Ullrich, Oliver: Mechanismen protektiver und destruktiver Funktionen der Poly(ADP-Ribose)-Polymerase-1 (PARP-1) bei Zell- und Gewebeschädigungen

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Kapitel 2. Ergebnisse

2.1 Regulation des nukleären Proteasoms durch die Poly(ADP-Ribose)-Polymerase

2.1.1 Verstärkter proteasomaler Abbau geschädigter Proteine bei oxidativen Stress durch die Poly(ADP-Ribose-Polymerase)

O. Ullrich et al. Free Radic. Biol Med. 31, 887-8983 (2001)

Zunächst wurde untersucht, ob und wie endogene oxidativ geschädigte Histone in lebenden, sich teilenden hämatopoetischen K562-Zellen proteolytisch abgebaut werden: Der endogene Abbau aller nukleären Proteine zeigte sich nach oxidativer Belastung mit H2O2 insgesamt erhöht (z.B. 28 % Abbau nach 48 h nach 30 min oxidativer Belastung mit 0,4 mM H2O2 im Vergleich zu 17 % Abbau ohne oxidative Schädigung). Auch der Abbau der Histon-Proteine war nach oxidativer Belastung erhöht, wobei Histon H1 die deutlich stärksten Abbauraten aufwies (Abb. 2). Nach Erhöhung der oxidativen Belastung kam es zu einer deutlichen Steigerung hauptsächlich des initialen Abbaus innerhalb von 30 min nach Zugabe des Oxidanz, während der weitere Abbau einen langsameren Verlauf als nach geringgradigerer oxidativer Belastung aufwies. Während der Histon-Abbau in ungeschädigten Zellen annähernd eine lineare Kinetik zeigte, verschwanden mehr als die Hälfte aller insgesamt abgebauten Histone nach oxidativer Belastung mit 0,4 mM H2O2 innerhalb von 6 h, nach Belastung mit 1 mM H2O2 sogar innerhalb von 30 min. Dabei wies Histon H1 wiederum die mit Abstand höchsten Abbauraten auf (Abb. 2). Bei näherer Untersuchung dieses kurzen, der oxidativen Belastung unmittelbar folgenden Zeitraumes war bereits nach 5 min ein Abbau von Histonen meßbar. Dabei unterschied sich die Geschwindigkeit des Abbaus von Histon H1 wiederum deutlich von allen anderen Histon-Fraktionen. Dem Histon H1 wird eine spezifische Rolle bei der Transkriptionsregulation und der Assemblierung regulatorischer Nukleoproteinkomplexe zugesprochen (Wolffe et al., 1997; Gunjan et al., 1999; Thomas et al., 1999). Aufgrund des deutlichen proteolytischen Abbaus von Histon H1 konzentrierten wir die weiteren Untersuchungen auf diese Histon-Fraktion und versuchten, die für den Abbau oxidativ geschädigter Histone verantwortliche Protease zu identifizieren:


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Abb. 2: (aus O. Ullrich et al. Free Radic. Biol Med. 31, 887-8983, 2001): Abbau endogener Histone in K562-Zellen nach oxidativer Belastung. Endogene Proteine wurden mit [3H]-Lysin markiert und nach dem Auswaschen der extrazellulären Radioaktvität mit 0 mM (A), 0,4 mM (B) oder 1 mM (C) H2O2 für 30 min oxidativ belastet. Der anschließende Abbau der Histone wurde mittels AUT/PAGE-Analyse der Histonfraktionen nach Isolierung der Zellkerne bestimmt.

Da das Proteasom für den Abbau oxidativ geschädigter zytosolischer Proteine verantwortlich ist, untersuchten wir in weiteren Experimenten den Beitrag des nukleären Proteasoms beim Abbau des endogenen Histons H1 (Abb. 3). Nach Einsatz des hochspezifischen Proteasom-Inhibitors Lactacystin wurde die nach oxidativer Belastung erhöhte Proteolyse von Histon H1 annähernd auf die Abbauraten ungeschädigter Histone reduziert. Die Hemmung der PARP mit dem Inhibitor 3-Aminobenzamid reduzierte nicht die Höhe des Gesamtabbaus von Histon H1 nach 48 h, führte aber zu einer deutlichen Änderung der Kinetik des Histon-Proteolyse: Der schnelle, initiale Abbau innerhalb von 30 min nach Beginn der oxidativen Schädigung wurde deutlich verlangsamt, dafür wurde der initial nicht abgebaute Anteil im weiteren Zeitverlauf von 24 h abgebaut (Abb. 3). Immunopräzipitationen der endogenen Histone und die Analyse ihres Oxidationsgrades mittels Carbonyl-Blot zeigte, daß das Proteasom tatsächlich spezifisch oxidierte Histone abgebaut hat.


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Abb. 3: (aus O. Ullrich et al. Free Radic. Biol Med. 31, 887-8983, 2001): Proteasomaler Abbau von Histon H1 in K562-Zellen nach oxidativer Belastung. Endogene Proteine wurden mit [3H]-Lysin markiert und nach dem Auswaschen der extrazellulären Radioaktvität mit 1 mM H2O2 für 30 min oxidativ belastet. Der anschließende Abbau der Histone wurde mittels AUT/PAGE-Analyse der Histonfraktionen nach Isolierung der Zellkerne im Zeitraum bis 30 min (A) und bis 48 h (B) bestimmt. LC = Inkubation mit 5 µM des spezifischen Proteasominhibitors Lactacystin, 3-ABA = Inkubation mit 1 mM des PARP-Inhibitors 3-Aminobenzamid

O. Ullrich et al. Arch. Biochem. Biophys. 362, 211-216 (1999)

Weitere Experimente konzentrierten sich auf den Einfluß der DNA-Bindung auf den proteolytischen Abbau oxidativ geschädigter Histone. Dazu wurde in Ergänzung zu den in lebenden Zellen durchgeführten Studien der Abbau isolierter Histone untersucht: Die proteolytische Abbaubarkeit isolierter Histonen stieg nach Oxidation an und fiel nach Erreichen eines Maximums wieder ab. Nach Erreichen eines Optimums an proteolytischer Suszeptibilität (z.B. die 7,8-fache Abbaubarkeit nach Oxidation isolierten Histons H2B mit 15 mM H2O2) führte weitere Oxidation wieder zu einer verringerten Abbaubarkeit. Beim Vergleich der proteolytischen Abbaubarkeit aller Histonfraktionen fiel eine 4-5-fach höhere basale Abbaubarkeit des Histons H1 auf. Da nur ein geringer Teil aller Histone im Zellkern in gelöster Form vorliegen, wurde


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anschließend die Abbaubarkeit DNA-gebundener Histone untersucht. Dazu wurde mit EcoRI linearisierte pGEM-Plasmid-DNA mit Histonen beladen, mit H2O2 oxidativ belastet und im Electrophoretic Mobility Shift-Assay (EMSA) untersucht. Nach oxidativer Belastung dieser in vitro-rekonstituierten DNA-Histon-Komplexe mit 5 mM H2O2 kam es zur Ablösung von etwa 35% der zuvor gebundenen Histone von der DNA. Stärkere Oxidation reduzierte wiederum diese Ablösung aufgrund der Ausbildung von DNA-Histon-Crosslinks. Nach Oxidation mit 5 mM H2O2 wurden praktisch alle zuvor DNA-gebunden Histone durch das isolierte Proteasom abgebaut, stärkere Oxidation verringerte wiederum die Abbaubarkeit in gleicher Weise, wie im EMSA Histon-DNA-Crosslinks nachweisbar wurden. Diese in vitro-Studien erbrachten folgende Reihung der proteasomalen Abbaubarkeit der einzelnen Histonfraktionen (höchste Abbaubarkeit zuerst): H1 > H4 > H3 > H2A > H2B.

