Ullrich, Oliver: Mechanismen protektiver und destruktiver Funktionen der Poly(ADP-Ribose)-Polymerase-1 (PARP-1) bei Zell- und Gewebeschädigungen
Mechanismen protektiver und destruktiver
Funktionen der Poly(ADP-Ribose)-Polymerase-1
(PARP-1)
bei Zell- und Gewebeschädigungen
HABILITATIONSSCHRIFT

ZUR ERLANGUNG DER LEHRBEFÄHIGUNG
FÜR DAS FACHANATOMIE UND ZELLBIOLOGIE

vorgelegt dem Fakultätsrat der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von

Dr.med. Dr.rer.nat. Oliver Ullrich,
geboren am 09. Juli 1970 in Berlin

Präsident:Prof. Dr. rer.nat. J. Mlynek
Dekan: Prof. Dr. med. Joachim W. Dudenhausen

Gutachter:
Gutachter: Prof. Dr. med. K. Unsicker
Prof. Dr. med. K. Zilles

eingereicht am: 25. Januar 2002
Datum der Habilitation: 01. Oktober 2002


106


Seiten: [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76] [77] [78] [79] [80] [81] [82] [83] [84] [85] [86] [87] [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94] [95] [96] [97] [98] [99] [100] [101] [102] [103] [104] [105] [106]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteMechanismen protektiver und destruktiver Funktionen der Poly(ADP-Ribose)-Polymerase-1 (PARP-1) bei Zell- und Gewebeschädigungen
1 Einleitung
1.1Die Poly(ADP-ribosyl)ierung - Biochemische und zellbiologische Grundlagen
1.1.1Historische Aspekte
1.1.2Enzyme und Gene des Poly(ADP-Ribose)-Stoffwechsels
1.2Zelluläre und molekulare Funktionen der Poly(ADP-Ribosyl)ierung
1.2.1DNA-Reparatur und genomische Stabilität
1.2.2Transkriptionskontrolle
1.2.3Alterungsprozesse
1.2.4Apoptose
1.3Die Rolle der Poly(ADP-Ribosyl)ierung bei der Tumortherapie
1.4Die Rolle der Poly(ADP-Ribosyl)ierung bei Erkrankungen des ZNS
1.4.1Ischämie-Reperfusionsschäden
1.4.2Die Rolle der Mikroglia nach primärer neuronaler Schädigung
1.4.3Die Bedeutung der PARP bei der inflammatorische Sekundärschädigung
2 Ergebnisse
2.1Regulation des nukleären Proteasoms durch die Poly(ADP-Ribose)-Polymerase
2.1.1Verstärkter proteasomaler Abbau geschädigter Proteine bei oxidativen Stress durch die Poly(ADP-Ribose-Polymerase)
2.1.2Molekulare Grundlagen der Proteasomaktivierung durch die Poly(ADP-Ribose)-Polymerase
2.1.3Endogene Inhibitoren der Poly(ADP-Ribose)-Polymerase
2.2Mechanismen der antioxidativen Protektion von Tumorzellen durch die Poly(ADP-Ribose)-Polymerase
2.2.1Differenzierungsabhängige Regulation der Poly(ADP-Ribose)-Polymerase
2.2.2Poly(ADP-Ribose)-Polymerase-vermittelte Chemotherapie-Resistenz
2.3Protektive Funktionen der Poly(ADP-Ribose)-Polymerase in aktivierten Mikrogliazellen
2.4Die Funktion der mikroglialen Poly(ADP-Ribose)-Polymerase in exzitotoxisch geschädigtem lebenden Hirngewebe
3 Diskussion und Ausblick
4 Zusammenfassung
Bibliographie Literaturverzeichnis
Danksagung
Lebenslauf
Anhang A Publikationsverzeichnis
Anhang B Stipendien und Preise
Anhang C Lehre
Anhang D Drittmittel
Anhang E Wissenschaftlicher Werdegang
Selbständigkeitserklärung

