Ullrich, Oliver: Mechanismen protektiver und destruktiver Funktionen der Poly(ADP-Ribose)-Polymerase-1 (PARP-1) bei Zell- und Gewebeschädigungen

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Kapitel 1. Einleitung

1.1 Die Poly(ADP-ribosyl)ierung - Biochemische und zellbiologische Grundlagen

1.1.1 Historische Aspekte

Die Existenz von Poly(ADP-Ribose)-Molekülen im Kern von Säugerzellen als eine bis dahin noch unbekannte "dritte Art von Nukleinsäuren" (D´Amours et al., 1999) wurde vor etwa 40 Jahren erstmals 1963 von Chambon et al. beschrieben (Chambon et al., 1963). Dieses unbekannte Molekül wurde ursprünglich als ein Homopolymer aus Riboadenylat-Einheiten (Poly-A) angesehen (Chambon et al., 1963), 3 Jahre später aber von den gleichen Autoren nun richtigerweise als ein Homopolymer aus ADP-Ribose-Einheiten beschrieben, bei dessen Synthese die Hydrolyse von NAD+ und die Freisetzung von Nikotinamid beobachtet wurde (Chambon et al., 1966; Chambon et al., 1963). Im Zuge der Fokussierung der biowissenschaftlichen Forschung auf die Nukleinsäuren DNA und RNA vergingen anschließend mehr als 10 Jahre bis zur vollständigen Aufklärung der Struktur dieser "ditten Nukleinsäure", die sich als hochverzweigtes Molekül mit einer helicalen Struktur in den linearen Abschnitten erwies (Miwa et al., 1981; Minaga et al., 1983).

Über mögliche zellbiologischen Funktionen gab es damals so gut wie keine Erkenntnisse, und die Arbeit an dem Phänomen "Poly(ADP-Ribosyl)ierung" galt noch bis zum Beginn der 90-er Jahre als ein eher "esoterisches" Gebiet, auf dem nur eine sehr begrenzte Zahl von Forschergruppen tätig war (Bürkle et al., 2001). Diese Situation hat sich den letzten 10 Jahren dramatisch geändert, nicht nur mit dem deutlichen Zuwachs an Erkenntnissen über die biochemischen Aspekte der Poly(ADP-ribosyl)ierung wie z.B. die Indentifizierung wichtiger Zellkernproteine, deren Funktionen Poly(ADP-ribosyl)ierungs-abhängig reguliert werden, sondern auch vor allem mit der Erkenntnis ihrer Beteiligung an der DNA-Reparatur, an der Apoptose und an der Transkriptionsregulation (Bürkle et al., 2001; D´Amours et al., 1999). Hinzu kamen wesentliche neue Erkenntnisse über die zentrale Rolle der Poly(ADP-Ribosyl)ierung im Rahmen von Ischämie-Reperfusionsschäden im ZNS, bei neurodegenerativen Erkrankungen (Ha et al., 2000) und bei inflammatorischen Gewebeschäden wie z.B. beim juvenilen Diabetes mellitus (Burkart et al., 1999; Pieper et al., 1999), beim


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septischen Schock (Szabo et al., 1996; Szabo et al., 1997; Oliver et al., 1999), beim M.Crohn (Jijon et al., 2000) und beim Myokardinfarkt (Pieper et al., 2000; Zingarelli et al., 1998). Neben den Erkrankungen des ZNS wird der Poly(ADP-Ribosyl)ierung aufgrund ihrer Funktion bei der DNA-Reparatur auch eine wesentliche Bedeutung im Rahmen der Abwehrmaßnahmen von Tumorzellen bei der chemo- oder radiotherapeutischen Tumorbehandlung zugesprochen (de Murcia et al., 2000).

Seit Mitte und Ende der 90-er Jahre haben daher eine Vielzahl pharmazeutischer Unternehmen mit der präklinischen Entwicklung von selektiven Inhibitoren der Poly(ADP-Ribose)-Polymerase-1 (PARP-1) begonnen, deren Haupteinsatzgebiet die Therapie des Schlaganfalls und die Behandlung von Tumorerkrankungen sein soll (z.B. Guilford Inc. und Agouron/Pfizer Inc.). Eine ganz neue Dimension erhielt die Erforschung der Poly(ADP-ribosyl)ierung mit der Entdeckung einer Vielzahl "neuer" PARPs ab dem Jahr 1998, deren Funktion und Lokalisation sich teilweise grundsätzlich von der "klassischen" PARP, nun PARP-1 genannt, unterscheidet: Diese neuen PARPs sind z.B. an der Regulation der Telomersynthese (Tankryase, Smith et al., 1998) oder der Funktion der mitotischen Spindel (VPARP, Kieckhoefer et al., 1999) essentiell beteiligt.

Die in dieser Schrift zusammengefaßten Arbeit sollten durch die Entdeckung von zwei grundsätzlich neuen zellbiologischen Funktionen der PARP-1 und der Identifizierung und Charakterisierung dieser neuen Funktionen unter pathophysiologischen Bedingungen zu einem erweiterten molekularen und funktionellen Verständnis der Poly(ADP-ribosyl)ierung bei Zell- und Gewebeschädigungen beitragen. Diese hier vorgelegten Arbeiten haben bereits Eingang in kürzlich erschienene Übersichtarbeiten (Bürkle et al., 2001) gefunden und wurden im Zusammenhang mit der im Juni 2001 stattgefundenen "18th Conference on ADP-ribosylation reactions" in New York als eine der fünf wichtigsten Fortschritte der PARP-Forschung der letzten 5 Jahre genannt (Jacobson et al., 2001).

1.1.2 Enzyme und Gene des Poly(ADP-Ribose)-Stoffwechsels

Die Poly(ADP-Ribosyl)ierung ist eine direkte posttranslationale Modifikation von Glutamat-, Aspartat- und Lysin-Resten nukleärer Proteine (Akzeptorproteine), die durch ein 113 kDa-großes Enzym, die Poly(ADP-Ribose)-Polymerase-1 (PARP-1; EC 2.4.2.30), katalysiert wird. Diese ADP-Ribose-Polymere entstehen aus der sequentiellen


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Synthese von ADP-Ribose-Einheiten aus NAD+ und können eine sehr hohe Komplexität erreichen, mit bis zu 200 Einheiten und verschiedenen Verzweigungsstellen. Diese Polymere repräsentieren nun eine geballte Ansammlung negativer Ladungen, die entscheidend für die physiologische Funktion der Poly(ADP-Ribose) sind (de Murcia et al., 2000; Realini et al., 1992).

Ohne den später behandelten physiologischen und pathophysiologischen Funktionen der PARP vorzugreifen, soll zum Verständnis der Biochemie dieser Reaktion bereits hier erwähnt werden, welche dramatischen Auswirkungen diese auf den Zellstoffwechsel haben kann: Im Zellkern von Säugerzellen lauert etwa ein PARP-1-Molekül pro 1000 DNA-Basenpaare (Lautier et al., 1993), das sind etwa eine Million PARP-1-Moleküle pro Zelle (Ludwig et al., 1988), bereits nach geringsten DNA-Schäden sofort hochaffin an die DNA zu binden (Zhang et al., 1995) und unter einer etwa 500-fachen Aktivitätssteigerung innerhalb von Minuten (Krupitza et al., 1989) gewaltige Mengen an ADP-Ribose-Polymeren zu synthetisieren. Dabei kann es innerhalb von wenigen Minuten zur Hydrolyse von über 80 % des gesamten zellulären NAD+ -Pools kommen, worauf die Zelle den durch ATP-Mangel verursachten nekrotischen Tod stirbt (Berger et al., 1985; Ha et al., 2000; Bürkle et al., 2001).

