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2.  Ergebnisse

2.1. Die Proteomanalyse von Apoptose in T-Zellen

Jurkat T-Zellen dienten als Modellsystem für den Vergleich von unbehandelten Kontrollzellen mit apoptotischen Zellen durch klassische Proteomanalyse. Zunächst wurde eine 2DE-Datenbank vom Totallysat der unbehandelten Zellen erstellt [2.1.1.]. Anschließend wurde die Apoptose über den Fas-Rezeptor-Signalweg eingeleitet und mit den Kontrollzellen verglichen. Um eine Anreicherung der Proteine und Informationen über Translokationen zu erhalten wurden die Jurkat T-Zellen außerdem in die Kompartimente Mitochondrien, Kern, Membran und Cytosol getrennt. Die analoge Vorgehensweise erfolgte durch Induktion der Apoptose mittels Cis-Platin, um die Proteomanalysen der Apoptose vermittelt über einen Todesrezeptor und durch DNA-Schädigung zu vergleichen [2.1.2.].

2.1.1. Die 2DE-Datenbank von Jurkat-T-Zellen

Die Proteine der humanen Jurkat T-Zelllinie E6 wurden durch hochauflösender 2DE getrennt. Nach der Silberfärbung wurden etwa 2.000 Proteinspots detektiert. Von diesen wurden 95 Proteinspots von 83 verschiedenen Proteinen nach Coomassie Blau-Färbung durch Peptidmassenfingerabdruck mit MALDI-MS identifiziert. Die theoretischen Werte für die Molekulargewichte und die isoelektrischen Punkte wurden zur Kalibrierung der Gele verwendet. Damit wurde aus den gewonnenen Daten eine 2DE-Datenbank erstellt, die im Internet zugänglich ist (http://www.mpiib-berlin.mpg.de/2D-PAGE/) [Thiede et al., 2000a]. In dieser Datenbank können sowohl das 2DE-Gesamtbild sowie auch sechs vergrößerte Sektionen betrachtet werden. Die Informationen über die theoretischen- und praktischen molekularen Massen (Mw) und isoelektrischen Punkte (pI), die Identifizierungsmethode und die Sequenzabdeckung durch den Peptidmassenfingerabdruck der identifizierten Proteinspots ist angegeben. Weiterhin besteht eine Verbindung zu den NCBI- und Swiss-Prot-Datenbanken über die Zugangsnummern der Proteine.

Die 2DE-Datenbanken sind allgemein nützlich für die grundlegende biochemische Erforschung von Proteomen. Aus diesem Grund wurde das Konzept der föderativen 2DE-Datenbanken entwickelt [Appel et al., 1996], in denen auch die Jurkat T-Zelllinie integriert ist (http://www.expasy.ch/ch2d/2d-index.html). Die leukämischen Jurkat T-Zellen werden in vielen Projekten zu Untersuchung der T-Zellrezeptor-vermittelten [Seite 29↓] Signalgebung und für viele andere Studien verwendet, darüber hinaus sind sie für die Krebsforschung von Interesse [Simpson und Dorow, 2001].

Die 2DE-Datenbank der Jurkat T-Zellen war für die folgenden Proteomanalysen der Apoptose essentiell. Die relativ genaue Kalibrierung anhand der identifizierten Proteine wurde eingesetzt, um die Resultate der Peptidmassenfingerabdrücke durch Datenbanksuchen abzuschätzen. Da die massenspektrometrische Identifizierung über Peptidmassenfingerabdrücke auf Wahrscheinlichkeiten beruht, ist trotz der resultierenden Qualitätskennzahl ein Vergleich mit den theoretischen molekularen Massen und den isoelektrischen Punkten der identifizierten Proteine eine wichtige Kontrolle. In den Kontrollgelen sollten die Werte der identifizierten Proteinspots mit den theoretischen Werten übereinstimmen. Nach der Induktion der Apoptose wurden hingegen auch proteolytische Spaltungen von Caspasesubstraten erwartet. Diese Proteinfragmente ergeben eine geringere Sequenzabdeckung bei der Identifizierung, dennoch konnten die zugeordneten Peptide in der Regel einem Teil des Proteins zugeordnet werden. Die theoretischen Werte bzgl. Mw und pI der Proteinfragmente konnten berechnet werden (http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html) und folglich mit den praktischen Werten verglichen werden. Weiterhin konnten damit die putativen Caspase-Schnittstellen vorhergesagt werden. Die Genauigkeit dieser Vorhersage war abhängig von der Anzahl der Asparaginsäuren in dem berechneten Proteinbereich.

