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1.  Einleitung

1.1. Die Definition von Proteom und Proteomics

Das Proteom wurde definiert als die Gesamtheit der Proteine, die durch das Genom einer Zelle oder eines Organismus kodiert werden [Wasinger et al., 1995; Wilkins et al., 1996]. Im Gegensatz zum statischen System des Genoms, welches in jeder Zelle und in jedem Entwicklungszustand des Organismus unverändert vorliegt, ist das Proteom ein dynamisches, sich ständig veränderndes Gebilde. Einerseits ist die Proteinbiosynthese zell- und gewebespezifisch und andererseits haben die äusseren Bedingungen einen Einfluss auf die Quantität der exprimierten Proteine. Unter Proteomics versteht man die Untersuchung ganzer Proteome oder Subproteome in großem Umfang.

Den immensen Daten, die durch die Genomsequenzierungsprojekte erzeugt wurden, müssen nun biologische Informationen der einzelnen Gene zugeordnet werden. Leider gibt es jedoch keine einfachen Rückschlüsse vom Gen zum erzeugten Protein, da ein Gen durch die hohe kombinatorische Vielfalt wie z.B. durch alternatives Spleißen und posttranslationale Modifikationen zu einer Vielzahl verschiedener Proteinprodukte führen kann. Außerdem läßt auch die mRNA-Menge keinen Rückschluss auf die Quantität eines Proteins zu [Gygi et al., 1999a]. Proteine enthalten im Unterschied zu den Genen mehrere Dimensionen an Informationen welche vielmehr die tatsächlichen als die potentiellen Funktionen darstellen. Diese Informationen enthalten u.a. die Menge, den Status der Modifikation, die subzelluläre Lokalisierung, die dreidimensionale Struktur und Interaktionen mit anderen Molekülen. Daher ist es erforderlich die Proteine auf Proteinebene zu untersuchen.

Ursprünglich ist das Feld der Proteomics aus der Technik der zweidimensionalen Gelelektrophorese (2DE) entstanden [O`Farrell, 1975; Klose, 1975]. Dabei wird versucht, die in den erzeugten Proteinmustern enthaltenen Informationen zur Lösung biologischer und medizinischer Fragestellungen zu nutzen. Die subtraktive Analyse durch den Vergleich von Proteinmustern aus verschiedenen definierten Zuständen ermöglicht die Charakterisierung der Zustände durch Veränderungen im Proteinmuster. Die rasante Entwicklung der biologischen Massenspektrometrie und der Sequenzdaten ermöglicht inzwischen die schnelle Identifizierung der Proteine vieler Organismen.Die Verwendung des Begriffs Proteomics wurde mittlerweile erweitert. Man spricht z.B. von funktioneller Proteomics [Godovac-Zimmermann und Brown, 2001] oder struktureller Proteomics [Norin und Sundstöm, 2002].


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Unter funktioneller Proteomics versteht man u.a. die globale Analyse von Interaktionen, posttranslationalen Modifikationen und molekularen Netzwerken. Dazu können andere Techniken als die 2DE eingesetzt werden, wie z.B. das Two-Hybrid-System [Uetz et al., 2000], die Tandemaffinitätsaufreinigung (Tandem affinity purification; TAP) [Gavin et al., 2002], die Immunopräzipitation in großem Maßstab [Ho et al., 2002], die Oberflächenplasmonresonanz [Nedelkov und Nelson, 2001] für Interaktionsproteomics oder die Kombination von chemischer Modifikation der Proteine und immobilisierter Metallaffinitätschromatographie (IMAC) [Ficarro et al., 2002], die Immunopräzipitation mit Anti-Phosphotyrosin [Kaufmann et al., 2001; Stancato und Petricoin, 2001] oder die Phosphoprotein-Isotopenkodierte Affinitätsmarkierung [Goshe et al., 2001] für Phosphoproteomics.

Als strukturelle Proteomics bezeichnet man die Erzeugung von dreidimensionalen Strukturen in großem Maßstab. Die Proteinproduktion erfolgt dabei im Hochdurchsatzverfahren, zur Analyse werden Röntgenstrukturanalysen und multidimensionale Kernresonanzspektroskopie verwendet [Norin und Sundstöm, 2002]. Darüberhinaus werden die gewonnenen Strukturen und die Sequenzinformationen genutzt, um mit bioinformatischen Methoden die dreidimensionalen Strukturen in silico vorherzusagen. Mit Hilfe dieser Daten wird dann versucht Aussagen über die Funktionen der Proteine anhand der Strukturdaten zu erhalten.

1.2. Die Proteomanalyse

Die klassische Proteomanalyse beinhaltet folgende Schritte: Die Probenvorbereitung, die Trennung der Proteine mit 2DE, die Analyse der Gele, die Proteinidentifizierung und der Aufbau von 2DE-Datenbanken.

Das Ziel der Probenvorbereitung ist, möglichst viele Proteine reproduzierbar in Lösung zu bringen. Um Proteinverluste zu vermeiden, sollte die Probenvorbereitung aus wenigen Schritten bestehen. Üblicherweise werden die Proben mit denaturierenden Stoffen wie Harnstoff oder Thioharnstoff und nicht-ionischen- oder zwitterionischen Detergenzien wie Triton X-100 oder CHAPS und Ampholyten gelöst. Spezielle Probenvorbereitungsprotokolle müssen für schwierige Proben ausgearbeitet werden.

Die 2DE ist die Technik mit der höchsten Auflösung zur Trennung von Proteinen [Klose und Kobalz, 1995] und daher seit 1975 immer noch die wichtigste Separationstechnik zur Trennung komplexer Proteingemische [Rabilloud, 2002]. In [Seite 9↓] der ersten Dimension erfolgt dabei die isoelektrische Fokussierung (IEF), in der zweiten Dimension werden die Proteine durch SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese getrennt. Nach der 2DE können die Proteine direkt aus dem Gel oder nach dem Blotten auf Blotmembranen durch Färbung quantifiziert und identifiziert werden.

Um eine globale Analyse der Proteine durchzuführen, ist die 2DE für komplexe Organismen gewöhnlich nicht ausreichend. Eine Möglichkeit zur Steigerung der Auflösung besteht in der Vorfraktionierung. Die Proben können z.B. durch differentielle Zentrifugation in die Zellkompartimente und Organellen getrennt werden, durch Anwendung von chromatographischen Trennmethoden [Fountoulakis et al. 1999a, Fountoulakis et al., 1999b, Butt et al., 2001] oder mittels Multikompartiment-Elektrolyse [Herbert und Righetti, 2000]. Mit Hilfe von begrenzten pH-Gradienten für die isoelektrische Fokussierung kann die Auflösung weiter erhöht werden [Görg et al., 2000]. Die Begrenzung der pH-Gradienten hat jedoch den Nachteil, dass der Großteil der Proteine einen pI außerhalb dieses Bereiches hat und diese Proteine präzipitieren, wodurch die isoelektrische Fokussierung gestört wird. Eine Vorfraktionierung über diskrete isoelektrische Fraktionen ist deswegen empfehlenswert.