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: (aus Smith S. The world according to PARP. Trends in Biochemical Sciences 26, 174-179, 2001): (a) ADP-Ribosylierung eines Akzeptor-Proteins: Übertragung von ADP-Ribose aus NAD+ auf einen Glutamat-Rest an einem Akzeptor-Protein durch die PARP. Die an das Protein gebundene ADP-Ribose-Einheit kann nun als Akzeptor für weitere ADP-Ribose-Einheiten dienen. (b) Synthese des hochgradig negativ geladenen langen, linnearen und verzweigten ADP-Ribose-Polymers. (c) Viele kovalent gebundene hochgradig negativ geladene ADP-Ribose-Polymere lösen das so modifizierte Protein von der DNA ab.
Abb. 2: (aus O. Ullrich et al. Free Radic. Biol Med. 31, 887-8983, 2001): Abbau endogener Histone in K562-Zellen nach oxidativer Belastung. Endogene Proteine wurden mit [3H]-Lysin markiert und nach dem Auswaschen der extrazellulären Radioaktvität mit 0 mM (A), 0,4 mM (B) oder 1 mM (C) H2O2 für 30 min oxidativ belastet. Der anschließende Abbau der Histone wurde mittels AUT/PAGE-Analyse der Histonfraktionen nach Isolierung der Zellkerne bestimmt.
Abb. 3: (aus O. Ullrich et al. Free Radic. Biol Med. 31, 887-8983, 2001): Proteasomaler Abbau von Histon H1 in K562-Zellen nach oxidativer Belastung. Endogene Proteine wurden mit [3H]-Lysin markiert und nach dem Auswaschen der extrazellulären Radioaktvität mit 1 mM H2O2 für 30 min oxidativ belastet. Der anschließende Abbau der Histone wurde mittels AUT/PAGE-Analyse der Histonfraktionen nach Isolierung der Zellkerne im Zeitraum bis 30 min (A) und bis 48 h (B) bestimmt. LC = Inkubation mit 5 µM des spezifischen Proteasominhibitors Lactacystin, 3-ABA = Inkubation mit 1 mM des PARP-Inhibitors 3-Aminobenzamid
Abb. 4: (aus O. Ullrich et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 6223-6228, 1999): Aktivierung des nukleären Proteasoms und erhöhte proteolytische Abbaubarkeit von Histonen nach oxidativer Belastung. A: Proteolytischer Abbau des fluorogenen Modellpeptids sLLVY-MCA in Anwesenheit oder Abwesenheit des spezifischen Proteasom-Inhibitors Lactacystin innerhalb von 30 min nach oxidativer Belastung mit 1 mM H2O2 .B: Aktivitäts-Färbung des nativelektrophoretisch getrennten Proteasoms im Blot-Overlay-Verfahren innerhalb von 30 min nach oxidativer Belastung mit 1 mM H2O2 .C: Proteolytische Abbaubarkeit von H2O2 - modifizierten Histonen durch das isolierte 20S Proteasom.
Abb. 5: (aus O. Ullrich et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 6223-6228, 1999): Poly(ADP-Ribosyl)ierung des Proteasoms in Zellkernen von K562-Zellen nach oxidativer Belastung mit 1 mM H2O2 . A: Korrelation der proteasomalen Peptidase-Aktivität nach nativelektrophoretischer Analyse mit der Inkorporation von [14C] in das Protein aus [14C]-NAD+, einem Maß für das Ausmaß der Poly(ADP-Ribosyl)ierungs-Reaktion. B: Nachweis erhöhter Proteasomaktivität in der Aktivitätsfärbung nach nativelektrophoretischer Analyse in Korrelation mit dem Nachweis von Poly(ADP-Ribose) im Immunoblot (C). D: Einfluß der Hemmung der PARP mittels 1 mM 3-Aminobenzamid (3-ABA) auf die proteasomale Proteolyse des fluorogenen Modellpeptids sLLVY-MCA und die Inkorporation von [14C] in das Protein aus [14C]-NAD+ als Maß für das Ausmaß der Poly(ADP-Ribosyl)ierung.
Abb. 6: (aus Ö.Ciftci and O.Ullrich et al. Regulation of the nuclear proteasome activity in myelomonocytic human leukemia cells after adriamycin treatment. Blood 97, 2830-2828, 2001): PARP-regulierte Proteasomaktivierung in humanen U937-Leukämiezellen nach Adriamycin-Behandlung. Proliferierende humane U937-Leukämiezellen wurden für 15 min mit 10-7 M Adriamycin in An- oder Abwesenheit des PARP-Inhibitors 3-Aminobenzamid (3-ABA) behandelt und die immunpräzipitierte PARP-1 im Immunoblot mit PARP-1 und Proteasom-Antikörpern analysiert (A) sowie die Aktivität des copräzipitierten Proteasoms durch Inkubation mit dem fluorogenen Modellpeptid sLLVY-MCA bestimmt (B).