Natürlich markiert dieses Szenario nur das extreme Ende auf einer Skala abgestufter und fein regulierter Poly(ADP-ribosly)ierungs-Reaktionen im Rahmen der physiologischen Zellfunktion, macht aber deutlich, daß die Frage der Balance zwischen physiologischer und destruktiver Funktion der PARP eher ein rein quantitative als ein qualitative Frage ist (Bürkle et al., 2001).

Die PARP-1 ist das bisher am besten untersuchte Protein der PARP-Protein-Familie. Sie ist ein evolutionär hochkonserviertes Enzym mit einer charakteristischen 3-Domänen-Struktur: Die 42 kDa große aminoterminale Region bindet über zwei Zink-Finger-Motive an DNA-Strangbrüche, die zu einer sofortigen Aktivierung des katalytischen Zentrums der carboxyterminalen NAD+ -bindenen Domäne führt. Die katalytisch aktive Form der PARP-1 ist ein Dimer (Mendoza-Alvares, 1993). Das wichtigste Akzeptorprotein für die ADP-Ribose-Polymere ist dabei die PARP-1 selbst, wobei diese Automodifikation hauptsächlich an einer 16 kDa-großen separaten Protein-Domäne stattfindet, die 15 konservierte Glutamat-Seitenketten als Akzeptorstellen für die Poly(ADP-Ribose) besitzt (D´Amours et al., 1999). Eine weitere, Strangbruch-unabhängige, aber sequenzspezifische DNA-Bindungsaktivität der PARP-1 wird den


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Modulen C und D zugesprochen, die somit wahrscheinlich eine Rolle in der Transkriptionsregulation spielen (D´Amours et al., 1999).

Abb. 1: (aus Smith S. The world according to PARP. Trends in Biochemical Sciences 26, 174-179, 2001): (a) ADP-Ribosylierung eines Akzeptor-Proteins: Übertragung von ADP-Ribose aus NAD+ auf einen Glutamat-Rest an einem Akzeptor-Protein durch die PARP. Die an das Protein gebundene ADP-Ribose-Einheit kann nun als Akzeptor für weitere ADP-Ribose-Einheiten dienen. (b) Synthese des hochgradig negativ geladenen langen, linnearen und verzweigten ADP-Ribose-Polymers. (c) Viele kovalent gebundene hochgradig negativ geladene ADP-Ribose-Polymere lösen das so modifizierte Protein von der DNA ab.


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Die PARP-1 wird vom humanen ADPRT-Gen (chromosomale Lokalisation 1q41-q42) codiert, das analoge murine Adprt1-Gen codiert zusätzlich noch für das murine 55kDa große sPARP-1-Protein (Sallmann et al., 2000). Experimente an Ewing´s-Sarkom-Zellen haben Hinweise darauf geliefert, daß die ADPRT-Expression durch einen ETS-Transkriptionsfaktor reguliert wird, der mit multiplen ETS-Bindungs-Motiven der ADPRT-Promoter-Region interagiert (Soldatenkov et al., 1999). Während das ADPRT-Gen konstitutionell abhängig vom Zelltyp und Differenzierungsgrad exprimiert wird, kann die katalytische Aktivität der PARP-1 durch Bindung an DNA-Einzel- oder Doppelstrangbrüche bis auf das 500-fache gesteigert werden (Krupitza et al., 1989). Diese Aktivierung findet unmittelbar nach einem DNA-Schaden statt und kann bereits bei sehr wenigen DNA-Schäden nachgewiesen werden (Zhang et al., 1995).

Seit wenigen Jahren ist bekannt, daß die "klassische" PARP, die heutige "PARP-1" nicht das einzige Enzym mit Poly(ADP-Ribosyl)ierungs-Aktvität ist. So wurden kürzlich weitere Poly(ADP-Ribose)-Polymerasen identifiziert (Smith et al., 2001), die bis zu 25% der gesamten zellulären Poly(ADP-Ribose)-Produktion ausmachen (Shieh et al., 1998). Zu diesen neu entdeckten Proteinen aus der PARP-Familie gehören die humane hPARP-2, die humane hPARP-3, die murine mPARP-2 und die murine sPARP (Ame et al., 1999; Berghammer et al., 1999; Johansson et al., 1999; Sallmann et al., 2000). Auch die bisher verbreitete Ansicht, daß PARPs nur auf den Säugerorganismus beschränkt sind, konnte widerlegt werden: Zwar konnten bisher weder in Hefen, noch in Bakterien PARPs nachgewiesen werden, wohl aber in Pflanzen. So besitzen Arabidopsis thaliana (Babiychuk et al., 1998) und Zea mays (Mahajan et al., 1998) eine PARP ohne aminoterminale Zink-Finger-Domäne. Auch in Drosophila konnte eine PARP mit (dPARP-1) und eine PARP ohne (dPARP-2) Automodifikationsdomäne nachgewiesen werden (Kawamura et al., 1998).

Während die carboxyterminale katalytische Domäne der 62 kDa großen mPARP-2 homolog zur PARP-1 ist, fehlen der aminoterminalen Domäne die beiden Zink-Finger-Motive und die Kernlokalisationssequenz. Trotzdem zeigt auch die mPARP-2 eine DNA-abhängige Aktivität (Ame et al., 1999). Der 55,3 kDa großen sPARP-1 fehlen die aminoterminale und zentrale Proteindomäne, während die carboxyterminale katalytische Domäne zur PARP-1 identisch ist. Im Gegensatz zur PARP-1 und mPARP-2 kann aber die sPARP DNA-unabhängig aktiviert werden, aber


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auch durch DNA-Strangbrüche (Sallmann et al., 2000). Die mPARP-2 ist weit weniger katalytisch aktiv als die PARP-1, kann aber wahrscheinlich zu einem großen Teil zur Gesamt-PARP-Aktivität der Zelle beitragen. Wie die PARP-1, kommen auch die hPARP-2, mPARP-2 und hPARP-3 praktisch ubiquitär vor. Alle diese PARPs werden von grundsätzlich verschiedenen Genen mit Lage auf verschiedenen Chromosomen codiert, mit Ausnahme der sPARP-1, deren Gen unmittelbar in der Nähe zu dem der PARP-1 liegt (Ame et al., 1999). Das legt die Vermutung nahe, daß die sPARP-1 ein Produkt einer alternativen Initiationsstelle der Transkription des PARP-Gens darstellt.

Ein weiteres interessantes Protein aus der PARP-Familie ist die 1998 entdeckte Tankryase (Smith et al., 1998). Diese 142 kDa große PARP interagiert über 24 ankryin-repeat-Motive mit der aminoterminalen Domänen von TRF1, einem Telomer-spezifischen Protein, das die Polymerlänge reguliert (Smith et al., 1998). Der Name leitet sich von "TRF1-interacting, ankryin-related ADP-ribose polymerase" = "Tankryase" (Smith et al., 1998) her. Durch die Bindung an TRF-1 verhindert die Tankryase dessen Bindung an die Telomere, was die Telomer-Elongation begünstigt, vermutlich über eine Eröffnung des Telomer-Komplexes und Ermöglichung des Zuganges der Telomerase (Smith et al., 2000). Eine weiteres Protein aus der Familie der PARPs stellt die 1999 entdeckte 93 kDa große Vault-Poly(ADP-Ribose)-Polymerase (VPARP) dar, die das “major vault protein“ (MVP) ADP-ribosyliert und in der Mitosespindel lokalisiert ist (Kieckhoefer et al., 1999).

