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4  Diskussion

Der Organismus des Wirtes wird ständig mit Antigenen und Mitogenen der Nahrung sowie bakteriellen Bestandteilen der residenten und pathogenen Darmflora konfrontiert. Er muss dabei eine überschiessende Wirtsantwort auf die ihm präsentierten Antigene vermeiden, muss aber auch einen effektiven Schutz gegenüber pathogenen Einflüssen aufbauen. Zur Erfüllung dieser Doppelaufgabe hat der Organismus eine intestinale Barriere aufgebaut, deren drei Hauptbestandteile ein protektiver Schleimfilm, die mukosale Epithelschicht und die immunkompetenten Zellen der Lamina propria sind [6].

Die erste Grenzzone zwischen den Bestandteilen des gastrointestinalen Lumens und dem Wirt liegt oberhalb der Epithelschicht und wird aus einem Film muzinöser Glykoproteine und biphasischer Lipide gebildet [74]. Während einer Entzündungsreaktion kommt es zu einer Aktivierung der Phospoholipid-Biosynthese und Freisetzung von Lipidmediatoren, die die immunologische Reaktion des Organismus hinsichtlich Entzündungs- und Wundheilungsreaktionen modulieren [41, 75, 76, 77]. Aus der Gruppe der zellmodulatorisch aktiven Phospholipide scheint die LPA die stärkste Potenz hinsichtlich einer Wachstumsmodulation zu besitzen [78, 79]. Wir konnten erstmalig zeigen, dass LPA die Migration intestinaler Epithelzellen nach einer Verletzung fördert und das dieser Effekt durch die Bindung von LPA an G-Proteinrezeptoren der Epithelzellen vermittelt wird [65]. Die Migration epithelialer Zellen in eine Wunde führt zu einer raschen Versiegelung des Wunddefektes, stellt somit die epitheliale Barrierefunktion gegenüber den Pathogenen des Darmlumens wieder her und ist daher einer der wichtigsten Schritte zur Wiederherstellung der intestinalen Barriere [9].

TGF-β spielt eine zentrale Rolle in der epithelialen Zellmigration und Proliferation und zahlreiche Zytokine vermitteln ihre Effekte über TGF-β abhängige Signalwege [35, 40]. In Keratinozyten fördert LPA die Proliferation über einen TGF-β abhängigen Signalweg [79]. Wir konnten jedoch zeigen, dass im Gegensatz hierzu die Restitution von intestinalen Epithelzellen durch LPA über einen TGF-β unabhängigen, G-Protein-vermittelten Signalweg beeinflusst wird [65]. Auch in Fibroblasten, Endothelzellen oder Keratinozyten bindet LPA an einen G-Protein-abhängigen Rezeptor, steigert aber die Proliferation in diesen Zellen [78, 79]. Im Gegensatz hierzu inhibiert LPA die Proliferation intestinaler Epithelzellen und zeigt [Seite 23↓]so, dass es trotz der gemeinsamen Bindung von LPA an den G-Proteinrezeptor der Zellen intrazellulär unterschiedliche Signalkaskaden aktiviert werden [65].

Proliferation und Migration sind entscheidend für die Modulation der intestinalen Wundheilung, die nach dem Auftreten von Verletzungen, z.B. im Rahmen von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen, Strahlenkolitis, infektiöser Kolitis oder der einheimischer Sprue, auftreten. Um den Einfluss von LPA auf die intestinale Wundheilung in-vivo zu untersuchen, behandelten wir Ratten, bei denen eine Kolitis chemisch durch TNBS induziert wurde, mit LPA [65]. Gegenüber der mit Placebo behandelten Gruppe kam es bei den mit LPA behandelten Tieren zu einer signifikanten Abnahme der intestinalen Entzündungsreaktion und Akkumulation pro-inflammatorischer Botenstoffe in der intestinalen Mukosa [65].

