Stoll, Christian: Phänotypische Untersuchungen zur prognostischen Bedeutung Proliferations- und Apoptose-assoziierter Faktoren sowie der Expression von Adhäsionsmolekülen in Plattenepithelkarzinomen der Mundhöhle und des Oropharynx

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Kapitel 5. Diskussion

5.1 Klinische und kausale Aspekte der Kanzerogenese

Bei dem Patientengut dieser Studie fanden sich typische Merkmale von Patienten mit Plattenepithelkarzinomen der Mundhöhle und des Oropharynx. So entsprach die Altersverteilung der Patienten ( Abb. 12 ) den bisherigen Erhebungen, die in neueren Untersuchungen einen Altersgipfel von 50 bis 60 Jahren, in älteren Untersuchungen einen Altersgipfel von 60 bis 70 Jahren zeigten [ 20 , 174 ]. Ebenso war die höhere Inzidenz für das männliche Geschlecht wie auch der frühere Erkrankungsbeginn bei Männern gegenüber Frauen am vorliegenden Patientengut nachweisbar ( Abb. 12 ). Das mittlere Erkrankungsalter lag 1997 in der Bundesrepublik Deutschland für die 7200 betroffenen Männer bei 57,5 Jahren und für die 2500 erkrankten Frauen bei 63,0 Jahren [ 217 ]. Die Bedeutung der bekannten Risikofaktoren Rauchen und Alkoholabusus war ebenfalls nachvollziehbar ( Abb. 13 ) [ 145 , 291 ], wobei zusätzlich zu berücksichtigen ist, daß diese Daten lediglich retrospektiv anhand der vorliegenden Krankenunterlagen erhoben wurden. Der tatsächliche Anteil an Rauchern und Alkoholkonsumenten am Patientengut dürfte erfahrungsgemäß noch höher liegen. Die ungleiche Verteilung der Risikofaktoren Rauchen und Alkoholabusus auf Männer und Frauen kann eine Erklärung für die höhere Inzidenz von Plattenepithelkarzinomen der Mundhöhle und des Oropharynx bei Männern liefern. Ebenso typisch für diese Tumorentität ist die Verteilung der Tumoren innerhalb der Mundhöhle und des Oropharynx mit Bevorzugung des Mundbodens ( Tab. 1 ) [ 20 , 174 ], da hier ein besonders intensiver und lange andauernder Kontakt von kanzerogenen Noxen mit dem Plattenepithel der Schleimhaut stattfinden kann. Auch die bekannte Tatsache, daß Patienten mit Karzinomen im anterioren Bereich der Mundhöhle eine bessere Prognose besitzen als solche mit Karzinomen im dorsalen Bereich [ 20 , 174 ], war im untersuchten Patientenkollektiv tendenziell erkennbar ( Abb. 14 ). Statistisch signifikante Unterschiede waren jedoch nicht auszumachen. Da sich Karzinome der Mundhöhle, der Zunge und des Oropharynx hinsichtlich der Geschlechts- und Altersverteilung und der Überlebensraten sehr ähnlich verhalten, Plattenepithelkarzinome der Lippen jedoch eine andere Ätiologie (Sonneneinstrahlung, Pfeifenraucher), Geschlechts- und Altersverteilung, eine wesentlich geringere Metastasierungstendenz und eine deutlich bessere Prognose haben, wurden Plattenepithelkarzinome der Lippen von dieser Untersuchung ausgeschlossen, um ein möglichst homogenes Patientenkollektiv zu erhalten [ 148 ].

Bei der Ätiologie von Tumoren sind endogene und exogene Faktoren zu berücksichtigen. Durch sie kommt es in der initialen Phase der Kanzerogenese zu Mutationen an Protoonkogenen mit Aktivierung von Onkogenen und Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen und damit zu einer Transformation von Zellen [ 44 , 92 , 194 ]. Diese können bei irreversibler Transformation anschließend als Tumorzellen ein weitgehend ungehemmtes, autonomes und zumindest in den frühen Stadien monoklonales Wachstum zeigen.

Die Bedeutung von endogenen Faktoren für die Kanzerogenese ist unstrittig. So ist eine genetische Disposition bei verschiedenen Tumoren des menschlichen Organismus in unterschiedlichem Ausmaß nachgewiesen [ 61 ]. Zu den Erbkrankheiten, die mit einem erhöhten Risiko einhergehen, an Krebs zu erkranken, zählen die Fanconi-Anämie, das Bloom-Syndrom, das Gardner-Syndrom, die Ataxia teleangiectasia, die Neurofibromatose Recklinghausen, das Basalzellnävussyndrom, die familiäre Adenomatosis coli, das Lynch-Syndrom, das Xeroderma pigmentosum, das Retinoblastom und letztlich auch das seltene Li-Fraumeni-Syndrom [ 92 , 155 , 162 ]. Für einen Teil der Mammakarzinome ist ebenfalls eine hereditäre Disposition bekannt [ 61 ]. Es gibt auch Hinweise, daß eine gestörte zelluläre Immunität eine Tumorentstehung begünstigt, indem sich Tumorzellen dem Zugriff des Immunsystems zumindest zeitweilig entziehen können und der „Immuno-Surveillance“, der immunologischen Überwachung, entgehen [ 20 , 174 ]. So wird eine erhöhte Tumorinzidenz bei Patienten mit genetisch bedingtem oder erworbenem (HIV) Immundefekt und mit medikamentös induzierter (Transplantatträger) wie auch alimentär bedingter (chronischer Alkoholabusus) Immunsuppression gefunden. Durch eine äthyltoxische Leberschädigung wird außerdem die chemische Entgiftungsfunktion der Leber und die zelluläre Abbaufunktion des retikuloendothelialen Systems negativ beeinflußt. Auch einem Mangel an verschiedenen Vitaminen, insbesondere den Vitaminen A und B, und an Spurenelementen, wie zum Beispiel Selen, wird eine kokanzerogene Wirkung zugesprochen [ 20 , 174 ].

Der große Einfluß von exogenen Faktoren auf die Kanzerogenese wird insbesondere dadurch deutlich, daß Karzinome beim Menschen etwa zwanzigmal so häufig vorkommen wie Sarkome, obwohl der menschliche Körper sich zu etwa fünf Sechstel aus mesenchymalem Gewebe auf


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baut, woraus bei maligner Entartung Sarkome entstehen [ 83 ]. Nur zu etwa einem Sechstel besteht der Körper aus epithelialem Gewebe, das die äußeren und inneren Oberflächen des Körpers bedeckt und damit erheblich intensiver äußeren, direkt einwirkenden Einflüssen ausgesetzt ist als das mesenchymale Gewebe. Eine maligne Entartung des Epithels führt zur Entstehung von Karzinomen [ 83 ]. Als exogene kanzerogene Faktoren kommen überwiegend physikalische, chemische und biologische, das heißt durch Erreger verursachte Noxen in Betracht, die als Auslöser bei der Tumorentstehung, das heißt als Kanzerogene wirken. Mutagene Kanzerogene führen zu Veränderungen der DNA. Kanzerogene, die keine nachweisbaren Veränderungen der DNA bewirken, werden als epigenetische Kanzerogene bezeichnet. Dabei summieren sich im Laufe des Lebens auch unterschwellige Reize, die allein nicht zur Tumorentstehung ausreichen. Bei Überschreiten der Reizschwelle durch die Summation der Reize kann auch nach langer Latenzzeit ein Geschwulstwachstum ausgelöst werden (Synkarzinogenese) [ 83 ]. Dadurch ist die bei den meisten Tumorentitäten wie auch beim Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle und des Oropharynx beobachtete ansteigende Tumorinzidenz im höheren Lebensalter zu erklären. Neben Kanzerogenen spielen Kokanzerogene, die den Effekt von Kanzerogenen verstärken ohne selbst kanzerogen bzw. initiierend zu wirken, und Promotoren, die die Progression einer initiierten Zelle bis zum klinisch manifesten Tumor fördern, eine Rolle. Verbindungen, die gleichzeitig Initiator- und Promotoreigenschaften besitzen, werden komplette Kanzerogene, nur initiierend wirkende Kanzerogene inkomplette Kanzerogene genannt [ 225 ].

Unter den physikalischen Noxen sind insbesondere aktinische Faktoren wie ionisierende Strahlung, die unter anderem eine direkte Schädigung des Genoms durch Doppelstrangbrüche der DNA bewirken und ein sogenanntes Strahlenkarzinom zur Folge haben kann, und ultraviolette Strahlung, die zur Dimerentstehung von Pyrimidin-Basen in der DNA führen kann, von Bedeutung [ 20 , 82 ]. Auch radioaktive Substanzen können durch ihre alpha-, beta- oder gamma-Strahlung zu DNA-Veränderungen führen. Ferner gelten Fasern jeder Substanz, die vom Organismus nicht abgebaut werden können, als kanzerogen, wenn sie eine Länge von 8 bis 200 µm und einen Durchmesser von maximal 1,5 µm aufweisen (Asbest) [ 20 ]. Möglicherweise wird durch solche Partikel der regelrechte Ablauf von interzellulären Interaktionen gestört. Als kokanzerogene physikalische Faktoren kommen beim Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle und des Oropharynx chronische, immer wiederkehrende, mechanische oder thermische Einflüsse auf das Gewebe wie lang andauernde, rezidivierende Traumatisierungen der Mukosa durch scharfe Zahn- und Füllungskanten mit anschließender Geweberegeneration, chronische, rezidivierende Verbrennungen durch heißen Tabakrauch und Ablösen protektiv wirkender oberflächlicher Faktoren der Mukosa durch hochprozentigen Äthylalkohol in Betracht. Hochprozentiger Äthylalkohol wirkt dabei zusätzlich direkt lokal zellschädigend und dient als Vektor für Kanzerogene [ 291 ].