Die Vielzahl neu entdeckter Proteine aus der PARP-Familie legen nahe, daß die Poly(ADP-Ribosyl)ierung ein innerhalb der Zelle durchaus sehr verbreitetes Regulationsprinzip sein könnte, das nicht allein auf den Zellkern beschränkt ist. Die Schnelligkeit dieser Reaktion innerhalb von Minuten nach einem auslösenden Ereignis, die gravierenden Veränderungen der physikochemischen Eigenschaften eines so modifizierten Proteins durch das Einführen einer gewaltigen Zahl negativer Ionenladungen und die Existenz DNA-unabhängiger PARPs lassen vermuten, daß die Poly(ADP-Ribosyl)ierung wahrscheinlich in noch vielfältigerer Weise an der intrazellulären Signaltransduktion teilnimmt, als bisher vermutet. Unabhängig davon trägt die rein nukleär lokalisierte PARP-1 zu über 80 % der Poly(ADP-Ribsoyl)ierungs-Kapazität einer Zelle bei und ist hier Gegenstand der Untersuchungen.

Nach der Betrachtung der Poly(ADP-Ribose)-Synthese soll hier auch der enzymatische Abbau der Poly(ADP-Ribose) nicht unerwähnt bleiben: Poly(ADP-Ribose) hat eine sehr


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kurze Halbwertszeit von etwa 1 min (Alvarez-Gonzales et al., 1989) und wird durch die Poly(ADP-Ribose)-Glykohydrolase (PARG) zu freier ADP-Ribose abgebaut (Miwa et al., 1971). Diese PARG ist ebenfalls im Zellkern lokalisiert und in etwa 13-50-mal geringerer Konzentration vorhanden als die PARP, ist dafür aber etwa 50-70-mal katalytisch aktiver und dadurch in der Lage, Poly(ADP-Ribose) ohne kinetische Limitierung abzubauen (Hatakeyama et al., 1986). Über die physiologischen und pathophysiologischen Wirkungen des dabei entstehenden Produktes, der freien ADP-Ribose, ist bisher nur wenig bekannt. Diese freie ADP-Ribose ist in der Lage, sehr schnell über die Maillard-Reaktion mit Lysin-Seitenketten von Proteinen zu reagieren und diese nichtenzymatisch zu glykosylieren (Cervantes-Laurean et al., 1996). Die Reaktion von Histon H1 mit freier ADP-Ribose führt zur dessen Carbonylierung (Wondrak et al., 2000). Derzeit vorherrschende Ansichten favorisieren allerdings die Abspaltung der ADP-Ribose-Polymere vom Akzeptorprotein durch eine ADP-Ribosyl-Protein-Lyase, wonach eine ADP-Ribose-Pyrophosphatase die freien ADP-Ribose-Monomere zu AMP und Ribose-5-Phosphat abbaut (Wielckens et al., 1982).

1.2 Zelluläre und molekulare Funktionen der Poly(ADP-Ribosyl)ierung

Grundlage der zellulären und molekularen Funktionen der Poly(ADP-Ribosyl)ierung ist entweder die direkte kovalente Modifikation von Aminosäureseitenketten von Akzeptorproteinen durch Synthese polymerer ADP-Ribose-Ketten (Heteromodifikation), oder die nichtkovalente Bindung von Poly(ADP-Ribose)-Ketten der automodifizierten PARP-1 an Effektorproteine (de Murcia et al., 2000; Pleschke et al., 2000). Die Poly(ADP-Ribosyl)ierung von Histonen führt zur Chromatindekondensation (Frechette et al., 1985, Niedergang et al., 1985), die eine Voraussetzung für die Bindung von Transkriptionsfaktoren an die DNA darstellt. Nach Abbau der Poly(ADP-Ribose) kommt es wieder zur Kondensation des Chromatins (de Murcia et al., 1986). Die sofortige und schnelle Bindung der PARP-1 an DNA-Schäden verhindert hocheffektiv die Interaktion geschädigter DNA mit genetischen Rekombinationssystemen und die Bindung anderer DNA-bindener Moleküle (Chatterjee et al., 1999; de Murcia et al., 1997; Morrison et al., 1997; Wang et al., 1997). Dadurch kann ein sofortiger Stop der Translation durch Bindung an Stellen der Transkriptionsinitiation (“nick-protection“) erreicht werden, so daß eine fehlerhafte Translation vermieden wird. Nach Abdiffusion der PARP-1 unter Mitnahme von nicht-


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kovalent-gebundenen Histonen wird dann die DNA ihren Reparaturenzymen zugänglich gemacht (de Murcia et al., 1994). Dieses "Histon-Shuttling" und die "Nick-Protection" sind wichtige Erklärungsmodelle der Funktion der PARP-1 bei DNA-Reparatur und Erhaltung der genomischen Stabilität:

1.2.1 DNA-Reparatur und genomische Stabilität

Schon seit 1985 ist bekannt, daß die Behandlung mit DNA-schädigenden Substanzen über die Aktivierung der PARP zu einer deutlichen NAD+ -Depletion führt (Berger et al., 1985). Daher können entsprechend massive DNA-Schäden über eine Überaktivierung der PARP, zum schnellen und drastischen Verlust an NAD+ und ATP zum Zelltod führen (Berger et al., 1985). Dieses Konzept stellt etwa 10 Jahre später die Grundlage späterer Experimente zum neuronalen Zelltod nach einem Ischämieschaden und seiner Verhinderung durch Hemmung der der PARP-1 dar (Zhang et al., 1994; Cosi et al., 1994; Eliasson et al., 1997).

Es gilt als sicher, daß die Poly(ADP-Ribosyl)ierung das Überleben von proliferierenden Zellen ermöglicht, die auf einem moderaten Niveau mit DNA-schädigenden Substanzen wie Alkylantien, Oxidantien und ionisierender Strahlung ausgesetzt worden sind (de Murcia et al., 2000). Ebenso gilt eine Beteiligung der PARP-1 bei der DNA-Basen-Exzisionsreparatur, dem bevorzugten Weg, DNA-Schäden geringer Größe zu entfernen, als sicher (de Murcia et al., 2000). Die Poly(ADP-Ribosyl)ierung repräsentiert hier eine sofortige zelluläre Antwort auf DNA-Schäden, induziert durch ionisierende Bestrahlung, alkylierende Agentien und Oxidantien (de Murcia et al., 2000). Die molekulare Funktion der PARP-1 bei der nukleären Reaktion auf DNA-Schäden liegt dabei wahrscheinlich in der nicht-kovalenten Bindung der Poly(ADP-Ribose) an spezifische Checkpoint-Proteine des DNA-Schadens über eine 20 Aminosäuren lange Poly(ADP-Ribose)-Bindungssequenz begründet: So wurde eine Bindung der automodifizierten PARP an folgende Checkpoint-Proteine nachgewiesen: p53, p21 CIP1/WAF1, XPA, MSH6, DNA-Ligase III; XRCC1, DNA-Polymerase epsilon, DNA-PKCS, Ku70, NF-_B, iNOS, Caspase-aktivierte DNase und Telomerase (Pleschke et al., 2000).

Auf den ersten Blick erscheint es nun widersprüchlich, daß die PARP-1 über "nick-protection", das "histon-shuttling" und die Bindung an Checkpoint-Proteine des DNA-Schadens die DNA-Reparatur einleitet, auf der anderen Seite aber ebenfalls nach einem


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DNA-Schaden über die NAD+- und ATP-Depletion die Zelle metabolisch zu töten vermag. Doch dieses ist nur scheinbar ein Widerspruch, denn genomisch schwer geschädigte Zellen zeigen eine erhöhte Mutationsrate und eine höhere Wahrscheinlichkeit zur malignen Transformation. Die Aktivierung der PARP nach einem DNA-Schaden führt dann für die individuelle Zelle zu einer schicksalshaften Entscheidung, entweder zur Reparatur des Schadens oder zum Tod der schwer genomisch geschädigten Zelle. Für den Gesamtorganismus hat diese extreme Dichotomie auf Zellebene, Reparatur oder Tod, allerdings nur eine Konsequenz: Das Vermeiden der Entstehung genomisch geschädigter Zellpopulationen.