O. Ullrich et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 6223-6228 (1999)

Aufgrund der in unseren vorangegangenen Studien festgestellten zweiphasigen Kinetik des proteolytischen Abbaus oxidativ geschädigter Histone, die aus einer sehr schnellen, innerhalb von 30 min ablaufenden Komponente und einer langsamen linearen Komponente innerhalb von Stunden bis Tagen nach dem Schädigungsereignis bestand, sollte nun die für diesen schnellen Abbau verantwortliche Protease sicher identifiziert und ihre Regulation unter den Bedingungen oxidativer Belastung untersucht werden. Dazu wurden K562-Zellen metabolisch über 5 Tage mit [3H]-Lysin markiert, anschließend über 30 min mit 0,4 bzw. 1 mM H2O2 oxidativ belastet und der Abbau der endogenen Histone mittels AUT/PAGE gemessen. Untersuchungen zur Zellvitalität nach dieser H2O2 - Behandlung erbrachten im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen keinen Hinweis auf einen Verlust der Vitalität innerhalb des Vesuchszeitraumes. Bereits nach 30 min nach oxidativer Belastung wurden 57,5 % des Histon H1 und zwischen 24 % und 34 % aller anderen Histonfraktionen abgebaut.

Um zu untersuchen, ob diesem gesteigerten Abbau die oxidative Modifikation der Substratproteine oder eine Aktivitätssteigerung der Protease zugrundeliegt, wurde auch die nukleäre Proteasomaktivität während der oxidativen Belastung gemessen: Während bei früheren Untersuchungen die Aktivität des zytoplasmatischen 20S Proteasoms unter vergleichbaren Bedingungen oxidativer Belastung im wesentlichen stabil blieb, kam es beim 26S Proteasom zu einem vollständigen Aktivitätsverlust (Reinheckel et al., 2000). Überraschenderweise aber konnte hier im Zellkern nicht nur eine gleichbleibende,


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sondern sogar eine drastisch gesteigerte Aktivität des Proteasoms direkt nach Beginn der oxidativen Belastung gemessen werden (Abb. 4). Auch in oxidativ belasteten isolierten Zellkernen konnte eine erhöhte Aktivität des 20S Proteasoms und ein um das 4,2-fache verstärkter Abbau oxidativ geschädigter Histone beobachtet werden.

Abb. 4: (aus O. Ullrich et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 6223-6228, 1999): Aktivierung des nukleären Proteasoms und erhöhte proteolytische Abbaubarkeit von Histonen nach oxidativer Belastung. A: Proteolytischer Abbau des fluorogenen Modellpeptids sLLVY-MCA in Anwesenheit oder Abwesenheit des spezifischen Proteasom-Inhibitors Lactacystin innerhalb von 30 min nach oxidativer Belastung mit 1 mM H2O2 .B: Aktivitäts-Färbung des nativelektrophoretisch getrennten Proteasoms im Blot-Overlay-Verfahren innerhalb von 30 min nach oxidativer Belastung mit 1 mM H2O2 .C: Proteolytische Abbaubarkeit von H2O2 - modifizierten Histonen durch das isolierte 20S Proteasom.

Die Inkubation mit 3-Aminobenzamid, einem Inhibitor der PARP, während der oxidativen Belastung der Zellkerne führte zu einer Blockade des gesteigerten Abbaus oxidierter Histone, während der Abbau nativer Histone unbeeinträchtigt blieb. In Nativ-Elektrophoresen isolierter Zellkerne nach oxidativer Belastung wurde im Immunoblot, als auch indirekt über die Inkubation mit [14C]-NAD+ Proteasom-gebundene Poly(ADP-Ribose) detektiert, deren Menge positiv mit der Proteasomaktivität korrelierte (Abb. 5). Eine Immunpräzipitation der PARP-1 aus oxidativ belasteten K562-Zellen führte zur Copräzipitation von Proteasom-Untereinheiten, mit einem Maximum zum Zeitpunkt der höchsten Aktiviät des nukleären Proteasoms.


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Abb. 5: (aus O. Ullrich et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 6223-6228, 1999): Poly(ADP-Ribosyl)ierung des Proteasoms in Zellkernen von K562-Zellen nach oxidativer Belastung mit 1 mM H2O2 . A: Korrelation der proteasomalen Peptidase-Aktivität nach nativelektrophoretischer Analyse mit der Inkorporation von [14C] in das Protein aus [14C]-NAD+, einem Maß für das Ausmaß der Poly(ADP-Ribosyl)ierungs-Reaktion. B: Nachweis erhöhter Proteasomaktivität in der Aktivitätsfärbung nach nativelektrophoretischer Analyse in Korrelation mit dem Nachweis von Poly(ADP-Ribose) im Immunoblot (C). D: Einfluß der Hemmung der PARP mittels 1 mM 3-Aminobenzamid (3-ABA) auf die proteasomale Proteolyse des fluorogenen Modellpeptids sLLVY-MCA und die Inkorporation von [14C] in das Protein aus [14C]-NAD+ als Maß für das Ausmaß der Poly(ADP-Ribosyl)ierung.

Paralellel zur Aktivierung des Proteasoms und mit dem Auftreten copräzipitierter Proteasom-Untereinheiten im anti-PARP-1-Immunpräzipitat wurde in Western-Blots der Präzipitate eine Verschiebung der PARP-1-Bande in den Bereich höherer Molekulargewichte beobachtet, was für das Auftreten der automodifizierten Poly(ADP-ribosyl)ierten PARP-1 spricht. Daher konnte hier vermutet werden, daß die Bindung der PARP-1 über Poly(ADP-Ribose) vermittelt wird. In vitro-Rekonstitutionsexperimente mit dem isolierten Proteasom und der isolierten PARP-1 erbrachten den finalen Beweis einer Aktivierung des Proteasoms durch die aktive PARP-1, wobei allerdings die in vitro detektierbare Aktivitätssteigerung deutlich unter den in isolierten Zellkernen oder in ganzen Zellen gemessenen Anstieg der


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Proteasomaktivität lag.

O. Ullrich et al. Free Radic. Biol. Med. 27, 487-492 (1999)

Neben freien Sauerstoffradikalen produzieren neutrophile Granulozyten und Makrophagen im entzündlichen Gewebe auch große Mengen an hypochlorischer Säure (Hazen et al., 1997). Diese wird von dem Enyzm Myeloperoxidase aus H2O2 und Chloridanionen synthetisiert (Weiss et al., 1982) und liegt mit einem pKa von 7,53 bei physiologischen pH-Werten zu etwa gleichen Teilen als freie Säure und als Salz vor. Die hypochlorische Säure ist eine der stärksten bekanntesten Oxidantien, zerfällt in wäßrigem Milieu zu Singulett-Sauerstoff (Khan et al., 1994) und reagiert mit Proteinen, Lipiden, Kohlenhydraten und Nukleinsäuren (Test et al., 1986; Albrich et al., 1981), Während nun der proteosomale Abbau von Proteinen, die mit H2O2, Superoxid und Peroxynitrit modifiziert worden sind, weitgehend untersucht ist (Grune et al., 1995; Grune et al., 1996; Grune et al., 1997; Grune et al., 1998), ist über den proteolytischen Abbau Hypochlorit-geschädigter Proteine noch wenig bekannt. Diese Untersuchungen wurden an der isolierten Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PD) vorgenommen, dem regulatorischen Schlüsselenzym des Pentosephosphatwegs, der das für die Glutathion-Regeneration essentielle Nikotinamid-Dinukleotidphosphat (NADPH) bereitstellt. Die G6PD ist daher ein für die antioxidative Abwehr und das Überleben der Zelle unter oxidativen Stress essentielles Enzym (Ursini et al., 1997).