An chemischen Faktoren sind schon seit langem polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (Tabakrauch), N-Nitrosoverbindungen (Tabakrauch), aromatische Amine, alkylierende Substanzen wie Senfgas und Äthylenimine, Urethan, halogenierte aliphatische Kohlenwasserstoffe, verschiedene Kunststoffe vor allem als Monomere und anorganische Substanzen wie Arsen (Tabakrauch), Cadmium und Chrom als Kanzerogene bekannt, wobei diese Liste durch verbesserte Analysetechniken und detaillierte Untersuchungen sicher weiter anwachsen wird ( Tab. 15 ) [ 225 ]. Hierbei ist hauptsächlich von einer Kanzerogenese durch chemische Reaktion der Verbindungen (primäre oder direkt wirkende Kanzerogene) oder ihrer Metaboliten (sekundäre oder indirekt wirkende Kanzerogene oder Prokanzerogene) mit der DNA als ultimales Kanzerogen und der daraus resultierenden Veränderung des Genoms auszugehen [ 189 ].

Tab. 15: Auswahl humanpathogener Kanzerogene.

Stoffklasse

Kanzerogene

Wirkung

Alkylanzien

 

 

(chemisch und strukturell heterogene, jedoch sämtlich alkylierende Substanzen; meist synthetisch; Therapeutika, insbesondere Zytostatika; auch für Tierexperimente)

Bis(chloromethyl)äther, Diepoxybutan, Glycinaldehyd, beta-Propionolacton, Stickstoff-Lost

systemisch, lokal


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anorganische Substanzen

 

 

(wirksam durch ihre Ionen; auch gewerblich = Berufs-Kanzerogene)

als physikalische Kanzerogene:

Kanzerogene zur tierexperimentellen Auslösung von Tumoren:

Arsen, Chrom, Nickel


Polonium, Radium, Uran

Beryllium, Blei, Cadmium

lokal

aromatische Amine

 

 

(als chemische Syntheseprodukte; auch tierexperimentell genutzt)



analog Pyrolyse-Produkte von Aminosäuren:

4-Aminobiphenyl, 2-Aminoanthracen, 2-Aminonaphthalin, 2-Aminophenanthren, Benzidin, 2-Naphthylamin, o-Toluidin

Tryptophan- und Glutaminsäure-Heterozyklen (Trp-P-1, Glu-P-1)

systemisch, organotrop

aromatische Kohlenwasserstoffe

 

 






als Berufskanzerogene:

Benzo(a)pyren, 1,2-5,6-Dibenzanthracen, 7,12-Dimethylbenzanthracen, 3-Methylcholanthren

Anthracenöl, Asphalt, Auramin, Benzinmotor-Abgase, Benzol, Bohröl, Dieselöl und -abgase, Ölschieferprodukte, (Roh-)Paraffinöl, Pech, Ruß, Schmierfett und -öl

bevorzugt lokal

Festkörper

 

 

(kanzerogene Wirkung bedingt durch Größe, Form und Biobeständigkeit)

Asbestfasern, Kunststoff-, Glasfasern

lokal

Naturstoffe

Aflatoxine, Aristolochia-Säure (in Osterluzei), Cycasin (in Cycadennüssen; Asien), Pyrrolizidinalkaloide (in Senecio, Crotalaria), Safrol

 

 

 

 

 

N-Nitroso-Verbindungen

Nitrosamine, Nitrosamide

systemisch, organotrop

Einen weiteren Komplex von exogenen Faktoren in der Kanzerogenese bilden Parasiten und andere Krankheitserreger [ 225 ]. Bei den Parasiten spielt wohl der durch sie verursachte, andauernde Entzündungsreiz als Kokanzerogen eine Rolle, in dessen Folge es über Fehlregenerationen des Epithels ausgelöst durch Kanzerogene zur Krebsentstehung kommen kann. In gleicher Weise kann sich eine bakterielle oder durch Pilze verursachte Entzündung (Soor) auswirken, wobei allerdings Stoffwechselprodukte der Erreger wie das Aflatoxin B1 aus Aspergillus flavus auch direkt kanzerogen wirken können. Ungefähr 25% der bisher entdeckten 600 für Menschen und Tiere pathogene Viren sind potentielle Tumorviren. Onkogene DNA- und RNA-Viren können eine direkte Transformation von Zellen bewirken, indem ihre Gene in das Zellgenom integriert werden. Humanpathogene transformierende DNA-Viren sind einige humane Papilloma-Viren, insbesondere Typ 16 und 18 (High-risk-HPV-Infektionen), die häufig in Plattenepithelkarzinomen und dysplastischen Läsionen der Cervix uteri aber auch der Mundhöhle und des Oropharynx gefunden werden [ 177 ], das Epstein-Barr-Virus und das Hepatitis-B-Virus. Im Tier


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versuch weisen das SV40-Papovavirus und einige Adenoviren eine kanzerogene Wirkung auf. Onkogene RNA-Viren (Retroviren) sind beim Menschen die humanen T-Zell-Leukämie-Viren (HTLV-I und -II) [ 225 ].

Bemerkenswert bei dem untersuchten Patientenkollektiv ist der hohe Anteil von dysplastischem Epithel außerhalb des infiltrierend wachsenden Tumorgewebes, der auf den vorhandenen Schnitten miterfaßt wurde und die Bedeutung der multifokalen Kanzerogenese oder Feldkanzerisierung für die Entstehung von Plattenepithelkarzinomen der Mundhöhle und des Oropharynx unterstreicht [ 39 , 188 ]. In einem Organ oder System können gleichzeitig (synchron) oder nacheinander (metachron) in Form von einer multifokalen Krebsentstehung mehrere primäre Tumorherde entstehen [ 82 ]. Dieser Mechanismus ist besonders typisch für die Kolonkarzinome bei der Adenomatosis coli, wird aber auch beim Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle und des Oropharynx im Rahmen einer Feldkanzerisierung beobachtet [ 39 , 188 ]. Zweitkarzinome in den Bronchien, in der Lunge, im Magen, im Rektum und im Uterus werden beim primären Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle und des Oropharynx in 3,2-5,9% der Fälle angegeben [ 20 ].

Bei der klinischen Beobachtung können sich Plattenepithelkarzinome der Mundhöhle und des Oropharynx zwar aus (scheinbar) intakter Schleimhaut entwickeln. Häufig gehen jedoch der Karzinomentstehung verschiedene Formen von Präkanzerosen voraus ( Abb. 1 ) [ 82 ]. Als wichtigste Präkanzerosen sind hierbei bestimmte Formen der Leukoplakien zu nennen [ 210 ]. Die rein klinische, deskriptive Diagnose einer Leukoplakie ist von der WHO als begrenzte, weißliche Fleckung der Mundschleimhaut definiert worden, die nicht wegwischbar und keiner anderen Erkrankung zuzuordnen ist [ 210 ]. Die häufigste Form der Leukoplakien ist die homogene, plane oder einfache Leukoplakie, die jedoch insgesamt noch keine Präkanzerose im eigentlichen Sinn darstellt. Bei dieser Form besteht ein geschätztes Entartungsrisiko von 3-6% in 5-20 Jahren [ 83 , 138 ]. Ohne daß dies für die rein klinische Einteilung der Leukoplakien Voraussetzung ist, ist hierbei histopathologisch neben einer Verlängerung und Verbreiterung der Epithelzapfen (Akanthose), einer zur Tiefe hin entzündlichen Infiltration des Stromas und einer Hyperkeratose und Dyskeratose, gelegentlich auch einer Parakeratose als Zeichen einer überstürzten Verhornung der oberen Zellen des Stratum spinosum nur beim Übergang in die präkanzeröse Form eine leichte bis mäßige Dysplasie erkennbar. Die inhomogene, präkanzeröse Leukoplakie in ihren Formen der verrukösen und nodulären Leukoplakie sowie der erosiven Leukoplakie oder Erythroleukoplakie ist histopathologisch häufig mit einer Dysplasie höheren Grades vergesellschaftet. Das Entartungsrisiko dieser Veränderungen liegt bereits bei 20-40%. Die Erythroplakie entspricht letztlich einem Carcinoma in situ und geht zu etwa 50% in ein invasiv wachsendes Karzinom über [ 83 , 138 ].

Das histopathologische Korrelat zu den verschiedenen Stufen der Kanzerogenese bei den Plattenepithelkarzinomen der Mundhöhle und des Oropharynx ist häufig in Gewebsschnitten in verschiedenen Stadien nachweisbar ( Abb. 26 und Abb. 31 ) [ 82 , 179 , 210 ]. So ist in dem zunächst intakten Plattenepithel der Schleimhaut bei der leichten oder geringen Dysplasie (Grad 1) neben einer Verbreiterung der Basalzellschicht (Basalzellenhyperplasie) bei intakter Schichtung der oberen Zellagen eine geringgradige Zell- und Kernpolymorphie zu beobachten. Eine mäßige oder mittelgradige Dysplasie (Grad 2) ist durch ein Übergreifen der vermehrten Basalzellen auf die mittlere Epithelschicht mit deutlicher Zell- und Kernpolymorphie und Mitosen, auch einzelnen atypischen Kernteilungsfiguren, in der basalen und mittleren Zellschicht charakterisiert. Bei der schweren oder hochgradigen Dysplasie (Grad 3) ist die Epithelschichtung fast völlig aufgehoben. Nur die oberflächliche Zellschicht ist noch etwas abgeflacht. Ausgeprägte Zell- und Kernpolymorphie sowie zahlreiche typische und atypische Mitosen sind im gesamten Epithel nachweisbar. Die Übergänge zum Carcinoma in situ, das sich vom eigentlichen Karzinom nur durch das fehlende invasive Wachstum bei intakter Basalmembran unterscheidet, sind hierbei fließend.

Der relativ hohe Anteil an kleineren Tumoren und die relativ geringe Metastasierungsrate im Bereich der ableitenden Lymphwege im erfaßten Patientenkollektiv sind darauf zurückzuführen, daß in dieser Studie nur Patienten berücksichtigt wurden, die primär chirurgisch und kurativ intendiert therapiert worden waren. Bei Patienten mit ausgedehnten Tumorinfiltrationen in benachbarte Strukturen und fortgeschrittenen Lymphknotenmetastasierungen wie auch Fernmetastasierungen ist der kurative Erfolg einer Operation nur mit wesentlichen Funktionseinschränkungen für den Patienten oder gar nicht zu erreichen, weshalb auf andere, oft palliative, Therapieformen ausgewichen wird. Der Einfluß der „klassischen“ Prognosefaktoren Tumorgröße (pT), Lymphknotenmetastasierung (pN) und Tumor-Grading (G) auf das Überleben und das Rezidiv-


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freie Überleben der Patienten war in dem Patientenkollektiv dieser Studie signifikant ( Abb. 16 , Abb. 17 und Abb. 19 ). Trotzdem wären angesichts der noch immer unbefriedigenden Heilerfolge für die einzelnen Patienten zusätzliche Parameter zur Abschätzung des wahrscheinlichen Wachstumsverhaltens einer Neoplasie wünschenswert, welche die Grundlage für eine individuell angepaßte Therapie verbreitern würden. Daher ist eine intensive Suche nach neuen, objektiv quantifizierbaren Parametern notwendig.


