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1  Einleitung

1.1 Problemstellung

Die Grenzfläche der gastrointestinalen Mukosa stellt mit 200-400m2 die größte Oberfläche dar, mit der der menschliche Organismus mit seiner Außenwelt in Kontakt steht [1]. Über diese Oberfläche muss sich der Mensch täglich nicht nur mit den Fremdstoffen der Nahrung auseinandersetzen, die aufzuspalten und zu prozessieren sind, sondern auch mit den 1014 Bakterien des Dünn- und Dickdarmes, gegen die er eine Toleranz bewahren soll [2, 3, 4, 5]. Für diese diffizilen Aufgaben verfügt die Mukosa des Gastrointestinaltraktes über effektive Mechanismen, die den Wirt vor dem Eindringen dieser potentiellen Noxen schützen. Die wichtigsten Bestandteile dieser Barriere umfassen einen protektiven Schleimfilm aus muziniösen Glykoproteinen, Phospholipiden und Lipidmediatoren, eine Epithelzellschicht und die darunter liegende Lamina propria [6]. Der Erhaltung und der Wiederherstellung der intestinalen Barriere nach Gewebeschädigung, wie z.B. bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen, kommt eine zentrale Rolle in der Pathogenese vieler gastrointestinaler und systemischer Erkrankungen zu [7, 8].

Das Ziel der vorliegenden Arbeiten war es:

1.2 Aufbau und Funktion der intestinalen Barriere

1.2.1 Die mukosale Epithelzellschicht

Das Mukosaepithel ist eine hochselektive Barriere, die die Passage potentiell toxischer Stoffen, wie z.B. von der intestinalen Mikroflora produzierte Endotoxine, in den Wirt verhindert, aber die Aufnahme von Nährstoffen aus dem intestinalen Lumen in die Zirkulation erlaubt. Das Mukosaepithel ist durch einen hohen Zellumsatz mit nahezu kompletten Austausch der intestinalen Epithelzellpopulation innerhalb von 24 bis 96 Stunden gekennzeichnet [9]. Das proliferative Epithelzellkompartiment ist innerhalb der intestinalen Krypten lokalisiert und räumlich von einem funktionellen Epithelzellkompartiment getrennt, [Seite 9↓]das zum Teil aus hochdifferenzierten Epithelzellen im Bereich der intestinalen Villi besteht. Epithelzellen des funktionellen Epithelzellkompartiments migrieren in Richtung Villusspitze und durchlaufen dabei eine zunehmende Differenzierung und Spezialisierung.

Unter physiologischen Bedingungen entsteht ein ausgewogenes Gleichgewicht zwischen der Neubildung von intestinalen Epithelzellen durch Proliferation und dem Verlust von Zellen durch natürlichen Zellentod, Apoptose sowie mechanische Abschilferung. Das intestinale Epithel ist durch eine hohe Regenerationsfähigkeit gekennzeichnet, die eine rasche Wiederherstellung der Integrität des Oberflächenepithels auch nach ausgedehnten Verletzungen ermöglicht. Die gastrointestinale epitheliale Wundheilung kann dabei vereinfacht in drei Phasen eingeteilt werden [9]:

1.2.2 Das intestinale Immunsystem

Unterhalb der mukosalen Epithelzellbarriere existiert eine komplexe immunologische Barriere, die sich aus dem angeborenen, antigen-unspezifischen Abwehrsystem (innate immunity) und dem erworbenen, antigen-spezifischen Immunsystem (adaptive immunity) zusammensetzt. Das Immunsystem kann mit hoher Selektivität zwischen Pathogenen und der apathogenen, residenten Standortflora unterscheiden, wobei pathogene Keime nach spezifischen Antikörperreaktionen rasch eliminiert werden und eine systemische Immunreaktion auf Nahrungsmittelantigene und Antigene der physiologischen Darmflora unterdrückt wird [11].


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Das antigen-unspezifische Abwehrsystem kann vereinfacht in vier Systeme unterteilt werden: die physiologische Barriere (Temperaturunterschiede, variierende pH -Werte und chemische Mediatoren wie Lysozyme, Komplementfaktoren oder Defensine), die anatomische Barriere (Haut, Mukosa), die phagozytotische und endozytotische Barriere (Phagozytose und Internalisierung von Antigenen) und die entzündliche Barriere (z.B. Chemotaxis, Freisetzung von Akutphase-Proteinen, Vasodilatation) [12]. Im Gegensatz zur unspezifischen Abwehr ist die erworbene Abwehr antigen-spezifisch, verfügt über ein immunologisches Gedächtnis und kann zwischen Fremd und Selbst-Antigenen unterscheiden. Die zellulären Bestandteile des antigen-spezifischen Immunsystems sind antigenpräsentierende Zellen wie dentritische Zellen oder Makrophagen, B- und T-Lymphozyten [11], [13].