Nach ansteigender Schädigung mit Hypochlorit kam es zunächst zur enzymatischen Inaktivierung (IC50 etwa 0,02 µmol OCl- / mg Protein), dann zum drastischen Anstieg der proteasomalen Abbaubarkeit (ab 0,05 µmol OCl- / mg Protein) und schließlich zur Proteinfragmentation (ab 0,08 µmol OCl- / mg Protein). Diese Sequenz der Ereignisse macht deutlich, daß einer funktionellen Inaktivierung der G6PD direkt der proteolytische Abbau durch das Proteasom nachfolgt, und einer möglichen Proteinfragmentierung vorausgeht. Das 20S Proteasom zeigte sich hierbei auch gegenüber Hypochlorit äußerst resistent und ein progredienter Aktivitätsverlust war erst oberhalb von 0,2 µmol OCl- / mg Protein zu beobachten.


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2.1.2 Molekulare Grundlagen der Proteasomaktivierung durch die Poly(ADP-Ribose)-Polymerase

P. Meyer-Kuckuk and O.Ullrich et al. Biochem. Biophys. Res. Comms. 259, 576-581 (1999)

Weitere Untersuchungen wurden vorgenommen, um den molekularen Mechanismus der Aktivierung des 20S Proteasoms durch die PARP-1 zu identifizieren. Dabei wurde untersucht, ob das isolierte 20S Proteasoms in vitro mit der poly(ADP-ribosyl)ierten PARP-1 oder mit der unmodifizierten PARP-1 interagiert. Das 20S Proteasom wurde anschließend mittels Nativ-Elektrophorese und Aktvitätsfärbung sowie im in vitro-Aktivitätsassay, die gebundene Poly(ADP-Ribose) einer elektrophoretischen Kettenlängenanalyse unterzogen.

Dabei zeigte sich nach Inkubation mit der Poly(ADP-ribosyl)ierten PARP-1 eine deutliche Verschiebung des intakten 20S Proteasoms hin zu höheren Molekulargewichten und eine gleichzeitig deutlich erhöhte Aktivität. Am Proteasom konnten Poly(ADP-Ribose)-Polymere identischer Kettenlänge wie an der PARP-1 nachgewiesen werden. Interessanterweise waren diese Befunde nach Inkubation mit von der PARP-1 abgelösten Poly(ADP-Ribose)-Polymeren identisch, nicht aber nach Inkubation mit der unmodifizierten PARP-1, die nicht in der Lage war, an proteasomale Untereinheiten zu binden. Zur Untersuchung der Spezifität dieser Bindung wurden die Experimente auch mit oligo(ADP-ribosyl)ierter PARP-1, mit abgelösten oligo(ADP-Ribose)-Oligomeren (mit etwa 20 ADP-Ribose-Einheiten), und auch mit fragmentierter RNA und DNA durchgeführt. Dabei wurde mit Fragmentgrößen gearbeitet, die der Poly(ADP-Ribose) vergleichbar sind. In keinem dieser Fälle kam es zur Bindung an das 20S Proteasom oder zu seiner Aktvierung. Auch eine kovalente Modifikation des 20S Proteasoms mit Poly(ADP-Ribose)-Polymeren war nicht möglich.

Es konnte also gezeigt werden, daß die automodifizierte PARP-1 über die nichtkovalente Bindung ihrer Poly(ADP-Ribose)-Ketten zu einer Aktvierung des 20S Proteasoms führt. Diese Bindung erfordert darüberhinaus eine bestimmte Kettenlänge der Poly(ADP-Ribose) und ist spezifisch von der Struktur dieser Polymere abhängig.


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2.1.3 Endogene Inhibitoren der Poly(ADP-Ribose)-Polymerase

O. Ullrich et al. Biochem. J. 315, 705-708 (1996)

Wenn die PARP-1 sowohl über ihre Mitwirkung an der DNA-Reparatur, als auch an der Regulation des Abbaus geschädigter Histone wesentlich beteiligt ist, so stellt sich die Frage, inwieweit dieses Enzym nicht auch durch oxidativen Stress selbst endogen geschädigt oder inaktiviert werden kann. Während die PARP-1 in isolierter Form oxidationsempfindlich ist, scheint sie innerhalb der lebenden Zelle und sogar in isolierten Zellkernen gut gegenüber oxidativen Streß wie z.B. nach Behandlung mit H2O2 oder radikalgenerierenden Pharmaka, geschützt zu sein (Ullrich et al., 1999, Ullrich et al., 2000; Ciftci et al., 2001; Ullrich et al., 2001).

Der direkten Wirkung freier Sauerstoffradikale auf zelluläre Funktionen stehen aber auch die Vielzahl indirekter Wirkungen über Sekundärprodukte oxidativen Stresses gegenüber. Diese entstehen vor allem bei der in Zellmembranen ausgelösten Lipdperoxidation aus besonders oxidationsempfindlichen polyungesättigten Fettsäuren, wobei relativ langlebige toxische aldehydische Lipidperoxidationsprodukte gebildet werden, die als Mediator von Entzündungsprozessen angesehen werden. Diese sind nicht nur relativ langlebig und können daher innerhalb der Zelle in verschiedenen Kompartimenten, Organellen und Strukturen ihre Wirkung entfalten, sondern können die Zellfunktion auf verschiedene Art und Weise beeinträchtigen (Esterbauer et al., 1993).

Unter diesen aldehydischen Lipidperoxidationsprodukten erweis sich das 4-Hydroxynonenal in pathophysiologischen Konzentrationen (Selley et al., 1992; Esterbauer et al. 1993) als starker Inhibitor der isolierten PARP-1 mit einem Ki von etwa 4 µmol/l. In lebenden primären Zellen (Fibroblasten aus der Kniegelenkssynovia) war bereits eine Konzentration von 1 µmol/l 4-Hydroxynonenal effektiv, um die Poly(ADP-ribose)-Synthese nach Induktion von DNA-Strangbrüchen mit einem Xanthin/Xanthin-Oxidase-System auf 51 % zu senken.

O. Ullrich et al. Free Radic. Biol. Med. 22, 1153-1157 (1997)

Da das aldehydische Lipidperoxidationsprodukt 4-Hydroxynonenal nicht nur die PARP als wichtiges Schlüsselenzym der antioxidativen Abwehrsysteme der Zelle hemmt, sondern auch im Rahmen oxidativer Zellschädigung ständig produziert wird, besteht


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nun grundsätzlich die Gefahr der Ausschaltung PARP-abhängiger Schutzsysteme wie die DNA-Reparatur und den Abbau geschädigter Proteine durch Akkumulation von 4-Hydroxynonenal. Daher wurde untersucht, ob und wie dieses Produkt metabolisiert wird.

Im Rahmen dieser Untersuchungen konnten wir die mitochondriale Metabolisierung, vor allem über die Oxidation zu 4-Hydroxynonensäure und Einschleusung in die beta-Oxidation und den Zitratzyklus als einen wichtigen Abbauweg identifizieren (Ullrich et al., 1994; Ullrich et al., 1997). Darüberhinaus kommt es noch zur Bildung eines Adduktes mit reduziertem Glutathion und in geringem Maße zur Reduktion zum korrespondierenden Alkohol 1,4-Dihydroxynonen. Aufgrund der vornehmlich oxidativen Metabolisierung des 4-Hydroxynonenals, hauptsächlich in Mitochondrien, kann also angenommen werden, daß ischämisch-hypoxische Prozesse im ZNS zur Akkumulation von 4-Hydroxynonenal und damit zur Beeinträchtigung PARP-regulierter Reparatursysteme führen.