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5.2 Regulation von Zellzyklus und Apoptose

5.2.1 P53 und die assoziierten Parameter p90MDM2 und p21CIP

Die zahlreichen durchgeführten immunhistologischen Untersuchungen zum Nachweis von p53 bei verschiedenen Tumorentitäten gründen sich zum einen auf die Erkenntnis, daß das p53 bei der Regulation des Zellzyklus insbesondere bei im Genom geschädigten Zellen eine zentrale Rolle spielt, indem es für eine Unterbrechung des Zellzyklus sorgt, bis der genetische Schaden repariert ist oder die Apoptose der Zelle eingeleitet wird ( Abb. 2 ), und zum andern auf die Annahme, daß das physiologisch in der Zelle vorhandene Wildtyp-p53 infolge einer sehr kurzen Halbwertszeit von etwa 20 Minuten im Zellzyklus nicht immunhistologisch nachweisbar, das mutierte und nicht funktionsfähige p53 mit seiner auf mehrere Stunden verlängerten Halbwertszeit durch Akkumulation im Zellkern jedoch immunhistologisch nachweisbar ist [ 11 , 82 , 154 , 282 ]. Diese angenommene Korrelation zwischen Mutation mit Funktionsverlust und immunhistologischer Nachweisbarkeit kann jedoch durch einige Faktoren gestört werden [ 11 , 87 , 298 ].

Zu falsch negativen Ergebnissen kann es durch Artefakte bei der Fixierung des Tumorgewebes kommen, wenn das ursprünglich im Gewebe vorhandene Phosphoprotein p53 zum Beispiel durch Autolyse des Gewebes oder bakteriellen Abbau soweit verändert wurde, daß es durch den bei der Immunhistologie verwendeten Primärantikörper nicht mehr erkannt wird [ 298 ]. Eine Relevanz dieser Fehlerquelle ist bei den hier untersuchten, standardisiert gewonnenen Präparaten unwahrscheinlich, da an Stufenschnitten mehrere Parameter immunhistologisch untersucht wurden und in keinem Fall alle Ergebnisse negativ waren. So ist zumindest davon auszugehen, daß die Gewinnung und Vorbehandlung der Präparate generell zur Durchführung von immunhistologischen Untersuchungen geeignet war. Deletionen von Allelen des p53 haben bei immunhistologischen Methoden natürlich verminderte Ergebnisse zur Folge, wobei eine Deletion von beiden Allelen zu einem völligen Fehlen des p53 führt. Funktionell hat das aber die gleichen Auswirkungen wie ein durch Missense-Mutation funktionsunfähiges p53, das immunhistologisch nachweisbar sein sollte. Nonsense-Mutationen können ein soweit verkürztes, funktionsloses Phosphoprotein zur Folge haben, daß die vom Primärantikörper erkannte Determinante nicht mehr vorhanden ist. Außerdem haben Nonsense-Mutationen in der Regel keine Akkumulation des p53 zur Folge [ 82 , 196 , 298 ]. Weiterhin ist nicht sicher, das jede Missense-Mutation, die zu einem funktionsunfähigen p53 führt, auch eine so große stabilisierende Funktion ausübt, daß die Halbwertszeit des veränderten p53 soweit verlängert wird, daß es sich im Zellkern anreichert [ 11 ].

Falsch positive Ergebnisse bei der immunhistologischen Färbung können dadurch zustande kommen, daß die Sensitivität der Methode soweit gesteigert wird, daß auch schon in physiologischen Mengen vorhandenes Wildtyp-p53 im Zellkern nachgewiesen wird [ 87 ]. Weiterhin kann es im Zellkern von Zellen zur Hochregulation von Wildtyp-p53 kommen, bei denen ein Schaden im Genom aufgetreten ist, was ja dem physiologischen Ablauf zur Reparatur des Genomschadens oder zur Einleitung der Apoptose entspricht [ 125 ]. Es kommt hierbei in erster Linie nicht zu einer erhöhten Produktion von p53, sondern ähnlich wie bei einer Punktmutation zu einer Verlängerung der Halbwertszeit von p53, hier allerdings durch Änderung des Phosphorylierungsgrades des Phosphoproteins.

Ein erhöhter Spiegel des zellulären Phosphoproteins p90MDM2 führt neben einer Bindung und funktionellen Inaktivierung auch zu einer wahrscheinlich sekundären Induktion des Wildtyp-p53 [ 82 ]. Ob das Wildtyp-p53 in der an das p90MDM2 gebundenen Form immunhistologisch nachweisbar ist oder nicht, hängt zum einen von der möglichen Maskierung der antigenen Determinante für den Primärantikörper des immunhistologischen Nachweissystems, zum anderen von der Halbwertszeit dieser Wildtyp-p53-p90MDM2-Komplexe ab [ 87 ]. Aber auch Proteine aus Viren, wie das große T-Antigen des SV40-Papovavirus, das E1B-55-kD-Protein des Adenovirus, Typ 5 und das E6-Protein der humanen Papilloma-Viren 16 und 18 wie auch das EBNA-5 und das BZLF1-Protein des Epstein-Barr-Virus können durch Bindung an das Wildtyp-p53 eine Inaktivierung bewirken [ 230 ]. Eine Interaktion des großen T-Antigens und E1B-55-kD-Proteins führt dabei zu einer Stabilisierung des p53, womit ein immunhistologischer Nachweis möglich sein sollte, wenn die vom verwendeten Antikörper erkannte antigene Determinante freigelegt werden kann [ 79 , 230 , 233 ]. Dagegen hat eine Bindung von E6-Protein der humanen Papilloma-Viren 16 und 18 neben der Inaktivierung einen raschen, Ubiquitin-abhängigen proteolytischen Abbau des p53 zur Folge, wobei es aber trotzdem noch immunhistologisch nachweisbar sein kann [ 224 , 230 ]. In diesen Fällen ist vergleichbar zur Situation nach einer Missense-Mutation im


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TP53-Gen der positive immunhistologische Nachweis von p53 mit einem Funktionsverlust dieses Tumorsuppressors verknüpft.

Für einen sicheren Nachweis von Mutationen im p53-Gen sind direkte Nachweismethoden im Genom, das heißt in der DNA erforderlich. Die immunhistologische Technik bietet allerdings die Vorteile, daß sie schnell auch bei größeren Fallzahlen durchführbar ist und die Ergebnisse direkt zu histomorphologischen Parametern innerhalb und außerhalb des Tumorgewebes korreliert werden können. In verschiedenen Tumorentitäten wie kolorektalen Karzinomen, primären Lungenkarzinomen und Harnblasenkarzinomen haben sich in vergleichenden Untersuchungen insgesamt gute Korrelationen zwischen Punktmutationen in den Exons des TP53-Locus und dem immunhistologischen Nachweis des p53-Phosphoproteins ergeben [ 11 , 87 ]. Beim Leberzellkarzinom bei Kindern und beim Pankreas-Adenokarzinom konnte dagegen eine solche Korrelation nicht gefunden werden [ 11 ]. Weiterhin gibt es immunhistologische Untersuchungen, bei denen ein hoher Anteil an Cervixkarzinomen und Prostatakarzinomen immunhistologisch positiv für das p53-Phosphoprotein reagierte, in anderen Studien bei diesen Tumorentitäten aber nur in den wenigsten Fällen eine Mutation im TP53 nachgewiesen werden konnte [ 11 ]. Im Bereich der Karzinome der Mundhöhle, des Pharynx, Hypopharynx und des Larynx ergaben sich in vergleichenden Studien gute Korrelationen zwischen Mutationen im TP53 und dem immunhistologischen Nachweis von p53 im Tumorgewebe [ 2 , 31 , 33 , 196 ]. In der vorliegenden Untersuchung wurde der immunhistologische Nachweis des p53-Phosphoproteins durch einen ebenfalls immunhistologischen Nachweis seines Regulator-Phosphoproteins p90MDM2 und seiner Effektor-Proteine p21CIP und BAX an Serienschnitten ergänzt, wodurch ein Einblick in die Regulationsprozesse im Gewebe erreicht werden könnte ( Abb. 5 ) [ 168 , 254 ].

In etwa einem Drittel der Fälle, in denen das auf den Gewebsschnitten miterfaßte Epithel außerhalb des infiltrierend wachsenden Tumorgewebes keine erkennbaren Dysplasien aufwies, war ein immunhistologischer Nachweis von p53 in diesem Epithel möglich. Der Nachweis beschränkte sich dabei regelmäßig auf das Stratum basale, was darauf hindeutet, daß p53 in die Regulation der Zelldifferenzierung involviert ist [ 2 , 31 , 168 , 169 ]. Das p90MDM2 und das p21CIP waren erheblich öfter nachweisbar, wobei wiederum eine zonale Gliederung auffiel, indem diese Färbungen regelmäßig auf das Stratum spinosum und höhere Schichten begrenzt waren. Für das p21CIP ist eine erhöhte Expression in weiter ausdifferenzierten Zellen allgemein bekannt, was zur alternativen Bezeichnung SDI1 (senescent cell derived inhibitor 1) geführt hat [ 60 , 193 ]. Die selektive Expression von p90MDM2 im Stratum spinosum und höheren Schichten des Mundschleimhautepithels unterscheidet sich dagegen von der Situation in der äußeren Haut [ 48 ].