Die identifizierten Proteine dienten außerdem der Beurteilung der Aufreinigung der Kompartimente. Die Lokalisation zu einem Kompartiment wurde bei der überwiegenden Anzahl der Proteine in der Swiss-Prot-Datenbank spezifiziert. Theoretische Berechnungen der Zuordnung der Proteine zu den Kompartimenten basierend auf die Primärsequenz sind zwar möglich (http://psort.nibb.ac.jp/form2.html), lieferten aber z.T. falsche Ergebnisse. Eine Anreicherung von mehr als 90% konnte anhand der 2DE-Gele mit den bekannten Lokalisationen der Proteine von den Kompartimenten Cytosol, Kern und Mitochondrien festgestellt werden. Die sogenannte Membranfraktion hingegen zeigte zwar auch ein anderes 2DE-Spotmuster als die anderen Kompartimente, aber es wurden nicht nur Membranproteine angereichert.

Ein entscheidendes Kriterium für die Identifizierung von Proteinen per Peptidmassenfingerabdruck ist die Sequenzabdeckung. Unter der Sequenzabdeckung versteht man das prozentuale Verhältnis der Anzahl der durch [Seite 30↓] die detektierten Massen zugeordneten Aminosäuren zu der Gesamtanzahl der Aminosäuren des jeweiligen Proteins. Mit Hilfe eines Teils der identifizierten Spots wurde gezeigt, dass die Sequenzabdeckung in 18 von 23 Fällen durch die Verwendung einer zweiten Matrix für die massenspektrometrische Messung gesteigert werden konnte, da z.T unterschiedliche Massen mit den verschiedenen Matrices detektiert wurden. Aufgrund ihrer Einfachheit ist diese Vorgehensweise empfehlenswert, wenn das Ergebnis der Identifikation mit einer Matrix nicht eindeutig ist. Bei der zweiten Messung kann außerdem auf einen internen Standard verzichtet werden, was zur Überdeckung von Massen der Probe führen kann. Andererseits wird die doppelte Materialmenge und Zeit für die Messung benötigt [Thiede et al., 2000a].

Die Peptidmassenfingerabdrücke von 69 Proteinen der Jurkat T-Zelllinie und 50 Proteinen aus M. tuberculosis wurden hinsichtlich der ausgelassenen tryptischen Spaltstellungen, der Oxidation von Tryptophan und der N-terminalen Pyroglutamatbildung analysiert [Thiede et al., 2000b].

Fast 90% der ausgelassenen tryptischen Spaltstellen konnten drei Sequenzmotiven zugeordnet werden: (I) ein C-terminales Prolin zu Lysin bzw. Arginin, (II) benachbarte Lysine/Arginine und (III) Asparaginsäure oder/und Glutaminsäure N- oder C-terminal zu Lysin bzw. Arginin. Die Erhöhung von ausgelassenen Spaltstellen bei der Proteinidentifizierung führt zu einer verringerten Präzision bei der Suche. Die Berücksichtigung der Sequenzmotive für die ausgelassenen Spaltstellen kann diesen Effekt deutlich minimieren. In vielen Fällen wird der Abstand zu zufällig zugeordneten Proteinen größer.