Es konnte also nachgewiesen werden, daß

2.2 Mechanismen der antioxidativen Protektion von Tumorzellen durch die Poly(ADP-Ribose)-Polymerase

2.2.1 Differenzierungsabhängige Regulation der Poly(ADP-Ribose)-Polymerase

O. Ullrich et al. Free Radic. Biol. Med. 29, 995-1004 (2000)

Oxidativer Stress in Zellkern führt zu Histonmodifikationen wie Oxidation von Aminosäureseitenketten, Protein-Protein-Crosslinks und DNA-Protein-Crosslinks (Jones et al., 1993; Altmann et al., 1995), wodurch die Funktionaliät der Histone bei DNA-Transkription, -Replikation und -Reparatur empfindlich gestört werden kann. Daher scheint der selektive und spezifische Abbau oxidativ geschädigter Histone eine wichtige Voraussetzung zum Erhalt der genomischen Stabilität zu sein. Da im Rahmen der Tumortherapie viele Chemotherapeutika über die Induktion von oxidativen Schäden am Chromatin wirken, kann angenommen werden, daß sich auch proliferierende Tumorzellen dieser Systeme bedienen, um eine oxidative Schädigung zu überleben.

In diesem Zusammenhang wurde ein gut charakterisiertes Zellkulturmodell aus differenzierenden und retrodifferenzierenden humanen U937 myelomonozytären Leukömiezellen verwendet (Rovera et al., 1979; Hass et al., 1989; Hass et al., 1992), die die Untersuchung differenzierungsabhängiger Zellfunktionen in genetisch identischen Zellpopulationen ermöglicht. Darüberhinaus weisen die mittels des Phorbolesters 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA) differenzierten U937-Zellen eine Vielzahl von morphologischen und funktionellen Eigenschaften von Makrophagen auf (Hass et al., 1989), so daß diese Untersuchung als Grundlage für die weiteren Arbeiten an Mikrogliazellen, den Makrophagen des Gehirnes, dienen sollen.

Diese mit TPA-differenzierten U937-Zellen verharren für etwa 2-3 Wochen in einer transienten G´0-Wachstumsarretierung. Anschließend verlieren diese makrophagenähnlichen Zellen wieder ihre Differenzierungsmarker, entwickeln einen


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undifferenzierten Phänotyp und treten in den proliferativen Zellzyklus ein (Hass et al., 1992). Außerdem wurde eine weitere, den U937-Zellen genetisch identische Zellpopulation untersucht, die aber differenzierungsresistent sind, einen beschleunigten Zellzyklus aufweisen und in Tierexperimenten eine höhere Tumorigenität zeigen, die TUR-Zellen (Hass et al., 1993; Hass et al., 1997).

In unseren Untersuchungen kam es nach Behandlung mit H2O2 in proliferierenden U937-Zellen zu einer etwa 2,5-fachen Aktivitätssteigerung des Proteasoms, in differenzierten U937-Zellen, die zudem eine um etwa 40 % reduzierte konstitutionelle Proteasomaktivität aufwiesen, aber nicht. Verschiedene Inhibitorexperimente brachten das Ergebnis, daß diese Proteasomaktivierung von der Aktivität der PARP abhängig war. Während in Abhängigkeit vom Differerenzierungsstadium keine Unterschiede in der Expression des Proteasomproteins gefunden wurden, zeigte sich in der Regulation der Expression der PARP-1 eine deutliche Abhängigkeit von Differenzierungsgrad der Zellpopulation, mit einer reduzierten Expression in differenzierten U937-Zellen und einer erhöhten Expression in der differenzierungsresistenten U937-Zellpopulation (TUR-Zellen). Immunpräzipitations-experimente erbrachten den Nachweis einer direkten Protein-Protein-Interaktion des Proteasoms mit der automodifizierten poly(ADP-ribosyl)ierten PARP-1, die für die beobachtete Aktivitätssteigerung des Proteasoms nach oxidativer Belastung verantwortlich ist. Es konnte weiterhin gezeigt werden, daß diese PARP-regulierte Proteasomaktivierung oxidativ belastete proliferierende U937-Zellen vor der Akkumulation oxidativ geschädigter Proteine schützt, während differenzierte U937-Zellen nach oxidativer Belastung sehr schnell und stark oxidativ geschädigte Proteine akkumulieren. Weitergehende Experimente haben gezeigt, daß diese akkumulierenden oxidativ geschädigten Proteine in differenzierten U937-Zellen in der Lage sind, eine Retrodifferenzierung auszulösen (Selle et al., 2001).

Die PARP-Aktivierung folgt relativ streng der Bildung und Reparatur von DNA-Strangbrüchen (Cantoni et al., 1989). Eine höhere PARP-Aktivität wurde auch in anderen proliferierenden Zellpopulationen im Vergleich zu differenzierten Zellen beobachtet (Tomoda et al., 1992; Kirsten et al., 1991; Bhatia et al., 1996). Hochmaligne schnell proliferierene Zellen scheinen im allgemeinen besonders gut in der Lage zu sein, sich gegen oxidativen Streß zu schützen (Plummer et al., 1994; Toyokuní et al., 1995). Teilweise wurden allerdings auch entgegengesetzte Beobachtungen beschrieben, nämlich eine Erhöhung der PARP-Expression und -Aktivität während der


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Differenzierung (Simbulan-Rosenthal et al., 1999; Quesada et al., 1996). Daher sind über die PARP-Expression in Abhängigkeit vom Differenzierungsgrad keine allgemeingültigen Aussagen möglich, sondern diese scheint eher von Zelltyp und der Art des Differenzierungsinduktors abhängig zu sein.

2.2.2 Poly(ADP-Ribose)-Polymerase-vermittelte Chemotherapie-Resistenz

Ö. Ciftci and O. Ullrich et al. Blood 97, 2830-2838 (2001)

Die chemotherapeutische Behandlung der akuten myeloischen Leukämie (AML) führt in etwa 60-70 % der Fälle zu einer kompletten Remission. Allerdings erleiden der Großteil der Patienten, die sich nach der Initialtherapie in kompletter Remission befinden, ein das Krankheitsbild deutlich verschlimmerndes Rezidiv (Preisler et al., 1989; Champlin et al., 1987). Daher sind Untersuchungen angebracht, die Effektivität der chemotherapeutischen Initialbehandlung zu verbessern. Chemotherapien zur Behandlung der AML basieren üblicherweise auf dem Nukleosid-Analogon Cytosin-Arabinosid (AraC), dem Topoisomeraseinhibitor Etoposid (VP-16) und einem DNA-interkalierenden und radikal-produzierenden Anthrachinon (z.B. Adriamycin). Die zytotoxische Wirkung der Anthracycline beruht auf der Produktion freier Sauerstoffradikale in unmittelbarer Nähe zum Chromatin aufgrund von Redox-Zyklen oder durch den intrazellulären Metabolimus dieser Substanzen (Sinha et al., 1990; Davies et al., 1986; Marcillat et al., 1989; Feinstein et al., 1993). Frühere Untersuchungen haben Hinweise ergeben, daß durch Inhibition der PARP die tumortoxische Wirkung von chemotherapeutischen Substanzen gesteigert werden kann, wahrscheinlich über die Störung der DNA-Reparatur (Boulikas et al., 1993; Tentori et al., 1998), die Induktion von Resistenz-Molekülen (Chatterjee et al., 1995) oder den Verlust von amplifizierten Onkogenen (Nagao et al., 1991). Die PARP wird daher als vielversprechendes Ziel toxizitätsverstärkender chemotherapeutischer Interventionen angesehen (Ruf et al., 1998; Watson et al., 1998; Boulikas et al., 1993; Berger et al., 1987), vor allem bei der Behandlung mit Anthracyclinen (Kato et al., 1988).