Der wesentlichste Ort der intestinalen Immunantwort ist die Lamina propria, in die gereifte B- und T-Zellen nach Induktion durch ein Antigen in den Peyer’schen Plaques wandern [14]. Die Lamina propria besteht aus einer großen heterogenen Anzahl von lymphoiden und myeloiden Zellen, neben Lymphozyten lassen sich hier Makrophagen, dendritische Zellen, neutrophile Granulozyten und Mastzellen finden. Bei einer intestinalen Immunreaktion wird das Antigen durch antigenpräsentierende Zellen aufgenommen und das opsonierte Peptid den T-Zellen präsentiert. Durch die antigen-vermittelte Stimulierung der T-Zelle kommt es zu einer Aktivierung, Expansion und Differenzierung spezifischer T-Zellpopulationen. Diese können in Gedächtnis- und Effektorzellen unterteilt werden, führen zu einer Elimination des Antigens und besitzen somit eine zentrale Rolle in der mukosalen Immunabwehr des Wirtes. Aus der Vielzahl von Faktoren, die die intestinale Immunantwort modulieren können, spielen daher die T-Zellen der Lamina propria (LPT) eine wesentliche Rolle in der Modulation der intestinalen Entzündungsreaktion.

1.3 Phänotypische und funktionelle Charakterisierung von Lamina propria T-Zellen

Lamina propria T-Zellen (LPT) bilden das größte immunologische Organ des Menschen [15]. Um ihrer spezialisierten Rolle in der mukosalen Immunabwehr gerecht zu werden, unterschieden sich LPT bezüglich ihres Phänotypes und Funktion wesentlich von peripheren, zirkulierenden T-Zellen (PBT) [16, 17, 18]. Viele der distinkten Eigenschaften von LPT sind wahrscheinlich Folge ihrer [Seite 11↓]vorherigen Aktivierung durch Antigene und Mitogene, welche ihnen im GI-Trakt präsentiert wurden. Über 95% der LPT und intraepithelialen Lymphozyten sind Gedächtniszellen und exprimieren den CD45RO Rezeptor [18]. Sie sind adaptiert an ihre neuen Aufgabe durch die Exposition verschiedener Oberflächenantigene, die in der nativen T-Zelle nicht oder zu einem geringeren Niveau exprimiert werden. Das Migrieren der aktivierten T-Zelle in die Lamina propria wird ermöglicht durch die Aktivierung von Adhäsionsmolekülen, wie z.B. Selektine oder Integrine [19, 20, 21, 22]. Im Vergleich zu PBT exprimieren LPT mehr Moleküle, die in der Zelladhäsion und Zellinteraktion involviert sind, wie z.B. CD2, LFA1, LFA3, CD29 oder CD44 [23].

Die Aktivierung von T-Zellen führt zu einer raschen Expression des IL-2-Rezeptors auf der Zelloberfläche und die autokrine und parakrine Interaktion von IL-2 mit seinem Rezeptor führt zur Proliferation und Differenzierung der T-Zellen [24, 25]. LPT sind in unmittelbarer physikalischen Nachbarschaft mit einer großen Anzahl von Antigenen und Mitogenen und befinden sich daher in einem ständigen Status der Zellaktivierung [18]. Im scheinbaren Gegensatz zu dem erhöhten Aktivierungsstatus von LPT ist die Proliferation dieser Zellen nach Antigenstimulation jedoch signifikant geringer als die von PBT [26, 27]. Kausal hierfür ist, dass LPT, verglichen mit PBT, nach Triggerung ihres TCR/CD3-Komplexes signifikant geringer in den Zellzyklus eintreten und expandieren [16]. Im Gegensatz hierzu proliferieren LPT nach Aktivierung des ko-stimulatorischen CD2-Rezeptors signifikant stärker als PBT [28], was LPT vor einer unkontrollierten Aktivierung durch die Vielzahl der luminalen Antigene des GI-Traktes schützt und Grundlage der sogenannten intestinalen Toleranz ist.