Tryptophan wurde in der unoxidierten-, monooxidierten- und dioxidierten Form beobachtet. Die Intensität der Peaks war immer in der geringer oxidierten Form höher. Peptide mit N-terminalen Glutamin wurden stets als Paar mit der Pyroglutamatform detektiert. Unnatürliche Modifikationen durch die Probenbehandlung entstehen hauptsächlich durch die Oxidation von Methionin und durch die Umsetzung von Cystein mit Acrylamid zum β -Propionamid. Weitere Modifikationen können bei der Datenbanksuche eingegeben werden. Je mehr Modifikationen bei der Suche berücksichtigt werden, desto mehr theoretische Massen sind möglich und desto ungenauer wird die Identifikation. Die Berücksichtigung, dass Peptide mit N-terminalen Glutamin immer paarweise mit der Pyroglutamatform vorkommen und die Feststellung, dass die Intensität der Tryptophan enthaltenen Peptide geringer wird, je höher die Oxidation ist, kann somit [Seite 31↓] die Proteinidentifizierung verbessern. Bei den unnatürlichen Modifikationen sollte auf jeden Fall der Effekt des jeweiligen Experimentators verifiziert werden.

Die Ergebnisse der Analyse der Peptidmassenfingerabdrücke können zur Verfeinerung und damit zur Verbesserung von Programmen zur Identifikation von Proteinen verwendet werden. Diese Daten wurden z.B. in das Programm ChemApplex integriert [Parker, 2002].

2.1.2. Die Proteomanalyse der Apoptose über den Fas-Rezeptor-Signalweg und durch DNA-Schädigung mittels Cis-Platin

Das Vorgehen zur Proteomanalyse der Apoptose ist in Abbildung 2 schematisch dargestellt. Die Apoptose wurde entweder durch den Anti-Fas-Antikörper oder durch

Abbildung 2 : Schematische Darstellung der Proteomanalyse der Apoptose und anschließende Experimente.

Cis-Platin eingeleitet. Um sekundäre Effekte zu vermeiden wurden die Zellen zusätzlich mit einer geringen Menge des Translationshemmers Cycloheximid behandet,. Die Kontrollzellen und die apoptotischen Zellen wurden anschließend als Totallysat oder nach Separation in die einzelnen Kompartimente mittels 2DE aufgetrennt. Die Kontrollzellen des Totallysates wurden zum Aufbau einer 2DE-Datenbank verwendet. Veränderte Proteinspots wurden durch den Vergleich der 2DE-Gele aufgeklärt. Diese Apoptose-assoziierten Proteinspots wurden anschließend überwiegend durch Peptidmassenfingerabdruck identifiziert. [Seite 32↓] Interessante Proteine wurden dann kloniert. Der Caspase-3 Verdau nach in vitro Translation verifizierte, ob es sich um Caspase-3 Substrate handelte.

Die subtraktive Analyse der 2DE-Gele von unbehandelten- und von apoptotischen Jurkat T-Zellen nach Induktion der Apoptose über den Fas-Rezeptor zeigte Unterschiede in 45 Proteinspots. Von diesen konnten zunächst 20 Spots von 11 verschiedenen Proteinen identifiziert werden. Nach der Trennung der Kompartimente wurden zusätzlich 165 differentielle Proteinspots von 73 Proteinen aufgeklärt. Die analoge Vorgehensweise nach Induktion der Apoptose durch Cis-Platin erbrachte 85 differentielle Spots. 61 Proteinspots waren bereits aus der Fas-induzierten Apoptose bekannt. Die zusätzlichen 24 Proteinspots konnten 11 Proteinen zugeordnet werden. Diese Ergebnisse zeigten eine relativ hohe Übereinstimmung der Proteomanalyse von Todesrezeptor- und über DNA-Schädigung-vermittelte Apoptose.

Den 209 identifizierten Proteinspots konnten 95 Proteine zugeordnet werden. 78 Proteine waren bisher im Apoptoseprozess unbekannt. Die restlichen Proteine waren überwiegend als Caspase-Substrate geläufig.