In unseren Arbeiten führte die Behandlung von proliferierenden U937-Zellen mit 10-7 M Adriamycin zur einer Steigerung der nukleären Proteasomaktivität auf das etwa 4,3-fache der Ausgangsaktivität mit einem Maximum nach 15 min, während AraC oder VP-16 im Zeitraum von bis zu 24 h keine Erhöhung der nukleären Proteasomaktivität bewirkten. Diese Proteasomaktivierung nach Adriamycin-Behandlung blieb in differenzierten U937-Zellen weitgehend aus und zeigte sich sehr


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sensitiv gegenüber einer Hemmung der PARP mittels 3-Aminobenzamid. Immunpräzipitationsexperimente gegen die PARP in Lysaten aus isolierten Zellkernen von Adriamycin-behandelten U937-Zellen verschiedenen Differenzierungsgrades belegten die Protein-Protein-Interaktion der automodifizierten poly(ADP-ribosyl)ierten PARP mit dem 20S Proteasom als ursächlich für die Proteasomaktivierung nach Adriamycin-Behandlung und ihrer differenzierungsabhängigen Unterschiede (Abb. 6).

Abb. 6: (aus Ö.Ciftci and O.Ullrich et al. Regulation of the nuclear proteasome activity in myelomonocytic human leukemia cells after adriamycin treatment. Blood 97, 2830-2828, 2001): PARP-regulierte Proteasomaktivierung in humanen U937-Leukämiezellen nach Adriamycin-Behandlung. Proliferierende humane U937-Leukämiezellen wurden für 15 min mit 10-7 M Adriamycin in An- oder Abwesenheit des PARP-Inhibitors 3-Aminobenzamid (3-ABA) behandelt und die immunpräzipitierte PARP-1 im Immunoblot mit PARP-1 und Proteasom-Antikörpern analysiert (A) sowie die Aktivität des copräzipitierten Proteasoms durch Inkubation mit dem fluorogenen Modellpeptid sLLVY-MCA bestimmt (B).

Zur Untersuchung der Spezifität der beobachteten Effekte wurde in weiteren Experimenten ein antisense-PARP-1-pcDNA3.1-Vektor konstruiert und eine stabil transfizierte U937-Zelllinie hergestellt. Durch antisense-PARP-1-Transfektion konnte die im Vergleich zu U937-Zellen auf um das etwa 25-fache erhöhte halbletale Konzentration LD50 von Adriamycin (5x10-6 M) auf 2x10-7 M und damit auf das Niveau


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der U937-Zellen gesenkt werden. Die generelle Hemmung der ADP-Ribosylierungs-Reaktionen mit 3-Aminobenzamid erwies sich hier als noch effektiver und konnte die LD50 noch einmal um den Faktor 4 senken, was auf eine Beteiligung auch anderer PARP-Proteine außer der PARP-1 an der Adriamycin-Resistenz deutet (Ame et al., 1999). Interessant ist, daß anscheinend diese initiale, innerhalb der ersten 30 min nach Beginn der Adriamycin-Behandlung auftretende Aktivierung der PARP entscheidenen Einfluß auf die detektierte Zytotoxität nach einer Latenz von 24 h zu nehmen scheint.

Um diesem Phänomen auf den Grund zu gehen, untersuchten wir, welche oxidativen Schäden an der Zelle zu welchem Zeitpunkt nach Beginn der Adriamycin-Behandlung auftraten und welchen Einfluß die Hemmung der PARP mit 3-Aminobenzamid oder die Ausschaltung der PARP-1 mittels einer stabilen antisense-Transfektion dabei hatte. Dabei waren bei Behandlung mit einer sublethalen Konzentration von 10-7 M Adriamycin nach 15 min sowohl DNA-Protein-Crosslinks, als auch DNA-Schäden nachweisbar. Gleichzeitig erreichte die Proteasomaktivität ihr Maximum. Die DNA-Protein-Crosslinks waren nach 1 h abgebaut, während die DNA-Schäden dort ihr Maximum erreichten und anschließend, wahrscheinlich durch nun einsetzende Reparaturprozesse, wieder abnahmen. Im Falle einer Hemmung der PARP oder nach ihrer Ausschaltung mittels stabiler antisense-Transfektion kam es ebenfalls 15 min nach Beginn der Adriamycin-Behandlung zum Auftreten von DNA-Protein-Crosslinks, die dann aber mit der Zeit deutlich akkumulierten. Mit der Nachweisbarkeit von DNA-Protein-Crosslinks kam es auch, allerdings zeitversetzt, nach 24 h zu einem deutlichen Aktivitätsverlust des 20S Proteasoms, was in einem starken Anstieg der Gesamtmenge an oxidierten Proteinen resultierte.

Interessanterweise erfolgte zwar ein Anstieg der DNA-Schäden bereits nach 15 min, der stärkste Anstieg aber war erst nach 24 h zu verzeichnen. Daher scheint also in der Verhinderung einer initialen Akkumulation von DNA-Protein-Addukten der entscheidene Schlüssel zu Überleben der Zelle zu liegen. Kommt es dagegen zur Akkumulation dieser DNA-Protein-Addukte, wird eine Art sich selbst verstärkende zelluläre Schadenskaskade eingeleitet, bestehend aus der Hemmung des Proteasoms, der Akkumulation oxidativ geschädigter Proteine und geschädigter DNA. Da das nukleäre 20S Proteasom, wie unsere Arbeiten gezeigt haben, in der Lage ist, innerhalb von wenigen Minuten nach Aktivierung durch die PARP, oxidativ geschädigte Kernproteine selektiv und hocheffektiv abzubauen (Ullrich et al., 1999; Ullrich et al., 1999; Ullrich et al., 2001), kann dadurch die Bildung von Crosslinks mit der DNA und damit die


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Initiation dieser zellulären Schadenskaskade verhindert werden. Dieser PARP-regulierten schnellen Aktivierung des 20S Proteasoms innerhalb der ersten Minuten nach Beginn einer zytotoxischen Chemotherapie scheint also eine entscheidene Bedeutung für ihre Wirksamkeit zuzukommen. Experimente mit primären isolierten leukämischen Blasten aus Patienten mit einer AML konnten diese schnelle Aktivierung des 20S Proteasoms nach Adriamycin-Behandlung durch Interaktion mit der PARP-1 bestätigen.

Es konnte also nachgewiesen werden, daß


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2.3 Protektive Funktionen der Poly(ADP-Ribose)-Polymerase in aktivierten Mikrogliazellen

O. Ullrich at al. FASEB J. 15, 1460-1462 (2001)

In diesen Experimenten fanden wir einen erhöhten intrazellulären Proteinabbau in mit TNF-alpha behandelten, aktivierten, amöboiden BV-2-Mikrogliazellen im Vergleich zu mit alpha-Tocopherol behandelten ruhenden und ramifizierten BV-2-Mikrogliazellen. Dieser erhöhte intrazelluläre Proteinabbau war hierbei hauptsächlich im Zellkern lokalisiert, die verantwortliche Protease konnte in Hemmstoffexperimenten als das Proteasom identifiziert werden. Interessanterweise wurde der konstitutive endogene Proteinturnover durch spezifische Hemmung des Proteasoms nicht beeinträchtigt, was darauf hinweist, daß der proteasomale Proteinabbau eher in aktivierten als in ruhenden Mikrogliazellen eine Rolle spielt.

Da das Proteasom in der Lage ist, oxidativ geschädigte Proteine spezifisch zu erkennen und abzubauen, kann ein erhöhter intrazellulärer Proteinabbau entweder aus einem höheren Maß an oxidativer Proteinschädigung oder einer Zunahme der Proteasomaktivität oder aus beidem resultieren. Daher untersuchten wir den Abbau eines in vitro oxidativ geschädigten Modellproteins in Lysaten ruhender und aktivierter Mikrogliazellen, wobei dieses Modellprotein in Lysaten aktivierter Mikrogliazellen deutlich stärker proteasomal abgebaut wurde. Direkte Messungen der Proteasomaktivität mit einem fluorogenen Modellpeptid erbrachten eine 1,6-fach erhöhte Aktivität im Gesamtzelllysat und eine 3,9-fach erhöhte Aktivität in den Zellkern aktivierter Mikrogliazellen. Aktivierte Mikrogliazellen zeichnen sich also durch eine erhöhte proteasomale proteolytische Aktvität im Vergleich zu ruhenden Mikrogliazellen aus.