Für die Analyse der Gele werden diese normalerweise mit Coomassie Blau oder Silber gefärbt und anschließend densitometrisch ausgewertet. Die Gele können nach der Färbung entweder visuell oder mit Softwareprogrammen ausgewertet werden. Moderne Softwareprogramme ermöglichen Spoterkennung, Quantifizierung und Gelvergleiche. Jedoch ist die Leistungsfähigkeit dieser Programme stark abhängig von der Gelqualität und beträchtliche Eingriffe des Nutzers sind erforderlich.

Kürzlich wurden fluoreszierende Proteinfärbereagenzien entwickelt, wie z.B. der Farbstoff SYPRO Ruby [Patton, 2000; Berggren et al., 2002] bzw. Ruthenium(II)-tris-(bathophenanthrolindisulfonat) [Rabilloud et al., 2001]. Der größere lineare dynamische Bereich der Intensitäten, die höhere Sensitivität und die Kompatibilität mit der Massenspektrometrie sind die wichtigsten Vorteile gegenüber den konventionellen Färbetechniken [Lopez et al., 2000].

Zur Identifizierung der Proteine können verschiedene Techniken verwendet werden wie z.B. massenspektrometrische Methoden, N-terminale Sequenzierung, Aminosäureanalyse und Immunoblotting [Jungblut und Thiede, 1997].

Peptidmassenfingerabdruck und MS/MS-Fragmentierungen mit MALDI-MS oder ESI-MS von proteolytisch erzeugten Peptiden sind dabei die Methoden der Wahl [Seite 10↓] aufgrund der Sensitivität im Femtomol-Bereich, der Schnelligkeit der Analysen und der möglichen Automatisierbarkeit.

Die automatische N-terminale Sequenzanalyse hat eine Sensitivität im Bereich von 0.5 bis 1 Picomol mit modernen Geräten. Die Proteine können komplett nach dem Blotten auf eine PVDF-Membran sequenziert werden. Jedoch dürfen die Proteine nicht N-terminal blockiert sein, was insbesondere bei eukaryotischen Proteinen häufig auftritt. Daher werden die Proteine in der Regel proteolytisch gespalten und die erzeugten Peptide über HPLC getrennt und anschließend sequenziert. Dieser gesamte Prozess ist arbeitsaufwendig und die Sequenzierung ist relativ langsam (~ 45 Minuten pro Aminosäure).

Die Aminosäureanalyse kann mit Mengen > 100 ng durchgeführt werden und ermöglicht eine quantitative Analyse. Aufgrund der kompletten oder partiellen Zerstörung während der Hydrolyse können einige Aminosäuren nicht bestimmt werden, so dass diese Methode nicht zur Proteinidentifizierung als alleinige Methode zuverlässig ist.

Immunoblotting ist eine sehr sensitive Methode, jedoch bedarf es einer Vermutung über das jeweilige zu identifizierende Protein und ein geeigneter Antikörper muss verfügbar sein.

Bei der Proteomanalyse fallen eine große Menge an Daten an, die in 2DE-Datenbanken gespeichert werden sollten. Gewöhnlich werden die 2DE-Gelbilder mit den theoretischen und praktischen Molekulargewichten und isoelektrischen Punkten, den Proteinnamen und den Zugangsnummern (e.g. NCBI, Swiss-Prot) und der Identifizierungsmethode der identifizierten Proteine versehen.

Bisher ermöglichte die klassische Proteomanalyse über die Kombination von 2DE und Massenspektrometrie die größte Menge an biologisch relevanten Informationen über die Diversität von Proteomen. Obwohl die 2DE immer noch mit Abstand die wichtigste Separationstechnik zur Proteomanalyse ist, hat sie folgende Einschränkungen: die fehlende Automatisierung, die begrenzte Reproduzierbarkeit, die relativ langsame und schwierige technische Durchführung, der Transfer von der ersten auf die zweite Dimension birgt die Gefahr von Proteinverlusten, Proteine mit extremen Eigenschaften (Membranproteine, sehr große-, sehr kleine-, stark saure-, und stark basische Proteine) sind unterrepräsentiert, die Quantifizierung ist unvollkommen und es besteht keine ausreichende Dynamik d.h. sehr selten [Seite 11↓] vorkommende Proteine können nicht gleichzeitig neben sehr häufigen Proteinen dargestellt werden [Gygi et al., 2000].

Die wichtigsten Entwicklungen zur Proteomanalyse mit 2D-Gelelektrophorese in den letzten Jahren waren der molekulare Scanner [Bienvenut et al., 1999; Binz et al., 1999; Müller et al., 2002], die differentielle Gelelektrophorese (DIGE) [Unlu et al., 1997; Tonge et al., 2001], die metabolische Markierung [Oda et al., 1999], die Kombination der Isotopenkodierten Affinitätsmarkierung (Isotope coded affinity tag; ICAT) mit 2-DE [Smolka et al., 2002] und die Kombination der trägerfreien Elektrophorese (free flow electrophoresis, FFE) für die isoelektrische Fokussierung und anschließende SDS-PAGE der Fraktionen [Hoffmann et al., 2001].

Die wichtigsten Entwicklungen zur Proteomanalyse ohne 2D-Gelelektrophorese sind zur Zeit die Multidimensionale-Flüssigkeitschromatographie (Multidimensional liquid chromatography; MDLC) [Washburn et al., 2001] und die Isotopenkodierte Affinitätsmarkierung [Gygi et al., 1999b; Zhou et al., 2002] in Kombination mit der direkten Identifzierung und Quantifizierung der Proteine mit MS/MS. Damit wurden auch Proteine, die in geringen Mengen vorkommen, sowie Proteine mit extremen Molekulargewicht und isoelektrischen Punkt identifiziert. Von Proteinchips erhofft man sich ebenfalls Verbesserungen gegenüber der klassischen Proteomanalyse bezüglich der Automatisierung, der Kosten, der Reproduzierbarkeit und des Durchsatzes [Figeys und Pinto, 2001; Zhu et al., 2001].

1.3. Die Apoptose

Die Apoptose ist ein Selbstmordprogramm der Zelle, das innerhalb weniger Stunden die Zelle vollständig eliminiert. Durch die detaillierte Beschreibung der morphologischen Veränderungen während der Apoptose im Jahre 1972 [Kerr et al., 1972] wurde die physiologische Zellelimination als eigenständige und genetisch kontrollierte Form des Zelltods erkannt und der Begriff Apoptose geprägt.

Im Gegensatz zur Nekrose läuft bei der Apoptose ein genetisch gesteuertes Programm ab. In der Regel sind nur einzelne Zellen betroffen und diese reagieren auf Signale von innen, auch wenn sich die Auslöser des Signals außerhalb der Zelle befinden. In der Anfangsphase schrumpfen Zellkern, Cytoplasma und Mitochondrien. Die Zellmembran bleibt unbeschädigt, so dass keine Entzündungsreaktion eintritt. Infolge des sinkenden Zellvolumens verliert die Zelle ihren Kontakt zu den Nachbarzellen, anschließend verdichtet sich das Chromatin und wird zerstückelt. [Seite 12↓] Schließlich zerfällt die Zelle in membranumschlossene apoptotische Körperchen, die von Nachbar- oder Fresszellen eliminiert werden. Die resorbierten Vesikel werden durch Lysozyme biochemisch aufgeschlossen und auf diese Weise werden die Reste der abgestorbenen Zelle vollständig wiedergewonnen [Häcker, 2000].