Die Synthese von Phosphatidsäure durch pro-inflammatorische Mediatoren wie z.B. IL-1, TNF-α, LPS oder PAF spielt eine zentrale Rolle in der Entzündungskaskade [80]. Lisofylline inhibiert die Lipidperoxidation und unterdrückt so die Synthese von pro-inflammatorischer Zytokine [81, 82]. Durch die Inhibierung distinkter Signaltransduktionswege blockiert Lisofylline auch die Effekte des pro-inflammatorischen Zytokins TNF-α [83], das eine zentrale Rolle in der Pathogenese von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen einnimmt. Durch die systemische Applikation von Lisofylline konnten wir in einem experimentellen Kolitismodel die intestinale Entzündungsreaktion nach TNBS Gabe signifikant reduzieren, den Gewichtsverlust verringern und das Überleben der Tiere fördern [55]. Diese Untersuchungen zeigen, dass sowohl durch eine topische Applikation von Phospholipiden, als auch durch die systemische Inhibierung der Phosphatidsäure-Synthese die intestinale Wundheilung nach einer Verletzung gefördert werden kann und somit die Möglichkeit bietet, LPA und Lisofylline therapeutisch, z.B. bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen, einzusetzen. Hier müssen weitere Studien folgen, die diese Effekte in anderen Tiermodellen weiter verifizieren.

IL-2 wird hauptsächlich von T-Lymphozyten nach ihrer Aktivierung synthetisiert und ist ein essentieller Wachstumsfaktor für alle T-Zell-Subpopulationen [84]. IL-2 ist ein antigen-unspezifischer Proliferationsfaktor für T-Zellen, der sowohl autokrin, als auch parakrin die Progression ruhender Zellen in den Zellzyklus bewirkt und eine klonale Expansion der aktivierten T-Zellen bewirkt [85]. Während einer [Seite 24↓]intestinalen Entzündungsreaktion kommt es zu einer Aktivierung von T-Zellen der intestinalen Mukosa. Da bekannt ist, dass die intestinale Epithelzellschicht die Funktion der immunkompetenten Zellen der darunter liegenden Lamina propria beeinflusst [86, 87, 88, 89, 90, 91], wollten wir untersuchen, ob es auch umgekehrt zu einer Beeinflussung der Epithelzellfunktion durch Faktoren kommt, die während einer intestinalen Entzündungsreaktion durch T-Zellen sezerniert werden. Unsere Untersuchungen zeigten, dass eine Kokultivierung von Epithelzellen mit T-Zellen die Migration von intestinalen Epithelzellen über eine gesteigerte Produktion von IL-2 signifikant bescheunigt. Dies legt somit nahe, dass sich T-Zellen und Epithelzellen bilateral beeinflussen [67].

Die unterhalb der Epithelzellschicht liegende Lamina propria besteht aus einer großen Anzahl von B-Zellen, Plasmazellen, Makrophagen und T-Zellen. LPT repräsentieren eine hoch spezialisierte Population von Immunzellen, die im Darm-assoziierten lymphatischen Gewebe (gut-associated lymphoid tissue, GALT) generiert werden und nach Zirkulation durch die Blutstrombahn in die intestinale Mukosa migrieren (“homing“)[37]. Die Erhaltung der intestinalen Immunhomöostase erfordert, dass Proliferation, Expansion, Zytokinproduktion und Apoptose von LPT streng geregelt werden müssen. Wir konnten zeigen, dass LPT nach Stimulation ihres TCR/CD3 Komplexes ihre maximale Proliferationsrate nach 4-6 Tagen erreichen, während PBT, unabhängig von ihrem Phänotyp als naïve (CD45RA+) oder Gedächtnis T-Zellen (CD45RO+) das Maximum ihrer proliferativen Kapazität bereits nach 2-3 Tagen erreicht haben [16]. Interessanterweise ist jedoch das mitochondriale Membranpotential als Hinweis auf den zellulären Energiestatus der Zellen in aktivierten PBT und LPT vergleichbar, welches daher eine intrinsische Inhibierung der Zellzyklusprogression von LPT vermuten lässt [16]. p53 ist ein wichtiger Zellzyklusinhibitor und induziert die Apoptose von Zellen, wenn DNA Schäden auftreten [92, 93]. Wir konnten erstmalig zeigen, dass LPT eine im Vergleich mit PBT signifikante höhere Expression von p53 haben und konnten durch Blockierung der p53 Expression in LPT die Geschwindigkeit des LPT Zellzyklus an den von PBT anpassen [16]. LPT von Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen haben, verglichen mit LPT von Patienten ohne intestinale Entzündung, eine signifikant geringere Expression von p53 [62], wodurch die wichtige Rolle von p53 als Regulator der intestinalen Immunantwort unterstrichen [Seite 25↓]und eine wichtige Rolle dieses Zellzyklusinhibitors in der Pathogenese von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen impliziert wird.