Aufgrund früherer Studien mit humanen K562-Leukämiezellen (Ullrich et al., 1999b), aber auch mit makrophagenartig differenzierten U937-Zellen (Ullrich et al., 2000) war bekannt, daß das nukleäre Proteasom nach exogener oxidativer Belastung durch Interaktion mit der poly(ADP-ribosyl)ierten PARP-1 aktiviert werden kann. Dennoch konnte bisher noch kein Nachweis erbracht werden, daß auch physiologische Vorgänge ohne direkte exogene oxidative Belastung zu dieser PARP-1-regulierten Proteasomaktivierung führen können, so daß ein Analogieschluß auf die Mechanismen in aktivierten Mikrogliazellen nicht unmittelbar möglich war. Daher untersuchten wir


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hier zunächst den Effekt einer Hemmung der mikroglialen PARP-1 mit 3-Aminobenzamid und fanden eine deutlich geringere Proteasomaktivierung in Zellkernen aktivierter Mikrogliazellen. Unter den Bedingungen oxidativer Belastung kam es in NGF-differenzierten und wachstumsarretierten neuronalen PC12-Zellen nicht zur Proteasomaktivierung, wohl aber in aktivierten und proliferierenden BV-2-Mikrogliazellen. Tatsächlich gibt es also Hinweise, daß diese PARP-1-regulierte Proteasomaktivierung ein besonderes Merkmal proliferierender Zellen ist und wahrscheinlich eng mit protektiven, antioxidativen Funktionen verbunden ist, wie es schon im Falle der Adriamycin-Behandlung von myelomonozytären human U937-Leukämiezellen, aber auch in leukämischen Blasten von Patienten mit einer akuten myeloischen Leukämie von uns gezeigt werden konnte (Ciftci et al., 2001). Mittels Immunpräzipitationsexperimenten konnte auch im Falle der aktivierten Mikrogliazellen eine funktionelle Interaktion der poly(ADP-ribosyl)ierten PARP-1 mit dem Proteasom demonstriert werden, die zur Aktivierung des Proteasoms führte.

Abb. 7: (aus O. Ullrich at al. FASEB J. 15, 1460-1462, 2001): Spezifische Beteiligung der PARP-1 an der TNF-alpha-induzierten Erhöhung des Proteinturnovers und der nukleären Proteasomaktivität. A: Proteinabbau in Lysaten isolierter Zellkerne aus stabil mit einem antisense-PARP-1-Vektor transfizierten (asPARP cells) oder mit einem Kontroll-Vektor (control cells) transfizierten BV-2-Mikrogliazellen mit und ohne Stimulation mit TNF-alpha. B: Lactacystin-sensitive Proteasomaktivität in isolierten Zellkernen. C: PARP-1-Protein-Expression in stabil mit einem antisense-PARP-1-Vektor transfizierten (asPARP cells) oder mit einem Kontroll-Vektor (control cells) transfizierten BV-2-Mikrogliazellen. * = p<0,05, ** = p<0,005, *** = p<0,0005


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Um die Spezifität dieser Untersuchungen zu belegen, konstruierten wir einen antisense-PARP-1-pTracerCMV2-Vektor und stellten eine stabil transfizierte BV-2-Mikrogliazelllinie her, in der die PARP-1-Expression komplett supprimiert war (Abb. 7). In diesen antisense-PARP-1-Mikrogliazellen konnte nun, im Vergleich mit den Kontroll-Vektor-transfizierten Mikrogliazellen, kein erhöhter Proteinabbau nach Aktivierung mit TNF-alpha gemessen werden, und auch die Aktivierung des nukleären Proteasoms war deutlich geringer. Daraus kann gefolgert werden, daß in aktivierten Mikrogliazellen tatsächlich die PARP-1 die nukleäre Proteasomaktivität positiv reguliert.

Da der selektive Abbau geschädigter zellulärer Proteine eine gutbekannte und gut untersuchte biologische Funktion des ATP- und Ubiquitin-unabhängigen 20S-Proteasoms darstellt (Grune et al., 1995; Grune et al., 1996; Grune et al., 1997), könnte die PARP-1-regulierte Aktivierung dieser Protease in aktivierten, phagozytierenden und große Menge an toxischen freien Radikalen produzierenden Mikrogliazellen ein wirksames System zum antioxidativen Selbstschutz darstellen. Um diese Hypothese zu überprüfen, untersuchten wir das Auftreten oxidativ geschädigter Proteine in aktivierten Mikrogliazellen und fanden keine Akkumulation geschädigter Proteine. Nach spezifischer Hemmung des Proteasoms oder der PARP stellt sich die Situation aber grundsätzlich anders dar: Nun kam es zu einer massiven Akkumulation oxidativ geschädigter Proteine in aktivierten Mikrogliazellen, die schließlich zum Tod der Zelle führte. In ruhenden Mikrogliazellen allerdings kam es nach Hemmung der PARP zu keiner Akkumulation oxidativ geschädigter Proteine, und auch eine Hemmung des Proteasoms führte nur zu einem leichten Anstieg. Daraus kann gefolgert werden, daß allein die konstitutive Proteasomaktivität ruhende Mikrogliazellen ausreichend vor oxidativen Schäden schützt.

In dieser Arbeit konnte also gezeigt werden, daß die PARP-1-regulierte Aktivierung des nukleären Proteasoms ein bereits auf pyhsiologische Bedingungen reagierendes wichtiges antioxidatives Schutzsystem in Mikrogliazellen darstellt.


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2.4 Die Funktion der mikroglialen Poly(ADP-Ribose)-Polymerase in exzitotoxisch geschädigtem lebenden Hirngewebe

O. Ullrich et al. Nature Cell Biol. 3, 1035-1042 (2001)

Exzitotoxische Hirnschädigungen, z.B. nach Hirninfarkt oder Schädel-Hirn-Trauma, führen zunächst zu einer primären Schädigung von Hirnparenchym. Innerhalb von Stunden bis Tagen nach diesem Ereignis kommt es dann zu einer Invasion aktivierter Mikrogliazellen in die Region des neuronalen Schadens, die dort große Mengen an toxischen Zytokinen und Sauerstoffradikalen freisetzten und dadurch zu einer weiteren, sekundären neuronalen Schädigung führen (Mabuchi et al., 2000; Stoll et al., 1998). Diese weitere Schädigung initial überlebender Neurone trägt wesentlich zur Gesamtschädigung bei und ist für einen großen Teil der funktionellen Einbußen verantwortlich, die ein Patient nach einem solchen Ereignis erleidet. Daher sollten therapeutische Ansätze nach bereits eingetretenem Primärschaden die Protektion dieser initial überlebenden Neurone vor weiterer sekundärer Schädigung zum Ziel haben.