Bereits während der Embryonalentwicklung spielt der gezielte apoptotische Tod bestimmter Zellen eine wichtige Rolle. So erfolgt während der Entwicklung des Embryos die Formgebung von Körper und Organen durch Apoptose, beispielsweise werden die Häute zwischen Zehen und Fingern in der menschlichen Embryonalentwicklung apoptotisch entfernt. Im Verlauf des Lebens entfernt Apoptose nicht mehr funktionsfähige, unnötigt gewordene und kranke Zellen aus dem Organimus. Zelluläre Eliminationsvorgänge treten meist in Geweben mit hohem Zellumsatz auf wie z.B. die Haut, die Zellen des Magen-Darm-Traktes und die kernhaltigen Zellen des Blutes. Auch veränderte Zellen müssen beseitigt werden. Krankheiten können daraus resultieren, dass Zellen, die sterben sollen, überleben und solche, die überleben sollen, sterben, weil Störungen in der Regulation der Apoptose vorliegen. Die Störung des fein ausbalancierten Gleichgewichtes zwischen Zellproliferation und -elimination verursacht zwangsläufig pathologische Zustände. Diese Störungen werden mit einer Reihe von Krankheitsbildern beim Menschen in Verbindung gebracht. Eine zu niedrige Apoptoserate kann z.B. zu Autoimmunstörungen, Diabetes und zur Proliferation entarteter Zellen führen. Übermäßige Apoptose charakterisiert die Krankheitsbilder von Herzinfarkt, AIDS und neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer, Parkinson und Huntington [Mattson, 2000; Yuan und Yankner, 2000; Evan und Vousden, 2001]. Ein genaues Verständnis der apoptotischen Prozesse und der möglichen Veränderungen birgt daher ein großes Potential für die Entwicklung geeigneter Medikamente bzw. für die Therapie [Nicholson, 2000; Huang und Oliff, 2001; Johnstone et al., 2002]

Die Durchführung der Apoptose ist ein komplizierter biochemischer Prozess und benötigt die koordinierte Aktivierung und Exekution vieler Unterprogramme. Die wichtigsten Komponenten des Todesprogrammes sind die Caspasen und deren Inhibitoren und Substrate, die Todesrezeptoren, das Mitochondrium unter der Kontrolle von Proteinen der Bcl-2 Familie und andere Organellen [Hengartner, 2000; Ferri und Kroemer, 2001].

Caspasen spielen eine essentielle Rolle bei der Initiation und Exekution der Apoptose. Diese Proteasen schneiden Proteinsubstrate C-terminal von [Seite 13↓] Asparaginsäuren und aktivieren, inaktivieren oder zerstören diese [Earnshaw et al., 1999]. Die Substratspezifität wird durch vier Aminosäuren vor der Schnittstelle bestimmt [Thornberry et al., 1997].

Die Umwandlung der inaktiven Procaspasen in die aktive Form kann durch drei Mechanismen erfolgen: Die proteolytische Spaltung von Effektorcaspasen (z.B. Caspase-3, -6 und -7) durch eine vorgeschaltete Caspase, die Induktion durch eine hohe Konzentration (z.B. Caspase-8) von Initiatorcaspasen [Salvesen und Dixit, 1999] oder die Holoenzymbildung durch Bildung großer Komplexe von Initiatorcaspasen (z.B. Caspase-9).

Die Caspaseaktivierung wird durch drei Mechanismen reguliert: die Regulation der Transkription der Zymogene, die Blockierung der Induktion durch eine hohe Konzentration einer Caspase durch anti-apoptotische Mitglieder der Bcl-2-Familie bzw. andere Proteine (z.B. Smac/Diablo, c-FLIP) oder durch Bindung von zellulären Apoptose-Inhibitorproteinen (inhibitor of apoptosis, IAP) an Caspasen.

Zur Zeit sind etwa 100 Caspasesubstrate bekannt. Diese Substrate lassen sich in folgende Klassen einordnen: häufig vorkommende cytoplasmatische Proteine (z.B. Actin, Gelsolin, α -Fodrin), häufig vorkommende Kernproteine (z.B. Lamin A und B, hnRNP C, U1 snRNP), Proteine des DNA-Metabolimus und der DNA-Reparatur (z.B. PARP, RAD51, Topoisomerase I), Kinasen (z.B. Protein Kinase C, p12-aktivierte Kinase, Raf1), andere Proteine der Signalübertragungswege (z.B. Prointerleukine, STAT1, NFκ B), Proteine der Regulation des Zellzyklusses und der Proliferation (z.B. p21Cip/Waf1, pRB, CDC27), Proteine, die mit humanen Krankheiten assoziiert sind (z.B. Huntingtin, Preseniline, amyloides Precursorprotein) und Proteine des Apoptoseprozesses (z.B. Procaspasen, Bcl-2, Bid, ICAD/DFF45) [Earnshaw et al., 1999].

Die Todesrezeptoren sind Mitglieder der Tumornekrosefaktor (TNF)-Rezeptor-Superfamilie. Sechs Todesrezeptoren sind bisher bekannt: TNF-R1 (CD120a), Fas (CD95, Apo1), TRAMP (DR3, Apo3), TRAIL-R1 (DR4), TRAIL-R2 (DR5, Apo2) und DR6. Die Apoptose wird durch Rezeptor-Oligomerisierung mittels folgender Todesrezeptorliganden vermittelt: TNF für TNF-R1, FasL für Fas, Apo3L für TRAMP, TRAIL für TRAIL-R1 und -R2. Anschließend wird ein Adaptorprotein (FADD, TRADD, RIP, TRAF-2) durch Interaktion von Todesdomänen rekrutiert. Die Adaptorproteine interagieren dann ihrerseits mit einer Procaspase, diese wird autoproteolytisch in die aktive Caspase umgewandelt und leitet die Caspase-Kaskade ein.


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Köderrezeptoren (decoy receptors; DcR), die entweder keinen intrazellulären Teil haben oder keine funktionelle Todesdomäne besitzen, konkurrieren mit den Todesrezeptoren um die Todesrezeptorliganden (TRAIL-R3 (DcR1) und TRAIL-R3 (DcR2) mit TRAIL; DcR3 mit Fas) und inhibieren den apoptotischen Prozess [Ashkenazi und Dixit, 1999].

Proteine der Bcl-2 Familie werden in drei Untergruppen eingeteilt: Die Inhibitoren der Apoptose beeinhalten die vier Domänen BH1-BH4 (z.B. Bcl-2, Bcl-XL ), die Promotoren der Apoptose enthalten entweder die drei Domänen BH1-BH3 ( z.B. Bax, Bak) oder nur die BH3-Domäne (z.B. Bad, Bid, Noxa, PUMA). Bcl-2-Proteine können Homo- und Heterokomplexe bilden und sich somit gegenseitig regulieren. Die Bcl-2-Proteine können mit Membranen assoziiert sein und/oder sich im Cytosol befinden. Die Interaktion mit intrazellulären Membranen wird bei den meisten Bcl-2-Proteinen durch ein hydrophobes C-terminales Segment erreicht. An den Mitochondrien assoziierte antiapoptotische Bcl-2-Proteine verhindern die Apoptose. Proapoptotische Bcl-2-Proteine können das Todessignal vom Cytosol auf die Mitochondrien übertragen. Diese Translokation kann z.B. durch Dephosphorylierung (z.B. Bad) oder Caspase-Spaltung (z.B. Bid) ausgelöst werden. Das apoptotische Signal führt zur Freilassung von Caspasen [Susin et al., 1999a], Caspase-Aktivatoren (z.B. Cytochrom c, Hsp10) [Liu et al., 1996; Samali et al., 1999] und Caspase-unabhängigen Todeseffektoren (z.B. AIF) [Susin et al., 1999b]. Über die Art und Weise wie diese Proteine freigesetzt werden, existieren verschiedene Modelle, die kontrovers diskutiert werden [Desagher und Martinou, 2000]. Zum einen wird das Zerreißen der äußeren mitochondrialen Membran durch Anschwellen der mitochondrialen Matrix angenommen, entweder durch das Ansteigen des mitochondrialen Transmembranpotentials oder durch Öffnung der Permeabilitätstransitionspore. Zum anderen wird die Bildung von großen Kanälen durch Bax allein oder mit VDAC oder durch Bildung lipidischer Poren postuliert.

