine bevorzugte Lokalisation der p16INK4a-positiven Zellen innerhalb umschriebener Gewebsareale. Immunhistologische Färbung (Primärantikörper: 13521A, Klon G175-405 / Chromogen: Diaminobenzidin / Gegenfärbung: Hämalaun); Originalvergrößerung: 100x.

Abb. 41: Der immunhistologische Nachweis von p16INK4a im Tumorgewebe war in 19,6% der Fälle komplett negativ, in 67,6% partiell und in 12,7% in mehr als zwei Drittel der Zellkerne positiv.

P16INK4a war im Epithel außerhalb des invasiv wachsenden Tumorgewebes ubiquitär unter Aussparung des Stratum basale als schwache nukleäre Braunfärbung immunhistologisch nachweisbar. Im Tumorgewebe waren die positiven Zellen gleichmäßig über die verschiedenen Gewebsareale verteilt ( Abb. 40 ), wobei sich eine relativ regelmäßige Einordnung der Nachweisergebnisse in die verschiedenen Gruppen ergab ( Abb. 41 ). Bei den 31 Patienten, bei denen mehrere verschiedene Paraffinblöcke der Primärtumoren vorlagen, resultierten Unterschiede in der immunhistologischen Färbung für p16INK4a zwischen den verschiedenen Gewebsschnitten des Primärtumors als Zeichen einer intratumoralen Heterogenität nur in einem Fall (3,2%). Unterschiedliche Ergebnisse zwischen Primärtumoren und entsprechenden Lymphknotenmetastasen oder zwischen verschiedenen Lymphknotenmetastasen identischer Primärtumoren ergaben sich nicht.

Die Ergebnisse des p16INK4a-Nachweises im Tumorgewebe waren unabhängig von der Tumorlokalisation (Kruskal-Wallis-ANOVA), dem Alkohol- und Tabakabusus, dem Geschlecht (Mann-Whitney U-Test) und Alter der Patienten, der Tumorgröße pT, der Lymphknotenmetastasierung


55

pN, dem Tumorstadium, dem immunhistologischen Nachweis von p53, p90MDM2 und p21CIP (Gamma-Test) sowie dem Überleben und Rezidiv-freien Überleben der Patienten nach Kaplan und Meier ( Abb. 42 ). P16INK4a war zwar in höher differenzierten Tumoren tendenziell häufiger nachweisbar als in geringer differenzierten ( Tab. 6 ), letztlich ergab sich aber auch kein statistisch signifikanter Zusammenhang zum histopathologischen Tumor-Grading (Gamma-Test).

Abb. 42: Der immunhistologische Nachweis von p16INK4a im Tumorgewebe zeigte keinen signifikanten Einfluß auf das Überleben oder Rezidiv-freie Überleben der Patienten (Kaplan-Meier).

Tab. 6: P16INK4a war zwar in höher differenzierten Tumoren (G1) öfter nachweisbar als in geringer differenzierten (G3), dieser Zusammenhang war aber statistisch nicht signifikant (Gamma-Test).

histopathologisches Grading

p16

G1

G2

G3

 

Summe

negativ

1

13

6

 

20

p16<33%

5

27

9

 

41

33%<p16<66%

5

21

2

 

28

66%<p16

2

7

4

 

13

Summe

13

68

21

 

102


56

4.1.5 Cyclin D1

Abb. 43: Im Epithelbereich außerhalb des invasiv wachsenden Tumorgewebes war der immunhistologische Nachweis von Cyclin D1 regelmäßig auf die suprabasal gelegenen, bis ins Stratum spinosum reichenden Zellkerne beschränkt. Immunhistologische Färbung (Primärantikörper: 18-0220, Klon Am29 / Chromogen: 3-Amino-9-äthylcarbazol / Gegenfärbung: Hämalaun); Originalvergrößerung: 100x.

Abb. 44: Im Tumorbereich war Cyclin D1 bevorzugt in den äußeren Zellagen umschriebener Areale nachweisbar, während die zentral gelegenen Zellen bei nur partieller Färbung meistens keine Reaktion zeigten. Immunhistologische Färbung (Primärantikörper: 18-0220, Klon Am29 / Chromogen: 3-Amino-9-äthylcarbazol / Gegenfärbung: Hämalaun); Originalvergrößerung: 100x.

Im Epithelbereich außerhalb des invasiv wachsenden Tumorgewebes war der immunhistologische Nachweis von Cyclin D1 in den Zellkernen regelmäßig auf das Stratum spinosum beschränkt, während er in höheren Schichten und im Stratum basale negativ ausfiel ( Abb. 43 ). Auch im Tumorbereich war Cyclin D1 in den meisten Fällen (93,6%) in unterschiedlichen Ausmaßen bevorzugt in den äußeren Zellagen von Tumorsträngen nachweisbar, während die zentral gelegenen Zellen meistens keine Reaktion zeigten ( Abb. 44 und Abb. 45 ). Bei den 31 Patienten, bei denen mehrere verschiedene Paraffinblöcke der Primärtumoren vorlagen, gab es


57

Unterschiede in der immunhistologischen Färbung für Cyclin D1 zwischen den verschiedenen Gewebsschnitten des Primärtumors als Zeichen einer intratumoralen Heterogenität in 2 Fällen (6,5%). In den Fällen, in denen Primärtumoren und zugehörige Lymphknotenmetastasen oder jeweils zwei verschiedene Lymphknotenmetastasen miteinander verglichen werden konnten, ergaben sich keine Differenzen.