1.4 Orale Toleranz

Die physiologische Antwort des Immunsystems gegenüber Nahrungsmittelantigenen und der kommensalen Darmflora ist das Fehlen einer spezifischen Immunantwort, welches als orale Toleranz bezeichnet wird [29, 30]. Im Gegensatz hierzu kommt es bei der Präsentation von Pathogenen oder im Stadium der intestinalen Entzündung zu einer potenten mukosalen Immunantwort, die impliziert, dass das mukosale Immunsystem zwischen potentiell gefährlichen und harmlosen Antigenen unterscheiden kann. Die orale Toleranz ist bei intestinalen Immunerkrankungen, wie z.B. chronisch entzündlichen Darmerkrankungen oder der einheimischen Sprue gestört, wo es als Folge des [Seite 12↓]Verlustes der oralen Toleranz zu einer überschiessenden Immunantwort gegen Bestandteile der kommensalen Darmflora oder Gluten kommt [31, 32, 33].

Die physiologische Toleranz des intestinalen Immunsystems gegenüber den Antigenen der Nahrung und Darmflora wird durch vielfältige Mechanismen reguliert; die wichtigsten sind die klonale Deletion von antigenspezifischen T-Zellen, die Anergie durch das Fehlen ko-stimulatorischer Moleküle und die Präsenz von regulatorischen T-Zellen, wie z.B. Tr1- oder CD4+CD25+ Zellen [2], [4], [5], [14].

1.5 Störungen der intestinalen Barriere am Beispiel von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen

Die intestinale Barriere wird durch verschiedene Faktoren, wie z.B. Nahrungsbestandteile, die residente und pathogene Flora, regulatorische Peptide und verschiedene Nichtpeptidfaktoren, wie z.B. Phospholipide, Spurenelemnte oder Adeninnukleotide moduliert. Aus der Vielzahl der modulierenden Faktoren spielen insbesondere regulatorische Peptide und Phospholipide eine essentielle Rolle, so dass diese im folgenden eingehender diskutiert werden sollen. Chronisch entzündliche Darmerkrankungen sind charakterisiert durch rezidivierende Ulzerationen des Mukosaepithels, die zu einer Störung der intestinalen Barriere und konsekutiven Aktivierung des Mukosa-assoziierten Immunsystems führen. Diese Barrierestörung führt zu einer permanenten Aktivierung des mukosalen Immunsystems durch die luminale Darmflora und Nahrungsbestandteile, woraus eine persistierende chronische Entzündung resultiert. Daher erscheint es essentiell, neben einer Modulation der intestinalen Entzündung auch direkt die Wiederherstellung der intestinalen Integrität zu beeinflussen.

Untersuchungen anderer und unserer Arbeitsgruppe konnten zeigen, dass verschiedene Zytokine durch einen TGF-β abhängigen Mechanismus die intestinale epitheliale Restitution stimulieren [34],[35],[36]. Neben der potenten Beeinflussung der epithelialen Restitution konnte auch gezeigt werden, dass eine Vielzahl von regulatorischen Peptiden die epitheliale Proliferation und Differenzierung beeinflusst, von denen TGF-β eine herausgehobenen Bedeutung hat, da es die Effekte verschiedener pro-proliferativer Peptide komplett inhibieren kann [34],[35],[36]. Da TGF-β von nahezu allen Zellen exprimiert wird, nahezu alle Zellen Rezeptoren für TGF-β tragen und es neben Epithelzellen auch die Funktion von Immunzell-Populationen und Fibroblasten beeinflusst [37, 38, 39], ist eine [Seite 13↓]selektive Beeinflussung des intestinalen Epithels durch TGF-β kaum möglich. Eine systemische Beeinflussung der intestinalen Mukosa durch regulatorische Peptide wird auch dadurch erschwert, dass bei oraler Gabe diese Peptide durch Proteasen und die Darmflora degradiert und inaktiviert werden und somit eine direkte therapeutische Applikation kaum möglich erscheint. Im Gegensatz hierzu werden Nicht-Peptide, wie z.B. Phospholipide, Spurenelemente und Adeninnuklotide nicht vorzeitig gespalten. Neben ihrer ortständigen Funktion als Hauptbestandteil der Zellmembran verfügen einige Phospholipide und deren Metaboliten auch über die Fähigkeit, zelluläre Regulationsmechanismen zu modulieren, die einer Wachstumsfaktor-ähnlichen Beeinflussung verschiedener Zellfunktionen entspricht [40, 41].