Neben den Mitochondrien sind auch andere Organellen wie das endoplasmatische Retikulum, Lysosomen und der Golgi-Apparat an der Apoptose beteiligt (Ferri und Kroemer, 2001].

Der Prozess der Apoptose wird generell in zwei Kategorien eingeteilt werden: Der intrinsische (oder mitochondriale)- und der extrinsische (oder Todesrezeptor)- Signalweg [Hengartner, 2000] (Abbildung 1).


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Der extrinsische Signalweg wird über Todesrezeptoren vermittelt und wird anhand des Fas-Rezeptor/Fas-Ligand (CD95/CD95L)-System unter 1.3.1. beschrieben. Der intrinsische Signalweg wird durch extrazelluläre Signale oder intrazelluläre Ereignisse wie DNA-Schädigung eingeleitet und wird anhand der DNA-Schädigung und Apoptose durch Cis-Platin exemplarisch unter 1.3.2. beschrieben. Beide Signalwege

Abbildung 1 : Die schematische Darstellung der apoptotischen Signalwege.

(Modifiziert aus: N. Machuy, Dissertation, Universität Potsdam, 2001).

können über das Protein Bid, ein proapoptotisches Mitglied der Bcl-2-Familie, verbunden werden. Nach Aktivierung des extrinsischen Signalweges wird Bid durch [Seite 16↓] Caspase-8 geschnitten, der C-terminale Teil von Bid (tBid) transloziert anschließend nach posttranslationaler N-Myristylierung zum Mitochondrium, wo es den intrinsischen Signalweg fördert [Zha et al., 2000]. Diese Verbindung der zwei Signalwege ist unter normalen Bedingungen jedoch gering [Gross et al., 1999].

1.3.1. Das Fas-Rezeptor/Fas-Ligand (CD95/CD95L)-System

Der Fas-Rezeptor (bzw. CD95 oder Apo-1) ist ein Mitglied der Todesrezeptor-Superfamilie. Die Wechselwirkung mit dem Fas-Liganden (bzw. CD95L oder Apo-1L) (oder Fas-Antikörper) führt zur Auslösung der Apoptose. Das Fas-Rezeptor/Fas-Ligand-System wird mit verschiedenen Krankheiten wie Erkrankungen des Immunsystems und die Pathogenese von Tumoren in Zusammenhang gebracht [O´Connell et al., 1999; Krammer, 2000; Siegel et al., 2000a].

Für die Bindung des Fas-Rezeptors und des Fas-Liganden existieren zwei Modelle. Das Modell der Post-Liganden-Trimerisierung beschreibt die Bindung durch ein Homotrimer des Fas-Liganden, welcher drei monomere Fas-Rezeptoren bindet; dieses führt schließlich zum Zusammenbau des trimeren Rezeptors. Das neue Modell der Pre-Liganden-Trimerisierung beschreibt zunächst die Trimerisierung des Fas-Rezeptors vor der Bindung des Fas-Liganden [Siegel et al., 2000b].

Das Todessignal führt anschließend zur Bildung eines Tod-induzierenden Signalkomplexes (Death-inducing signal complex, DISC) im Cytoplasma [Kischkel et al., 1995]. Der DISC besteht aus dem trimerisierten Fas-Rezeptor, dem Adaptorprotein FADD, und der Procaspase-8 oder -10. FADD interagiert über eine Todesdomäne mit dem Fas-Rezeptor und über eine Todeseffektordomäne mit der Procaspase. Dadurch wird die Procaspase autoproteolytisch prozessiert und es entsteht die aktive, freigesetzte Caspase. In Typ I-Zellen kann Caspase-8 direkt andere Caspasen aktivieren, während in Typ II-Zellen, über die Spaltung von Bid, der intrinsische Apoptoseweg eingeleitet wird [Scaffidi et al., 1998] (Abbildung 1).

Das Protein Daxx interagiert ebenfalls mit der Todesdömane von des Fas-Rezeptors, obwohl es selbst keine derartige Dömane enthält. Daxx und FADD binden unabhängig voneinander an den Fas-Rezeptor und aktivieren verschiedene Signalwege. Durch Daxx wird der Apoptose-stimulierende Kinase 1 (ASK1)-Signalweg und anschließend der c-Jun N-terminale Kinase (JNK)-Signalweg aktiviert und vermittelt Caspase-unabhängigen Zelltod [Yang et al., 1997; Chang et al., 1998; Charette et al., 2001].


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Der Fas-induzierte Zelltod kann durch verschiedene Proteine wie DcR3, c-FLIP oder durch Regulatoren des mitochondrialen Signalweges (z.B. Bcl-2-Proteine, Smac/Diablo) kontrolliert werden. Der lösliche Rezeptor DcR3 wurde in Lungen- und Dickdarmkarzinomen amplifiziert und kann ebenfalls an den Fas-Liganden binden und damit die Bindung an den Fas-Rezeptor verhindern [Pitti et al., 1998]. C-FLIP ist strukturell der Caspase-8 ähnlich, jedoch ohne enzymatische Aktivität. C-FLIP kann in den DISC-Komplex eingebaut werden und verhindert dadurch die Aktivierung von Caspase-8 [Scaffidi et al., 1999].

1.3.2. Die DNA-Schädigung und Apoptose durch Cis-Platin

Das Antitumormittel Cis-Diammin-dichloro-Platin (II) (Cis-Platin) wird als Chemotherapeutikum bei Bronchialkarzinomen und bei Tumoren des Urogenitaltraktes eingesetzt. Cis-Platin bindet über das Platin (II) an das N-7 oder O-6 von Guanin-Basen doppelsträngiger DNA, wobei vorwiegend 1,2-Intrastrang-Quervernetzungen entstehen [Jamieson und Lippard, 1999]. Durch diese DNA-Schädigung wird die DNA-Replikation und die Transkription inhibiert.