Abb. 45: Cyclin D1 war in den meisten Plattenepithelkarzinomen (93,6%) nachweisbar, in beinahe der Hälfte der Fälle (45,7%) sogar in mehr als zwei Drittel der Zellkerne.

Tab. 7: Zwischen dem Nachweis von Cyclin D1 und p21CIP ergab sich im Tumorgewebe ein signifikant positiver Zusammenhang (Gamma-Test: p<0,001).

p21

Cyclin D1

negativ

p21<33%<p21<66%<p21

 

Summe

negativ

2

3

1

0

 

6

Cyclin D1<33%

2

6

7

4

 

19

33%<Cyclin D1<66%

0

9

13

4

 

26

66%<Cyclin D1

1

11

15

16

 

43

Summe

5

29

36

24

 

94

Tab. 8: Cyclin D1 war in metastasierenden Tumoren (pN1 und pN2) häufiger nachweisbar als in nicht metastasierenden (pN0, Gamma-Test: p<0,001).

Lymphknotenmetastasierung

Cyclin D1

pN0

pN1

pN2

 

Summe

negativ

6

0

0

 

6

Cyclin D1<33%

16

1

2

 

19

33%<Cyclin D1<66%

20

5

1

 

26

66%<Cyclin D1

25

5

13

 

43

Summe

67

11

16

 

94

Die Ergebnisse des Cyclin D1-Nachweises im Tumorgewebe waren unabhängig von der Tumorlokalisation (Kruskal-Wallis-ANOVA), dem Alkohol- und Tabakabusus, dem Geschlecht (Mann-Whitney U-Test) und Alter der Patienten, der Tumorgröße und -infiltration pT, dem histopathologischen Grading und dem immunhistologischen Nachweis von p53, p90MDM2 und p16INK4a (Gamma-Test). Sie waren aber positiv korreliert mit dem Nachweis von p21CIP im Tu


58

morgewebe ( Tab. 7 , Gamma-Test: p<0,001). Außerdem zeigte der Cyclin D1-Nachweis einen Zusammenhang mit der Lymphknotenmetastasierung: Cyclin D1 war in metastasierenden Tumoren häufiger nachweisbar als in nicht metastasierenden ( Tab. 8 , Gamma-Test: p<0,001). Zwischen Primärtumoren und entsprechenden Lymphknotenmetastasen war allerdings, wie oben erwähnt, in keinem Fall ein Unterschied nachweisbar. Infolge der positiven Korrelation zwischen Cyclin D1-Nachweis und Lymphknotenmetastasierung pN ergab sich trotz fehlendem Zusammenhang mit der Tumorgröße und -infiltration pT eine solche Korrelation auch zur Tumorstadieneinteilung (Gamma-Test: p<0,02). Eine prognostische Bedeutung für das Überleben und Rezidiv-freie Überleben der Patienten nach Kaplan und Meier hatte der immunhistologische Cyclin D1-Nachweis nicht ( Abb. 46 ).

Abb. 46: Der immunhistologische Nachweis von Cyclin D1 im Tumorgewebe zeigte keinen signifikanten Einfluß auf das Überleben und Rezidiv-freie Überleben der Patienten nach Kaplan und Meier.


59

4.1.6 PRB

Abb. 47: Das durch das Retinoblastoma-Gen kodierte Phosphoprotein pRB war im gesamten Epithelgewebe mit Ausnahme der obersten Zellagen immunhistologisch nachweisbar (Gelber Pfeil). Auch im Tumorgewebe war die nukleäre Färbung ohne Bevorzugung einer bestimmten Lokalisation innerhalb der Tumorareale erkennbar (Grüner Pfeil). Immunhistologische Färbung (Primärantikörper: MU2900396, Klon G3-245 / Chromogen: Fast-Red / Gegenfärbung: Hämalaun); Originalvergrößerung: 100x.

Abb. 48: PRB war im Tumorgewebe in unterschiedlichen Ausmaßen immunhistologisch nachweisbar.

Das durch das Retinoblastoma-Gen kodierte Phosphoprotein (pRB) war im gesamten Epithel außerhalb des invasiv wachsenden Tumorgewebes mit Ausnahme der obersten Zellschichten immunhistologisch nachweisbar ( Abb. 47 ). In der überwiegenden Anzahl der Fälle (74,5%) war auch im Tumorbereich eine nukleäre Färbung ohne Bevorzugung einer bestimmten Lokalisation innerhalb der Tumorareale beim immunhistologischen Nachweis von pRB erkennbar ( Abb. 47 und Abb. 48 ). Bei den 31 Patienten, bei denen mehrere verschiedene Paraffinblöcke der Primärtumoren vorlagen, gab es Unterschiede in der immunhistologischen Färbung für pRB zwischen den verschiedenen Gewebsschnitten des Primärtumors als Zeichen einer intratumoralen Heterogenität in 8 Fällen (25,8%). Bei den 9 Fällen, in denen die immunhistologische Färbung im Gewebe der Primärtumoren mit der in den Lymphknotenmetastasen verglichen werden konnte, ergaben sich wie in den beiden Fällen, in denen jeweils zwei verschiedene Lymphknotenmetastasen untersucht werden konnten, keine Differenzen.


60

Abb. 49: Die Ergebnisse des pRB-Nachweises im Tumorgewebe zeigten keinen signifikanten Einfluß auf das Überleben und Rezidiv-freie Überleben der Patienten nach Kaplan und Meier.