Abb. 7: (aus O. Ullrich at al. FASEB J. 15, 1460-1462, 2001): Spezifische Beteiligung der PARP-1 an der TNF-alpha-induzierten Erhöhung des Proteinturnovers und der nukleären Proteasomaktivität. A: Proteinabbau in Lysaten isolierter Zellkerne aus stabil mit einem antisense-PARP-1-Vektor transfizierten (asPARP cells) oder mit einem Kontroll-Vektor (control cells) transfizierten BV-2-Mikrogliazellen mit und ohne Stimulation mit TNF-alpha. B: Lactacystin-sensitive Proteasomaktivität in isolierten Zellkernen. C: PARP-1-Protein-Expression in stabil mit einem antisense-PARP-1-Vektor transfizierten (asPARP cells) oder mit einem Kontroll-Vektor (control cells) transfizierten BV-2-Mikrogliazellen. * = p<0,05, ** = p<0,005, *** = p<0,0005
Abb. 8: (aus O. Ullrich et al. Nature Cell Biol. 3, 1035-1042, 2001): Ausschaltung der PARP-1 in BV-2-Mikrogliazellen schützt vor sekundärem neuronalem Schaden in lebenden organotypischen hippocampalen Schnittkulturen (OHSCs). a: Propidium-Iodid-positive tote Zellen in den neuronalen Schichten der Degenerationszone im Cornu ammonis und Gyrus dentatus. Zellzahlen relativ zur Zahl in ungeschädigten OHSCs ohne Zugabe von Mikrogliazellen (control=1), nicht-vitale Mikrogliazellen wurden subtrahiert. NMDA: Induktion der neuronalen Schädigung mit 5 µM NMDA; control = ohne Mikrogliazellen; 3-ABA = ohne Mikrogliazellen, 1 mM 3-Aminobenzamid; BV-2 = mit Kontroll-Vektor-transfizierten BV-2-Mikrogliazellen, asPARP = mit antisense-PARP-1-Vektor transfizierten BV-2-Mikrogliazellen. Mean + S.D., n=30, * = p<0,05, ** = p<0,005. b: Propidium-Iodid-Fluoreszenz-Mikroskopie der neuronalen Degenerationszonen in der CA-Region in lebenden OHSCs vor der Fixierung, Skala = 40 µm. c: Vitalität der invadierten BV-2-Mikrogliazellen. Mean + S.D., n=30, n.s. = nicht signifikant. d: Keine Kolokalisation der Propidium-Iodid-positiven toten Zellen (Rotfluoreszenz) mit Mini-Emerald-vormarkierten BV-2-Mikrogliazellen (Grünfluoreszenz). Skala = 20 µm
Abb. 9: (aus O. Ullrich et al. Nature Cell Biol. 3, 1035-1042, 2001): Kontrolle der mikroglialen Migration in die neuronalen Degenerationszonen durch die PARP-1. a: Durchlicht- und Rhodamin-Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der lebenden hippocampalen Hirnschnittkulturen (OHSCs). Vector control=Kontroll-Vektor-transfizierte BV-2-Mikrogliazellen, asPARP = mit antisense-PARP-1-Vektor transfizierte BV-2-Mikrogliazellen, NMDA=Induktion der neuronalen Schädigung mit 5 µM NMDA, LV=linker Ventrikel, H=Hilus, MEC=medialer entorhinaler Kortex, FH=Fissura hippocampi. Skala = 40 µm. b: Ortsspezifität der mikroglialen Migration zum Ort der neuronalen Schädigung von Kontroll-Vektor-transfizierten BV-2-Mikrogliazellen (Con.) und antisense-PARP-1-Vektor transfizierten BV-2-Mikrogliazellen (asPARP) vor und nach Induktion der neuronalen Schädigung mit 5 µM NMDA (NMDA). Ortsspezifität = (Zellzahl in der Pyramidenzellschicht des Cornu ammonis und der Körnerzellschicht des Gyrus dendatus) - (Zellzahl außerhalb der neuronalen Schichten). Mean + S.D., n=30, * = p<0,05, ** = p < 0,005.