Da in diesen Epithelabschnitten der Mundschleimhaut mit nicht transformierten Zellen und nur sehr selten mit einer Mutation im TP53 zu rechnen ist, ist davon auszugehen, daß das nachgewiesene p53 durch exogene, genomschädigende Noxen wie Tabakrauch insbesondere in Zusammenhang mit hochprozentigem Alkohol hochreguliert wurde und es sich um Wildtyp-p53 handelt [ 64 , 65 ]. Sowohl die zonale Gliederung des Nachweises von p53 im Stratum basale und des nachfolgend exprimierten Effektormoleküls p21CIP [ 60 ] sowie des ebenfalls vom p53 induzierten Antagonisten p90MDM2 in höheren Zellschichten ist durch physiologische Regulationsmechanismen erklärbar, wie auch der signifikant positive Zusammenhang zwischen der Expression von p53 und p90MDM2, der sich aus der Induktion des p90MDM2 durch das p53 ergibt [ 181 , 297 ]. Die fehlende Korrelation zwischen der Expression von p53 und p21CIP im Epithel ohne Dysplasien könnte darauf zurückzuführen sein, daß p53 nur einer von mehreren induzierenden Faktoren des p21CIP ist [ 59 ]. Unabhängig vom p53 ist eine Induktion des p21CIP auch durch Zytokine über den PDGF-Rezeptor (platelet-derived growth factor receptor), den FGF-Rezeptor (fibroblast growth factor receptor) und den EGF-Rezeptor (epidermal growth factor receptor) möglich [ 44 , 175 ], deren Einfluß in dieser Studie nicht berücksichtigt wurde.

Im auf den Gewebsschnitten miterfaßten dysplastischen Epithel außerhalb des invasiv wachsenden Tumorgewebes war das p53 signifikant häufiger nachweisbar als im Epithel ohne Dysplasien, was sich aus einer häufigeren Genomschädigung in diesem Bereich gegenüber Epithel ohne Dysplasien ergibt [ 148 ]. Darüberhinaus war zwischen dem Dysplasiegrad und der p53 Expression hier ein signifikant positiver Zusammenhang nachweisbar [ 223 , 239 , 240 , 295 ]. Wie im Epithel ohne Dysplasien war auch hier die zonale Gliederung des Nachweises von p53 im Stratum basale und von p90MDM2 sowie p21CIP in höheren Zellschichten in ihrer Eigenschaft als vom p53 induzierten Molekülen erkennbar. Es ergab sich eine signifikant positive Korrelation zwischen dem Nachweis von allen drei Parametern im dysplastischen Epithel, was ein Hinweis


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darauf ist, daß in diesem Bereich nicht nur die Induktion von p90MDM2 durch das p53 in physiologischen Bahnen verläuft, sondern auch die Induktion von p21CIP durch das p53 gegenüber anderen Regulationsmechanismen in den Vordergrund rückt.

Eine Korrelation zwischen dem Rauchen und dem Alkoholabusus mit der Expression von p53 [ 65 , 145 ], p90MDM2 und p21CIP im Epithel mit und ohne Dysplasien ergab sich in dieser Studie allerdings nicht, da in diese Studie nur Patienten mit einem invasiv wachsenden Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle und des Oropharynx eingegangen waren. In diesem Kollektiv liegt der Anteil an Tabak- und Alkoholkonsumenten so hoch, daß eine statistische Signifikanz mangels Patienten ohne Nikotin- und Alkoholabusus nicht zu erwarten war.

Der Anteil der Tumoren, in denen p53 immunhistologisch nachweisbar war, entspricht mit etwa der Hälfte der Fälle dem anderer Untersuchungen von Plattenepithelkarzinomen der Mundhöhle und des Oropharynx [ 9 , 31 , 145 , 148 , 168 , 191 , 211 , 240 , 285 ]. Auch bei den invasiv wachsenden Plattenepithelkarzinomen war die zonale Gliederung des Nachweises von p53 in der peripheren, am wenigsten ausdifferenzierten Zellschicht [ 31 ] und von p90MDM2 sowie p21CIP bevorzugt in den zentral gelegenen, am weitesten ausdifferenzierten Zellen in umschriebenen Tumorarealen in den Fällen nachvollziehbar, in denen es zu einer partiellen Färbung der Tumorzellkerne kam und das Wachstumsmuster des Tumors die Abgrenzung von größeren umschriebenen Tumorarealen erlaubte. Zusätzlich war das p90MDM2 in höher differenzierten Tumoren signifikant häufiger nachweisbar als in geringer differenzierten. Diese Befunde sprechen dafür, daß mitunter auch bei invasiv wachsenden Plattenepithelkarzinomen der Mundhöhle und des Oropharynx das physiologische Regulationsprinzip zwischen p53, p90MDM2 und p21CIP noch vorhanden ist. Diese nur teilweise Färbung der Zellkerne war aber gerade im Falle des p53 selten. Dagegen kam es in jeweils annähernd der Hälfte der Fälle zu einer Anfärbung von praktisch allen Zellkernen des Tumorgewebes oder umgekehrt zu keinerlei Anfärbungen.

Nur für den immunhistologischen Nachweis von p53 und p90MDM2 ergab sich eine signifikant positive Korrelation im Tumorgewebe [ 211 ]. Dabei ist zu berücksichtigen, daß zwar eine Induktion des p90MDM2 durch eine Mutation des TP53-Gens beeinflußt wird, indem insbesondere bei Mutationen in den Exons 5 und 7 kein oder aber bei Mutationen im Exon 8 ein häufig allerdings verändertes p90MDM2 induziert wird, die Interaktion zwischen den Phosphoproteinen p53 und p90MDM2 durch eine Missense-Mutation in den „hotspots“ des TP53 jedoch nicht verhindert wird [ 7 , 181 ]. Zwischen dem p53 und p21CIP ergab sich hier dagegen keine Korrelation. In diesem Fall ist am ehesten von einer Störung dieses Regulationsprinzips durch Funktionsverlust des p53 auszugehen, da eine Induktion des p21CIP durch p53 ein intaktes Wildtyp-p53 voraussetzt [ 214 , 281 ]. Diese Regulationsstörung kann somit als Anhalt dafür gewertet werden, daß das immunhistologisch im Tumorgewebe nachgewiesene p53 größtenteils durch Inaktivierung und Akkumulation infolge einer Mutation des TP53-Gens oder Bindung des p53 durch zelluläre oder virale Proteine nachweisbar war.

In 12,9% der Fälle, in denen mehrere verschiedene Schnitte des Primärtumors miteinander verglichen werden konnten, ergaben sich für den Nachweis des p53 innerhalb des Primärtumors Differenzen als Zeichen einer intratumoralen Heterogenität. Für das p90MDM2 und das p21CIP lag der Anteil dieser Fälle noch höher. Dieser Befund stützt die These einer teilweise multifokalen Kanzerogenese bei Plattenepithelkarzinomen der Mundhöhle und des Oropharynx [ 39 , 188 ]. Allerdings ergaben sich auch Differenzen zwischen den Primärtumoren und den zugehörigen Lymphknotenmetastasen, was ein Zeichen für eine Änderung des Expressionsverhaltens von p53, p90MDM2 und p21CIP während der Tumorprogression und Metastasierung sein kann. Es ist allerdings nicht sicher auszuschließen, daß hier ebenfalls primär verschiedene Tumorzellklone nachgewiesen wurden, die im Primärtumor bei dieser Untersuchung nur nicht vollständig erfaßt worden waren. Eine Korrelation zwischen der Expression von p53, p90MDM2 und p21CIP in den Primärtumoren und auch der Änderung des Expressionsverhaltens in den Lymphknotenmetastasen gegenüber den Primärtumoren und der Lymphknotenmetastasierung (pN) oder der Tumorgröße (pT) ergab sich dabei nicht.

Die Resultate des p53-Nachweises lassen sich mit den Ergebnissen einer durchflußzytometrischen Untersuchung des DNA-Gehaltes von Plattenepithelkarzinomen der Mundhöhle und der Lippen vergleichen, die teilweise mit Hilfe einer bildanalytischen Zytometrie der Gewebsschnitte nach Feulgen-Färbung kontrolliert und ebenfalls an in Paraffin eingebettetem Tumorgewebe vorgenommen wurde [ 6 ]. Eine Durchführung dieser immunhistologischen Untersuchungen bei dem identischen Patientengut zum direkten Vergleich mit den Ergebnissen der zytometrischen Untersuchungen war allerdings nicht möglich, da bei der durchflußzytometrischen Untersu


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chung so viel Tumorgewebe zur Messung verwendet werden mußte, daß hier überwiegend auf ein anderes Patientenkollektiv ausgewichen werden mußte. Hierbei ergab sich eine gute Übereinstimmung von dem Anteil der Tumoren, bei dem p53 immunhistologisch nachweisbar war, mit dem Anteil der aneuploiden Tumoren von 55% in der eigenen zytometrischen Untersuchung wie auch in einer anderen Untersuchung [ 293 ]. Wenn man davon ausgeht, daß das nachgewiesene p53 im Tumorgewebe mutiertem, funktionsunfähigem p53 entspricht, kommt es in diesen Fällen zu einem Ausfall des „Wächters des Genoms“: Schäden im Genom führen dann nicht mehr zu einer Unterbrechung des Zellzyklus mit Reparatur des Genomschadens oder Einleitung der Apoptose [ 143 ]. Damit können Schäden im Genom durch Zellproliferation weitergegeben werden, was zur Ausbildung von aneuploiden Zellklonen führen kann. Die Diskrepanz im DNA-Gehalt zwischen den Primärtumoren und deren Lymphknotenmetastasen in 17% der untersuchten Fälle als Zeichen einer intraindividuellen Heterogenität stimmt ebenso mit den Ergebnissen dieser immunhistologischen Untersuchungen weitgehend überein [ 6 ].