Tab. 9: Zwischen dem immunhistologischen Nachweis von pRB und P53 ergab sich im Tumorgewebe ein signifikant positiver Zusammenhang (Gamma-Test: p<0,05).

p53

pRB

negativ

p53<33%<p53<66%<p53

 

Summe

negativ

13

1

1

9

 

24

pRB<33%

10

0

0

5

 

15

33%<pRB<66%

10

0

2

12

 

24

66%<pRB

12

1

1

17

 

31

Summe

45

2

4

43

 

94

Die Ergebnisse des pRB-Nachweises im Tumorgewebe waren unabhängig von der Tumorlokalisation (Kruskal-Wallis-ANOVA), dem Alkohol- und Tabakabusus, dem Geschlecht (Mann-Whitney U-Test) und Alter der Patienten, der Lymphknotenmetastasierung pN, dem histopathologischen Grading, dem immunhistologischen Nachweis von p90MDM2, p21CIP, p16INK4a und Cyclin D1 (Gamma-Test) und dem Überleben und Rezidiv-freien Überleben der Patienten nach


61

Kaplan und Meier ( Abb. 49 ). Es gab eine positive Korrelation zum immunhistologischen Nachweis von p53 ( Tab. 9 , Gamma-Test: p<0,05). Außerdem war pRB in größeren Tumoren vermehrt nachweisbar ( Tab. 10 , Gamma-Test: p<0,002), und damit bestand trotz fehlender Korrelation zur Lymphknotenmetastasierung auch ein positiver Zusammenhang mit dem Tumorstadium (Gamma-Test: p<0,01).

Tab. 10: PRB war in größeren und die Nachbarstrukturen infiltrierenden Tumoren signifikant häufiger nachweisbar als in kleineren Tumoren ohne Infiltration von benachbarten Strukturen (Gamma-Test: p<0,002).

Tumorgröße und -infiltration

pRB

pT1

pT2

pT3

pT4

 

Summe

negativ

15

6

1

2

 

24

pRB<33%

10

4

0

1

 

15

33%<pRB<66%

15

6

0

3

 

24

66%<pRB

11

9

2

9

 

31

Summe

51

25

3

15

 

94


62

4.1.7 BCL-2

Abb. 50: BCL-2 konnte in nahezu einem Drittel der Fälle (31,8%) im Zytoplasma der Tumorzellen immunhistologisch nachgewiesen werden.

Abb. 51: Ein immunhistologischer Nachweis von BCL-2 war im Zytoplasma der Tumorzellen möglich. Immunhistologische Färbung (Primärantikörper: M 887, Klon 124 / Chromogen: Fast-Red / Gegenfärbung: Hämalaun); Originalvergrößerung: 150x.

BCL-2 konnte im Epithel außerhalb des invasiv wachsenden Tumorgewebes nicht, im Zytoplasma der Tumorzellen aber in nahezu einem Drittel der Fälle (31,8%) in unterschiedlichen Intensitätsstufen nachgewiesen werden ( Abb. 50 ). Das Färbungsmuster innerhalb umschriebener Tumorareale war bei nur teilweise positiver, hier allerdings im Zytoplasma lokalisierter immunhistologischer Färbung vergleichbar zu der Verteilung der p53-Expression, nämlich positiv in den äußeren und negativ in den inneren Zellagen der Tumoren ( Abb. 51 ). In 3 von 31 Fällen (9,7%) war wiederum eine intratumorale Heterogenität mit Differenzen von mindestens zwei Eingruppierungen zwischen verschiedenen Gewebsschnitten identischer Primärtumoren nachweisbar. Verschiedene Färbungsintensitäten zwischen Primärtumoren und entsprechenden Lymphknotenmetastasen oder zwischen Lymphknotenmetastasen eines Primärtumors untereinander wurden nicht gefunden.

Die Ergebnisse des BCL-2-Nachweises im Tumorgewebe waren unabhängig von der Tumorlokalisation (Kruskal-Wallis-ANOVA), dem Alkohol- und Tabakabusus, dem Geschlecht (Mann-Whitney U-Test) und Alter der Patienten, der Tumorgröße pT, der Lymphknotenmetastasierung


63

pN, dem Tumorstadium, dem immunhistologischen Nachweis von p53, p90MDM2, p21CIP, p16INK4a, Cyclin D1 und pRB (Gamma-Test) und dem Überleben und Rezidiv-freien Überleben der Patienten nach Kaplan und Meier ( Abb. 52 ). Es gab aber eine Korrelation zwischen dem Nachweis von BCL-2 und dem histopathologischen Grading: BCL-2 war in geringer differenzierten Tumoren vermehrt nachweisbar ( Tab. 11 , Gamma-Test: p<0,001).

Abb. 52: Der immunhistologische Nachweis von BCL-2 im Tumorgewebe zeigte keinen Einfluß auf das Überleben und Rezidiv-freie Überleben der Patienten nach Kaplan und Meier.

Tab. 11: BCL-2 war in geringer differenzierten Tumoren gegenüber höher differenzierten Tumoren vermehrt nachweisbar (Gamma-Test: p<0,001).

histopathologisches Grading

BCL-2

G1

G2

G3

 

Summe

negativ

13

50

10

 

73

BCL-2<33%

1

9

1

 

11

33%<BCL-2<66%

0

8

5

 

13

66%<BCL-2

0

5

5

 

10

Summe

14

72

21

 

107


64

4.1.8 BAX

Abb. 53: BAX konnte in nahezu allen Fällen (94,7%) im Zytoplasma der Tumorzellen immunhistologisch nachgewiesen werden.