39 Proteine (= 40%) enthalten ein oder mehrere RNA-Bindungsmotive (RNP- bzw. KH-Motiv). Diese Tatsache ist signifikant, da in der Spezies H. sapiens nur 464 von 38002 (= 1.2%) Proteinen (http://www.ebi.ac.uk/proteome/index.html) mit diesen Motiven bzw. in der 2DE-Datenbank der Jurkat T-Zellen nur 7 von 83 Proteinen (= 8.4 %) gefunden wurden. Auffällig war außerdem die Identifikation von 21 Onkoprotein oder Onkoprotein-interagierenden Proteinen.

Die identifizierten Proteine lassen sind in folgende Klassen einteilen (Anzahl ≥ 5): 17 hnRNPs, 8 Spleissfaktoren, 8 Proteine aus dem Translationsprozess, 5 Proteine aus Signalübertragungswegen, 5 Proteine des Chromatins und 5 proteasomale Proteine.

34 Proteine wurden bisher in vitro translatiert. Anschließend erfolgte der Caspase-3-Assay, wobei die translatierten Proteine einerseits mit Caspase-3 und andererseits mit Caspase-3 und den Caspase-Inhibitor Z-VAD-fmk behandelt wurden. 24 Proteine wurden damit als Caspase-3-Substrate nachgewiesen.

20 Proteine wurden sowohl in den Kontroll- als auch in den apoptotischen Zellen identifiziert. 12 dieser Proteine zeigten im Vergleich der Proteinspots eine Verringerung im Molekulargewicht. Neun weitere Proteine, die nur in apoptotischen Zellen identifiziert wurden, hatten einen signifikanten Unterschied im Molekulargewicht größer 10 % zwischen der beobachteten Masse im 2DE-Gel und der theoretischen Masse. Zusammenfassend konnte für 39 der Proteine eine [Seite 33↓] proteolytische Spaltung vorausgesagt werden. 25 Proteine werden nicht geschnitten bzw. nur nahe am N- oder C-Terminus.

Die möglichen Spaltstellen der putativen Caspase-Substrate konnten mehr oder weniger genau mit Hilfe der gewonnenen Daten wie Mw, pI, Peptidmassenfingerabdruck und Caspase-3-Assay vorhergesagt werden. Es wurde keine einheitliche Regel für die RNP-Motive beobachtet. Nur teilweise erfolgten die Spaltungen innerhalb des Sequenzmotivs. Die vielen neuen Caspasesubstrate lassen vermuten, dass es deutlich mehr als die etwa 100 bisher identifizierten Proteine gibt [Earnshaw, 1999]. Die funktionellen Rollen der Spaltprodukte muß in weiteren Untersuchungen aufgeklärt werden [Thiede et al., 2001].

Eindeutige Hinweise auf Translokationen während der Apoptose wurde für 14 der 20 Proteine gefunden, die sowohl in Kontroll- als auch apoptotischen Zellen identifiziert wurden, da die Spots in unterschiedlichen Kompartimenten auftraten. Dabei wurde zur einen Hälfte die gleichen, zur anderen Hälfte unterschiedliche Spotpositionen der Proteine gefunden [Thiede et al., 2002]. Relativ wenige Unterschiede wurden in den Mitochondrien gefunden, obwohl dieses Kompartiment eine bedeutende Rolle im Apoptoseprozess spielt. In den anderen Kompartimenten wurden deutlich mehr Unterschiede entdeckt.

Das Protein p54 nrb besitzt ein RNA-Bindungsmotiv und wurde als mögliches Caspase-Substrat im 2DE-Gel identifiziert. Der Caspase-3-Assay zeigte mehrere Spaltprodukte. Mutationen von drei Asparaginsäuren zu Asparagin bewiesen drei Caspase-Schnittstellen in p54 nrb . Weiterhin wurde gezeigt, dass die RNA einen Einfluss auf die Spaltung durch Caspase-3 hat. Bei Zugabe von RNAse A zum Caspase-3-Assay wurde nur das Spaltfragment beobachtet, welches in der 2DE-Analyse identifiziert wurde, während die anderen Spaltprodukte nicht auftraten. Bei Zugabe des RNAse-Inhibitors RNAsin, RNAse A und Caspase-3 zu p54 nrb hingegen wurde das ursprüngliche Spaltungsmuster von p54 nrb erzeugt.