Im Gegensatz zur Tumorgröße und -infiltration (pT), zur Lymphknotenmetastasierung (pN), zum Tumor-Grading (G) und zur Stadieneinteilung ergab sich für den immunhistologischen Nachweis von p53, p90MDM2 und p21CIP im Tumorgewebe in dieser Studie keine Korrelation zum Überleben und Rezidiv-freien Überleben der Patienten. Damit finden Ergebnisse von anderen Untersuchungen bei Plattenepithelkarzinomen aus dem Mundhöhlen-, Pharynx-, Hypopharynx- und Larynxbereich eine Bestätigung, bei denen das p53 allein immunhistologisch oder aber auch durch Sequenzierung des TP53-Gens untersucht wurde [ 2 , 31 , 71 , 148 , 205 , 240 , 293 ]. Bei verschiedenen anderen Tumoren des menschlichen Organismus wie dem Mammakarzinom, dem Kolonkarzinom, dem Magenkarzinom, dem Bronchialkarzinom, dem Harnblasenkarzinom, Lymphomen und Weichteilsarkomen ist der Einfluß des p53 auf die Prognose in zahlreichen Studien untersucht und belegt worden [ 100 ], was dafür spricht, daß bei diesen Tumorentitäten eine Veränderung der funktionellen Aktivität des p53 ein spätes Ereignis in der Kanzerogenese darstellt. Jeder Organtumor muß folglich bezüglich der molekulargenetischen Abläufe bei der Kanzerogenese und Tumorprogression einzeln betrachtet werden. Die Korrelation zwischen dem immunhistologischen Nachweis von p53 im Epithel außerhalb des invasiv wachsenden Tumorgewebes und dem zugehörigen Dysplasiegrad des Epithels kann so interpretiert werden, daß Veränderungen in der Regulation des Zellzyklus durch das p53 bei der Kanzerogenese des Plattenepithelkarzinoms der Mundhöhle und des Oropharynx ein frühes Ereignis darstellen [ 240 ]. Bei dieser Tumorentität hat die Expression von p53 somit in frühen Stadien der Kanzerogenese eine Bedeutung, nicht aber für die weitere Prognose bei Patienten mit einem invasiv wachsenden Plattenepithelkarzinom [ 2 , 31 , 148 ].

5.2.2 PRB und assoziierte Parameter

Während der Phosphorylierungsgrad des vom Retinoblastoma-Gen kodierten Phosphoproteins pRB vom Zellzyklus abhängig ist ( Abb. 2 ) und von der Aktivität der CDK bestimmt wird ( Abb. 5 ), ändert sich die Menge des pRB während des Zellzyklus physiologischerweise nicht [ 27 , 36 , 44 , 88 , 287 ]. Insoweit ist die fehlende Abhängigkeit des immunhistologischen pRB-Nachweises im Tumorgewebe von den Ergebnissen der immunhistologischen Bestimmungen von Cyclin D1, das die Aktivität der CDK induziert [ 44 , 66 , 92 ], p16INK4a und p21CIP, die die Aktivität der CDK blockieren [ 90 , 122 , 231 , 301 , 306 ], ebenso wie die fehlende zonale Gliederung der pRB-Expression im Epithel und Tumorgewebe nicht ungewöhnlich. Auch ein Zusammenhang mit der p53-Expression war über diese Regulationskaskade nicht zu erwarten, zumal im Tumorgewebe die p21CIP-Expression nicht vom immunhistologischen Nachweis von p53 abhängig war. Die positive Korrelation zwischen den Ergebnissen der immunhistologischen Bestimmungen von p53 und pRB im Tumorgewebe ist eher auf gemeinsame oder zumindest miteinander in Beziehung stehende Antagonisten zurückzuführen. So bindet und inaktiviert das zelluläre Protein p90MDM2 sowohl p53 als auch pRB ( Abb. 85 ) [ 299 ]. Einige onkogene Viren führen zur Freisetzung von Proteinen, die mit beiden Tumorsuppressorgen-Produkten interagieren: Die humanen Papilloma-Viren 16 und 18 bewirken nicht nur eine Produktion des E6-Proteins [ 177 , 288 ], das an die C-terminale Domäne des p53 bindet und eine Ubiquitin-abhängige Degradation des Moleküls induziert [ 224 ], sondern auch des E7-Protein, welches an pRB bindet und es inaktiviert [ 57 , 104 ]. Das E1B-55-kD-Protein des Adenovirus, Typ 5 hat spezifische Bindungsstellen im p53-Phosphoprotein [ 222 ] und das E1A-Protein desselben Virus im pRB [ 290 ]. Das große T-Antigen des SV40-Papovavirus kann mit seinen Aminosäuren 400-650 an p53 [ 144 , 222 ] und mit seinen Aminosäuren 105-114 an pRB [ 49 ] binden. Zumindest aus der Gruppe der onkogenen DNA-Viren scheinen somit vor allem diejenigen transformierend zu wirken, die die Produkte von beiden Tumorsuppressorgenen binden und inaktivieren können. Ein alleiniger Verlust der tumorsuppri


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mierenden Wirkung von pRB könnte durch eine erhöhte p53-abhängige Apoptose kompensiert werden [ 44 , 62 , 182 ]. So ergab sich auch bei den hier untersuchten Tumoren ein signifikant positiver Zusammenhang zwischen dem immunhistologischen Nachweis des Zellzyklus-Promotors Cyclin D1, der eine Hyperphosphorylierung des pRB und damit eine Freisetzung des Transkriptionsfaktors E2F bewirkt, und sowohl einer erhöhten p53-abhängigen Apoptoserate als auch der Expression des Apoptoseförderers BAX.

Abb. 85: Das zelluläre Phosphoprotein p90MDM2 und die viralen Proteine E1A und E1B des Adenovirus, Typ 5, großes T-Antigen des SV40-Papovavirus und E6 und E7 der humanen Papilloma-Viren 16 und 18 (HPV) können das p53 und/oder das pRB binden und inaktivieren. Die Fähigkeit des pRB, die transaktivierende Funktion des E2F zu blockieren, geht dabei verloren.

Eine weitere Beschränkung des Wertes des immunhistologischen Nachweises von pRB neben der Unabhängigkeit der Ergebnisse vom Zellzyklus ist das Fehlen von charakteristischen Mutationen im Retinoblastoma-Gen, die analog zu den typischen Punktmutationen im TP53-Gen zu einer Expressionsänderung von pRB führen. Es wurden bei verschiedenen Tumorentitäten zwar Mutationen im Bereich der sogenannten pRB-Tasche gefunden, ansonsten sind aber Deletionen und Punktmutationen relativ gleichmäßig über das gegenüber dem TP53-Gen komplexere Retinoblastoma-Gen verteilt [ 44 ]. Ein Einfluß auf die immunhistologischen Ergebnisse ist hierbei nur im Falle von Deletionen im Retinoblastoma-Gen oder von Mutationen oder einer Hypermethylierung in der Promotorregion zu erwarten [ 24 , 158 ].

Insgesamt stellen Veränderungen dieses Tumorsuppressorgens bei verschiedenen Tumorentitäten frühe Ereignisse in der Kanzerogenese dar [ 16 ]. Letztlich hatte auch in dieser Untersuchung der immunhistologische Nachweis von pRB im Tumorgewebe keine prognostische Bedeutung für das Überleben oder Rezidiv-freie Überleben von Patienten mit einem manifesten Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle und des Oropharynx. Es ergaben sich lediglich positive Korrelationen zur Tumorgröße und -infiltration pT und zur Proliferationsaktivität im Tumorgewebe, wobei allerdings aus der immunhistologischen Untersuchung nicht zu ermitteln war, ob das nachgewiesene pRB in der Lage ist, den Transkriptionsfaktor E2F zu binden, oder infolge einer Hyperphosphorylierung oder einer Konformationsänderung durch Missense-Mutation im Retinoblastoma-Gen seine tumorsupprimierende Wirkung verloren hat.

Der immunhistologische Nachweis von p16INK4a im Epithel zeigte parallel zu dem des p21CIP eine Aussparung des Stratum basale, obwohl beide Proteine unterschiedlichen Familien von Inhibitoren von Cyclin-abhängigen-Kinasen angehören [ 90 , 122 , 231 , 301 , 306 ]. Die Inhibitoren der CIP-Familie (CDK interacting protein), in die p21CIP einzuordnen ist, und der INK4-Familie (polypeptid inhibitor of CDK4 and CDK 6), der p16INK4a angehört, zeigen zueinander keine strukturelle Ähnlichkeit. Die Mitglieder der INK4-Familie sind nur in der Lage die CDK4 und CDK6 zu inhibieren, während im Gegensatz dazu die CIP-Familie auch die CDK2 im Komplex mit den entsprechenden Cyclinen hemmen kann. P21CIP entfaltet seine Wirkung in vivo allerdings wie p16INK4a hauptsächlich in der G1-Phase des Zellzyklus, obwohl es durch Bindung an Cyclin, CDK und PCNA (proliferating cell nuclear antigen), eine Untereinheit der DNA-Polymerase delta, auch in der Lage wäre, die DNA-Synthese in der S-Phase zu hemmen [ 30 , 90 , 301 , 306 ].


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Im Tumorgewebe war dagegen diese zonale Gliederung der immunhistologischen Färbung für p16INK4a nicht nachvollziehbar. Auch zwischen den Ergebnissen der immunhistologischen Bestimmungen von beiden CDK-Inhibitoren war eine Korrelation nicht erkennbar. Neben einer nur tendenziellen Abhängigkeit des p16INK4a-Nachweises vom Tumor-Grading, bei der p16INK4a in höher differenzierten Tumoren gegenüber gering differenzierten Tumoren vermehrt nachweisbar war, ergab sich kein Zusammenhang mit der Tumorgröße und -infiltration, der Lymphknotenmetastasierung und dem Tumorstadium. Ebenso war ein Einfluß auf das Überleben und Rezidiv-freie Überleben der Patienten nicht feststellbar.

Die Expression von Cyclin D1 war im Mundschleimhautepithel außerhalb des invasiv wachsenden Tumorgewebes streng auf suprabasal gelegene Zellkerne beschränkt. Sowohl im Stratum basale als auch in den über dem Stratum spinosum liegenden Gewebsschichten war regelmäßig keine immunhistologische Färbung erkennbar. Auch im Tumorgewebe war diese regionale Verteilung der Cyclin D1-Expression bei nur partieller Färbung der Zellkerne innerhalb umschriebener Tumorbezirke nachvollziehbar, indem die zentral gelegenen Zellen meistens negativ waren. Eine Aussparung der Färbung in der äußeren Zellage der Tumorareale analog zum Stratum basale im Epithel war hier allerdings nicht zu finden. Die Expression des Cyclin D1 zeigt durch die topographische Begrenzung der immunhistologischen Färbungen somit eine Abhängigkeit von der Zelldifferenzierung. Die Unterschiede zwischen den Ergebnissen im Epithel und im Tumorgewebe weisen auf eine geänderte Regulation der Zelldifferenzierung im Tumorgewebe gegenüber der physiologischen Situation im Epithel hin.