Abb. 10: (aus O. Ullrich et al. Nature Cell Biol. 3, 1035-1042, 2001): PARP-1 reguliert die CD11a-Expression in aktivierten BV-2-Mikrogliazellen, die notwendig ist für die spezifische Migration zum Ort der neuronalen Schädigung. a: FACS-Analyse der Expression von Oberflächenmolekülen in Kontroll-Vektor-transfizierten (schwarze Balken) und antisense-PARP-1-Vektor-transfizierten (graue Balken) BV-2-Mikrogliazellen vor und nach Stimulation mit 10 µg/ml Lipopolysaccharid (LPS). Mean + S.D., n=5, * = p<0,005. b: Ortsspezifität der mikroglialen Migration zum Ort der neuronalen Schädigung von Kontroll-Vektor-transfizierten BV-2-Mikrogliazellen (Con.) und antisense-CD11a-Vektor transfizierten BV-2-Mikrogliazellen (asCD11a) vor und nach Induktion der neuronalen Schädigung mit 5 µM NMDA (NMDA). Ortsspezifität = (Zellzahl in der Pyramidenzellschicht des Cornu ammonis und der Körnerzellschicht des Gyrus dendatus) - (Zellzahl außerhalb der neuronalen Schichten). Mean + S.D., n=30, * = p<0,05, ** = p < 0,005.
Abb. 11: (aus O. Ullrich et al. Nature Cell Biol. 3, 1035-1042, 2001): Transkriptionelle Regulation der CD11a-Expression in aktivierten BV-2-Mikrogliazellen durch NF-_B-Translokation, PARP-1-Aktivierung und Bildung eines PARP-1/NF-_B/HMG-I(Y)-Komplexes. a: FACS-Analyse der CD11a-Expression Kontroll-Vektor-transfizierter BV-2-Mikrogliazellen mit und ohne Stimulation mit LPS, Hemmung der PARP mit 3-Aminobenzamid (3-ABA) oder der I-_B-Phosphorylierung mit BAY 11-7085 (BAY). Mean + S.D., n=5, * = p<0,005. b: Immunoblot von Lysaten isolierter Zellkerne gegen PARP-1 und NF-_B (p65). c: Northern-Blot-Analyse der CD11a-mRNA-Expression in Kontroll-Vektor-transfizierten und mit einem antisense-PARP-1-Vektor transfizierten BV-2-Mikrogliazellen. d: Bildung eines PARP-1/NF-_B/HMG-I(Y)-Komplexes in aktivierten Mikrogliazellen, Coimmunopräzipitationsexperimente vom Kontroll-Vektor-transfizierten BV-2-Mikrogliazellen mit und ohne Stimulation mit LPS oder Hemmung der PARP mit 3-Aminobenzamid (3-ABA). e: Links: Expression des PARP-, NF-_B- und HMG-I(Y)-Proteins in Kontroll-Vektor-transfizierten und antisense-PARP-1-Vektor transfizierten BV-2-Mikrogliazellen. Rechts: Nukleäre Translokation von NF-kB (p65) in Lysaten isolierter Nuklei.
Abb. 12: (aus O. Ullrich et al. Nature Cell Biol. 3, 1035-1042, 2001): Depletion der PARP-1 durch transiente antisense-Transfektion primärer Mikrogliazellen hemmt die Migration zum Ort der neuronalen Schädigung und schützt vor sekundärer Schädigung. a: Propidium-Iodid-Fluoreszenz-Mikroskopie der neuronalen Degenerationszonen in der CA-Region in lebenden OHSCs vor der Fixierung, Skala = 40 µm. NMDA: Induktion der neuronalen Schädigung mit 5 µM NMDA; control = ohne Mikrogliazellen, ohne NMDA; 3-ABA = 1 mM 3-Aminobenzamid; vc-MG = mit Kontroll-Vektor-transfizierte primäre Mikrogliazellen, asPARP-MG = mit antisense-PARP-1-Vektor transfizierte primäre Mikrogliazellen. b: Propidium-Iodid-positive tote Zellen in den neuronalen Schichten der Degenerationszone im Cornu ammonis und Gyrus dentatus. Zellzahlen relativ zur Zahl in ungeschädigten OHSCs ohne Zugabe von Mikrogliazellen (control=1). c: Ortsspezifität der mikroglialen Migration zum Ort der neuronalen Schädigung von Kontroll-Vektor-transfizierten primären Mikrogliazellen (vc-MG) und antisense-PARP-1-Vektor transfizierten primären Mikrogliazellen (asPARP) nach Induktion der neuronalen Schädigung mit 5 µM NMDA. Ortsspezifität = (Zellzahl in der Pyramidenzellschicht des Cornu ammonis und der Körnerzellschicht des Gyrus dendatus) - (Zellzahl außerhalb der neuronalen Schichten). Mean + S.D., n=30, * = p<0,05, ** = p < 0,005. d: Residuale PARP-1-Proteinexpression in antisense-PARP-1-Vektor transfizierten primären Mikrogliazellen.

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Thu Nov 7 16:02:32 2002