Der bedeutendste Nachteil von Cis-Platin zur Behandlung von Patienten besteht in den starken Nebenwirkungen, insbesondere bei der Behandlung über längere Zeiträume. Somit ist auch eine Anwendung in hohen Dosen nicht möglich. Intrazellulär wird Cis-Platin rasch hydrolysiert und daher liegen hauptsächlich Aquakomplexe vor, die kinetisch relativ labil sind. Antitumor-Platin-Komplexe der zweiten Generation wie z.B. Cis-Diammin(1,1-cyclobutandicarboxylato)-Platin (II) (Carboplatin) oder Aquo-1,1-bis(aminomethyl)cyclo-hexansulfato-Platin (II) (Spiroplatin) sind stabiler als Cis-Platin. Dieses führt vermutlich zu einem reduzierten Abbau von schädlichen Derivaten, wodurch diese Verbindungen besser verträglich sind und weniger toxische Nebenwirkungen aufweisen.

Die Zelle reagiert auf eine DNA-Schädigung entweder durch Zellzyklusstop, um die DNA-Reparatur zu ermöglichen oder durch Apoptose. Diese Prozesse werden über ein Netzwerk von interagierenden Signaltransduktionswegen eingeleitet [Zhou, Elledge, 2000]. Eine bedeutende Rolle für die zelluläre Antwort auf eine DNA-Schädigung hat der Tumorsuppressor p53 [Bennett, 1999; Bates und Vousden, 1999; Coultas und Strasser, 2000]. Zellen mit Wildtyp-p53 antworten auf DNA-Schädigungen mit Erhöhung von p53. Die Menge an p53 wird im Normalzustand auf einem geringen Level durch einen negativen Feedback-Loop zwischen p53 und dem [Seite 18↓] Oncoprotein MDM2 gehalten [Momand et al., 2000]. Dabei wird die Ubiquitin-vermittelte Degradation von p53 über die Ubiquitin-Ligase Aktivität von MDM2 gesteuert. Ausgelöst durch Stressbedingungen, wie z.B. eine DNA-Schädigung, wird p53 durch posttranslationale Modifikationen, insbesondere Phosphorylierungen, verändert. Dadurch wird die Interaktion mit MDM2 verringert und die Transkriptionsaktivität erhöht [Vogelstein et al., 2000; Alarcon-Vargas und Ronai, 2002].

Die Tumorsuppressorfunktion von p53 ist abhängig von der DNA-Bindungsaktivität. Wildtyp-p53 bindet kooperativ als Tetramer über die DNA-Bindungsdomäne im Mittelteil des Proteins an eine DNA-Consensus-Sequenz. Durch die Quervernetzung der DNA mit Cis-Platin wird einerseits die Bindungsaffinität von p53 zu der DNA-Bindungsdomäne durch konformative Veränderungen verringert, andererseits zu der modifizierten DNA erhöht [Kasparkova et al., 2001]. Damit könnte die Antitumoraktivität von Cis-Platin auf die Bindungsfähigkeit von p53 zu Platin-modifizierter DNA erklärt werden. Neben der DNA-Bindungsdomäne scheint aber auch die C-terminale Domäne einen Einfluss auf die Interaktion mit platinierter DNA zu haben [Wetzel und Berberich, 2001]. Eine andere Erklärung für den Antitumoreffekt von Cis-Platin im Zusammenhang mit p53 bietet das High-mobility group 1- (HMG-1) Protein. HMG-Proteine binden spezifisch an 1,2-Intrastrang- Quervernetzungen von Cis-Platin und vermitteln dadurch Antitumoreffekte von Cis-Platin [Jamieson und Lippard, 1999]. Diese Bindung wird verstärkt durch die Interaktion von p53 mit HMG-1 [Imamura et al., 2001].

Bei der Vermittlung der Apoptose durch DNA-Schädigung über p53 spielt der Bcl-2-regulierte apoptotische Signalweg eine essentielle Rolle; die Beobachtungen der Bedeutung des Todesrezeptors Fas für diesen Prozess sind hingegen unterschiedlich [Coultas und Strasser, 2000].

Die kontroversen Ergebnisse für das Fas/Fas-Ligand-System bei der p53-vermittelten Apoptose wurden mit Hilfe von transformierten Zelllinien erhalten. Einerseits wurde gezeigt, dass Apoptose durch Cis-Platin und andere DNA schädigende Agentien über das Fas-System vermittelt wird [Fulda et al., 1997; Friesen et al., 1996; Kasibhatla et al., 1998; Müller et al., 1998], andererseits wurden keine Effekte des Fas-Systems gefunden [Gamen et al., 1997; McGahon et al., 1998; Ruiz-Ruiz und Lopez-Rivas, 1999]. Aufgrund der Verwendung transformierter Zelllinien sind unbekannte Mutationen von Genen nicht auszuschließen, die einen [Seite 19↓] Einfluss auf die Regulation der Apoptose haben können. Experimente mit nicht-transformierten Zelllinien wie Thymozyten von Fas-defizienten Mäusen bzw. Lymphozyten von Mäusen mit mutierten Fas-Ligand, welcher nicht fähig ist an den Fas-Rezeptor zu binden, zeigten eine normale Sensitivität des Fas-System gegenüber Cis-Platin, Etoposid und Doxyrubicin [Newton und Strasser, 2000; O`Connor et al., 2000].

Die p53-vermittelte Apoptose mit Proteinen der Bcl-2-Familie kann durch Inhibierung von antiapoptotischen Proteinen wie Bcl-2 [Miyashita et al., 1994] oder durch Aktivierung von proapoptotischen Proteinen wie Bax [Miyashita et al., 1995], Noxa [Oda et al., 2000a], PUMA [Yu et al., 2001; Nakano und Vousden, 2001] und das mitochondriale Protein p53AIP1 [Oda et al., 2000b] stattfinden. Der intrinsische Signalweg der Apoptose wird durch die Translokation von Bax, Noxa und PUMA vom Cytosol zur äußeren Membran des Mitochondriums induziert. Anschließend erfolgt die Freisetzung von mitochondrialen Proteinen wie z.B. Cytochrom c [Liu et al., 1996] und Smac/Diablo [Du et al., 2000; Verhagen et al., 2000] [Desagher und Martinou, 2000]. Die Freisetzung von Smac/Diablo führt zur Inhibierung von IAPs. Cytochrom c hingegen bildet mit Apaf-1 und dATP bzw. ATP einen oligomeren Komplex, das Apoptosom, und bindet und prozessiert Procaspase-9, was wiederum zur Aktivierung von weiteren Caspasen führt [Acehan et al., 2002] (Abbildung 1).

Kürzlich wurde die Translokation von p53 an die Mitochondrien durch ein Todessignal festgestellt [Marchenko et al., 2000]. Dabei wurde die Freisetzung von Cytochrom c und ein Feedback-Loop zwischen den antiapoptotischen Proteinen Bcl-2 und Bcl-XL und p53 beobachtet. Aus diesen Ergebnissen ist auf einen direkten Signalweg von p53 über die Mitochondrien bei der Apoptose zu schließen.

1.3.3. Die Proteomanalyse von Apoptose

Globale Proteomanalysen durch 2DE und anschließende Identifikation der Proteine durch proteinanalytische Methoden von Apoptose wurden in verschiedenen Zellsystemen und mit unterschiedlichen Auslösern des Zelltods durchgeführt: in Jurkat T-Zellen mit anti-Fas-Antikörper [Gerner et al., 2000; Thiede et al., 2001; Thiede et al., 2002] bzw. mit EGTA und Lovastatin [Patterson et al., 1995], in der Burkitt-Lymphomzelllinie BL60 [Brockstedt et al., 1998] mit anti-IgM-Antikörper, in der SV40-immortalisierten humanen Epithelzelllinie 267B1-XR durch Ionisierungsstrahlung [Prasad et al., 1999] und in der humanen akuten [Seite 20↓] promyelocytischen Leukämiezelllinie HL-60 durch Entzug von all-trans Retinoesäure [Wan et al., 2001]. Dabei wurden sehr unterschiedliche Ergebnisse hinsichtlich der veränderten Proteinspots und der identifizierten Proteine erhalten.