Abb. 54: Die zytoplasmatische Färbung beim immunhistologischen BAX-Nachweis war innerhalb der abgrenzbaren Tumorareale homogen verteilt. Immunhistologische Färbung (Primärantikörper: 18-0218, Klon 2D2 / Chromogen: 3-Amino-9-äthylcarbazol / Gegenfärbung: Hämalaun); Originalvergrößerung: 100x.

BAX konnte im Zytoplasma der Tumorzellen in nahezu allen Fällen (94,7%) in unterschiedlichen Intensitätsstufen nachgewiesen werden ( Abb. 53 ). Die Färbung war dabei innerhalb der verschiedenen Tumorareale relativ homogen verteilt ( Abb. 54 ). In einem von 31 Fällen (3,2%) war wiederum eine intratumorale Heterogenität mit Differenzen von mindestens zwei Eingruppierungen zwischen verschiedenen Gewebsschnitten identischer Primärtumoren nachweisbar. Verschiedene Färbungsintensitäten zwischen Primärtumoren und entsprechenden Lymphknotenmetastasen oder zwischen Lymphknotenmetastasen eines Primärtumors untereinander wurden nicht gefunden.

Die Ergebnisse des BAX-Nachweises im Tumorgewebe waren unabhängig von der Tumorlokalisation (Kruskal-Wallis-ANOVA), dem Alkohol- und Tabakabusus, dem Geschlecht (Mann-Whitney U-Test) und Alter der Patienten, der Tumorgröße pT, der Lymphknotenmetastasierung pN, dem histopathologischen Grading, dem Tumorstadium und dem immunhistologischen Nachweis von p90MDM2, p21CIP, p16INK4a und pRB (Gamma-Test). Es zeigte sich ein negativer


65

Einfluß der BAX-Expression auf die Dauer des Überlebens und Rezidiv-freien Überlebens der Patienten nach Kaplan und Meier, der statistisch aber nicht signifikant war ( Abb. 55 ). Es ergab sich aber eine negative Korrelation zwischen dem immunhistologischen Nachweis von BAX und p53 im Tumorgewebe ( Tab. 12 , Gamma-Test: p<0,03) und eine positive Korrelation zum Nachweis von Cyclin D1 ( Tab. 13 , Gamma-Test: p<0,05). Außerdem waren die Ergebnisse des BAX-Nachweises reziprok zu denen des BCL-2-Nachweises ( Tab. 14 , Gamma-Test: p<0,001).

Abb. 55: Der immunhistologische Nachweis von BAX im Tumorgewebe zeigte einen negativen Einfluß auf die Dauer des Überlebens und Rezidiv-freien Überlebens der Patienten nach Kaplan und Meier, der aber statistisch nicht signifikant war.


66

Tab. 12: Zwischen dem immunhistologischen Nachweis von BAX und p53 im Tumorgewebe ergab sich eine signifikant negative Korrelation (Gamma-Test: p<0,03).

p53

BAX

negativ

p53<33%<p53<66%<p53

 

Summe

negativ

2

0

0

3

 

5

BAX<33%

13

1

1

17

 

32

33%<BAX<66%

22

1

3

18

 

44

66%<BAX

9

0

0

4

 

13

Summe

46

2

4

42

 

94

Tab. 13: Zwischen dem immunhistologischen Nachweis von BAX und Cyclin D1 war im Tumorgewebe ein signifikant positiver Zusammenhang nachweisbar (Gamma-Test: p<0,05).

Cyclin D1

BAX

negativ

Cyclin D1<33%<Cyclin D1<66%<Cyclin D1

Summe

negativ

0

4

0

1

5

BAX<33%

4

5

9

13

31

33%<BAX<66%

1

8

12

22

43

66%<BAX

1

1

5

6

13

Summe

6

18

26

42

92

Tab. 14: Die immunhistologischen Nachweisergebnisse von BAX und BCL-2 im Tumorgewebe waren negativ miteinander korreliert (Gamma-Test: p<0,001).

BCL-2

BAX

negativ

BCL-2<33%<BCL-2<66%<BCL-2

 

Summe

negativ

0

1

2

2

 

5

BAX<33%

17

4

7

4

 

32

33%<BAX<66%

34

4

3

3

 

44

66%<BAX

11

0

1

1

 

13

Summe

62

9

13

10

 

94


67

4.1.9 E-Cadherin

Abb. 56: Beim immunhistologischen Nachweis von E-Cadherin ergab sich im Epithel außerhalb des invasiv wachsenden Tumorgewebes ausnahmslos eine membranöse Färbung der Zellen im Stratum spinosum und granulosum unter Aussparung des Stratum basale. Immunhistologische Färbung (Primärantikörper: PC10028, Klon 5H9 / Chromogen: Diaminobenzidin / Gegenfärbung: Hämalaun); Originalvergrößerung: 150x.

Abb. 57: Im Tumorgewebe konnte E-Cadherin in der Mehrzahl der Fälle ebenfalls immunhistologisch nachgewiesen werden. Immunhistologische Färbung (Primärantikörper: PC10028, Klon 5H9 / Chromogen: Diaminobenzidin / Gegenfärbung: Hämalaun); Originalvergrößerung: 200x.

