[Seite 15↓]

2  Eigene Arbeiten

Die intestinale Barriere bietet für den menschlichen Organismus einen effektiven Schutz vor den luminal präsentierten Fremdstoffen der Nahrung und Darmflora. Die Wiederherstellung dieser Barriere nach einer Verletzung und eine effektive Regulation der intestinalen Immunität und oralen Toleranz sind essentiell, um die mukosale Homöostase zu bewahren. Das Ziel der vorliegenden Arbeiten war es, Regulations- und Reparaturmechanismen der intestinalen Barriere und Immunabwehr zu untersuchen unter besonderer Berücksichtigung von:

2.1 Modulation der intestinalen Wundheilung durch Phospholipide

Neben ihrer ortständigen Funktion als Hauptbestandteil der Zellmembran verfügen einige Phospholipide und deren Metaboliten auch über die Fähigkeit, zelluläre Regulationsmechanismen zu modulieren, die einer Wachstumsfaktor-ähnlichen Modulation verschiedener intestinaler Zellfunktionen entspricht [41]. Aus der Gruppe der zellmodulatorisch aktiven Phospholipide scheint Lysophosphatidsäure (LPA) die stärkste Potenz hinsichtlich einer Wachstumsmodulation zu besitzen [42, 43, 63]. Aufgrund der oben dargestellten Wachstumsfaktor-ähnlichen Eigenschaften, der hohen Stabilität und guten Verfügbarkeit von LPA interessierte uns, ob LPA auch intestinale epitheliale Zellfunktionen modulieren könnte. Wir konnten erstmalig zeigen, dass LPA eine signifikante dosisabhängige Stimulation der intestinalen epithelialen Zellmigration (Restitution) sowie eine signifikante dosisabhängige Hemmung der intestinalen epithelialen Zellproliferation in-vitro bewirkt [64]. Die Modulation der epithelialen Proliferation und -migration erfolgt [Seite 16↓]durch einen TGF-β-unabhängigen Mechanismus und wird über einen G-Protein-abhängigen Rezeptor vermittelt, wie wir im Rahmen umfangreicher Untersuchungen zur Signaltransduktion unter Verwendung spezifischer Modulatoren der Signaltransduktion wie Bradykinin, Phorbolester, Pertussistoxin, Suramin und neutralisierender TGF-β Antikörper belegen konnten [65].

Da unsere in-vitro Ergebnisse auch positive Effekte von LPA im Rahmen intestinaler epithelialer Wundheilungsmechanismen in-vivo vermuten ließen und da - wie oben dargestellt - LPA relativ stabil und in größeren Mengen verfügbar ist, untersuchten wir, ob die Effekte von LPA auch bei Entzündungs- und Wundheilungsvorgängen in-vivo nachvollzogen werden konnten. Dies erfolgte mit Hilfe des gut etablierten und weit verbreiteten experimentellen Kolitismodells der TNBS-Kolitis [66]. Dabei konnten wir zeigen, dass mit LPA behandelte Tiere einen verminderten Gewichtsverlust sowie ein geringeres Ausmaß an intestinaler Entzündung und Nekrose aufwiesen [65]. Auch eine histologische Evaluierung mit einer quantitativen Auswertung unter Verwendung eines standardisierten histologischen Scores zeigte, dass LPA eine raschere Wundheilung sowie eine geringere intestinale Entzündung in der experimenteller TNBS-Kolitis bewirkt [65].

Während einer Entzündungsreaktion kommt es durch die Aktivierung der Phospholipid-Biosynthese zu einer Generierung der pro-inflammatorischen Phosphatidsäure [46]. Lisofylline ist ein funktioneller Inhibitor dieser Phosphatidsäure und hemmt die Wirkung von TGF-β. Wir untersuchten daher, ob es durch eine Hemmung der Phosphatidsäure-Synthese zu einer Beeinflussung einer intestinalen Entzündungsreaktion kommt. Nach Induktion einer Kolitis mit TNBS applizierten wir Lisofylline intraperitoneal bei Ratten welches den intestinalen Entzündungsscore bei den Tieren verbesserte, die Gewichtsabnahme reduzierte und die Akkumulation pro-inflammatorischer Botenstoffe in die intestinale Mukosa inhibierte [55].

Diese Untersuchungen zeigen erstmalig, dass eine Gabe von Phospholipiden mit wachstumsfaktor-ähnlichen Eigenschaften oder eine Modulation der Phosphatidsäure-Synthese intestinale Wundheilungsvorgänge beeinflussen kann und zeigen so die Möglichkeit auf, mukosale Entzündungsvorgänge bei Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen durch diese Substanzen positiv zu beeinflussen.