1.4. RNA-Protein-Wechselwirkungen

RNA-Protein-Wechselwirkungen haben wesentliche Funktionen bei der Transkriptionskontrolle, der RNA-Prozessierung und der Translationskontrolle [Siomi und Dreyfuss, 1997]. Die Identifizierung und Charakterisierung von RNA-Protein-Wechselwirkungen ist bedeutend für das Verständnis der Regulation dieser wichtigen Prozesse. Verschiedene Bindungsmotive wurden sowohl auf Protein- als auch auf RNA-Ebene aufgeklärt.

Auf RNA-Ebene unterscheidet man zwischen globalen-, gruppenspezifischen- und typenspezifischen Proteinbindungsmotiven [Keene, 2001]. Globale Motive binden fast alle RNAs. Gruppenspezifische Motive wie z.B. das AU-reiche-Element (ARE) assoziieren mit strukturell bzw. funktionell verwandten Proteinen. Typenspezifische Motive wie z.B. das Eisenreaktionselement (iron response element, IRE) [Rouault und Klausner, 1997] bzw. das Histon-mRNA-Stielschleife-Bindungsprotein [Wang et al., 1999] erkennen einzigartige RNA-Sequenzen.

Ein Anteil der Gene kodiert für RNA-Bindungsmotive z.B. in S. cerevisiae (5-8 %), in C. elegans (2-3%), in D. melanogaster (2-3%) und in H. sapiens (2-8 %). Die bekanntesten Proteinsequenzmotive für die RNA-Bindung sind das Ribonukleoprotein (RNP)-Motiv, die Doppelstrang-RNA-Bindungsdomäne (dsRBD) und die K-homologe Domäne (KH-Motiv). Von diesen Motiven sind dreidimensionale Strukturen sowohl separat als auch im Komplex mit RNA bekannt [Perez-Canadillas und Varani, 2001]. Meistens sind mehrere Domänen zur Erkennung der RNA erforderlich. Vom RNP-Motiv sind mehrere 3D-Strukturen bekannt. Diese Strukturen unterscheiden sich am deutlichsten in der RNA-Bindungsoberfläche, wodurch wahrscheinlich unterschiedliche RNA-Sequenzen differenziert werden können.

1.4.1. Das Ribosom

Das Ribosom ist eine molekulare Maschine und der Ort der Proteinbiosynthese (Translation) der Zellen [Spirin, 2002; Ramakrishnan, 2002]. Die Proteinbiosynthese an Ribosomen verläuft in drei Schritten: Die Initiation, die Elongation und die Termination. Bei der Initiation bindet sich eine Boten-RNA (mRNA) an die kleine [Seite 21↓] Untereinheit eines Ribosoms. Beginnend am Starttriplett oder Startcodon lagern sich Transfer-Ribonukleinsäuren (tRNAs) mit spezifisch gebundenen Aminosäuren entsprechend des kopierten genetischen Codes auf der mRNA während der Elongation nacheinander an das Ribosom an. Mit Hilfe der Peptidyltransferase werden die Aminosäuren aneinander geknüpft. Dabei lösen sich die tRNAs wieder vom Ribosom, nachdem sie ihre Aminosäuren abgegeben haben. Die Termination erfolgt, sobald das Stopcodon der mRNA erreicht ist. Dann zerfällt das Ribosom in seine Untereinheiten unter GTP-Verbrauch und das fertige Protein löst sich von der letzten tRNA. Da an einem mRNA-Faden sehr viele Ribosomen hintereinander sitzen, können synchron mehrere Proteine gebildet werden.

Das Ribosom besteht aus einer großen und einer kleinen Untereinheit. Jedes ist in etwa zu zwei Dritteln ihres Gewichts aus RNA und zu einem Drittel aus Protein zusammengesetzt. Im prokaryotischen Darmbakterium E. coli besteht das 70S Ribosom aus einer 50S- und einer 30S-Untereinheit. Die 50S-Untereinheit enthält die 23S-rRNA, die 5S-rRNA und 34 verschiedene Proteine, während die 30S-Untereinheit aus der 16S-rRNA und 21 verschiedenen Proteinen zusammengesetzt ist. Eukaryotische Ribosomen bestehen aus einer 60S- und einer 40S-Untereinheit und besitzen zusätzlich eine rRNA und 20-30 Proteine im Vergleich zu prokaryotischen Ribosomen. Rekonstitutionsexperimente von prokaryotischen Ribosomen führten zur Annahme, dass die notwendigen Informationen für funktionelle Ribosomen in der rRNA und den ribosomalen Proteinen enthalten sind. Mittlerweile wurden jedoch einige 100 zusätzliche Proteine und snRNAs entdeckt, die am Zusammenbau des Ribosoms in der Hefe beteiligt sind [Warner, 2001].

Das Ribosom ist schon seit mehr als 40 Jahren Gegenstand biochemischer Forschung. Ein herausragendes Ziel dieser Forschung war die Bestimmung der räumlichen Anordnung der Komponenten, um die Funktionsweise auf molekularer Ebene zu verstehen. Zunächst wurden mit Hilfe einer Fülle von biochemischen Daten grobe 3D-Modelle konstruiert [Brimacombe et al., 1988; Walleczek et al. 1988]. Die 3D-Strukturen einzelner Proteinfaktoren und ribosomaler Proteine ohne und mit rRNA-Fragmenten führten zur Verfeinerung der Modelle [Ramakrishnan und White, 1998]. Einen großen Fortschritt für die Strukturaufklärung ganzer Ribosomen erfolgte durch die Kryoelektronenmikroskopie von 70S E. coli -Ribosomen mit einer Auflösung von 23-25 Å [Stark et al., 1995; Frank et al., 1995]. Die Kombination der biochemischen Daten und der Strukturen aus der Kryoelektronenmikroskopie [Seite 22↓] lieferten wiederum exaktere Modelle des Ribosoms [Mueller und Brimacombe, 1997a,b; Mueller et al., 1997]. Weiterhin konnten mit Hilfe der kryoelektronen-mikroskopischen Daten die ersten zufriedenstellenden Elektronendichtekarten von ribosomalen Kristallen erzeugt werden [Ban et al., 1998]. Anschließend wurden dreidimensionale Strukturen der beiden Untereinheiten und kompletter Ribosomen mit atomarer Auflösung erhalten [Yonath, 2002]. Diese Kristallstrukturen lieferten eine riesige Menge an Informationen über die Gesamtstruktur und Detailstrukturen von RNA-Protein-Wechselwirkungen. Des weiteren wurden auch 3D-Strukturen der ribosomalen Untereinheiten mit wichtigen Liganden wie Initiationsfaktoren, mRNA, tRNA und Antibiotika erzeugt [Carter et al., 2000; Brodersen et al. 2000; Carter et al., 2001; Ogle et al., 2001; Pioletti et al., 2001; Schlünzen et al. 2001]. Insgesamt wurde eine große Übereinstimmung der biochemischen- und der strukturellen Daten gefunden. Die Gestalt der ribosomalen Untereinheiten wird größtenteils von der Struktur der rRNA bestimmt, während sich die Proteine an der Peripherie befinden. An der Grenzfläche zwischen den Untereinheiten, der Peptidyltransferase-Region der 23S rRNA und der Dekodierungsregion der 16S rRNA sind keine Proteine vorhanden. Die rRNA scheint daher verantwortlich für die meisten enzymatischen Aktivitäten zu sein und fungiert als Ribozym [Nissen et al., 2000]. Die ribosomalen Proteine dienen anscheinend überwiegend zur Stabilisierung der rRNA-Strukturen, indem sie sich mit der RNA verflechten.