Die Bedeutung der PARP-1 für die genomische Stabilität konnte auch in in vivo-Experimenten gezeigt werden: So zeigte die PARP-1 -/- - Maus schwere Hämorrhagien nach ionisierender Bestrahlung aufgrund einer schweren Myelosuppression (Masutani et al., 2000) und eine hohe Anfälligkeit gegenüber alkylierenden Substanzen (Tsutsumi et al., 2001). Interessanterweise wird diese genomische Stabilität vermutlich nicht allein über die aktivierte PARP, sondern auch über das „inaktive“ PARP-Protein selber erreicht: So konnte die genomisch instabile tetraploide Zellpopulation in PARP-1 -/- -Fibroblasten durch Transfektion mit einer PARP-1-cDNA in eine stabile Form überführt werden, während PARP-1 +/+ - Fibroblasten durch Hemmung der PARP-1 aber nicht in eine tetraploide Form überführt werden konnten (Simbulan-Rosenthal et al., 2001). Diese Effekte der PARP-1 sind möglicherweise teilweise unabhängig von ihrer katalytischen Funktion, z.B. als Co-Transaktivator von NF-_B (Oliver et al., 1999) . In einem umgekehrten Ansatz verhinderte die Überexpression der PARP-1 deutlich den Alkylantien-induzierten siter-chromatid-exchange (SCE) bei gleichzeitigem Anstieg der Zytotoxizität (Meyer et al., 2000). Das Konzept "Reparatur oder Tod" im Falle von DNA-Schäden auf Einzelzellebene scheint hierbei für physiologische Bedingungen durchaus sinnvoll zu sein. Aber im Falle einer "unphysiologischen" und vorsätzlichen Zellschädigung, wie z.B. im Rahmen der Tumortherapie, kann der Eingriff in die Poly(ADP-Ribosyl)ierung prinzipiell zwei gegensätzliche Konsequenzen haben: Entweder den verstärkten Tumorzelltod durch Hemmung der Reparaturprozesse oder ein verbessertes Tumorzellüberleben durch Hemmung der todbringenden PARP-1-induzierten NAD+ - und ATP-Depletion. Das gleichzeitige Existieren beider gegensätzlicher Möglichkeiten dürfte die Anwendung von PARP-1-Inhibitoren in der Tumortherapie prinzipiell erschweren.


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1.2.2 Transkriptionskontrolle

In den letzten Jahren wurden viele funktionelle Interaktionen zwischen der automodifizierten PARP-1 mit verschiedenen Transkriptionsfaktoren gefunden (de Murcia et al., 2000): AP-2, DF1-4, E47, NF-_B, 53, PC1, Oct-1, RXR, TBP, TEF-1 und YY1. Diese Interaktion mit der automodifizierten PARP-1 hatte dabei entweder positve oder negative Effekte auf den Transaktivationsprozeß. Umfangreiche Mikroarray-Analysen zur Charakterisierung der Genexpression in PARP-1 -/- - Mäusen erbrachten eine verminderte Expression von Genen der Zellzyklus-Progression, der Mitose, der DNA-Replikation und der Chromosomen-Prozessierung und -Assemblierung (Simbulan-Rosenthal et al., 2000). Demgegenüber wurden Gene, die vermutlich in die Kanzerogenese oder vorzeitiges Altern involviert sind, verstärkt exprimiert (Simbulan-Rosenthal et al., 2000).

Darüberhinaus wurde die PARP-1 auch als ein Ko-Faktor der NF-_B-gesteuerten Transaktivierung identifiziert, die eine zentrale Rolle im Rahmen von Immunreaktionen und entzündlichen Prozessen spielt (Oliver et al., 1999; Kameoka et al., 2000). PARP-1 -/- - Mäusen fehlt die Lipopolysaccharid (LPS)-induzierte TNF-alpha-Produktion, iNOS-Expression und NO-Produktion und erwiesen sich äußerst resistent gegenüber septischen Schock. Die der iNOS-Expression zugrundeliegende Ko-Transaktivatorfunktion der NF-_B-gesteuerten Transaktivierung war dabei nur teilweise von der katalytischen Funktion der PARP abhängig, und NF-_B und die PARP-1 bildeten eine stabilen Komplex, unabhängig von der DNA-Bindung (Kameoka et al., 2000).

1.2.3 Alterungsprozesse

Noch bevor durch die Entdeckung der Tankryase eine direkte molekulare Verbindung von Poly(ADP-Ribosyl)ierungs-Reaktionen mit zellulären Mechanismen der Alterungsregulation bekannt war, gab es phänomenologische Untersuchungen zur Bedeutung der Poly(ADP-Ribosyl)ierung beim Alterungsprozess: Statistische Untersuchungen konnten im Speziesvergleich bei Säugern eine hohen Poly(ADP-Ribosyl)ierungs-Kapazität mit der Lebensdauer korrelieren (Muiras et al., 2000; Grube et al., 1992). In diesem Zusammenhang ist interessant, daß die zelluläre Poly(ADP-Ribosyl)ierungs-Kapazität bei Menschen und bei Ratten mit dem Alter abnimmt (Grube et al., 1992). Bei Patienten mit dem schweren Krankheitsbild der Progeria, das zu stark


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beschleunigtem Altern und zum Phänotyp eines Greisen bereits im späten Jugendalter führt, konnte eine deutlich verminderte PARP-1-Expression in Fibroblasten nachgewiesen werden (Ly et al., 2000). Im Hippocampus von alten Ratten war die PARP-Aktivität um etwa 50% im Vergleich zu Hippocampi erwachsener Ratten vermindert, während in Cortex und Cerebellum keine Änderung gemessen werden konnten (Strosznajder et al., 2000). Eine altersabhängige Abnahme der Poly(ADP-Ribosyl)ierungs-Kapazität konnte auch in Lymphozyten von Ratte und Mensch beobachtet werden (Grube et al., 1992).

Da bisher noch keine funktionellen Untersuchungen zum Alterungsprozess nach Ausschaltung oder Hemmung der Poly(ADP-Ribosyl)ierung vorliegen, ist das Aufstellen einer kausalen Beziehung zwischen Poly(ADP-Ribosyl)ierung und Verhinderung der Zell- oder Gewebealterung bisher nicht möglich. Auch würde die annähernd normale Lebenserwartung von PARP-1 -/- - Mäusen gegen eine kausale Bedeutung der PARP-1 im Alterungsprozess sprechen, während auf der anderen Seiten durch Fehlen eines Knock-out-Tieres die Beteiligung der Tankryase nicht eingeschätzt werden kann. Umgekehrt könnten die bisherigen Studien umsomehr auf eine Beeinträchtigung der Poly(ADP-Ribosyl)ierung im Alterungsprozess schließen lassen, womit eine erhöhte Wahrscheinlichkeit genomischer Instabilitäten und damit maligner Entartung im alternden Organismus verbunden sein könnte.

1.2.4 Apoptose

Die Apoptose ist der programmierte, energieabhängige und über definierte Signalwege ablaufende Zelltod. Diese Art des Zelltodes ist physiologisch aufs engste mit Wachstums- und Entwicklungsprozessen verbunden und führt in keinem Falle zu einer für das betroffene Gewebe schädlichen sekundären inflammatorischen Reaktion. So werden beispielsweise während der Entwicklung des ZNS mehr als doppelt soviele Neurone gebildet, als im adulten Organismus vorhanden sind (Oppenheim et al., 1991). Die apoptotische Degeneration dieser Neurone erfolgt während der Entwicklung ohne jegliche inflammatorische Komponente.