Beim immunhistologischen Nachweis von E-Cadherin ergab sich im Epithel außerhalb des invasiv wachsenden Tumorgewebes in allen Fällen, in denen solches Epithel auf den Gewebsschnitten miterfaßt war, eine membranöse Färbung im Stratum spinosum und granulosum unter Aussparung des Stratum basale ( Abb. 56 ). Im Tumorgewebe konnte E-Cadherin in der Mehrzahl dieser Fälle (84,6%) ebenfalls nachgewiesen werden ( Abb. 57 ). Die Färbung war aber nur in etwa der Hälfte der Fälle (49,5%) vergleichbar zum Epithel auf die Zellmembran begrenzt. In 20,9% der Fälle ergab sich auch im Zytoplasma der Tumorzellen eine vergleichbare positive Reaktion und in 14,3% der Fälle war diese sogar überwiegend oder ausschließlich auf das Zytoplasma beschränkt ( Abb. 58 ). In 2 von 31 Fällen (6,5%) bestand eine intratumorale Heterogenität, wobei in beiden Fällen eine überwiegend zytoplasmatische Färbung einer überwiegend membranösen Färbung in verschiedenen Gewebsschnitten identischer Primärtumoren gegenüberstand. In einem von 9 Fällen (11,1%), in denen ein Vergleich zwischen Primärtumoren und zugehörigen Lymphknotenmetastasen möglich war, resultierte eine zytoplasmatische Färbung


68

der Zellen im Primärtumor, während die zugehörige Lymphknotenmetastase negativ war. Zwischen verschiedenen Lymphknotenmetastasen ein und desselben Primärtumors gab es in keinem Fall Unterschiede.

Abb. 58: Die Färbung beim immunhistologischen Nachweis von E-Cadherin war nur in etwa der Hälfte der Fälle (49,5%) auf die Zellmembranen beschränkt. In 20,9% der Fälle ergab sich im Zytoplasma eine vergleichbare Färbung und in 14,3% der Fälle war diese sogar überwiegend im Zytoplasma zu finden. Die übrigen 15,4% waren komplett negativ.

Abb. 59: Zwischen dem Färbungsmuster des immunhistologischen E-Cadherin-Nachweises im Tumorgewebe und dem Überleben und Rezidiv-freien Überleben nach Kaplan und Meier ergab sich kein signifikanter Zusammenhang.


69

Die Ergebnisse des E-Cadherin-Nachweises im Tumorgewebe waren unabhängig vom Alkohol- und Tabakabusus, dem Geschlecht (Mann-Whitney U-Test) und Alter der Patienten, der Tumorlokalisation, der Tumorgröße pT, der Lymphknotenmetastasierung pN, dem histopathologischen Grading, dem Tumorstadium, den hier vorher aufgeführten, immunhistologisch bestimmten Parametern (Kruskal-Wallis-ANOVA) und dem Überleben und Rezidiv-freien Überleben der Patienten nach Kaplan und Meier ( Abb. 59 ). Bei einem Vergleich des Überlebens und Rezidiv-freien Überlebens zwischen den negativen und den unabhängig vom Färbungsmuster positiven Fällen zeigte sich tendenziell ein Nachteil der Patienten mit einem fehlenden E-Cadherin-Nachweis im Tumorgewebe, der aber statistisch nicht signifikant war ( Abb. 60 ).

Abb. 60: Beim Vergleich des Überlebens und Rezidiv-freien Überlebens zwischen den beim immunhistologischen E-Cadherin-Nachweis im Tumorgewebe negativen und unabhängig vom Färbungsmuster positiven Fällen zeigte sich tendenziell ein Nachteil für die Patienten mit fehlendem E-Cadherin-Nachweis, der aber statistisch nicht signifikant war.


70

4.1.10 CD44

Abb. 61: Der immunhistologische Nachweis der verschiedenen CD44-Isoformen (hier CD44v4) führte im Epithel außerhalb des invasiv wachsenden Tumorgewebes ausnahmslos zu einer membranösen Färbung im Stratum basale, spinosum und granulosum. Immunhistologische Färbung (Primärantikörper: BMS114, Klon VFF-11 / Chromogen: Fast-Red / Gegenfärbung: Hämalaun); Originalvergrößerung: 200x.

Abb. 62: In einem Fall eines gering differenzierten Plattenepithelkarzinoms (G3) war der immunhistologische Nachweis der CD44-Isoform v4 negativ. Immunhistologische Färbung (Primärantikörper: BMS114, Klon VFF-11 / Chromogen: Fast-Red / Gegenfärbung: Hämalaun); Originalvergrößerung: 200x.


71

Abb. 63: Der immunhistologische Nachweis von CD44v4 war mit Ausnahme eines gering differenzierten Plattenepithelkarzinoms ( Abb. 62 ) in allen Fällen positiv. Immunhistologische Färbung (Primärantikörper: BMS114, Klon VFF-11 / Chromogen: Fast-Red / Gegenfärbung: Hämalaun); Originalvergrößerung: 200x.

Abb. 64: Die Isoformen CD44v4, v5 und v6 waren mit einzelnen Ausnahmen in allen untersuchten Plattenepithelkarzinomen immunhistologisch nachweisbar. Dagegen zeigten sich beim Nachweis von CD44v7 und insbesondere CD44v9 häufiger verminderte Expressionen im Tumorgewebe.


72

Abb. 65: Der immunhistologische Nachweis von CD44v4 war bei einem Patienten mit einem gering differenzierten Plattenepithelkarzinom (G3) vermindert gegenüber der Expression im Epithel. Dieser Patient bekam 4 Jahre postoperativ ein Tumorrezidiv und verstarb weitere 2 Jahre und 4 Monate später.