Um nach einer Stimulation und Eliminierung des Antigens die Immunantwort zu terminieren und eine überschiessende Immunantwort zu verhindern, aktivieren T-Zellen den programmierten Zelltod, die Apoptose [69]. Verglichen mit PBT haben LPT eine höhere Apoptoserate nach Antigenstimulation (antigen-induced cell death, AICD) [94]. Caspasen sind Initiatoren, aber auch Exekutoren der Apoptose [71]. Wir konnten zeigen, dass die Apoptose von LPT über Caspase-8 vermittelt wird und die Inhibierung dieser Caspase den AICD von LPT verhindert [17]. Caspase-8 spielt eine zentrale Rille in der Fas vermittelten Apoptose [95] und die Aktivierung dieses Enzyms, zusammen mit der vermehrten Expression von Fas auf LPT [94, 96], demonstriert somit, dass die Apoptose von LPT über den Typ I Signalweg der extrinsischen Apoptose vermittelt wird [17]. Morbus Crohn und Colitis ulcerosa sind durch einen mukosalen Gewebeschaden charakterisiert, der durch eine pathologische T-Zellfunktion bedingt ist [97]. So konnte unter anderem gezeigt werden, dass LPT bei Morbus Crohn die Toleranz gegenüber der eigenen Darmflora verloren haben [31, 33, 98] und eine verminderte Apoptoserate haben [59, 60, 61], die gemeinsam zu einer Akkumulation von T-Zellen in der Mukosa führen. Im Gegensatz hierzu exprimieren LPT von Patienten mit Colitis ulcerosa, verglichen mit Kontrollgruppen und Morbus Crohn-LPT, vermehrt Fas [99], welches auf eine gesteigerte Apoptoserate hinweist. Wir konnten zeigen, dass LPT von Patienten mit Morbus Crohn ihre DNA, verglichen mit LPT von Patienten mit Colitis ulcerosa und Kontrollgruppen, signifikant schneller replizieren, woraus eine gesteigerte Zellzyklusprogression und Expansion der Zellen resultiert [62]. Die Produktion von Zytokinen, wie z.B. IFN-γ oder IL-4, steigt proportional mit der Anzahl der durchschrittenen Zellzyklen [100, 101, 102]. Die gesteigerte Zellzyklusprogression von Morbus Crohn-LPT könnte somit erklären, warum die IFN-γ Produktion bei Morbus Crohn, nicht jedoch bei Colitis ulcerosa erhöht ist [103].

Die Lebensdauer und Möglichkeit zur Expansion einer Zelle wird von vielen Faktoren beeinflusst, von denen die Telomerase, eine RNA-abhängige DNA Polymerase, eine zentrale Rolle einnimmt [104, 105, 106]. Telomerasen verlängern Telomere an den Enden der Chromosomen bei einer Zellteilung und erhalten so die Fähigkeit zur Zellteilung [107]. Verglichen mit LPT von Patienten [Seite 26↓]ohne intestinale Entzündung ist die Telomerasenaktivität bei Patienten mit Morbus Crohn signifikant höher, wodurch eine verstärkte LPT Proliferation und Expansion bei Morbus Crohn erklärbar ist [62]. Im Gegensatz hierzu konnte in LPT von Patienten mit Colitis ulcerosa keine Telomerasenaktivität nachgewiesen werden. Dies könnte ihre fehlende Möglichkeit zur Expansion erklären [62]. Diese Unterschiede sind überraschend, da das externe Milieu einschließlich der kontinuierlichen Stimulation der Zellen durch Antigene bei Morbus Crohn und Colitis ulcerosa vergleichbar ist. Auch in PBT von Patienten mit einer HIV-Infektion ist die Telomerasenaktivität signifikant verringert und deutet auf einen erhöhten Anteil anerger T-Zellen hin [108]. Warum Colitis ulcerosa-LPT möglicherweise anerg sind, ist noch unklar. Es wird ein systemischer Defekt postuliert, eine Hypothese, die durch die nachgewiesene genomische Instabilität und hohen Frequenz von Telomeren in PBT von Patienten mit Colitis ulcerosa gestützt wird [109].