Eine zentrales Ereignis der Apoptose ist die proteolytische Spaltung der PARP-1 in der DNA-bindenen Domäne in ein 89 kDa- und ein 24 kDa-Fragment (Kaufmann et al., 1993). Dadurch wird die Kopplung der regulatorischen DNA-bindenen Domäne an die katalytische Domäne aufgehoben. Diese PARP-1-Spaltung ist ein weit verbreiteter


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und etablierter Marker der Apoptose, unabhängig von ihrer funktionellen Bedeutung, die erst in den letzten Jahren aufgeklärt werden konnte:

So interagiert nämlich das bei der apoptotischen PARP-1-Spaltung entstandene 89 kDa-Fragment mittels eines BRCT-Motivs mit der Automodifikations-Domäne und hemmt dadurch die PARP-1-Aktivität durch Blockierung der Dimerisierung (Kim et al., 2000). Darüberhinaus wird durch die Spaltung und Inaktivierung der PARP-1 die Poly(ADP-Ribosyl)ierungs-abhängige Hemmung der Chromatin-gebundenen Ca/Mg-Endonuclease DNAS1L3, die zur DNA-Fragmentierung während der Apoptose beiträgt, aufgehoben (Yakovlev et al., 2000). Eine weiterer wesentlicher Aspekt ist, daß eine Verhinderung der PARP-1-Spaltung während der Apoptose sofort nach Beginn der DNA-Fragmentierung zu deren drastischen Aktivierung und damit zum zellulären Energie-Defizit führen würde, das die Ausführung der Apoptose unmöglich machen würde und die Zelle in einen nekrotischen Tod treiben würde (Herceg et al., 1999). So sind beispielsweise PARP-1 -/- - Mäuse gegenüber dem durch MNNG und H2O2 -induzierten nekrotischen Zelltod geschützt (Ha et al., 1999). PARP-1-Inhibition oder -Depletion verhindert auch den nekrotischen Zelltod bei N-methyl-D-Aspartat (NMDA)-induzierter Neurodegeneration, zerebraler Ischämie (Endres et al., 1997; Eliasson et al., 1999), Myokard-Ischämie (Zingarelli et al., 1997; Pieper et al., 2000) und Streptozotocin-induziertem Diabetes (Burkart et al., 1999; Masutani et al., 1999). PARP-1 -/- -Mäuse sind aber nicht gegenüber dem Fas-induziertem apoptotischen Zelltod geschützt (Ha et al., 1999), und die Hemmung der PARP-1 verhindert auch nicht den Zelltod durch Apoptose-induzierende Substanzen, z.B. durch TNF-alpha, Dexamethason oder Fas (Leist et al., 1997).

Da durch Depletion von ATP prinzipiell jeder apoptotische in einen nekrotischen Prozess überführt werden kann (Eguchi et al., 1997; Leist et al., 1997), stellt also die Spaltung der PARP-1 im Rahmen der Apoptose eine unabdingbare Voraussetzung für ihr ungestörtes Ablaufen dar und verhindert das Umschlagen des gezielten apoptotisches Prozesses in einen nekrotischen Prozess, der durch die ausgelöste inflammatorische Reaktion fatale Konsequenzen für das umgebende Gewebe hätte.


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1.3 Die Rolle der Poly(ADP-Ribosyl)ierung bei der Tumortherapie

Tumorzellen sind im Rahmen von Chemotherapien oxidativen Schädigungen ausgesetzt (Sinha et al., 1990; Davies et al., 1986; Doroshow et al., 1986; Marcillat et al., 1989). Dabei führt der intrazelluläre Metabolismus des Chemotherapeutikums oder seine Beteiligung an Redox-Cyling-Reaktionen, speziell in unmittelbarer Nachbarschaft zum Chromatin, zu einer Produktion von freien Radikalen (Sinha et al., 1990; Davies et al., 1986; Marcillat et al., 1989; Feinstein et al., 1993). Diese Sauerstoffradikale reagieren nun mit Strukturen des Chromatins, zum einen mit der DNA, was zu DNA-Strangbrüchen oder Oxidation von Nukleobasen führt, aber auch zum anderen mit den die DNA zu Nukleosomen organisierenden Proteinen, den Histonen. Die erwünschte DNA-Schädigung in Tumorzellen nach Chemotherapie kann aber auch Folge der direkten Reaktion der zytotoxischen Substanz mit der DNA sein, z.B. im Falle der Alkylantien (Goria-Gatti et al., 1992). Diese Chemotherapie-induzierte oxidative Modifikation von Nukleosom-Proteinen im Zellkern kann zur Oxidation von Aminosäurenseitenketten, zur Bildung von Protein-Protein-Crosslinks und zur Bildung von Protein-DNA-Crosslinks führen (Jones et al., 1993; Altmann et al., 1995). In diesem Zusammenhang werden die nukleosomalen Histone auch als ein Schutzsystem der DNA vor oxidativen Schäden angesehen (Enright et al., 1992).

Die Histone stellen nun aber nicht allein ein "Verpackungs- und Schutzsystem" für die DNA dar, sondern sind intensiv in chromatindynamische Prozesse wie Transkription, Replikation und Reparatur funktionell eingebunden (Realini et al., 1992; Jeggo et al., 1998). Da zu erwarten ist, daß im Rahmen eines radikalischen Angriffs auf das Chromatin die oxidative Schädigung der Histone mit einem Funktionsverlust verbunden ist, würde es Sinn machen, daß diese geschädigten Histone mit hoher Effizienz abgebaut werden und durch neue, intakte ersetzt werden. Bisher gab es aber keine Untersuchungen zum Abbau und Turnover geschädigter Histone, die verantwortliche Protease war unbekannt, ebenso wie deren mögliche Regulation und Einbindung in das Reparatur-Netzwerk nach einem genomischen Schaden. Das erstaunt umso mehr, da doch die Mechanismen der DNA-Reparatur schon lange Gegenstand intensiver Forschung sind, während aber geschädigte Histone nicht nur epigenetische Funktionen wie DNA-Transkription, -Replikation und -Reparatur entscheidend stören


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können, sondern auch selber direkt durch Crosslinking mit der DNA einen genomischen Schaden verursachen können (Jones et al., 1993; Dizdaroglu et al., 1993).

Histone werden in proliferierenden Zellen nicht nur in limitierten Phasen des Zellzyklus, sondern konstitutiv synthetisiert, gerade auch in nicht-proliferierenden Zellen (Waterborg el al., 1993). Früher berichtete Turnover-Raten von Histonen differieren beträchtlich hinsichtlich Zelltyp oder Kultivierungsbedingungen, von 18 h für Histon H1 in L5178Y Maus-Lymphomzellen (Higurashi et al., 1987) bis zu 136,6 d für Histon H4 in proliferierenden Friend-Zellen (Tsvetkov et al., 1989). In jedem Falle aber ist zu erwarten, daß aufgrund der langen Lebensdauer der Histone derartige proteolytische Prozesse hochselektiv und sehr exakt reguliert ablaufen müssen.

Eine bisher bekannte Protease, die in der Lage ist, oxidativ geschädigte Proteine selektiv zu erkennen und abzubauen, ist das Proteasom: Ein etwa 700 kDa großer, ubiquitärer, multikatalytischer Proteinasekomplex (Davies et al., 1987; Coux et al., 1996; Grune et al., 1995). Für das Zytoplasma ist bereits bekannt, daß oxidativ geschädigte Proteine einem selektiven proteolytischen Abbau über einen ATP- und Ubiquitin-unabhängigen Weg durch das 20S-Proteasom unterliegen (Grune et al., 1997). Das Proteasom ist aber neben seiner zytosolischen Lokalisation auch in großen Mengen im Zellkern vorhanden (Palmer et al., 1996), und interessanterweise besitzen Tumorzellen eine höhere Proteasomaktivität als nichtmaligne Zellen (Kumatori et al., 1990), die ebenfalls vor allem im Nukleus lokalisiert ist. Da ein mögliches System zur Abwehr oxidativer Histonschäden auch gerade von Tumorzellen genutzt werden könnte, um Schäden im Zellkern durch Radio- oder Chemotherapie zu überwinden, könnten derartige antioxidative Abwehrmaßnahmen natürlich auch die Effektivität einer Tumortherapie reduzieren und an der Therapieresistenz von Tumorellen beteiligt sein (Sinha et al., 1990). Aus diesem Grund wurden die Untersuchungen zu diesen Fragestellungen zunächst an lebenden, proliferierenden K562-Leukämie-Zellen (Ullrich et al., 1999b; Ullrich et al., 2001d) und anschließend an der zu einem Makrophagen-Phänotyp differenzierenden U937-Leukämiezelllinie (Ullrich et al., 2000b; Ciftci et al., 2001b) vorgenommen, um die dabei gefundenen Mechanismen schließlich in phagozytierenden Mikrogliazellen (Ullrich et al., 2001c) zu bestätigen.