Der immunhistologische Nachweis der verschiedenen Isoformen des CD44 führte im Epithel außerhalb des invasiv wachsenden Tumorgewebes wie beim E-Cadherin in allen Fällen, in denen solches Epithel auf den Gewebsschnitten miterfaßt war, zu einer membranösen Färbung im Stratum basale, spinosum und granulosum ( Abb. 61 ). Im Tumorgewebe zeigten mit Ausnahme eines gering differenzierten Karzinoms (G3, Abb. 62 ) alle Tumoren ohne Unterschied zwischen Primärtumoren und Lymphknotenmetastasen in mindestens der Hälfte der Tumorzellen einen positiven membranösen Nachweis von CD44v4 ( Abb. 63 und Abb. 64 ). Der Patient mit dem negativen Ergebnis im Tumor bekam 4 Jahre postoperativ ein Tumorrezidiv und starb weitere 2 Jahre und 4 Monate später ( Abb. 65 ). Nur in zwei Fällen von ebenfalls gering differenzierten Karzinomen (G3) war der Nachweis für CD44v5 in den Primärtumoren in weniger als der Hälfte oder sogar weniger als einem Viertel der Tumorzellen negativ ( Abb. 64 ). Bei dem ersten Patienten wurde 3 Jahre und 6 Monate postoperativ ein Tumorrezidiv diagnostiziert, an dem er weitere 9 Monate später verstarb ( Abb. 66 ). Der andere Patient war der einzige, bei dem auch der Nachweis von CD44v6 im Primärtumorgewebe negativ ausfiel ( Abb. 64 ). Er bekam nach 10 Monaten ein Tumorrezidiv und starb 2 Monate später ( Abb. 67 ). Die ebenfalls untersuchte Lymphknotenmetastase dieses Patienten war sowohl beim Nachweis von CD44v5 als auch von CD44v6 positiv. Ansonsten ergaben sich für beide Isoformen keine Unterschiede innerhalb der Primärtumoren, zwischen Primärtumoren und Lymphknotenmetastasen und zwischen verschiedenen Lymphknotenmetastasen identischer Primärtumoren. Beim Nachweis von CD44v7 und CD44v9 zeigten sich häufiger verminderte Expressionen dieser Isoformen im Tumorgewebe als bei CD44v4-6 ( Abb. 64 ). Während die Expression von CD44v7 unabhängig vom histopathologi


73

schen Grading war (Mann-Whitney U-Test), ergab sich eine statistisch signifikante Korrelation vom Grading zur CD44v9-Expression, die um so häufiger vermindert war, um so geringer differenziert die Tumoren waren ( Abb. 68 , Mann-Whitney U-Test: p<0,001). In 3 von 9 Fällen (33,3%) zeigten sich Differenzen in der CD44v9-Expression zwischen Primärtumoren und zugehörigen Lymphknotenmetastasen. Dabei war zweimal die Expression im Primärtumor positiv und in den Lymphknotenmetastasen vermindert, und umgekehrt exprimierte einmal nur die Lymphknotenmetastase CD44v9. Ansonsten ergaben sich sowohl für den Nachweis von CD44v7 als auch von CD44v9 keine Unterschiede innerhalb der Primärtumoren, zwischen Primärtumoren und Lymphknotenmetastasen und zwischen verschiedenen Lymphknotenmetastasen identischer Primärtumoren.

Abb. 66: Der immunhistologische Nachweis von CD44v5 war bei zwei Patienten mit gering differenzierten Plattenepithelkarzinomen (G3) vermindert. Der eine Patient bekam nach 10 Monaten ein Tumorrezidiv und starb weitere 2 Monate später, bei dem anderen wurde 3 Jahre und 6 Monate postoperativ ein Tumorrezidiv diagnostiziert und er verstarb weitere 9 Monate danach.


74

Abb. 67: Der immunhistologische Nachweis von CD44v6 war nur bei einem Patienten mit einem gering differenzierten Plattenepithelkarzinom im Vergleich zum Epithel vermindert. Er bekam 10 Monate post operationem ein Tumorrezidiv und verstarb weitere 2 Monate später.


75

Abb. 68: Zwischen dem immunhistologischen Nachweis von CD44v9 und dem Tumor-Grading ergab sich eine signifikante Korrelation (Mann-Whitney U-Test: p<0,001): Die CD44v9-Expression war um so häufiger vermindert, je geringer differenziert die Tumoren waren.

Die Ergebnisse des CD44-Nachweises im Tumorgewebe waren unabhängig von der Tumorlokalisation (Kruskal-Wallis-ANOVA), vom Alkohol- und Tabakabusus, dem Geschlecht (Mann-Whitney U-Test) und Alter der Patienten, der Tumorgröße pT, der Lymphknotenmetastasierung pN, dem Tumorstadium und den vorher hier aufgeführten, immunhistologisch bestimmten Parametern (Gamma-Test) einschließlich des Färbungsmusters beim Nachweis von E-Cadherin (Kruskal-Wallis ANOVA). Aber sowohl die CD44v7- als auch die CD44v9-Expression im Tumorgewebe zeigten einen signifikanten Einfluß auf das Überleben (CD44v7: p<0,05, CD44v9: p<0,02) und Rezidiv-freie Überleben (CD44v7: p<0,05, CD44v9: p<0,02) der Patienten nach Kaplan und Meier ( Abb. 69 und Abb. 70 ). Insgesamt fiel in 39 von 99 auswertbaren Fällen (39,4%) der Nachweis von mindestens einer der hier ausgetesteten CD44-Isoformen im Tumorgewebe vermindert aus. Bei der univariaten Analyse des Überlebens (p<0,002) und Rezidiv-freien Überlebens (p<0,005) nach Kaplan und Meier ergab sich in diesen Fällen eine signifikant schlechtere Prognose gegenüber Patienten, bei denen alle untersuchten Isoformen positiv im Tumorgewebe getestet wurden ( Abb. 71 ). In der multivariaten Analyse des Überlebens nach Cox unter Einschluß der Parameter Tumorgröße und -infiltration pT, Lymphknotenmetastasierung pN, histologisches Tumor-Grading G und verminderte Expression von mindestens einer der hier untersuchten CD44-Isoformen im Tumorgewebe waren nur pT (Wald-Statistik: W=5,24; p<0,03), pN (W=9,48; p<0,003) und die Bestimmung der Expression der CD44-Isoformen (W=9,67; p<0,002) unabhängige Prognosefaktoren ( Abb. 72 ). Für das Rezidiv-freie Überleben hatten in diesem Modell nur die Lymphknotenmetastasierung pN (W=4,72; p<0,03) und die CD44-Expression (W=6,14; p<0,02) unabhängige prognostische Bedeutung.