Es ist gut bekannt, daß es nach einer exzitotoxischen Schädigung von Neuronen zu einer schnellen und ausgeprägten Aktivierung der PARP-1 kommt, die durch die verursachte NAD+ - und ATP-Depletion das betroffene Neuron in den Tod treiben kann (Zhang et al., 1994). Daher wird die Hemmung der PARP-1 im Hirngewebe nach einem exzitotoxischen Insult als vielversprechende Therapieoption angesehen (Eliasson et al., 1997; Endres et al., 1997; Eliasson et al., 1999; Ha et al., 2000). Auf der anderen Seite aber gibt es viele Hinweise, daß die systemische Hemmung der PARP-1 bei zerebralen Insulten aufgrund der Störung von Reparaturprozessen auch mit durchaus negativen Auswirkungen auf das neuronale Überleben verbunden sein kann (Liu et al., 2000; Bürkle, 2001). So besteht grundsätzlich die Gefahr, daß die Therapie mit PARP-1-Inhibitoren nicht zum erwünschten protektiven Erfolg, sondern auch zu weiterer Destruktion funktionsfähigen Hirnparenchyms führen könnte. Aus diesen Gründen schien uns die weit verbreitete Strategie der systemischen PARP-1-Hemmung bei einem zerebralen Insult als nicht optimal, und wir konzentrierten uns auf die Rolle der Mikrogliazellen im Kontext von Schadenprozessen im Gewebeverband. Da aufgrund unserer Vorarbeiten bekannt war, daß die PARP-1 in phagozytierenden Mikrogliazellen aktiviert ist und diese an der Regulation eines wichtigen mikroglialen antioxidativen


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Schutzsystems teilnimmt (Ullrich et al., 2001c), könnte die spezifische Hemmung der PARP-1 eine neue Strategie zur Protektion initial überlebender Neurone vor weiterer Schädigung sein.

Um zu untersuchen, ob eine Herunterregulierung der PARP-1-Expression in Mikrogliazellen zu einem verringerten sekundären neuronalen Schaden führt, mußten wir uns eines Modellsystems bedienen, das die Möglichkeit der direkten Untersuchung von Neuronen und Mikrogliazellen im lebendem Hirngewebe ermöglicht, die organotypische hippocampale Hirnschnittkultur (OHSC). Mit diesem Modellsystem ist es möglich, exogene kultivierte vorbehandelte und vormarkierte Mikrogliazellen auf das Hirngewebe zu transferieren und die Invasion und Migration dieser Mikrogliazellen sowie ihre Interaktion mit Neuronen zu untersuchen (Hailer et al., 1997; Hailer et al., 1998; Heppner et al., 1998).

Zuerst wurde ein antisense-PARP-1-pcDNA3.1-Vektor kloniert und damit BV-2-Mikrogliazellen stabil transfiziert. Diese transfizierten Mikrogliazellen wurden dann im Anschluß an eine exzitotoxische Schädigung mit NMDA auf die Oberfläche von OHSCs transferiert und nach drei Tagen die Migration der Mikrogliazellen in die Regionen neuronaler Schädigung sowie der neuronale Zelltod untersucht. Der nach NMDA-Behandlung auftretende neuronale Schaden (in der Pyramidenzellschicht des Cornu ammonis und der Körnerzellschicht des Gyrus dentatus) konnte, wie erwartet und in Übereinstimmung mit den Befunden der Gruppe von Prof. Snyder (Wang et al., 1994; Eliassion et al., 1997), durch chemische Hemmung der PARP im gesamten Gewebeverband reduziert werden, nämlich auf etwa 45 % (Abb. 8a und 8b). Wurden auf den exzitotoxisch geschädigten Hirnschnitt Kontroll-Vektor-transfizierte Mikrogliazellen gegeben, so kam es zu einer annähernden Verdoppelung des neuronalen Gesamtschadens, auch hier konnte durch chemische Hemmung der PARP im gesamten Gewebeverband eine Reduktion des neuronalen Schadens auf etwa 63 % erreicht werden (Abb. 8a und 8b). Wurden nun aber antisense-PARP-1-Mikrogliazellen auf den Hirnschnitt transferiert, blieb trotz Invasion dieser Zellen in das Hirngewebe die Ausbildung eines sekundären Schadens völlig aus, und es konnte überraschenderweise sogar eine Reduktion des Gesamtschadens unter das Niveau der initialen exzitotoxischen Schädigung beobachtet werden (Abb. 8a und 8b). Daher scheint also die spezifische Ausschaltung der mikroglialen PARP-1 im lebenden Hirngewebe eine deutlich protektivere Wirkung auf die Neurone zu haben, als die Hemmung der PARP im gesamten Gewebe.


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Warum dieses so ist, untersuchten wir in den folgenden Experimenten: Zunächst prüften wir die naheliegende Hypothese, daß die durch die neuronale Schädigung aktivierte antisense-PARP-1-Mikrogliazellen durch Ausschaltung eines wesentlichen PARP-1-regulierten antioxidativen Schutzsystems ihre eigene Aktivierung nicht überleben (Ullrich et al., 2001c). Allerdings fanden wir keine Hinweise auf eine reduzierte Vitalität der antisense-PARP-1-Mikrogliazellen in den lebenden Hirnschnitten (Abb. 8c und 8d). Diese Ergebnisse stellen uns zunächst vor ein großes Problem, da sie sich doch offensichtlich im Widerspruch zu den Ergebnissen unserer Experimente mit kultivierten antisense-PARP-1-Mikrogliazellen befanden (Ullrich et al., 2001c). Hier zeigte sich besonders deutlich, wie exakt und reproduzierbar in einem Zellkultursystem gewonnen Ergebnisse auch sein können, aber wie wenig weitreichend aber die daraus zulässigen Schlußfolgerung auf die wirkliche physiologische Situation sein dürfen. In jedem Falle aber zwang uns dieser Negativbefund, der noch völlig ungeklärten Frage der Ursache der ausgeschalteten destruktiven Wirkung von antisense-PARP-1-Mikrogliazellen auf den Grund zu gehen.

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Abb. 8: (aus O. Ullrich et al. Nature Cell Biol. 3, 1035-1042, 2001): Ausschaltung der PARP-1 in BV-2-Mikrogliazellen schützt vor sekundärem neuronalem Schaden in lebenden organotypischen hippocampalen Schnittkulturen (OHSCs). a: Propidium-Iodid-positive tote Zellen in den neuronalen Schichten der Degenerationszone im Cornu ammonis und Gyrus dentatus. Zellzahlen relativ zur Zahl in ungeschädigten OHSCs ohne Zugabe von Mikrogliazellen (control=1), nicht-vitale Mikrogliazellen wurden subtrahiert. NMDA: Induktion der neuronalen Schädigung mit 5 µM NMDA; control = ohne Mikrogliazellen; 3-ABA = ohne Mikrogliazellen, 1 mM 3-Aminobenzamid; BV-2 = mit Kontroll-Vektor-transfizierten BV-2-Mikrogliazellen, asPARP = mit antisense-PARP-1-Vektor transfizierten BV-2-Mikrogliazellen. Mean + S.D., n=30, * = p<0,05, ** = p<0,005. b: Propidium-Iodid-Fluoreszenz-Mikroskopie der neuronalen Degenerationszonen in der CA-Region in lebenden OHSCs vor der Fixierung, Skala = 40 µm. c: Vitalität der invadierten BV-2-Mikrogliazellen. Mean + S.D., n=30, n.s. = nicht signifikant. d: Keine Kolokalisation der Propidium-Iodid-positiven toten Zellen (Rotfluoreszenz) mit Mini-Emerald-vormarkierten BV-2-Mikrogliazellen (Grünfluoreszenz). Skala = 20 µm


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Abb. 9: (aus O. Ullrich et al. Nature Cell Biol. 3, 1035-1042, 2001): Kontrolle der mikroglialen Migration in die neuronalen Degenerationszonen durch die PARP-1. a: Durchlicht- und Rhodamin-Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der lebenden hippocampalen Hirnschnittkulturen (OHSCs). Vector control=Kontroll-Vektor-transfizierte BV-2-Mikrogliazellen, asPARP = mit antisense-PARP-1-Vektor transfizierte BV-2-Mikrogliazellen, NMDA=Induktion der neuronalen Schädigung mit 5 µM NMDA, LV=linker Ventrikel, H=Hilus, MEC=medialer entorhinaler Kortex, FH=Fissura hippocampi. Skala = 40 µm. b: Ortsspezifität der mikroglialen Migration zum Ort der neuronalen Schädigung von Kontroll-Vektor-transfizierten BV-2-Mikrogliazellen (Con.) und antisense-PARP-1-Vektor transfizierten BV-2-Mikrogliazellen (asPARP) vor und nach Induktion der neuronalen Schädigung mit 5 µM NMDA (NMDA). Ortsspezifität = (Zellzahl in der Pyramidenzellschicht des Cornu ammonis und der Körnerzellschicht des Gyrus dendatus) - (Zellzahl außerhalb der neuronalen Schichten). Mean + S.D., n=30, * = p<0,05, ** = p < 0,005.