In diesem Zusammenhang muß dann auch die mögliche Rolle der Poly(ADP-Ribosyl)ierung untersucht werden: Denn ausgehend vom bisherigen Kenntnisstand gilt es als sicher, daß die Poly(ADP-Ribosyl)ierung das Überleben von proliferierenden


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Zellen ermöglicht, die auf einem moderaten Niveau mit DNA-schädigenden Substanzen wie Alkylantien, Oxidantien und ionisierender Strahlung ausgesetzt worden sind (de Murcia et al., 2000). Auch ist gut bekannt, daß die Hemmung der PARP proliferierende Zellen gegenüber sublethalen DNA-Schäden sensitiviert (de Murcia et al., 2000) und die Zytotoxizität des Topoisomerase I - Inhibitors Camphothecin potenziert (Bowman et al., 2001). Wenn also eine Rolle der PARP-1 für die Erhaltung der genomischen Stabilität angenommen werden kann, muß in der Konsequenz der oben formulierten Postulate auch untersucht werden, ob neben ihrer gut bekannten Funktion bei der DNA-Reparatur (de Murcia et al., 2000) nicht auch eine Funktion im Abbau oxidierter Histone vorliegt.

Bisher war noch nicht untersucht,


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1.4 Die Rolle der Poly(ADP-Ribosyl)ierung bei Erkrankungen des ZNS

Allgemeine Betrachtungen

Seit etwa 1994 wird der Erforschung der Rolle der Poly(ADP-Ribose)-Polymerasen bei Erkrankungen des ZNS eine besondere Aufmerksamkeit geschenkt. Diese gründet sich auf vielversprechende Resultate tierexperimenteller Krankheitsmodelle des ZNS, bei denen der Aktivierung der PARP-1 eine entscheidene Bedeutung zuzukommen scheint: So bietet beispielsweise die Hemmung der PARP-1 die bisher beste Neuroprotektion in Tiermodellen für den Schlaganfall (Ha et al., 2000). Auch weisen PARP-1 -/- - Mäuse nach Schädel-Hirn-Trauma geringere kognitive und motorische Defizite auf und sind in einem Parkinsonmodell vollständig gegenüber der 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) induzierten selektive Degeneration dopaminerger Neurone geschützt (Cosi et al., 1996). Diese tierexperimentellen Befunde werden teilweise von Untersuchungen an Autopsiematerial beim Menschen gestützt, die eine erhöhte postmortale Poly(ADP-Ribose)-Konzentrationen nach globaler Ischämie (Love et al., 1999) und auch eine erhöhte Poly(ADP-Ribose)-Konzentrationen bei Patienten mit M. Alzheimer (Love et al., 1999) nachweisen konnten. Die Beteiligung der PARP-1 beim NO-vermittelten exzitotoxischen neuronalen Zelltod nach ischämischer Hirnschädigung wurde von der Arbeitsgruppe um Prof. Snyder von der Johns Hopkins University in Baltimore so eindrucksvoll gezeigt (Zhang et al., 1994), daß nach umfassender patentrechtlicher Sicherung dieser Befunde die Entwicklung von klinisch anwendbaren PARP-1-Inhibitoren von pharmazeutischen Unternehmen massiv vorangetrieben wurde (z.B. Guilford Inc, Agouron/Pfizer Inc.). Aus diesen Entwicklung entstammen viele nun für die Forschung erhältliche hochspezifische Inhibitoren der PARP-1, deren halbinhibitorische Konzentration bis um den Faktor 106 niedriger liegt als bei den PARP-1-Inhibitoren der ersten Generation aus der Gruppe der Benzamide. Vorreiter auf diesem Gebiet ist die von Prof. Snyder gegründete Firma Guilford Inc., die bereits die ersten entwickelten PARP-1-Inhibitoren in klinischen Prüfungen der Phase I am Menschen einsetzt.


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1.4.1 Ischämie-Reperfusionsschäden

Die PARP-1 wurde zuerst in Verbindung mit dem NO-induzierten neuronalen Zelltod nach zerebralen Insult gebracht (Zhang et al., 1994): Die fokale Ischämie während eines zerebralen Insults führt zu einem etwa 50-fachen Anstieg der extrazellulären Glutamat-Konzentration, die über die Aktivierung von NMDA-Rezeptoren zur Aktivierung der neuronalen NOS und zur Stimulierung der cGMP-Bildung führt. Das im Rahmen dieser exzitotoxischen Schädigung freigesetzte NO führt zur Aktivierung und Poly(ADP-Ribosyl)ierung der PARP-1 (Zhang et al., 1994). Durch eine Hemmung der PARP konnte nun die NMDA-Rezeptor-vermittelte Glutamat-Toxizität verhindert werden (Zhang et al., 1994; Cosi et al., 1994). Die NMDA-Toxizität ist in kortikalen Neuronen von PARP-1 -/- - Mäusen praktisch aufgehoben und in PARP-1 +/- Mäusen um 60-70 % reduziert. Dieser Effekt konnte auch durch eine chemische Hemmung mit dem hochpotenten Inhibitor DPQ (3,4-Dihydro-5-[4-(1-piperinidyl)butox]-1(2H)-isoquinolinon) erreicht werden (Zhang et al., 1994). Weiterführende Arbeiten mit PARP-1 -/- - Mäusen zeigten, daß das Infarktvolumen nach Verschluß der A. cerebri media in PARP-1 -/- -Mäusen um 78 % (Eliasson et al., 1997) bzw. in einer anderen Studie um 40 % (Endres et al., 1997) reduziert war. Diese Neuroprotektion in PARP-1 -/- - Mäusen war größer als durch Behandlung mit NMDA-Antagonisten oder NOS-Inhibitoren (Eliasson et al., 1997; Tokime et al., 1998). Auch hier führte eine chemische Hemmung der PARP mit dem Inhibitor DPQ zu einer deutlichen Neuroprotektion im Sinne einer Verringerung des Infarktgebietes nach Verschluß der A. cerebri media, entweder bei Verabreichung vor oder direkt nach dem Infarkt (Takahasi et al, 1999). In diesem Zusammenhang muß erwähnt werden, daß die PARP-1 anscheinend nur eine Rolle in der NMDA-induzierten, nicht aber in der AMPA-induzierten Exzitotoxizität spielt (Mandir et al., 2000).

Alle diese Studien haben mit einer vollständigen Depletion der PARP-1 im ganzen Tier (PARP-1 -/- - Mäuse) oder mit einer systemischen und generellen pharmakologischen Hemmung der PARP-1 (durch DPQ) im gesamten Organismus, insbesondere in allen Zelltypen des ZNS gearbeitet. Der von den Autoren angenommene Mechanismus der so erreichten Neuroprotektion stellt die Funktion der neuronalen PARP-1 bei exzitotoxischen neuronalen Zelltod in der Vordergund und greift dabei auf das vor etwa 15 Jahren entwickelte und gut etablierte Modell der PARP-induzierten Zelltods durch NAD+ - und anschließende Energieverarmung zurück


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(Berger et al., 1985): Nach zerebraler Ischmämie konnte eine erhöhte PARP-Aktivität und erniedrigte ATP-Konzentrationen nachgewiesen werden, während beides durch PARP-Inhibition verhindert werden konnte (Plaschke et al., 2000). DNA-Schaden, PARP-1-Aktivierung und Energie-Depletion bilden zusammen den gemeinsamen finalen Weg der neuronalen Schädigung, so daß bei Hemmung der PARP-1 durch Eingriff in diese gemeinsame Endstrecke die beste Neuroprotektion erreicht werden kann (Ha et al., 2000).