76

Abb. 69: Der immunhistologische CD44v7-Nachweis im Tumorgewebe zeigte einen signifikanten Einfluß auf das Überleben und Rezidiv-freie Überleben der Patienten nach Kaplan und Meier (p<0,05): Patienten mit einer verminderten Expression hatten die signifikant schlechtere Prognose.


77

Abb. 70: Patienten mit einer verminderten CD44v9-Expression im Tumorgewebe hatten eine signifikant kürzere Überlebenszeit und Rezidiv-freie Überlebenszeit nach Kaplan und Meier als Patienten mit einer im Tumorgewebe gegenüber dem Epithel ebenfalls positiven Expression (p<0,02).


78

Abb. 71: Die Patienten, die bei allen ausgewerteten CD44-Isoformen eine positive Expression im Tumorgewebe zeigten, hatten verglichen mit denen (39,4%), die bei mindestens einer der untersuchten Isoformen eine verminderte Expression aufwiesen, ein signifikant günstigeres Überleben (p<0,002) und Rezidiv-freies Überleben (p<0,005) nach Kaplan und Meier.


79

Abb. 72: In der multivariaten Analyse im Cox-Modell war die verminderte Expression von mindestens einer der hier untersuchten CD44-Isoformen ein unabhängiger Prognosefaktor für das Überleben (p<0,002) neben der Tumorgröße und -infiltration (p<0,03) und der Lymphknotenmetastasierung (p<0,003) sowie für das Rezidiv-freie Überleben (p<0,02) neben der Lymphknotenmetastasierung (p<0,03).


80

4.1.11 Ki-67

Abb. 73: Der Prozentsatz angefärbter Zellkerne beim immunhistologischen Nachweis von Ki-67 war bei verschiedenen Tumoren sehr unterschiedlich. Immunhistologische Färbung (Primärantikörper: dia 505, Klon MIB 1 / Chromogen: Fast-Red / Gegenfärbung: Hämalaun); Originalvergrößerung: 100x.

Abb. 74: Die Anteile der nukleär angefärbten Tumorzellen beim immunhistologischen Ki-67-Nachweis bewegten sich innerhalb des untersuchten Tumorkollektivs in einem weiten Rahmen.


81

Abb. 75: Der Ki-67-Index war um so höher, je größer die Tumoren waren oder wenn die Tumoren benachbarte Strukturen infiltriert hatten (pT: Gamma-Test: p<0,006) und je weiter die Lymphknotenmetastasierung vorangeschritten war (pN: Gamma-Test: p<0,002). Damit ergab sich auch eine positive Korrelation zum Tumorstadium (Gamma-Test: p<0,001).

Ki-67 war in sehr unterschiedlicher Häufigkeit in den Zellkernen des Tumorgewebes nachweisbar ( Abb. 73 und Abb. 74 ). In 9 von 31 Fällen (29,0%), in denen mehrere Blöcke von einzelnen Primärtumoren untersucht werden konnten, war eine intratumorale Heterogenität durch Unterschiede im Ki-67-Index von mehr als 10% zwischen verschiedenen Blöcken von identischen Primärtumoren nachweisbar. In einem von 9 Fällen (11,1%), in denen Primärtumoren mit den zugehörigen Lymphknotenmetastasen verglichen werden konnten, war der Ki-67-Index im Primärtumor 35% und in der Lymphknotenmetastase 45%. Ansonsten ergaben sich wie zwischen verschiedenen Lymphknotenmetastasen keine Unterschiede.

Der Ki-67-Index war unabhängig von der Tumorlokalisation und dem E-Cadherin-Nachweis (Kruskal-Wallis-ANOVA), dem Alkohol- und Tabakabusus, dem Geschlecht (Mann-Whitney U-Test) und Alter der Patienten, dem immunhistologischen Nachweis von p53, p90MDM2, p21CIP, p16INK4a, Cyclin D1, BCL-2, BAX und CD44 und dem histopathologischen Tumor-Grading G (Gamma-Test). Es ergab sich aber eine positive Korrelation zum Tumor-Staging: Der Ki-67-Index war um so höher, je größer die Tumoren waren (pT: Gamma-Test: p<0,006) und je weiter die Lymphknotenmetastasierung vorangeschritten war (pN: Gamma-Test: p<0,002). Damit ergab sich auch eine positive Korrelation zum Tumorstadium ( Abb. 75 , Gamma-Test: p<0,001). Der Einfluß des Ki-67-Index im Tumorgewebe auf das Überleben und Rezidiv-freie Überleben der Patienten nach Kaplan und Meier war nicht signifikant, obwohl erkennbar war, daß Patienten mit einem Ki-67-Index im Tumorgewebe unter 25% günstiger und mit einem Ki-67-Index über 75% tendenziell ungünstiger lagen als die übrigen Patienten ( Abb. 76 ). Weiterhin ergab sich eine positive Korrelation zwischen dem Ki-67-Index und dem immunhistologischen Nachweis von pRB im Tumorgewebe ( Abb. 77 , Gamma-Test: p<0,001).