Globale Proteomanalysen von Apoptose mittels 2DE und anschließender Identifikation der Proteine wurden in unterschiedlichen Zellsystemen und verschiedenen Auslösern des Zelltods durchgeführt [Patterson et al., 1995; Brockstedt et al., 1998; Prasad et al., 1999; Wan et al., 2001]. Diese Analysen beschränkten sich auf Totallysate.

Eine vergleichbare Studie der Fas-induzierten Apoptose in Jurkat T-Zellen erbrachte überwiegend andere Ergebnisse als die hier beschriebenen. 57 Apoptose-assoziierte [Seite 34↓] Spots wurden detektiert. Proteine des Zytoskeletts und Chaperone würden überwiegend identifiziert. Bei diesen Experimenten wurde kein Translationsinhibitor zugegeben, so dass die unterschiedlichen Bedingungen vermutlich zu anderen Ergebnissen führten [Gerner et al., 2000]. Die Einleitung der Apoptose durch Ionisierungsstrahlung führte ebenfalls überwiegend zur Veränderung von vielen Chaperonen [Prasad et al., 1999]. Bei der durch EGTA bzw. Lovastatin-induzierten Apoptose in Jurkat T-Zellen wurden nur geringe Unterschiede festgestellt und nur ein Protein identifiziert [Patterson et al., 1995]. Bei der Proteomanalyse durch Vermittlung der Apoptose durch Entzug von all-trans Retinoesäure wurden 19 differentielle Proteine mit sehr verschiedenen Funktionen identifiziert [Wan et al., 2001]. Die Proteomanalyse der Burkitt Lymphomzelllinie BL60 durch Induktion der Apoptose mit anti-IgM-Antikörper erbrachte ähnliche Ergebnisse wie die in dieser Arbeit beschriebene Fas-induzierte Apoptose. Dabei wurde die gleiche 2DE-Technik verwendet. Etwa die Hälfte der identifizierten Proteine wurde auch bei der Fas- bzw. Cis-Platin induzierten Proteomanalyse gefunden [Brockstedt et al., 1998].

Aus den verschiedenen Proteomanalysen der Apoptose ließ sich eine starke Abhängigkeit bzgl. der experimentellen Bedingungen erkennen. Die Verhinderung der Translation vermeidet die Identifikation von Stressproteinen. Die Analyse der Kompartimente ergab eine deutlich höhere Anzahl von modifizierten Proteinen und Informationen über Translokationen.

2.2. Die Proteomanalyse von Ribosomen

Zwei verschiedene Projekte wurden für die Proteomanalyse des Ribosoms durchgeführt. Zum einen wurden unbekannte mitochondriale ribosomale Proteine über die klassische Proteomanalyse mit Hilfe von EST-Datenbanken aufgeklärt [2.2.1]. Zum anderen wurden strukturelle Proteomanalysen zur Aufklärung von RNA-Protein-Wechselwirkungen von Untereinheiten des Ribosoms von E. coli nach Quervernetzung durchgeführt [2.2.2.]. Der Vergleich von durch Quervernetzung ermittelten RNA-Peptid-Wechselwirkungen mit nicht-kovalenten Komplexen diente zur Bestätigung der Strukturabhängigkeit der RNA-Protein-Wechselwirkungen im Ribosom und zeigte, dass diese nicht-kovalenten Komplexe mit MALDI-MS qualitativ und quantitativ analysiert werden können [2.2.3.].