Die intestinale Entzündung wird als ein Prozess betrachtet, bei dem Effektorzellen des Immunsystems andere Zellen der intestinalen Mukosa zerstören. Während lange Zeit angenommen wurde, dass Nicht-Immunzellen der intestinalen Mukosa, wie z.B. Thrombozyten, nur passiv an dieser Entzündungsreaktion teilnehmen, hat sich durch neuere Arbeiten gezeigt, dass es bei einer intestinalen Entzündung zu einer komplexen Interaktion zwischen Immun und Nicht-Immunzellen kommt [110]. Es konnte kürzlich gezeigt werden, dass aktivierte Thrombozyten den CD40 Liganden (CD40L) exprimieren. Dies ermöglicht, dass diese Zellen mit der großen Anzahl an CD40 tragenden Immunzellen interagieren [111]. Wir konnten zeigen, dass Thrombozyten von Patienten mit Morbus Crohn und Colitis ulcerosa spontan und nach Aktivierung durch Thrombin CD40L exprimieren und so belegen, dass Thrombozyten bei Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen in einem dauerhaften Stadium der Aktivierung sind [112]. Bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen kommt es häufig zu einer reaktiven Thrombozytose und fehlgesteuerten Thrombopoese [113, 114], die möglicherweise auch durch die beobachtete erhöhte Aktivierung von Thrombozyten bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen erklärt werden kann.

Bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen kommt es zu einer Aktivierung von Endothelzellen der intestinalen Mukosa und vermehrten Expression von [Seite 27↓]Zelladhäsionsmolekülen und Chemokinen [115, 116]. Die vermehrte Expression von Zelladhäsionsmolekülen in Endothelzellen (HIMEC) wird durch CD40 vermittelt [117]. Wir konnten zeigen, dass HIMEC durch CD40+ Thrombozyten aktiviert werden und die Expression der zentralen Zelladhäsionsmoleküle VCAM-1 und ICAM-1 stimulieren [112]. Die Expression von VCAM-1 und ICAM-1 konnte noch weiter gesteigert werden, wenn Thrombozyten von Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen isoliert wurden und mit HIMEC ko-kultiviert wurden [112]. Die CD40L+ Thrombozyten binden an Endothelzellen und führen so unter anderem zu einer vermehrten Expression auch von IL-8 [112]. Wie wir in anderen Untersuchungen zeigen konnten, fördert dieses Chemokin die intestinale Restitution in-vitro (Sturm A, Baumgart D, Harder’de-Heureuse J, Hotz A, Wiedenmann B, Dignass A. CXCL8 (Interleukin-8) modulates human intestinal epithelial cells through a CXCR1 dependent pathway. Cytokine, im Druck). Diese Untersuchungen belegen somit, dass Thrombozyten aktiv an der multifaktoriellen mukosalen Entzündungskaskade teilnehmen und der Aktivierung von Thrombozyten eine pathophysiologische Rolle zukommt, die bisher klassischen Immunzellen vorbehalten war.

In den hier vorgelegten Arbeiten werden verschiedene Aspekte der intestinalen Barriere untersucht und Möglichkeiten zur Restitution der intestinalen Wundheilung nach Verletzung der Epithelzellschicht und Regulationsmechanismen von T-Zellen der Lamina propria untersucht. Hierbei konnte insbesondere gezeigt werden, dass der Regulation von Caspasen und dem Zellzyklusinhibitors p53 in der Bewahrung der mukosalen Immunhomöostase eine zentrale Rolle zukommt [16, 17]. Caspaseinhibitoren haben in verschiedenen Tiermodelellen, z.B. der bakteriellen Meningitis, des M. Parkinson oder der amyotrophen Lateralsklerose einen therapeutischen Einfluss gezeigt [118]. Da ihr Einsatz jedoch auch die Gefahr einer unkontrollierten Zellproliferation und kanzerogenen Wirkung beinhaltet, müssen weitere Untersuchungsergebnisse abgewartet werden. Dies gilt auch für p53, welches in nahezu allen Tumorerkrankungen mutiert oder vermindert exprimiert wird [119]. Auch bei Morbus Crohn ist die p53 Expression vermindert und eine p53 Gentherapie wäre eine grundsächlich mögliche therapeutische Option in der Behandlung vom Morbus Crohn. Bisherige Therapiestudien mit p53 bei onkologischen Erkrankungen konnten jedoch die erfolgsversprechenden Daten der Tierversuche nicht immer bestätigen [120, 121, 122, 123, 124], so dass eine erfolgreiche [Seite 28↓]Umsetzung der durch in-vitro Untersuchungen erhobenen Erkenntnisse in-vivo nicht zwangsläufig gesichert ist. Vorsicht scheint in diesem Zusammenhang insbesondere aufgrund der multifaktoriellen Natur der chronisch entzündlichen Darmerkrankungen angebracht.


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18.04.2005