82

Abb. 76: Der Einfluß des Ki-67-Index auf das Überleben und Rezidiv-freie Überleben der Patienten nach Kaplan und Meier war nicht signifikant, obwohl erkennbar war, daß die Patienten mit einem Ki-67-Index von unter 25% im Tumorgewebe sowohl beim Überleben als auch beim Rezidiv-freien Überleben günstiger und die Patienten mit einem Ki-67-Index von über 75% im Tumorgewebe bezüglich des Überlebens tendenziell ungünstiger lagen als die übrigen Patienten.


83

Abb. 77: Der Ki-67-Index im Tumorgewebe war signifikant positiv mit dem immunhistologischen Nachweis von pRB verknüpft (Gamma-Test: p<0,001).


84

4.2 Apoptosenachweis

Abb. 78: Im Tumorgewebe konnten mit Hilfe einer terminalen Transferase-Reaktion wenige apoptotische Zellen nachgewiesen werden. Färbung von DNA-Fragmenten mit dem ApopTag-Kit (Chromogen: Diaminobenzidin / Gegenfärbung: Methylgrün); Originalvergrößerung: 100x.

Abb. 79: Die Bandbreite der Resultate bei der Bestimmung des Apoptose-Index reichte von Fällen mit im Tumorgewebe nicht nachweisbarer Apoptose bis hin zu einem Fall mit einem Apoptose-Index von 5%.

In über der Hälfte der Fälle (55,0%) konnten nur wenige apoptotische Zellen im Tumorgewebe nachgewiesen werden (Apoptose-Index<0,5%, Abb. 78 und Abb. 79 ). Die Bandbreite der Resultate reichte von Fällen mit nicht nachweisbarer Apoptose bis hin zu einem Fall mit einem Apoptose-Index von 5%. Die höheren Apoptoseraten waren aber eher selten. In wiederum 3 von 31 Fällen (9,7%), in denen mehrere Blöcke von einzelnen Primärtumoren miteinander verglichen werden konnten, konnten Differenzen von mehr als 1% im Apoptose-Index zwischen verschiedenen Blöcken von ein und demselben Primärtumor als Zeichen einer intratumoralen Heterogenität nachgewiesen werden. Differenzen zwischen Primärtumoren und zugehörigen


85

Lymphknoten oder zwischen verschiedenen Lymphknotenmetastasen eines Tumors wurden nicht gefunden.

Abb. 80: Zwischen dem Apoptose-Index und der Tumorgröße und -infiltration pT ergab sich ein signifikant positiver Zusammenhang (Gamma-Test: p<0,03).

Abb. 81: Zwischen einem positiven immunhistologischen Nachweis von p53 im Tumorgewebe und einem geringen Apoptose-Index war eine signifikante Korrelation nachweisbar (Gamma-Test: p<0,003).

Der Apoptose-Index im Tumorgewebe war unabhängig von der Tumorlokalisation (Kruskal-Wallis-ANOVA), dem Alkohol- und Tabakabusus, dem Geschlecht (Mann-Whitney U-Test) und Alter der Patienten, der Lymphknotenmetastasierung pN, dem Tumorstadium und dem histopathologischen Grading G (Gamma-Test). Es gab aber einen positiven Zusammenhang zwischen der Tumorgröße pT und dem Apoptose-Index ( Abb. 80 , Gamma-Test: p<0,03). Außerdem war einerseits eine signifikante Korrelation zwischen positivem immunhistologischen Nachweis von p53 und einer geringeren Apoptoserate ( Abb. 81 , Gamma-Test: p<0,003) nachweisbar, andererseits war insbesondere der positive BCL-2-Nachweis und der fehlende BAX-Nachweis mit einem geringen Apoptose-Index verknüpft ( Abb. 82 , Gamma-Test: p<0,001). Zusätzlich war ein positiver Zusammenhang zwischen dem Apoptose-Index und dem positiven Nachweis von Cyclin D1 im Tumorgewebe erkennbar ( Abb. 83 , Gamma-Test: p<0,01). Ein Einfluß des Apoptose-Index im Tumorgewebe auf das Überleben und Rezidiv-freie Überleben der Patienten nach Kaplan und Meier war nicht nachweisbar ( Abb. 84 ).


86

Abb. 82: Ein positiver immunhistologischer BCL-2-Nachweis und ein fehlender BAX-Nachweis waren mit einem geringen Apoptose-Index im Tumorgewebe verknüpft (Gamma-Test: p<0,001).

Abb. 83: Zwischen dem Apoptose-Index und dem immunhistologischen Nachweis von Cyclin D1 im Tumorgewebe war ein signifikant positiver Zusammenhang nachweisbar (Gamma-Test: p<0,01).


87

Abb. 84: Ein Einfluß des Apoptose-Index im Tumorgewebe auf das Überleben und Rezidiv-freie Überleben der Patienten nach Kaplan und Meier war nicht erkennbar.


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