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2.2.1.  Die Proteomanalyse mitochondrialer Ribosomen

Mitochondriale ribosomale Proteine (MRPs) sind Teil des mitochondrialen Proteinbiosynthesesystems. Die Anzahl der MRPs ist im Vergleich zu bakteriellen Ribosomen vergrößert. Trotz der Annahme, dass bis zu 100 MRPs in mitochondrialen Ribosomen enthalten sind, wurde bislang nur ein Teil auf molekularer Ebene vollständig charakterisiert [Graack und Wittmann-Liebold, 1998]. Durch die Genomsequenzierungsprojekte sind mittlerweile eine Fülle von DNA-Sequenzen verfügbar, doch den meisten Sequenzen fehlt eine funktionelle Zuordnung. Partielle Aminosäuresequenzen von MRPs aus dem Rind wurden durch Screening von EST-Datenbanken verwendet, um die homologen Proteine aus Mensch, Maus und Ratte zu bestimmen [O´Brien et al., 1999; O´Brien et al., 2000]. Die Vorgehensweise ist in Abbildung 3 schematisch dargestellt. Die MRPs einer ribosomalen Untereinheit wurden zunächst durch 2DE getrennt. Dann erfolgte der Trypsin-Verdau einzelner Spots und schließlich wurden die erzeugten Peptide durch RP-HPLC getrennt. Die Sequenzierung erfolgte bei Peptidfraktionen ausreichender Menge (≥ 1 Picomol) durch N-terminale Sequenzanalyse, bei geringeren Mengen per ESI-MS/MS. Diese Vorgehensweise wurde gewählt, da durch die N-terminale Sequenzanalyse in der Regel eindeutigere und längere Sequenzen erhalten werden als über MS/MS, jedoch ist letztere Methode sensitiver. Die gewonnenen Sequenzen wurden mit EST-Datenbanken der Spezies Mensch, Maus und Ratte durch Verwendung von BLAST verglichen. Dabei wurden in der Regel ein oder mehrere cDNA-Sequenzabschnitte erhalten. Diese wurden wiederum verwendet, um überlappende und erweiternde cDNA-Sequenzabschnitte zu finden bis ein putativer offener Leserahmen aufgeklärt wurde. Auf dieser Ebene konnten in einigen Fällen auch Aussagen über die Exon/Intron-Struktur gemacht werden. Der putative offene Leserahmen konnte wieder in die Proteinsequenz umgewandelt werden. Daraus wurde das Molekulargewicht und der isoelektrische Punkt berechnet und mit der Herkunft des jeweiligen Proteinspots aus dem 2DE-Gel verglichen. Die Verwandtschaft zu anderen ribosomalen Proteinen und mitochondrialen Signalsequenzen konnte ebenfalls mit Hilfe der Primärsequenz ermittelt werden.

Insgesamt wurden 14 N-terminale und fünf de novo MS/MS-Sequenzen von neun Rinder-MRPs erhalten. Zwei ribosomale Säugetierproteine waren bereits bekannt. Die homologen cDNA-Sequenzen von Mensch, Maus und Ratte der restlichen sieben Proteine konnten in allen Fällen zugeordnet werden. Die Sequenzkonservierung der [Seite 36↓] Säugetierproteine von den MRPs (70-90 %) im Vergleich zu den cytosolischen ribosomalen Proteinen (> 95%) war geringer.

Abbildung 3 : Schematische Darstellung der Identifikation von mitochondrialen ribosomalen Proteinen aus EST-Datenbanken.

Von den sieben Proteinen wurden in vier Fällen Sequenzähnlichkeiten zu cytosolischen ribosomalen Proteinen aus E.coli und in drei Fällen zu MRPs aus Hefe gefunden. Die cytosolischen ribosomalen Proteine und die MRPs derselben Spezies zeigten eine nähere Verwandtschaft als die MRPs von Säugetier und Hefe. Außerdem konnten allen Proteinen korrespondierende Sequenzen aus C. elegans zugeordnet werden.

Die Ergebnisse der identifizierten MRPs bzgl. der mitochondrialen Signalsequenzen waren sehr variabel. Einerseits wurden typische, spaltbare Signalsequenzen gefunden, andererseits fehlten diese völlig [O´Brien et al., 1999; O´Brien et al., 2000].