Aber die systemische Hemmung der PARP-1 bei zerebralen Insulten scheint auch mit negativen Auswirkungen auf das neuronale Überleben verbunden zu sein: Denn wenn der neuronale Gesamtschaden nicht unmittelbar nach dem Infarkt, sondern 72h nach einer kurzen, globalen und sublethalen Ischämie bei Ratten gemessen wurde, reduzierte eine systemische PARP-Hemmung die Zahl überlebender Neurone in der hippocampalen CA1-Region (Liu et al., 2000). Eine PARP-Aktivierung ohne nachfolgende NAD+ -Depletion nach einer transienten Ischämie hat also eine neuroprotektive und keine destruktive Wirkung (Bürkle, 2001). Die anhaltene Erhöhung der PARP-1-mRNA-Expression im Hippocampus von Affen oder Ratten nach einer kurzen globalen Ischämie deutet nach Ansicht weiterer Autoren ebenfalls auf eine Beteiligung der PARP-1 an Reparaturprozessen nach dem initialen Schadensereignis hin (Liu et al, 2000).

Betrachtet man nun die evolutionäre Entwicklung, stellt sich sofort die Frage, warum denn diese besonders hohe PARP-1-Expression in Neuronen überhaupt aufrechterhalten wurde, trotz des Risikos eines katastrophalen Hirninfarktes nach schweren Ischämien. Dieser scheinbare Widerspruch ist nur lösbar, wenn der Gesamtorganismus durch eine hohe neuronale PARP-Aktivität prinzipiell profitieren würde, also der neuronalen PARP eher eine neuroprotektive statt destruktive Funktion zukommt (Bürkle, 2001). Daher können die Ereignisse bei sehr schwerer Ischämie auch hier als das extreme Ende einer Skala zellulärer Abwehrmechanismen gesehen werden, die aufgrund ihrer metabolischen Kosten dann in einen Todesmechanismus konvertieren.

Hier deutet sich also nun an, daß der PARP-1 beim neuronalen Zelltod eine ähnliche widerspüchliche Funktion zukommen könnte wie bei Tumorzelltod: Während auf der einen Seite durch Hemmung der PARP-1 der neuronale Zelltod verhindert werden könnte, könnte auf der anderen Seite durch genau dieselbe Hemmung ein


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weiterer neuronaler Schaden induziert werden. In welche Richtung sich die Situation des individuellen Neurons dabei entwickelt, hinge dann bei einer standardisierten Therapie mit PARP-1-Inhibitoren ausschließlich vom Grad der neuronalen Initialschädigung ab, ein klinisch äußerst schwer zu kalkulierender Parameter. So besteht grundsätzlich die Gefahr, daß die Therapie mit systemischen PARP-1-Inhibitoren nicht immer zum erwünschten protektiven Erfolg, sondern auch zu weiterer Destruktion funktionsfähigen Hirnparenchyms führen könnte. Dieses ist umsomehr wahrscheinlich, je später mit dieser Therapie nach dem Initialereignis begonnen wird, also je weniger die akute, auf Energiemangel zurückzuführende Neurotoxizität verhindert wird und je mehr in später ablaufende Reparatursysteme initial überlebender Neurone eingegriffen wird. Aus diesen Gründen schien uns die weit verbreitete Strategie der systemischen PARP-Hemmung bei einem zerebralen Insult als nicht optimal, und es mußten neue pathophysiologische Zusammenhänge betrachtet werden, um zu einer neuen therapeutischen Strategie der PARP-Hemmung bei zerebralen Insulten zu gelangen. Daher erschien es uns sinnvoll, den neuronalen Zelltod nicht isoliert, sondern im Kontext des Gewebeverbandes zu betrachten und dabei eine Zellpopulation zu untersuchen, die an Schadenprozessen im ZNS entscheidend mitbeteiligt ist, die Mikrogliazelle:

1.4.2 Die Rolle der Mikroglia nach primärer neuronaler Schädigung

Mikrogliazellen bilden etwa 5-15 % der gesamten Zellmenge des ZNS und repräsentieren eine Population immunkompetenter Phagozyten innerhalb des Hirnparenchyms, die im gesunden ZNS des erwachsenen Menschen einen „ruhenden“ Phänotyp mit typischer ramifizierter Morphologie aufweisen (Kreutzberg et al., 1996; Perry et al., 1993). Diese „ruhende“ Mikroglia reagiert auf eine Vielzahl pathophysiologischer Ereignisse mit bestimmten morphologischen und funktionellen Veränderungen (Hailer et al., 1996; Hailer et al., 1997; Bechmann et al., 1997). Als frühe Antwort auf Verletzungen und Infektionen des ZNS verwandelt sich die „ruhende“ Mikrogliazelle in eine „aktivierte“ immunologische Effektorzelle mit einer nun amöboiden Morphologie und verstärkten Expression des MHC-Komplexes und von verschiedenen Adhäsionsmolekülen. Darüberhinaus produzieren auch aktivierte Mikrogliazellen große Mengen freier Sauerstoff- und Stickstoffradikalen (Colton et al., 1987). Viele pathologische Veränderungen im ZNS, so z.B. beim M. Alzheimer, bei Tumoren oder beim Hirninfarkt sind mit einer Aktivierung von Mikrogliazellen


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assoziiert (Yan et al., 1996), die im Rahmen dieser Krankheitsprozesse eine deutlich erhöhte phagozytotische Aktivität, eine verstärkte Expression verschiedener Immunoeffektor-Moleküle und eine hohe Produktion proinflammatorischer und zytotoxischer Faktoren aufweisen (Kreutzberg et al., 1995).

Diese massive Freisetzung toxischer Produkte, vor allem freier Radikale, bringt nun das grundsätzliche Problem mit sich, daß dabei die freisetzende Zelle als erstes geschädigt oder getötet werden könnte. Es stellt sich die Frage, warum gerade die Mikrogliazellen diesem Angriff freier Radikale, dem sie gerade als Bildungsort im noch viel stärkeren Maße ausgesetzt sind, widerstehen können und daher ihre Konversion von der ruhenden zur aktivierten Mikrogliazelle überleben können. Wenn aber aktivierte Mikrogliazellen über einen längeren Zeitraum vital und funktionell aktiv bleiben sollen, kann erwartet werden, daß diese durch besonders effektive antioxidative Systeme geschützt sind. In diesem Zusammenhang wurde zuerst von Sugaya et al. vermutet, daß aktivierte Mikrogliazellen spezielle zelluläre Schutzsysteme aufweisen müssen, um gegenüber besonders hoher oxidativer Belastung resistent zu sein (Sugaya et al., 1997). Erste Hinweise auf eine besondere Resistenz aktivierter Mikrogliazellen gegenüber oxidativer Belastung ergaben sich aus Experimenten, die eine höhere Resistenz gegenüber NO (Sugaya et al., 1997) beschrieben, während ruhende Makrophagen leicht durch NO getötet werden konnten (Messmer et al., 1995). Erste Hinweise auf die zugrundeliegenden Mechanismen des besonderen antioxidativen Schutzes von Mikrogliazellen gibt es seit 1998, als über eine verstärkte Expression der Glutathion-Peroxidase (Lindenau et al., 1998) und der mitochondrialen Mn-Superoxiddismutase (Noack et al., 1998) in aktivierten Mikrogliazellen berichtet wurde. Diese primären antioxidativen Schutzsysteme reagieren dabei direkt mit toxischen Sauerstoffradikalen. Spezielle aktivierungabhängig-regulierte sekundäre Schutzsysteme, die bereits geschädigte DNA oder Proteine in Mikrogliazellen abbauen oder reparieren können, waren bisher nicht bekannt.