[Seite 17↓]

2.2  Untersuchungen zum Einfluss peripherer mononukleärer Blutzellen auf die intestinale epitheliale Wundheilung

Neben verschiedenen regulatorischen Peptiden und Nichtpeptiden können intestinale Epithelzellen auch durch direkte Zell-Zell-Interaktionen moduliert werden. Da die intestinale Mukosa eine wesentliche immunologische Funktion besitzt und das intestinale Epithel in enger räumlicher Beziehung mit verschiedenen Bestandteilen des Mukosa-assoziierten Immunsystems steht, sollten die Interaktionen des intestinalen Epithels mit klassischen Immunzellpopulationen weitergehend charakterisiert werden. Da auch periphere mononukleäre Blutzellen (PBMNC) im Rahmen von Homingvorgängen Kontakt mit intestinalen Epithelzellen erlangen können, wurden die Interaktionen von PBMNC, die von gesunden Kontrollpersonen gewonnen wurden, in einem Kokultursystem mit der nicht-transformierten intestinalen Epithelzellinie IEC-6 in-vitro untersucht. Ein Kokultivierung von PBMNC und intestinalen Epithelzellen bewirkte eine signifikante Zunahme der epithelialen Restitution in-vitro [67]. Weitere Untersuchungen konnten zeigen, dass PBMNC über einen IL-2- und IFN-γ-abhängigen Mechanismus die intestinale epitheliale Restitution modulieren, während TGF-β und TNF-α für die durch PBMNC vermittelte Stimulation der Restitution keine wesentliche Rolle spielen [67].

2.3 Untersuchung zur Sekretion und Funktion von Interleukin 8 auf die intestinale Wundheilung

Interleukin-8 (IL-8) ist ein multifunktionelles Mitglied der α-Chemokinfamilie der chemotaktischen CXC Zytokine. Es aktiviert neutrophile Granulozyten und bewirkt chemotaktisch ihre Rekrutierung in die intestinale Mukosa [68]. IL-8 spielt eine zentrale Rolle in der intestinalen Entzündungskaskade und seine Expression wird bei einer Vielzahl von akuten und chronischen Erkrankungen hochreguliert. Wir wollten daher untersuchen, welche Rolle IL-8 bei der intestinalen Wundheilung spielt. Dazu wurde zunächst die mRNA und Proteinexpression der beiden IL-8 Rezeptoren in intestinalen Epithelzellen untersucht. Wir konnten zeigen, dass in den intestinalen Epithelzelllinien HT-29 und Caco-2 nur der IL-8 Rezeptor CXCR-1, nicht aber CXCR-2 exprimiert wird (“CXCL8 (Interleukin-8) modulates human intestinal epithelial cells through a CXCR1 dependent pathway. Cytokine”; im Druck). Funktionelle Untersuchungen belegten, dass IL-8 die Migration intestinaler Epithelzellen in ein Wundgebiet fördert, die Proliferation dieser Zellen aber nicht [Seite 18↓]beeinflusst. Durch blockierende CXCR-1 und TGF-β Antikörper konnten wir nachweisen, dass dieser Effekt autokrin über den IL-8 Rezeptor 1 CXR-1 vermittelt wird und nicht TGF-β abhängig ist (“CXCL8 (Interleukin-8) modulates human intestinal epithelial cells through a CXCR1 dependent pathway. Cytokine”; im Druck).

2.4 Untersuchungen zur Regulation des Zellzyklus von Lamina propria T-Zellen

In der intestinalen Mukosa müssen LPT gegenüber der Vielzahl luminaler Antigene eine immunologische Toleranz bewahren. Um diese Toleranz zu erreichen, haben sich LPT durch eine umfangreiche Adaptation ihres Phänotypes an ihre Rolle als gewebeständigen T-Zelle angepasst [16, 17, 18]. Da die Funktion von T-Zellen durch ihre Aktivierung mit der konsekutiven Proliferation und Expansion bestimmt wird, untersuchten wir die Zellzyklusregulation von LPT.

LPT sind im Gegensatz zu peripheren Blut T-Zellen (PBT) nach Stimulierung ihres Antigen-Rezeptors hypoproliferativ, expandieren jedoch nach Stimulation des CD2 Rezeptors mehr als PBT [16, 18]. Unsere Arbeiten zeigen, dass die Zeit, die LPT in den individuellen Zellzyklusphasen verbringt, signifikant länger als die von PBT ist. Hieraus folgte eine verlängerte S-Phasensynthesezeit, die konsekutiv zu einer geringeren Expansion der Zellen führt [16]. Weitere Unterschiede in der Zellzyklusregulation von PBT und LPT zeigten sich, als wir die Expression und Phosphorylierung von Zellzykluspromotoren und -inhibitoren untersuchten. Im Gegensatz zu PBT exprimieren LPT nach Stimulation, unabhängig von ihrem Status als Gedächtniszelle, vermehrt das Retinoblastoma Protein, Cyclin D, A und B1, welches den verlangsamte Zellzyklus von LPT erklärt. Unsere Untersuchungen zeigten jedoch auch, dass LPT nach ihrer Stimulierung über einen mit PBT vergleichbaren Aktivierungsstatus haben [16], welches impliziert, dass LPT über Mechanismen verfügen, die trotz gleicher Aktivierung, ihre Zellzyklusprogression aktiv inhibieren. Als Ursache hierfür konnten wir eine signifikant vermehrte Expression des Zellzyklusinhibitors p53 in LPT identifizieren [16]. In weiteren Experimenten konnten wir durch eine Blockierung dieses Proteins durch anti-sense Strategien die Geschwindigkeit der Zellzyklusprogression von LPT an die von PBT angleichen und somit die funktionelle Relevanz einer p53 Überexpression in LPT zeigen [16]. Zusammenfassend konnten somit p53 als [Seite 19↓]negativen Regulator des LPT Zellzyklus identifizieren, der die immunologische Toleranz durch die Inhibierung einer exzessiven T-Zellreplikation vermindert.