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2.2.2.  Kovalente RNA-Protein-Wechselwirkungen im Ribosom von E. coli

Zum Verständnis von RNA-Protein-Wechselwirkungen ist die Aufklärung der in Kontakt stehenden Moleküle erforderlich. In Abwesenheit von hochauflösenden Strukturdaten sind Quervernetzungstechniken für diese Fragestellung nützlich [Haynes, 1999]. Zur Aufklärung der beteiligten Molekülabschnitte nach Quervernetzung wurde eine Vorgehensweise entwickelt, die ausschließlich auf proteinanalytischen Methoden beruhte (Abbildung 4).

Als Modellsystem wurden ribosomale Untereinheiten verwendet. Nach der Quervernetzung mit 2-Iminothiolan oder durch UV-Bestrahlung wurden die rRNA-enthaltenden Fraktionen durch Gelfiltration von den nicht quervernetzten Proteinen getrennt. Der anschließende Endoprotease-Verdau und die darauf folgende Gelfiltration wurden verwendet, um die rRNA-enthaltenden Fraktionen von den nicht quervernetzten Peptiden zu trennen. Danach wurde zur Erzeugung von Oligoribonukleotid-Peptid-Komplexen ein Verdau mit Ribonuklease T1 durchgeführt. Da die Struktur der rRNA den vollständigen Verdau bei der ersten Endoprotease-Behandlung behindert, war ein zweiter Endoprotease-Verdau erforderlich. Die Oligoribonukleotid-Peptid-Komplexe wurden schließlich durch RP-HPLC isoliert. Die Fraktionen mit einer Absorption bei 220 nm (Peptid) und 260 nm (RNA) wurden anschließend analysiert. Die Aminosäuresequenz wurde durch N-terminale Sequenzanalyse bestimmt. Die Sequenz bestimmte das beteiligte ribosomale Protein und eine Lücke innerhalb der Sequenzanalyse lokalisierte die quervernetzte Aminosäure. Die RNA-Sequenz wurde mit MALDI-MS oder ESI-MS/MS bestimmt. Der Vergleich der MALDI-MS Messungen vor, nach alkalischer Hydrolyse und nach 5´→ 3´-Phosphodiesterase-Verdau führten zu RNA-Sequenzleitern, woduch in der Regel die RNA-Sequenz und das quervernetzte Nukleotid bestimmt werden konnten. Die RNA-Sequenz konnte dann der rRNA zugeordnet werden. Die Fragmentierung der Oligoribonukleotid-Peptid-Komplexe mit ESI-MS/MS hingegen zeigte die RNA-Sequenz in einem Experiment. Die Dominanz der RNA-Fragmentierungen verhinderte jedoch den Erhalt von Sequenzinformationen des korrespondierenden Peptides.

Die beschriebenen Experimente wurden am 30S-Ribosom und am 50S-Ribosom von E. coli angewendet. Insgesamt wurden zehn RNA-Protein-Kontaktstellen von neun ribosomalen Proteinen mit der dargestellten Methodik identifiziert [Urlaub et al., 1997; Thiede et al., 1998]. Zu diesem Zeitpunkt gab es noch keine Kristallstrukturen des


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Abbildung 4 : Schematische Darstellung der Identifizierung der RNA-Protein-Quervernetzungsstellen am Beispiel der Ergebnisse des 30S-Ribosoms von E. coli .

Die Kästchen mit den Zahlen symbolisieren die 21 ribosomalen Proteine.


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Ribosoms und somit dienten diese Daten zur Verfeinerung von ribosomalen Modellen. Die dreidimensionale Struktur von vier (S4, S7, S8, S17) der neun ribosomalen Proteine war vor Lösung der Kristallstrukturen ganzer ribosomalen Untereinheiten bekannt [Ramakrishnan und White, 1998]. Dadurch konnten diese Proteine an festen Punkten in rRNA-Modelle eingepasst und mit kryoelektronenmikroskopischen Bildern korreliert werden [Mueller und Brimacombe, 1997b; Tanaka et al., 1998]. Anhand der Kristallstrukturen der vier ribosomalen Proteine konnten die RNA-Protein-Kontaktstellen sekundären Strukturmotiven zugeordnet werden. Vier der quervernetzten Aminosäuren (S4, S7, S8, S17) befanden sich in Schleifen und eine innerhalb (S7) eines β -Faltblattes. Auf rRNA-Ebene wurden fünf interne Schleifen (zu S7(2x), S17, L2, L27), drei Haarnadelschleifen (zu L4, L21, L23), ein Dreistammknotenpunkt (zu S8) und das 3´-Ende (zu S4) als Kontaktpunkte festgestellt. Aus diesen Ergebnissen läßt sich folgern, dass Schleife-Schleife-Strukturen begünstigte RNA-Protein-Interaktionsstrukturen sind.