Auffällig war weiterhin ein signifikant positiver Zusammenhang zwischen dem immunhistologischen Nachweis von p21CIP und Cyclin D1 im Tumorgewebe, der sich dadurch erklären läßt, daß durch das p21CIP Cyclin-CDK-Komplexe inhibiert werden [ 90 , 301 , 306 ]. Die Progression der Zellen durch den Zellzyklus wird aber durch diese Komplexe reguliert. Infolge einer Hemmung der Cyclin D1-CDK-Komplexe durch p21CIP könnte es zu einem prolongierten Verbleib der Zellen in der G1-Phase und als Gegenregulation zu einer Überexpression von Cyclin D1 mit dem Ziel kommen, doch in die nachfolgenden Phasen des Zellzyklus eintreten zu können. Der Zusammenhang zwischen einer positiven Cyclin D1-Expression im Tumorgewebe und der Ausbildung von Lymphknotenmetastasen unterstreicht die Bedeutung der Regulation des Zellzyklus und damit der Proliferation für die Progression der Tumorerkrankung. Ein signifikanter Einfluß des Cyclin D1-Nachweises auf das Überleben und Rezidiv-freie Überleben war dabei allerdings nicht feststellbar.

5.2.3 Proliferation und Apoptose

Abb. 86: Regulation der Zellzahl durch Proliferation, Differenzierung und Apoptose.

Proliferation und Apoptose beeinflussen die Zellzahl in einem Gewebsverband in entgegengesetzter Richtung ( Abb. 86 ) [ 130 , 215 ]. Die endgültige Zellzahl hängt neben Differenzierungsvorgängen letztlich vom Gleichgewicht zwischen Proliferation und Apoptose oder aber von einer Störung desselben ab [ 66 ]. Die Homöostase kann nur dann aufrecht erhalten werden, wenn die durch äußere und innere Faktoren regulierten Signalwege genau aufeinander abgestimmt sind. In diesem Patientenkollektiv war die große Bedeutung der Proliferation für die Progression der Tumorerkrankung dadurch erkennbar, daß die durch den immunhistologischen Nachweis von Ki-67 bestimmte Proliferationsaktivität sowohl einen signifikant positiven Einfluß auf die Tumor


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größe und -infiltration pT als auch auf die Lymphknotenmetastasierung pN und damit auch auf das Tumorstadium hatte. Es war zwar kein statistisch signifikanter Einfluß auf das Überleben und Rezidiv-freie Überleben der Patienten nachweisbar, Patienten mit einer geringen Proliferationsaktivität im Tumorgewebe hatten aber eine tendenziell bessere Überlebenszeit und Rezidiv-freie Überlebenszeit als die übrigen Patienten. Patienten mit einer besonders hohen Proliferationsaktivität zeigten umgekehrt einen tendenziell ungünstigeren Verlauf [ 300 ].

Bei der Bestimmung des Ki-67-Indexes fiel aber nicht nur eine starke intertumorale sondern auch eine erhebliche intratumorale Streuung der Ergebnisse auf. Tumoren haben in der Regel einen klonalen Ursprung, das heißt sie entstehen aus einer einzelnen normalen Zelle [ 194 ]. Die Entwicklung eines Tumors vollzieht sich nachfolgend in diskreten Schritten ( Abb. 8 ). Durch Aktivierung von Onkogenen oder Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen, die in diesen Signalwegen liegen, kann die Balance zwischen den verschiedenen Regulationsmechanismen nachhaltig gestört werden. In dieser Situation ist nicht selten ein Überwiegen der Apoptose die Folge. Die Chance, daß durch Mutationen von Onkogenen und Tumorsuppressorgenen ein neues Gleichgewicht geschaffen wird, in welchem die Proliferation dominiert, ist relativ gering. Dies ist möglicherweise einer der Gründe dafür, daß die maligne Transformation von einer von etwa 1017 Zellen des menschlichen Organismus nur einmal in der Lebenszeit von drei Menschen eintritt [ 62 ]. Im Rahmen der malignen Transformation erhält eine einzelne Zelle durch ein initiales Ereignis einen Wachstumsvorteil gegenüber den benachbarten Zellen ( Abb. 87 ) [ 194 ]. Dies führt dazu, daß die Einzelzelle zu einem Klon identischer Zellen expandieren kann. Nachfolgend kann eine Zelle dieses Klons von einem weiteren Ereignis getroffen werden, aus dem sich wiederum ein Wachstumsvorteil ergibt. Diese Sequenz wiederholt sich so lange, bis eine Zelle schließlich zu einem Tumor auswächst, der den Kontrollmechanismen des Wirts weitgehend entzogen ist. Der Tumor bricht in benachbartes Gewebe ein (Invasion) und siedelt schließlich Tochtergeschwülste in entfernt liegendem Gewebe ab (Metastasierung). Obwohl letztlich ein Zellklon den größten Wachstumsvorteil mit der Folge einer Verdrängung anderer Klone erlangen dürfte, ist zumindest temporär die Koexistenz verschiedener Klone denkbar. Die Differenzen beim Ki-67-Nachweis und der übrigen hier bestimmten Parameter innerhalb der einzelnen Tumoren, insbesondere aber auch der hohe Anteil von dysplastischem Epithel außerhalb des infiltrierend wachsenden Tumorgewebes, der auf den vorhandenen Schnitten miterfaßt wurde, stützen allerdings die Annahme einer multifokalen Kanzerogenese oder Feldkanzerisierung bei der Entstehung von Plattenepithelkarzinomen der Mundhöhle und des Oropharynx [ 39 , 188 ]. Unterschiede in der Proliferationsaktivität von Tumoren sind dabei aber sicherlich nicht nur von inneren Ursachen, sondern auch von äußeren Bedingungen, wie zum Beispiel einer genügenden Substratzufuhr abhängig.

Abb. 87: Modell der malignen Evolution maligner Tumoren: Aus einer normalen Zelle (N) entsteht ein Zellklon mit einem Wachstumsvorteil (K1). Durch weitere Ereignisse entstehen weitere Klone (K2-5) mit weiteren Wachstumsvorteilen. Nicht alle Klone sind überlebensfähig, einige werden durch Kontrollmechanismen des Wirts eleminiert.


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Ein direkter Zusammenhang zwischen Proliferation und Apoptose war generell in den Tumoren nicht nachweisbar. Aber große und die Nachbarstrukturen infiltrierende Karzinome zeigten neben einer verstärkten Proliferation auch eine erhöhte Apoptoserate. Zur Bestimmung des Apoptose-Index wurde eine Enzym-verbundene Nachweismethode von DNA-Fragmenten mit terminaler Transferase verwendet, die schon in früheren Untersuchungen eingesetzt worden war [ 3 , 5 , 72 , 134 , 253 , 300 ]. Die Apoptoserate war verglichen mit anderen Tumorentitäten eher gering [ 5 ], aber vergleichbar mit früheren Untersuchungen bei oralen Plattenepithelkarzinomen [ 22 , 134 , 300 ]. Zusätzlich wurden hier allerdings auch morphologische Aspekte berücksichtigt, um falsch positive Ergebnisse auszuschließen [ 111 , 131 ]. Beim Vergleich der so gewonnenen Apoptose-Indices mit den immunhistologisch bestimmten Ki-67-Indices fällt eine größenordnungsmäßige Diskrepanz auf. Dabei ist zu berücksichtigen, daß bereits ein Apoptose-Index von 2-3% einem Gewebsverlust von 25% pro Tag entsprechen kann [ 131 ]. Dagegen bedeutet die Expression von Ki-67 lediglich, daß sich die Zellen nicht in der G0- oder GT-Phase, sondern in der G1-, S- oder G2-Phase des Zellzyklus befinden, der sich über einen sehr langen Zeitraum erstrecken kann, bevor die Zellen in die eigentliche Zellteilung (Mitose) eintreten [ 44 ].

Die Regulation der Apoptose ist komplex und wird von verschiedenen positiven und negativen Signalen bestimmt [ 252 ]. In Zellen, die einen subletalen Schaden innerhalb ihres Genoms tragen, ist der Eintritt in die Apoptose zunächst von der Funktion des Tumorsuppressors p53 abhängig [ 44 , 143 ]. Im untersuchten Tumorkollektiv war p53 in etwa der Hälfte der Fälle im Tumorgewebe immunhistologisch nachweisbar. Diese positive Expression war mit einer geringen oder nicht nachweisbaren Apoptoserate verknüpft. Wenn man davon ausgeht, daß in diesen Fällen das p53 vorwiegend infolge einer Stabilisierung des Phosphoproteins wahrscheinlich durch eine Missense-Mutation im TP53-Gen in den Zellkernen akkumulierte, folgt daraus, daß die Funktion von p53, die Apoptose zu induzieren, in etwa dieser Hälfte der untersuchten Tumoren verlorengegangen ist [ 134 ]. Zusätzlich gestützt wird diese Annahme durch die nachgewiesene negative Korrelation zwischen den immunhistologischen Bestimmungsergebnissen von p53 und dem davon induzierten Apoptoseförderer BAX [ 180 ]. Auch hier ist nämlich ein positiver p53-Nachweis im Tumorgewebe mit einem Funktionsausfall, und zwar dem Verlust der Fähigkeit, die Expression von BAX zu induzieren, verknüpft. Diese Verbindung war bei einer Analyse der Interaktionen zwischen p53 und p21CIP im Tumorgewebe nicht nachweisbar, wobei allerdings zu berücksichtigen ist, daß an der Regulation der p21CIP-Expression noch zahlreiche andere Faktoren als p53 beteiligt sind [ 44 , 175 ].