Aus der Gruppe der zellmodulatorisch aktiven Phospholipide scheint die Lysophosphatidsäure (LPA) die stärkste Potenz hinsichtlich einer Wachstumsmodulation zu besitzen [42, 43]. LPA vermittelt ihre mitogenen Eigenschaften hauptsächlich über einen an der Zelloberfläche gelegenen, ca. 38-40 kDa schweren LPA-Rezeptor, der zu der Familie der G-Proteinrezeptoren gehört [44]. Neben einer Stimulation der Proliferation von Fibroblasten, kleinen Gefäßmuskelzellen, Endothelzellen und Keratinozyten fördert LPA die Thrombozytenaggregation und die Bindung des extrazellulären Matrixfaktors Fibronektin an die Zellmembran [42]. Diese Wachstumsfaktor-ähnliche Eigenschaften könnte eine Anwendung dieser Substanz zur Beeinflussung der intestinalen Mukosa nahe legen.

Bei einer Schädigung der intestinalen Schleimhautbarriere kommt es auch zu einer Kettenreaktion der membrangebundenen Phospholipide mit einer Oxidation von Lipiden und Freisetzung von Phospholipasen. Die Aktivierung dieser Enzyme gehört zu den ersten Schritten der Entzündungskaskade und führt direkt nach dem Antigenkontakt zu einer Hochregulierung der Phosphatidsäure-Synthese [45, 46]. Phosphatidsäure gehört zu den potentesten pro-inflammatorischen Botenstoffen und führt über die Lipoxygenase zu einer Freisetzung von Leukotrienen [47]. Schon seit einiger Zeit gibt es verschiedene therapeutische Ansätze, gezielt die Entstehung pro-inflammatorischer Phospholipidderivate zu blockieren. Die größten Erfahrungen beim Menschen liegen für Prostaglandin-E1 bei Patienten mit ARDS, Leukotrien-Inhibitoren bei Patienten mit Asthma bronchiale oder „Platelet-[Seite 14↓]activating Factor“-Rezeptorantagonisten bei atopischen Erkrankungen, schweren Verbrennungen oder Colitis ulcerosa vor [48, 49].

Lisofylline ist ein funktioneller Inhibitor der Phosphatidsäure-Synthese und der TNF-β Funktion [43, 46, 50]. Verschiedene tierexperimentelle Untersuchungen konnten zeigen, dass bei einer Sepsis und einem akuten respiratorischen Versagen durch eine Blockierung der Bildung von Phosphatidsäure durch Pentoxifyllin oder Lisofylline eine gesteigerte Expression proinflammatorischer Zytokine wie TNF-α, IFN-γ oder IL-1β verhindert werden kann, die Adhärenz neutrophiler Granulozyten vermindert wird und sich das Gesamtüberleben der Tiere verlängert [51, 52, 53]. Während eine Hemmung der Phosphatidsäure-Synthese durch Pentoxifyllin bei Patienten mit Morbus Crohn jedoch keinen therapeutischen Nutzen gezeigt hat [54], beeinflusst Lisofylline die experimentell induzierte Kolitis der Ratte günstig [55].

Bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen kommt es zu einer umfassenden Veränderung des intestinalen Immunsystems [56]. Bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen befinden sich Lamina propria T-Zellen (LPT) im Vergleich zu LPT von nicht-entzündeten Kontrollgruppen in einem erhöhten Stadium der Aktivierung und exprimieren mehr CD71 (Transferrin-Rezeptor), IL-2 oder CD25 (IL-2 Rezeptor-α-Kette) [57]. Beim Morbus Crohn kommt es zu einer polyklonalen T-Zell-Aktivierung und einer verstärkten Resistenz der Zellen gegenüber dem programmierten Zelltod , der Apoptose [58, 59, 60, 61]. Diese vermehrte Proliferation der Zellen und verminderte Apoptose führt zu einer pathologischen Akkumulation von Entzündungszellen in der Lamina propria, welche zur Perpetuierung des Morbus Crohn beiträgt. Ein Ergebnis unserer Untersuchung zeigte, dass auch eine vermehrte Expression von Zellzykluspromotoren, eine gesteigerte Telomerasenaktivität und verminderte Expression des Fasmoleküls auf der Oberfläche von LPT bei Patienten mit Morbus Crohn zu dieser pathologischen Akkumulation beiträgt [62]. Weitere signifikante Unterschiede sind eine vermehrte p53 Produktion von Morbus Crohn-LPT sowie eine fehlende Telomerasenaktivität dieser Zellen, wodurch die fehlende Möglichkeit einer substanziellen Expansion der T-Zellpopulation bei Colitis ulcerosa erklärbar erscheint [62].


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18.04.2005