Die Korrelation der Kristallstrukturdaten der kleinen ribosomalen Untereinheit mit den Quervernetzungsdaten zeigte gute Übereinstimmungen. Die Quervernetzungsstellen von den ribosomalen Proteinen S7 (2x) und S8 zur 16S rRNA wurden exakt als Kontaktstellen bestimmt. Bei S17 wurde eine Interaktionsstelle drei Nukleotide entfernt zur Quervernetzungstelle gefunden, was mit der Länge des Quervernetzers 2-Iminothiolan (7 Å) erklärt werden kann. Nur die Quervernetzungsstelle von S4 am 3`-Ende der 16S rRNA konnte nicht verifiziert werden [Brodersen et al., 2002]. Die Quervernetzungsstelle von L2 zur 23S rRNA wurde ebenfalls in unmittelbarer Nähe der dreidimensionalen Struktur der Komponenten gefunden [Sergiev et al., 2001], von L4, L21, L23 und L27 existieren bisher keine veröffentlichten Daten.

2.2.3. Nicht-kovalente RNA-Peptid Wechselwirkungen

Massenspektrometrische Methoden können zur Untersuchung von nicht-kovalenten Wechselwirkungen verwendet werden [Hofstadler und Griffey, 2001]. Für diese Analysen wird gewöhnlich ESI-MS bevorzugt verwendet, da nahezu unter physiologischen Bedingungen gearbeitet werden kann. Die Probenpräparation bei MALDI-MS hingegen verläuft unter denaturierenden Bedingungen. Aus diesem Grund wurden bisher nur wenige nicht-kovalente Komplexe mit dieser Technik untersucht.


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Synthetische Peptide und Oligoribonukleotide wurden zur Untersuchung von RNA-Peptid-Wechselwirkungen herangezogen. Dabei wurden u.a. Peptide und Oligoribonukleotide aus den Quervernetzungsstudien des Ribosoms verwendet [2.2.2].

Zunächst wurde eine geeignete Matrix für die MALDI-MS-Analyse gesucht. 2,4,6-Trihydroxyacetophenon erwies sich als günstig, da Oligoribonukleotide und Peptide mit etwa gleicher Intensität detektiert werden konnten und die Komplexe sichtbar waren. Die Intensität der RNA-Peptid-Komplexe war stark abhängig von basischen Aminosäuren, wobei Arginin den eindeutig stärksten Einfluss hatte. Das Arginin-reiche- und RGG-Motiv sind für die RNA-Erkennung bekannt [Burd und Dreyfuss, 1994]. Auf Nukleotidebene wurde keine Präferenz von bestimmten Basen bzw. Purinen/Pyrimidinen und keinen Einfluss der Sekundärstruktur festgestellt.

Diese Daten zeigten, dass die RNA-Protein-Wechselwirkungen im Ribosom von der komplexen Struktur des Ribonukleoproteinpartikels abhängig sind und nicht mit einfachen Peptiden und Oligoribonukleotiden gebildet werden. Andererseits konnte die prinzipielle Verwendbarkeit von MALDI-MS für nicht-kovalente Wechselwirkungen dargestellt werden. Außerdem können die Affinitäten von verschiedenen Molekülen zu einem Zielmolekül durch den Vergleich der Peakintensitäten ermittelt werden [Thiede und von Janta-Lipinski, 1998].


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