2.5 Untersuchungen zur Rolle von Caspasen in der Regulation von Apoptose und Zellzyklus von Lamina prpria T-Zellen

Die Depletion von T-Zellen nach Eliminierung des Antigens wird durch die Aktivierung des programmierten Zelltodes initiiert und verhindert die Ausbildung von Autoimmunerkrankungen oder Neoplasien [69]. LPT haben gegenüber PBT eine gesteigerte Apoptoserate [17, 70], was wahrscheinlich zur Bewahrung der intestinalen Immunhomöostase beiträgt. Caspasen, eine grosse Familie von Cysteinproteasen, initiieren und exekutieren den Zelltod [71]. Neben ihrer pro-apoptotischen Funktion wurde kürzlich auch gezeigt, dass bestimmte Caspasen auch für die Proliferation von PBT essentiell sind [17, 72].

Wir konnten zeigen, dass es in PBT nach ihrer Stimulierung zu einem signifikanten Anstieg der Caspasen 2, 3, 6 und 8 Aktivität kommt, die jedoch nicht die Apoptose dieser Zellen initiiert [17]. Wir zeigten, dass LPT nach ihrer Stimulierung eine signifikant geringere Caspasenaktivität als PBT haben, die jedoch im Gegensatz zu PBT zu einer signifikant höheren Apoptoserate führt [17]. Wir konnten nachweisen, dass bei LPT die Aktivierung der Caspase 8 eine entscheidende Rolle in der Apoptosekaskade hat, da eine Blockierung dieser Initiatorcaspase LPT vor den Antigen-induzierten Zelltod schützt [17]. Wir konnten weiterhin nachweisen, dass in Naiven und Gedächtnis PBT die Aktivierung bestimmter Caspasen für die Zellproliferation erforderlich sind, im Gegensatz hierzu die Verbindung zwischen Zelltod und Zellexpansion in LPT jedoch aufgehoben ist [17].

Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass die hohe Apoptoserate von LPT mit einer distinkten Caspase 8 Aktivität verknüpft ist und im Gegensatz zu PBT Caspasenaktivität und Zellproliferation nicht verbunden sind, eine Tatsache, die unabhängig von dem Status von LPT als Gedächtnis T-Zelle ist.

2.6 Untersuchungen zur Rolle der Wachstumsfaktoren TGF-β und HGF bei Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen

Der Wachstumsfaktor TGF-β besitzt eine Schlüsselrolle für die intestinale epitheliale Wundheilung und die Effekte verschiedener, in der intestinalen Mukosa exprimierter Zytokine wie z.B. TGF-β, HGF, FGF, IL-1, IL-2 und IFN-γ [35, 40]. Da [Seite 20↓]TGF-β und HGF in größerem Ausmaß bei intestinalen Entzündungen freigesetzt werden, wollten wir untersuchen, ob eine Bestimmung der TGF-β und HGF Serumkonzentrationen eine Möglichkeit bieten, die Krankheitsaktivität oder den Schweregrad der Entzündung bei Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen vorherzusagen. Daher wurden bei 29 Patienten mit Colitis ulcerosa und 45 Patienten mit Morbus Crohn sowie 28 gesunden Kontrollpatienten mit Hilfe von ELISA-Assays TGF-β1 und HGF Plasmaspiegel bestimmt. Die in Doppelbestimmungen bestimmten Peptidspiegel wurden mit Krankheitsaktivitätsindices für Morbus Crohn (CDAI) und Colitis ulcerosa (CAI) sowie verschiedenen Laborparametern korreliert [73]. Wir konnten in allen Kontrollen und allen Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen TGF-β1 und HGF im Plasma nachweisen. Obwohl eine Tendenz hinsichtlich erhöhter HGF- und TGF-β1-Peptidspiegel bei Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen sichtbar war, waren die Unterschiede zwischen beiden Gruppen nicht signifikant. Bei Patienten mit Colitis ulcerosa waren HGF-Plasmaspiegel positiv mit der Leukozytenzahl und negativ mit dem Serumalbumin und Hämatokrit korreliert. Bei Morbus Crohn-Patienten bestand eine positive Korrelation zwischen TGF-β-Plasmaspiegel und Thrombozytenzahl [73].

Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass TGF-β1 und HGF Plasmaspiegel bei Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen sich nicht signifikant von gesunden Probanden unterscheiden. Auch eine Stratifizierung der Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen nach entzündlicher Aktivität und Schweregrad der Erkrankung erbrachte keine signifikanten Unterschiede. Es kann daher gefolgert werden, dass HGF und TGF-β ihre Effekte autokrin und parakrin und nicht endokrin ausüben.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 3.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
18.04.2005