In Säugerzellen werden oxidativ geschädigte Proteine hauptsächlich über einen ATP- und Ubiquitin-unabhängigen Stoffwechselweg über das 20S Proteasom abgebaut (Grune et al., 1997). Es gibt nun Hinweise, daß sich die funktionellen Eigenschaften des Proteasoms während der Mikrogliaaktivierung verändern. So wurde beispielsweise in aktivierten Mikrogliazellen nach Behandlung mit Interferon-gamma oder LPS der Austausch von 3 konstitutiven beta-Untereinheiten durch die Immunoproteasom-Untereinheiten


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ibeta1/LMP1, ibeta2/MECL-1 und ibeta5/LMP7 beobachtet, wodurch das Proteasom an die Erfordernisse der optimalen MHCI-Epitop-Expression angepaßt wird (Stohwasser et al., 2000). Da aus Vorarbeiten bekannt war, daß Zellen mehrere Tage mit komplett in den 20S- und 19S-Anteil dissoziiertem und inaktiven 26S Proteasom überleben können (Reinheckel et al., 2000), während ein Aktivitätsverlust des 20S Proteasoms mit schweren Folgen für die Vitalität und das Überleben der Zelle verbunden ist, und dieses 20S Proteasom zudem noch äußerst resistent gegenüber oxidativer Belastung ist, scheint diese Protease ein geeigneter Kandidat, von aktivierten Mikrogliazellen als antioxidatives Schutzsystem eingesetzt zu werden. Wir haben daher die Untersuchung des mikroglialen 20S Proteasoms und seine Regulation in Abhängigkeit vom Aktivierungszustand der Mikrogliazelle in den Mittelpunkt der nachfolgenden Untersuchungen gestellt.

Bisher war noch nicht untersucht,

Die Aktivierung von Mikrogliazellen ist mit einem starken Freisetzung von freien Radikalen verbunden (Colton et al., 1987; Hu et al., 1995). Diese können nun natürlich nicht nur auf die Mikrogliazelle toxisch wirken, sondern vor allem auch auf Neurone und dadurch einen deutlichen neuronalen Schaden verursachen (Schubert et al., 1998). Daher kann die nach einem neuronalen Initialschaden zu beobachtene Invasion aktivierter Mikrogliazellen in die Regionen neuronaler Schädigung (Heppner et al., 1998) grundsätzlich für ursprünglich überlebende Neurone eine gefährliche Situation darstellen. Daher sollte die Funktion der PARP-1 nicht allein in Neuronen, sondern auch vor allem in Mikrogliazellen untersucht werden, um Hinweise auf den bisher noch


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völlig unbeachteten Anteil der Mikrogliazellinvasion innerhalb des neuronalen Gesamtschadens in den bisher verwendeten Tiermodellen zu erhalten. Während es für das ZNS bisher nur undeutliche Hinweise auf eine Beeinflussung der Invasion immunkompetenter Zellen und damit der neuroinflammatorischen Komponente im Zusammenhang mit der durch Hemmung der PARP-1 erzielten Neuroprotektion gibt (reduzierte Invasion neutrophiler Granulozyten bei PARP-Hemmung vor ischämischer Hirnschädigung bei neugeborenen Ratten, Ducrocq et al., 2000), existieren für das periphere Körpergewebe bereits klare Anhaltspunkte für eine wesentliche Bedeutung der PARP-1 bei entzündlichen Prozessen:

1.4.3 Die Bedeutung der PARP bei der inflammatorische Sekundärschädigung

Ein Großteil des Gewebeschadens beim Myokardinfarkt entsteht durch freie Sauerstoffradikale, einschließlich NO, Superoxidanionen und Peroxynitrit (Kukreja et al., 1992; Wang et al., 1996). Nach Behandlung mit PARP-Inhibitoren (Bowes et al., 1998) oder in PARP-1 -/- - Mäusen (Pieper et al., 2000; Zingarelli et al., 1998) wurde eine reduzierte Infarktgröße gemessen. Interessanterweise führen die Autoren aber hier diesen protektiven Effekt nicht auf eine Wirkung direkt in der Herzmuskelzelle, sondern auf eine Störung der einwandernen neutrophilen Granulozyten zurück (Zingarelli et al., 1997). Von der gleichen Arbeitsgruppe konnte wenig später gezeigt werden, daß Endothelzellen von PARP-1-/- - Mäusen eine verminderte Expression von P-Selektin und ICAM-1 aufwiesen, was zu einer deutlich reduzierten Invasion von neutrophilen Granulozyten in das geschädigte Gewebe führte (Zingarelli et al., 1998).

Auch bei der erfolgreichen Behandlung der Colitis in IL10 -/- - Mäusen mit PARP-Inhibitoren kam es zur Abschwächung der entzündlichen Infiltration (Jijon et al., 2000). Nach Verschluß der A. mesenterica superior wurde nach PARP-Hemmung oder in PARP-1 -/- -Mäusen im Darm nicht nur ein geringerer Schleimhautschaden und eine geringere Hyperpermeabilität, sondern auch eine geringere Invasion neutrophiler Granulozyten beobachtet (Liaudet et al., 2000).

Im Rahmen des destruktiven Autoimmunprozess des Typ-I-Diabetes haben aktivierte Makrophagen eine große Bedeutung in der Exekution des Zelltodes in den Langerhans-Inseln. Hier verhinderten PARP-Inhibitoren oder PARP-1-Gen-Deletion den durch makrophagiale Sauerstoffradikal- oder NO-Produktion induzierten Tod von Inselzellen


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im Pankreas (Burkart et al., 1993). PARP-1 -/- -Mäuse sind auch gegenüber dem Streptozotocin-induzierten Diabetes gut geschützt (Burkart et al., 1999; Pieper et al., 1999), und sogar in heterozygoten PARP-1 +/- - Mäusen war der Krankheitsausbruch deutlich verzögert, so daß bereits eine um 50% geringere PARP-1-Expression sich deutlich günstig auswirkte.

Beim septischen Schock lösen im Blut zirkulierende Endotoxine, hauptsächlich Interferon-gamma und Lipopolysaccharid (LPS), die Aktivierung der iNOS durch Bindung eines LPS-responsiven Elementes an die iNOS-Promotorregion aus (Lowenstein et al., 1993). Das daraufhin in großen Mengen freigesetzte NO führt dann zur massiven Vasodilatation und Reduktion des Blutdrucks. Während viele Autoren bereits früher die Rolle der PARP-1 bei septischem Schock und inflammatorischen Erkrankungen beschrieben haben (Szabo et al., 1996, 1997), wurde kürzlich gezeigt, daß PARP-1 -/- - Mäuse gegenüber dem Endotoxin-vermittelten septischen Schock über eine Herabregulation der iNOS und NF-_B-abhängigen TNF-alpha-Produktion resistent sind (Oliver et al., 1999).

Daher gibt es also in den bisherigen Studien durchaus Anhaltspunkte, daß der PARP-1 in der Regulation und Exekution inflammatorischer Prozesse durch einwandernde Entzündungszellen eine wichtige Bedeutung zukommen könnte. In der vorliegenden Arbeit wurde daher die Rolle der PARP-1 in den Makrophagen des ZNS, den Mikrogliazellen, bei exzitotoxischer Hirnschädigung näher betrachtet.

Bisher war noch nicht untersucht,


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Thu Nov 7 16:02:32 2002