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Daher untersuchten wir zuerst das Einwanderungsverhalten der Mikrogliazellen in die Regionen der neuronalen Zellschädigung und konnten eine starke, ortsspezifische Einwanderung in die neuronalen Schichten des Cornu ammonis und des Gyrus dentatus nach initialer exzitotoxischer Schädigung beobachten (Abb. 9). Antisense-PARP-1-Mikrogliazellen invadierten zwar in das Hirnschnittgewebe, waren aber im Gegensatz zu den Kontroll-Vektor-transfizierten Zellen nicht in der Lage, spezifisch in die neuronalen Degenerationszonen einzuwandern und verteilten sich diffus im gesamten Hirnschnittgewebe (Abb. 9a und 9b). Um Hinweise auf die molekulare Ursache dieser deutlich gestörten Migration zu erhalten, untersuchten wir die Expression aktivierungstypischer Oberflächenmoleküle auf den Mikrogliazellen und fanden eine massiv gestörte Expression des beta2-Integrins CD11a, während die Expression anderer aktivierungsabhängig regulierter Oberflächenmoleküle wie CD11b, CD18 und ICAM-1 unverändert war (Abb. 10a).

Um nun zu untersuchen, ob diese stark verringerte CD11a-Expression in antisense-PARP-1-Mikrogliazellen auch wirklich ursächlich für das gestörte Migrationsverhalten war, klonierten wir einen antisense-CD11a-pcDNA3.1-Vektor, stellten eine stabil transfizierte Mikrogliazelllinie her und wiederholten die Migrationsexperimente: Hierbei zeigte sich, daß auch die antisense-CD11a-Mikrogliazellen im Gegensatz zu Kontroll-Vektor-transfizierten Mikrogliazellen nicht mehr in der Lage waren, spezifisch zum Ort der neuronalen Schädigung zu migrieren und verteilten sich diffus im Hirngewebe (Abb. 10b).


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Abb. 10: (aus O. Ullrich et al. Nature Cell Biol. 3, 1035-1042, 2001): PARP-1 reguliert die CD11a-Expression in aktivierten BV-2-Mikrogliazellen, die notwendig ist für die spezifische Migration zum Ort der neuronalen Schädigung. a: FACS-Analyse der Expression von Oberflächenmolekülen in Kontroll-Vektor-transfizierten (schwarze Balken) und antisense-PARP-1-Vektor-transfizierten (graue Balken) BV-2-Mikrogliazellen vor und nach Stimulation mit 10 µg/ml Lipopolysaccharid (LPS). Mean + S.D., n=5, * = p<0,005. b: Ortsspezifität der mikroglialen Migration zum Ort der neuronalen Schädigung von Kontroll-Vektor-transfizierten BV-2-Mikrogliazellen (Con.) und antisense-CD11a-Vektor transfizierten BV-2-Mikrogliazellen (asCD11a) vor und nach Induktion der neuronalen Schädigung mit 5 µM NMDA (NMDA). Ortsspezifität = (Zellzahl in der Pyramidenzellschicht des Cornu ammonis und der Körnerzellschicht des Gyrus dendatus) - (Zellzahl außerhalb der neuronalen Schichten). Mean + S.D., n=30, * = p<0,05, ** = p < 0,005.


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Abb. 11: (aus O. Ullrich et al. Nature Cell Biol. 3, 1035-1042, 2001): Transkriptionelle Regulation der CD11a-Expression in aktivierten BV-2-Mikrogliazellen durch NF-_B-Translokation, PARP-1-Aktivierung und Bildung eines PARP-1/NF-_B/HMG-I(Y)-Komplexes. a: FACS-Analyse der CD11a-Expression Kontroll-Vektor-transfizierter BV-2-Mikrogliazellen mit und ohne Stimulation mit LPS, Hemmung der PARP mit 3-Aminobenzamid (3-ABA) oder der I-_B-Phosphorylierung mit BAY 11-7085 (BAY). Mean + S.D., n=5, * = p<0,005. b: Immunoblot von Lysaten isolierter Zellkerne gegen PARP-1 und NF-_B (p65). c: Northern-Blot-Analyse der CD11a-mRNA-Expression in Kontroll-Vektor-transfizierten und mit einem antisense-PARP-1-Vektor transfizierten BV-2-Mikrogliazellen. d: Bildung eines PARP-1/NF-_B/HMG-I(Y)-Komplexes in aktivierten Mikrogliazellen, Coimmunopräzipitationsexperimente vom Kontroll-Vektor-transfizierten BV-2-Mikrogliazellen mit und ohne Stimulation mit LPS oder Hemmung der PARP mit 3-Aminobenzamid (3-ABA). e: Links: Expression des PARP-, NF-_B- und HMG-I(Y)-Proteins in Kontroll-Vektor-transfizierten und antisense-PARP-1-Vektor transfizierten BV-2-Mikrogliazellen. Rechts: Nukleäre Translokation von NF-kB (p65) in Lysaten isolierter Nuklei.


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Abb. 12: (aus O. Ullrich et al. Nature Cell Biol. 3, 1035-1042, 2001): Depletion der PARP-1 durch transiente antisense-Transfektion primärer Mikrogliazellen hemmt die Migration zum Ort der neuronalen Schädigung und schützt vor sekundärer Schädigung. a: Propidium-Iodid-Fluoreszenz-Mikroskopie der neuronalen Degenerationszonen in der CA-Region in lebenden OHSCs vor der Fixierung, Skala = 40 µm. NMDA: Induktion der neuronalen Schädigung mit 5 µM NMDA; control = ohne Mikrogliazellen, ohne NMDA; 3-ABA = 1 mM 3-Aminobenzamid; vc-MG = mit Kontroll-Vektor-transfizierte primäre Mikrogliazellen, asPARP-MG = mit antisense-PARP-1-Vektor transfizierte primäre Mikrogliazellen. b: Propidium-Iodid-positive tote Zellen in den neuronalen Schichten der Degenerationszone im Cornu ammonis und Gyrus dentatus. Zellzahlen relativ zur Zahl in ungeschädigten OHSCs ohne Zugabe von Mikrogliazellen (control=1). c: Ortsspezifität der mikroglialen Migration zum Ort der neuronalen Schädigung von Kontroll-Vektor-transfizierten primären Mikrogliazellen (vc-MG) und antisense-PARP-1-Vektor transfizierten primären Mikrogliazellen (asPARP) nach Induktion der neuronalen Schädigung mit 5 µM NMDA. Ortsspezifität = (Zellzahl in der Pyramidenzellschicht des Cornu ammonis und der Körnerzellschicht des Gyrus dendatus) - (Zellzahl außerhalb der neuronalen Schichten). Mean + S.D., n=30, * = p<0,05, ** = p < 0,005. d: Residuale PARP-1-Proteinexpression in antisense-PARP-1-Vektor transfizierten primären Mikrogliazellen.


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Es konnte also nachgewiesen werden, daß


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Thu Nov 7 16:02:32 2002