BAX erwies sich auch in dieser Untersuchung als potenter Förderer der Apoptose [ 300 ]. Umgekehrt war bei einem positiven immunhistologischen BCL-2-Nachweis eine signifikante Hemmung der Apoptose nachweisbar. Zusätzlich bestand eine reziproke Korrelation zwischen diesen beiden antagonistisch wirkenden Regulatoren der Apoptose [ 1 , 119 , 200 ]. BCL-2 ist als Onkogen bekannt, das Zellen vor einer p53-induzierten Apoptose bewahren kann und in vielen Tumorentitäten verstärkt nachgewiesen werden konnte [ 5 , 35 , 53 , 142 , 147 , 207 , 209 ]. Der Mechanismus der Hochregulation in Tumoren ohne die 14;18-Translokation des BCL-2-Gens ist noch weitgehend unbekannt [ 206 ]. Es könnte eine Störung der posttranslatorischen Regulation von BCL-2 bei Plattenepithelkarzinomen geben [ 1 ]. BCL-2 war nicht nur hauptsächlich in den äußeren, weniger ausgereiften Zellen der Plattenepithelkarzinome nachweisbar, sondern auch vermehrt in weniger gut differenzierten Tumoren [ 56 , 243 ]. Diese Prädilektion des positiven BCL-2-Nachweises für geringer ausdifferenzierte Zellen ist bekannt und entspricht offensichtlich der natürlichen Funktion des BCL-2, Keimgewebe vor dem Untergang durch Apoptose zu bewahren [ 35 , 98 ]. Im Gegensatz zum konventionellen Tumor-Staging und -Grading erwies sich aber keiner der hier zusätzlich bestimmten Parameter als geeignet, das Überleben oder Rezidiv-freie Überleben der Patienten mit einem invasiv wachsenden Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle und des Oropharynx vorherzusagen, wenn sich auch eine vermehrte BAX-Expression im Tumorgewebe tendenziell als negativer Prognosefaktor herausstellte [ 300 ].


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5.3 Adhäsionsmoleküle

5.3.1 E-Cadherin

Die große Bedeutung von E-Cadherin als Adhäsionsmolekül, das interzelluläre Bindungen vermittelt, ist durch zahlreiche Beobachtungen aufgedeckt worden [ 118 ]: Zellen, die kein E-Cadherin exprimieren, zeigen keine Aggregation oder Adhäsion untereinander; umgekehrt führt eine Expression von E-Cadherin auf den Zellmembranen zur Fähigkeit der interzellulären Adhäsion [ 23 ]. E-Cadherin ist physiologischerweise vor allem auf den Zellmembranen zu finden und hier hauptsächlich im Bereich von interzellulären Bindungsstellen [ 86 ]. Bei Zellen, die E-Cadherin exprimieren, kann die Fähigkeit zur Aggregation durch monoklonale Antikörper gegen E-Cadherin neutralisiert werden [ 112 ]. Auch eine Deletion der E-Cadherin-kodierenden Gene oder hier lokalisierte Mutationen führen zu diesem Ergebnis [ 86 ]. Eine Ca++-freie Umgebung bewirkt eine Dissoziation der Zellen. Und letztlich können E-Cadherin-negative Zellen durch Transfektion mit E-Cadherin-cDNA ihre Fähigkeit zur Aggregation wiedererlangen [ 94 ].

Im gesamten auf den untersuchten Tumorpräparaten miterfaßten Epithel zeigte sich mit Ausnahme des Stratum basale eine kräftige membranöse Färbung beim immunhistologischen Nachweis von E-Cadherin. Während in den Keimzellen des Epithels somit kein E-Cadherin nachweisbar war, exprimierten die ausgereifteren Zellen der höheren Schichten dieses regelmäßig. Im Tumorgewebe war dagegen diese Färbung keineswegs immer auf die Zellmembranen begrenzt, sondern teilweise auch im Zytoplasma zu finden. Dabei überwog in einigen Fällen sogar die zytoplasmatische Färbungsintensität die membranöse. Daneben gab es einen Anteil an Tumoren ohne erkennbare Färbung beim immunhistologischen Nachweis von E-Cadherin; die Patienten, die an diesen Tumoren erkrankt waren, zeigten tendenziell ein schlechteres Überleben und Rezidiv-freies Überleben als die übrigen Patienten. Ansonsten hatte bei positiver Färbung das Färbungsmuster keine prognostische Bedeutung.

Eine Fehlfunktion im Bereich der E-Cadherin-vermittelten interzellulären Bindungen kann im Tumorgewebe durch verschiedene Pathomechanismen verursacht werden: Eine Herunterregulation der E-Cadherin-Expression kann durch Hypermethylierung der Promotorregion (5‘CpG-Insel) des E-Cadherin-Gens erfolgen [ 78 ]. In Tumoren wird häufig eine Heterogenität der verminderten Expression des E-Cadherin beschrieben. Hierfür kann zum einen eine echte zelluläre Heterogenität verantwortlich sein, zum anderen auch eine instabile E-Cadherin-Expression der Tumorzellen, die zum Teil auch von Milieubedingungen abhängen kann [ 93 , 165 ]. Überdies kann ein vermehrter proteolytischer Abbau des E-Cadherin-Moleküls zu einer verminderten Expression in Tumorzellen führen [ 126 ]. Bei den beschriebenen genetischen Aberrationen handelt es sich entweder um Allelverluste (loss of heterozygosity) [ 166 ] und/oder um echte Genmutationen wie Punktmutationen, die in diffusen Magenkarzinomen [ 12 , 13 , 14 ] und invasiv-lobulären Mammakarzinomen nachgewiesen werden konnten [ 18 , 123 ]. Durch Vermittlung von alpha-Catenin und beta-Catenin koppeln die E-Cadherin-Moleküle an das Zytoskelett [ 118 ]. Das alpha-Catenin zeigt eine signifikante Homologie zu Vinculin, das in den Zonulae adhaerentes und im Bereich von fokalen Zellkontakten lokalisiert ist [ 184 , 277 ]. Das beta-Catenin zeigt Homologien zu Plakoglobin (gamma-Catenin), einem wichtigen Bestandteil der Desmosomen und Zonulae adhaerentes [ 262 ]. In Tumoren kann die Störung der Cadherin-vermittelten Zelladhäsion auch durch eine reduzierte alpha- und beta-Catenin-Expression bedingt sein, was möglicherweise die Invasivität und metastatische Potenz der Tumorzellen beeinflußt [ 120 , 167 , 261 , 262 ]. Überdies können biochemische Modifikationen wie eine Tyrosin-Phosphorylierung von beta-Catenin die Funktion des Cadherin-vermittelten Zelladhäsionssystems modulieren oder supprimieren. Dabei kann die Tyrosin-Phosphorylierung durch Onkogene, wie das v-SRC (Onkogen des Rous-Sarkom-Virus) und v-FOS (Onkogen des murinen FBJ-Osteosarkom-Virus), sowie durch Wachstumsfaktoren, wie EGF (epidermal growth factor) und HGF (hepatocyte growth factor), vermittelt werden [ 95 , 241 ]. Mutationen der alpha- und beta-Catenin-Gene wurden jedoch bisher nur in Karzinomzellinien beobachtet, aber nicht in vivo [ 34 ]. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß das Produkt des Gens der adenomatösen Polyposis coli (APC) Bindungen mit alpha- und beta-Catenin eingeht [ 220 , 259 ]. E-Cadherin und APC kompetieren direkt um Bindungen mit dem beta-Catenin [ 110 ]. Die N-terminale Domäne des beta-Catenins vermittelt dabei die Ankoppelung der E-Cadherin-beta-Catenin- und APC-beta-Catenin-Komplexe an das Zytoskelett über eine Bindung an das alpha-Catenin. Plakoglobin, das ja strukturell mit dem beta-Catenin verwandt ist, vermittelt ähnliche Interaktionen. Bei Krebspatienten wurde eine deutlich erhöhte Urinausscheidung von löslichem E-Cadherin gefunden, was auf eine vermehrte Ablösung des Moleküls von der Zelloberfläche zurückgeführt wurde [ 126 , 127 ]. Alterierte immunhistologische Verteilungsmuster mit zytoplasmatischer Anfärbung werden mit


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einer abnormalen (Um-)Verteilung von Cadherin- und/oder Catenin-Molekülen in Verbindung gebracht [ 115 ]. Auch physiologischerweise existiert ein intrazellulärer Pool von freiem E-Cadherin und E-Caherin-Catenin-Komplexen. Zwischen membranständigem E-Cadherin und diesem Pool ist ein ständiger Austausch möglich [ 118 ].

Von diesen möglichen Mechanismen, die zu einer Änderung der Funktionsfähigkeit von E-Cadherin in Tumorzellen führen können, scheint der komplette Verlust der Expression von E-Cadherin im untersuchten Tumorkollektiv die größte Bedeutung zu haben, da er zumindest tendenziell einen Einfluß auf die Prognose der Patienten ausübt. Mutationen im E-Cadherin, die zu einem Funktionsverlust, aber nicht zu einer fehlenden Expression führen, lassen sich ebenso wie Fälle, in denen es zu Fehlfunktionen im Bereich der Catenine kommt, mit Hilfe dieser immunhistologischen Untersuchungen nicht abgrenzen. Lediglich eine Umverteilung der Expression zwischen Zellmembran und Zytoplasma war zu beobachten, die aber prognostisch nicht relevant war.