Die Ribosomen sind außer für die Translation auch verantwortlich für die Lenkung der Proteine an ihre zellulären Orte. Das Signalerkennungspartikel (Signal recognition particle, SRP) bindet an Ribosomen, die eine neuentstehende Proteinkette mit einer aminoterminalen Signalsequenz enthalten und diffundiert zum endoplasmatischen Retikulum (ER). Dort bindet sich der SRP an den SRP-Rezeptor und somit passiert die neuentstehende Kette die ER-Membran und kann vollständig im ER hergestellt werden.

Eine weitere wichtige Rolle haben Ribosomen bei der Antibiotika-Entwicklung. Einige Antibiotika nutzen die kleinen Unterschiede zwischen Ribosomen von Bakterien und höheren Zellen, um gezielt die Krankheitserreger zu vernichten, indem sie nur die bakterielle Proteinsynthese inhibieren. Jedoch sind einige Bakterien durch Mutationen resistent gegen Antibiotika geworden. Dreidimensionale Strukturen können bei der Entwicklung von Arzneistoffen äußerst hilfreich sein. Kokristallisationen der 30S-Untereinheit mit verschiedenen Antibiotika zeigten die [Seite 23↓] direkte Bindung an die 16S rRNA nahe der mRNA- und tRNA-Bindungsstellen [Brodersen et al., 2000; Carter et al., 2000; Pioletti et al., 2001; Schlünzen et al., 2001].

1.5. Die Massenspektrometrie in der Biochemie

Die Entwicklung der schonenden Ionisierungstechniken Matrixunterstützte Laser-desorption/Ionisation-Massenspektrometrie (MALDI-MS) und Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (ESI-MS) ermöglichten die Bestimmung der molekularen Masse von großen Molekülen und sind die Techniken der Wahl für die Peptid- und Proteinanalytik [Aebersold und Goodlett, 2001; Mann et al., 2001]. Andererseits können mit diesen Methoden auch andere biologisch wichtige Moleküle wie DNA, RNA, Kohlenhydrate und Lipide analysiert werden. Daher können unterschiedlichste biologische Fragestellungen mit diesen Techniken untersucht werden [e.g. Winston und Fitzgerald, 1997; Siuzdak, 1998; Griffin und Smith, 2000; Li et al., 2000; Fenselau und Demirev, 2001].

1.5.1. ESI-Massenspektrometrie

Ein ESI-Massenspektrometer besteht generell aus der Elektrospray-Ionenquelle, dort werden die Ionen erzeugt, dem Massenanalysator, wo die Ionentrennung erfolgt und dem Detektor zum Ionennachweis. Die Probe wird in das ESI-MS entweder im Offline- oder im Online-Betrieb flüssig eingeführt. Zum Offline-Betrieb werden mit Gold beschichtete Kapillaren verwendet. Im Online-Betrieb erfolgt eine direkte Kopplung mit Trenntechniken wie Flüssigkeitschromatographie oder Kapillarelektrophorese. Im Offline- bzw. Online-Betrieb können Flußraten von etwa 10-20 nl/min erreicht werden, was die Sequenzierung von enzymatisch verdauten Proteinen im Femtomolbereich ermöglicht.

Zur Ionenerzeugung beim ESI-MS werden die solvatisierten Probenmoleküle zunächst an der Oberfläche im starken elektrischen Feld geladen, wobei Tröpfchen mit einem Durchmesser von wenigen Mikrometern entstehen. Durch die Verdampfung des Lösungsmittels kommt es zur Coulomb-Explosion, wenn das Verhältnis von Ladung zur Oberfläche zu groß wird. Dabei entstehen viele Tröpfchen mit einem Durchmesser von wenigen Nanometern. Zur Erzeugung der freien Gasphasenionen gibt es zwei Modelle. Das Modell des geladenen Rückstands (charged-residue model, CRM) geht davon aus, dass durch eine Serie von Coulomb-[Seite 24↓] Explosionen, hervorgerufen durch die große Oberflächenladung, sehr kleine geladene Tröpfchen entstehen, die nur noch ein Analytmolekül enthalten. Aus diesen entstehen dann durch Desolvatisierung gasförmige Ionen [Dole et al., 1968]. Das Modell der Ionenemission (Ion evaporation model, IEM) beschreibt die Erzeugung der Gasphasenionen durch Emittierung aus hochgeladenen Tröpfchen mit einem Radius von etwa 8 nm und etwa 70 Ladungen [Iribarne und Thomson, 1976].

Drei verschiedene Typen von Massenanalysatoren werden gewöhnlich für ESI-MS in Proteomanalysen verwendet: Das Triple-Quadrupole (QqQ), die Ionenfalle (ion trap, IT) und das Quadrupole-Flugzeitmassenspektrometer (QqTOF). Diese Geräte können sowohl im MS-Modus zur Bestimmung der Komplettmassen als auch im MS/MS-Modus nach Kollision mit einem Gas zur Erzeugung von Fragmentmassen verwendet werden. Quadrupole bestehen aus vier parallelen Metallstäben, die Ionen mit einem bestimmten m/z-Verhältnis zum Detektor durchlassen. Das Scannen des Massenbereichs wird durch gleichzeitiges Erhöhen der Gleichspannung und der Amplitude des Wechselfeldes erreicht. Eine Ionenfalle besteht aus einer Ringelektrode und zwei Endkappen, an die Wechselspannungen angelegt werden. Die Funktion der Ionenfalle basiert im wesentlichen auf dem Prinzip der Quadrupole, jedoch können die Ionen für variable Zeiten eingefangen werden. Beim Flugzeitmassenspektrometer wird die Flugzeit der Ionen zwischen Quelle und Detektor vermessen, welche proportional zu (m/z) 0.5 ist.

Im Vergleich der drei verschiedenen Massenanalysatoren zeigt das Quadrupole-Flugzeitmassenspektrometer eine deutlich höhere Auflösung und höhere Transmission im MS/MS-Modus. Multiple Fragmentierungen und der verhältnismäßig geringe Preis sind die wichtigsten Vorteile der Quadrupole-Ionenfalle. Das Triple-Quadrupole scheint vorteilhaft für das Scannen von Bezugsionen, wobei gewöhnliche Fragmentierungsprodukte wie z.B. Immoniumionen zur Massenbestimmung und Fragmentierung der korrespondierenden Massen genutzt werden können, auch wenn diese Massen ein geringes Signal zu Rauschen-Verhältnis haben.