5.3.2 CD44

Durch die Ergebnisse zahlreicher Studien konnte nachgewiesen werden, daß die CD44-Expression und insbesondere die Expression von bestimmten varianten CD44-Isoformen einen Einfluß auf die Prognose und Metastasierungspotenz verschiedener Tumorentitäten ausübt. Dabei sind die Resultate dieser Studien zum Teil widersprüchlich. Grundsätzlich lassen sich drei Gruppen von Tumoren unterscheiden: Die erste Gruppe umfaßt Tumoren, bei denen die Expression bestimmter Isoformen überwiegend mit einer ungünstigeren Prognose korreliert, wie das Magenkarzinom [ 170 , 258 , 286 ], Kolorektalkarzinom [ 302 ], Mammakarzinom [ 47 , 128 ], Plattenepithelkarzinome der Cervix uteri [ 121 ] und Vulva [ 266 ] und maligne Lymphome [ 58 , 250 ]. Meistens ist hier die Neuexpression von Isoformen für die Prognoseverschlechterung entscheidend, die das variante Exon V6 enthalten. In der zweiten Gruppe sind Tumoren enthalten, bei denen die CD44-Expression keine erkennbare Bedeutung für den Krankheitsverlauf hat, wie das Ovarialkarzinom [ 244 ] und Bronchialkarzinom [ 75 ], oder die Daten widersprüchlich oder noch unzureichend sind, wie das Nierenzellkarzinom [ 269 ] und das maligne Melanom [ 21 , 135 ]. In der dritten Gruppe können Tumorentitäten zusammengefaßt werden, bei denen die Expression von CD44s oder bestimmter Isoformen meistens mit einer günstigeren Prognose korreliert, wie das Neuroblastom [ 41 , 267 ] und Plattenepithelkarzinome der Haut [ 229 ]. Bei laryngealen Plattenepithelkarzinomen im Tumorstadium IV [ 245 ] war eine Verminderung der CD44v6-Expression im Tumorgewebe mit einem kürzeren Überleben der Patienten korreliert [ 247 ]. In weiteren Untersuchungen war die CD44v6-Expression bei Plattenepithelkarzinomen der Mundhöhle in den Lymphknotenmetastasen im Vergleich zu den zugehörigen Primärtumoren vermindert [ 141 ] und in geringer differenzierten Tumoren gegenüber höher differenzierten Tumoren ebenfalls reduziert [ 246 ].

Über die molekularen Mechanismen, mit denen sich Tumorzellen durch Änderung der Expression von bestimmten CD44-Spleißvarianten einen Wachstumsvorteil oder die Fähigkeit zur Metastasierung verschaffen, wird zur Zeit noch spekuliert. Klar gezeigt werden konnte, daß die Metastasierung bestimmter Tumorzelltypen durch monoklonale Antikörper gegen CD44-Varianten supprimiert werden kann [ 228 ]. In vitro inhibieren Antikörper gegen CD44 überdies direkt die Endothelproliferation und -migration sowie auch den stimulierenden Effekt von Hyaluronsäure-Polysacchariden auf die Endothelproliferation und -migration [ 273 ]. Adhäsionsmoleküle wie das CD44 können sowohl positive als auch negative Einflüsse auf die Progression von malignen Tumoren ausüben [ 86 , 102 , 305 ]. Einerseits, wie im Falle des E-Cadherins, verhindern sie die Ablösung von potentiell metastasierenden Tumorzellen aus dem Zellverband des Primärtumors, indem sie den Zell-Zell-Kontakt erhalten. Andererseits ermöglichen sie die Bindung von extra- oder intravasalen, aus dem Zellverband des Primärtumors herausgelösten Zellen an Endothelien und fördern damit die hämatogene und lymphogene Metastasierung ( Abb. 9 ) [ 102 ]. Zusätzlich sind Adhäsionsmoleküle in die Bildung von homophilen und heterophilen Zellaggregaten involviert, die zu einer Metastasierung durch passive Embolisation von Kapillaren in entfernten Organen beitragen können. Durch Aggregatbildung ist außerdem die Chance, der immunologischen Überwachung des Wirtsorganismus zu entgehen, größer. Letztlich beeinflussen Adhäsionsmoleküle auch eine aktive Bindung von metastasierenden Zellen an Strukturen der Zielorgane. Damit sind Änderungen in der Expression und Funktion von Zelladhäsionsmolekülen zwar nicht allein zur malignen Transformation von Zellen ausreichend, für den Prozeß der Tumorprogression allerdings essentiell [ 186 ].


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Erst die Kenntnis der CD44-Isoformen, die physiologischerweise auf bestimmten Zellen in verschiedenen Differenzierungs- und Aktivierungsphasen exprimiert werden, vermag einen Einblick in die verschiedenen Funktionen des CD44 zu vermitteln. Daher ist insbesondere der Vergleich von CD44-Isoformen, die auf Tumorzellen exprimiert werden, mit denen, die physiologischerweise auf dem nicht transformierten Gewebe exprimiert werden, aus dem sich der jeweilige Tumor entwickelt hat, für diagnostische und prognostische Zwecke entscheidend [ 229 ]. Durch monoklonale Antikörper, die spezifisch für Proteinabschnitte sind, die von einzelnen varianten Exons kodiert werden, konnten Isoformen identifiziert werden, die physiologischerweise im Epithelgewebe exprimiert werden. Diese schließen neben der Standardform CD44s die sogenannte epitheliale Form CD44v8-v10 und die Keratinozytenform CD44v3-v10 ein [ 310 ]. Auch im Epithel der Mundhöhle und des Oropharynx waren in dieser Studie die Produkte der varianten Exons V4, V5, V6, V7 und V9 in allen Fällen nachweisbar. Die membranöse Färbung war dabei in allen Zellagen des Epithels mit Ausnahme der obersten Schicht erkennbar [ 26 , 96 , 108 , 140 , 199 ]. Die verschiedenen exprimierten CD44-Isoformen könnten somit im normalen Plattenepithel wichtig für die Adhäsion der Zellen untereinander, aber auch zur extrazellulären Matrix sein [ 108 , 176 ]. Darum ist wahrscheinlich eher die Herunterregulation oder sogar der Verlust der Expression von diesen Isoformen als pathologische Veränderung auf Tumorzellen in Plattenepithelkarzinomen anzusehen, die von diesem Gewebe ausgehen [ 96 , 221 , 229 ].

In etwa 60% der Fälle waren in dieser Studie alle untersuchten CD44-Spleiß-Varianten neben dem Epithel der Mundschleimhaut und des Oropharynx auch in den Plattenepithelkarzinomen nachweisbar, womit also keine Änderung des Expressionsverhaltens im Verlauf der Kanzerogenese feststellbar war. In etwa 40% der Fälle war allerdings die Expression von mindestens einer untersuchten Isoform vermindert. Eine verminderte Expression der varianten Exons V4, V5 und V6 wurde nur in einzelnen Fällen gefunden, so daß bei alleiniger Betrachtung eine signifikante Korrelation zu anderen hier berücksichtigten Parametern nicht zu erwarten war. Der immunhistologische Nachweis von CD44v7 und CD44v9 ergab dagegen wesentlich häufiger veränderte Resultate. Für beide Isoformen konnte ein signifikant negativer Einfluß der Expressionsminderung auf das Überleben und Rezidiv-freie Überleben der Patienten nach Kaplan und Meier nachgewiesen werden. Insbesondere aber die gemeinsame Auswertung der Expression aller hier untersuchten CD44-Isoformen auf die Prognose ergab nicht nur in der univariaten, sondern auch in der multivariaten Analyse mit Hilfe des Cox-Modells einen signifikant negativen Einfluß auf die Überlebenszeit und Rezidiv-freie Überlebenszeit der betroffenen Patienten, wenn eine der untersuchten Isoformen im Tumorgewebe im Vergleich zum Epithel vermindert exprimiert wurde [ 255 ]. Dagegen ist bei anderen Tumoren die verstärkte oder neu erworbene Expression verschiedener varianter CD44-Formen als pathognomonisch anzusehen [ 96 , 109 ]. Gerade auch im Falle des CD44 ist also jede Tumorentität separat zu untersuchen und zu bewerten.

Allerdings zeigte auch in Mammakarzinomen [ 67 ] und Nierenzellkarzinomen [ 269 ] eine Änderung des Expressionsverhaltens des Produkts des varianten Exons V9 einen Einfluß auf den Differenzierungsgrad der Tumoren. In dieser Untersuchung waren die einzelnen Tumoren, bei denen die Expression der Exons V4, V5 und V6 vermindert war, ausnahmslos gering differenziert. Eine statistische Signifikanz ergab sich bei der geringen Fallzahl allerdings nicht. Dagegen resultierte zwischen der Expression des varianten Exons V9 und dem Tumor-Grading eine statistisch signifikante Korrelation: Die Expression war in geringer differenzierten Tumoren signifikant häufiger vermindert als in höher differenzierten Tumoren ( Abb. 68 ). Das CD44v7 zeigte dagegen keinen Einfluß auf das Tumor-Grading.

Zwischen Primärtumoren und zugehörigen Lymphknotenmetastasen ergaben sich in dieser Untersuchung nur in wenigen Fällen Unterschiede im Expressionsverhalten verschiedener CD44-Isoformen. Ein eindeutiger Trend in der Änderung des Expressionsverhaltens während des Metastasierungsprozesses war ebenfalls nicht erkennbar. Dieses Ergebnis und die fehlende Korrelation zwischen dem Ausmaß der Lymphknotenmetastasierung der primären Plattenepithelkarzinome der Mundhöhle und des Oropharynx pN und der Expressionsminderung der verschiedenen CD44-Isoformen lassen einen vermuteten Einfluß der CD44-Expression auf die Metastasierungsneigung dieser Tumoren vermissen. Auch hier ergeben sich somit Differenzen [ 121 , 135 , 258 , 302 ], aber auch Übereinstimmungen zu anderen Tumorentitäten [ 75 ]. Insbesondere ist wohl zwischen Tumoren zu unterscheiden, die bevorzugt hämatogen, und denen, die bevorzugt lymphogen metastasieren, da beiden Metastasierungsformen teilweise verschiedene Mechanismen zugrunde liegen [ 55 , 289 ]. So spielen physikalische Kräfte in Lymphgefäßen keine wesentliche Rolle. Eine passive Metastasierung durch Embolisation von Kapillaren kommt


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nur bei hämatogener Metastasierung vor. Im Verlauf dieser beiden Metastasierungsvorgänge könnte folglich unterschiedlichen Faktoren eine entscheidende Bedeutung zukommen. In dieser Untersuchung stand der Vorgang der lymphogenen Metastasierung im Vordergrund; denn zum einen bilden Plattenepithelkarzinome der Mundhöhle und des Oropharynx hämatogene Fernmetastasen erst sehr spät im Verlauf der Tumorprogression aus, zum anderen wurden in dieser Studie nur Patienten mit Tumoren ohne Fernmetastasen (M0) untersucht, da in der Regel nur bei diesen eine kurativ intendierte chirurgische Therapie erfolgversprechend ist.

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Tue Apr 3 17:33:46 2001