Ein alternatives ESI-MS Gerät zu den drei genannten Techniken in der Proteinanalyse ist das Fourier-Transformations Ionencyclotronresonanz Massenspektrometer (FT-ICR-MS) aufgrund seiner hohen Auflösung und Massengenauigkeit [Shen et al., 2001]. Dieser Gerätetyp ist wegen des hohen technischen Aufwandes und des hohen Preises bisher wenig verbreitet.


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1.5.2. MALDI-Massenspektrometrie

Die schonende Ionisierung bei der MALDI-MS wird erreicht, indem die Probe mit einem etwa 1000-10000 fachen molaren Überschuss einer, bei der verwendeten Laserwellenlänge absorbierenden, Matrix vermischt wird. Nach der Verdampfung des Lösungsmittels können die Kokristalle in das Massenspektrometer eingeführt werden. Die Matrix absorbiert die Energie aus dem Laserpuls und schützt die Analytmoleküle vor der Photolyse, was bei direkten Laserbeschuss geschehen würde. Außerdem überträgt die Matrix die zur Desorption notwendige Energie, stellt die für die Ionisierung notwendigen Protonen zur Verfügung und reduziert die Wechselwirkung der Analytmoleküle untereinander. Die molekulare Masse wird in der Regel durch Messung der Flugzeit bestimmt, welche proportional zu (m/z)0.5 ist.

Bei den gängigen MALDI-Massenspektrometer wird ein Flugzeitanalysator (time-of-flight, TOF) verwendet. Als Flugzeitanalysatoren werden gewöhnlich Geräte verwendet, bei denen die Messungen wahlweise im Linear- oder Reflektron-Modus erfolgen. Im linearen Modus durchlaufen die Ionen auf einer geraden Flugbahn eine feldfreie Driftstrecke von der Quelle zum Detektor während im Reflektron-Modus die Ionen auf ihrem Flug durch das Anlegen eines elektrischen Gegenfeldes nach der freien Driftstrecke reflektiert werden. Im Reflektron wird durch die längere Flugstrecke und die Richtungsumkehr eine höhere Auflösung und Massengenauigkeit im Vergleich zum linearen Modus erreicht. Andererseits ist der lineare Modus aufgrund der kürzeren Flugstrecke geeigneter zur Detektion größerer Moleküle.

Die Entwicklung der zeitverzögerten Ionenextraktion (delayed extraction, DE) führte zur deutlichen Verbesserung der Auflösung bzw. Massengenauigkeit der MALDI-Massenspektrometrie [Brown und Lennon, 1995]. Dabei wird das elektrische Feld zeitversetzt zum Laserimpuls eingeschaltet, wodurch der Einfluss der Startgeschwindigkeitverteilung kompensiert wird.

Im MALDI-Flugzeitmassenspektrometer werden auch metastabile Fragmente erzeugt. Die Ionen dieser Fragmente können zur Sequenzanalyse genutzt werden. Der metastabile Zerfall erfolgt durch spontanen Zerfall in der feldfreien Driftstrecke. Dieser Prozess wird als Postquellenzerfall (post source decay, PSD) bezeichnet [Chaurand et al., 1999].


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Neben dem üblichen Flugzeitanalysator werden mittlerweile für MALDI-MS auch Quadrupole-Flugzeitanalysatoren [QqTOF] [Loboda et al, 2000 Flugzeit-Flugzeit-Analysatoren [TOF-TOF] [Medzihradszky et al., 2000], Ionenfallen [IT] [Qin et al., 1996] und Fourier-Transformations Ionencyclotronresonanz Massenspektrometer (FT-ICR-MS) [Solouki et al., 1995] kommerziell angeboten. Diese Geräte ermöglichen neben dem MS-Modus zur Bestimmung der Komplettmassen auch die Fragmentierung ausgewählter Ionen im MS/MS-Modus nach Kollision mit einem Gas.

1.5.3. Die Proteinidentifizierung mit Massenspektrometrie

Die Entwicklung der Massenspektrometrie und die drastische Vergrößerung der Sequenzinformationen durch die Genom-Projekte hat die Proteinidentifizierung revolutioniert. Der Peptidmassenfingerabdruck (Peptide mass fingerprinting, PMF) und uninterpretierte MS/MS-Spektren enthalten die Daten zur Proteinidentifikation.

Der Peptidmassenfingerabdruck wird durch enzymatische Spaltung des Proteins und anschließende Messung der Peptide erhalten. Gewöhnlich wird dazu MALDI-MS verwendet, da nur einfach geladene molekulare Massen erzeugt werden und somit die Interpretation der Spektren sehr einfach ist. Außerdem erhält man in der Regel eine bessere Sequenzabdeckung als mit ESI-MS. Die beobachteten Massen werden dann mit den theoretisch erzeugten enzymatischen Peptidmassen von kompletten Proteinsequenzdatenbanken verglichen [Fenyö, 2000]. Im Prinzip erfolgt die analoge Vorgehensweise bei der Identifikation über MS/MS-Spektren. Dazu werden jedoch einige Peptide der Peptidmischung fragmentiert und diese Massen zur Identifikation herangezogen, indem hier die theoretischen MS/MS-Massen mit den erhaltenen Massen verglichen werden [Eng et al., 1994]. Zur Erzeugung von MS/MS-Spektren wird in der Regel ESI-MS/MS verwendet. Die Spektren können einfacher generiert werden und in der Regel erhält man vollständigere Ionenserien im Vergleich zu PSD-MALDI-MS. Das kürzlich entwickelte MALDI-MS mit TOF/TOF-Analysator scheint diese Nachteile offenbar nicht mehr zu haben.

Eine alternative Vorgehensweise zur Proteinidentifizierung ist die Methode der Sequenzmarkierung (sequence tag) [Mann und Wilm, 1994]. Dazu werden manuell zwei bis drei aufeinander folgende Aminosäuren in den MS/MS-Spektren aufgeklärt. Mit Hilfe der Information der Start- und Endmasse dieser Aminosäuren inklusive Sequenz können die Proteine ebenfalls durch Korrelation mit Proteinsequenzdaten identifiziert werden.


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Die beschriebenen Methoden zur massenspektrometrischen Proteinsequenzierung sind beschränkt auf bekannte DNA- oder Proteinsequenzen. Außerdem können EST-Sequenzen nur mit MS/MS-Spektren korreliert werden. Die DNA-Segmente von ESTs sind nicht ausreichend, um eine ausreichende Anzahl von Peptiden aus einem Peptidmassenfingerabdruck zu korrelieren. Eine andere Möglichkeit zur Identifikation unbekannter Proteine besteht in der massenspektrometrischen de novo Sequenzierung. Das Problem bei dieser Vorgehensweise ist die äußerst komplexe Interpretation der Massenspektren. In der Regel ist es schwierig, Sequenzen ausreichender Länge zu erhalten. Diese sind zur Konstruktion von Oligonukleotid-Primern notwendig, um über PCR-Techniken die Sequenz zu erhalten oder um Sequenzvergleiche über Homologie-Suchen durchzuführen. Die sukzessive Suche in Sequenzdatenbanken mit Peptidmassenfingerabdruck, uninterpretierten MS/MS-Spektren und automatisch interpretierten MS/MS-Spektren wurde zur Verbesserung von Homologiesuchen entwickelt [Shevchenko et al., 2001].


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19.02.2004