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III.  Material und Methoden

Endothelzellen

ECV 304 wurde von der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC, CERDIC, Sophia Antipolis, Frankreich) erworben [498]. EA.hy926 erhielten wir von Dr. H.-D. Orzechowski, Berlin, mit Genehmigung von Prof. Dr. C.-J. S. Edgell, Chapel Hill, North Carolina, USA [123]. LEC erhielten wir von PD Dr. U.Rauen und Prof. Dr. Dr. H. de Groot, Essen [395]. Humane endotheliale Primärzellen aus einer peripheren Vene erhielten wir dankenswerterweise von PD Dr. H. Laube, Berlin.

Die Zelllinien wurden bei 37°C (21% O2 / 5% CO2) in RPMI-Medium (Sigma, Deisenhofen, Deutschland), supplementiert mit fötalem Kälberserum (10%, Sigma), Glutamin (2 mM, Gibco, Eggenstein, Germany), Penicillin (100 U/ml, Sigma) und Streptomycin (100 µg/ml) in beschichteten (Fibronectin, Sigma) Kulturflaschen (Falcon, Heidelberg, Germany) subkultiviert.

Chemikalien

3-morpholinosydnonimine-N-ethylcarbamid (SIN-1, Calbiochem-Novabiochem, Bad Soden/Ts., Deutschland), 4-hydroxy-Tempo (Tempol, Sigma), Adenosintriphosphat (ATP, Boehringer, Mannheim, Deutschland), bis-(2-amino-5-methylphenoxy)ethan-N,N,N',N'-tetraacetosäure-tetraacetoxymethylester (MAPT/ AM; Calbiochem-Novabio-chem), bis-(o-aminophenoxy)-N,N,N,N'-tetraacetosäure-acetoxymethylester (BAPT/-AM; Calbiochem-Novabiochem), Br A23187 (Calbiochem-Novabiochem), Dichloro-dihydrofluorescein (H2DCF, Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA), Dichlorodi-hydrofluorescein diacetat (H2DCFDA, Molecular Probes), Dihydrorhodamin 1,2,3 (DHR123, Molecular Probes), Diltiazem (Calbiochem-Novabiochem), Dimethyl-formamid (Sigma), Diphenyliodonium (DPI, Sigma), Ethylenglycol-bis(β-amino-ethylether)-N,N,N´,N´-tetraacetsäure (EGTA, Merck, Darmstadt, Deutschland), FURA2-AM (Molecular Probes, Calbiochem-Novabiochem), Glukoseoxidase (GO, Grad II, Boehringer), H2O2 (Merck, Deutschland), Histamin (Sigma), IFN-γ (Boehringer, Mannheim), IL-1β (Boehringer, Mannheim), IL-4 (Boehringer, Mannheim), Katalase (CAT; aus Rinderleber; 65.000 U/mg, Boehringer), KT5823 (Calbiochem-Novabiochem), LPS (E. coli 0127:B8, [Seite 21↓]Sigma), LY 83583 (Calbiochem-Novabiochem), Natrium-Nitroprussid (NP, Fluka, Sigma), N-Methyl-L-Arginin (NMMA, Sigma), Pertussistoxin (Sigma), o-Phenanthrolin (Sigma), Propidiumjodid (Sigma, Calbiochem-Novabiochem), Ryanodin (Calbiochem-Novabiochem), SKF 96365 (Calbiochem-Novabiochem), S-Nitroso-N-acetyl-penicillamin (SNAP, Calbiochem), Superoxid-dismutase (SOD; 5000 U/mg, Boehringer), Thapsigargin (Calbiochem-Novabiochem), Tiron (4,5-Dihydroxy-1,3-benzene-disulfonic acid, Sigma), TNF-α (Boehringer, Mannheim), TMB-8 (Calbiochem-Novabiochem), U73122 (Calbiochem-Novabiochem), Xanthinoxidase (XO, Boehringer, Mannheim, Germany).

Messung der Vitalität

Die Vitalität der Zellen wurde anhand verschiedener Parameter überprüft. Die Exklusion des Farbstoffs Trypanblau [498], die Freisetzung der zytoplasmatischen Laktatdehydrogenaseaktivität (LDH, kit tox-7, Sigma) [495], die mitochondriale Tetrazoliumreduktionskapazität (EZ4U®, Biozol, Eching, Deutschland) [497] und die Anfärbbarkeit des nicht permeablen DNS-bindenden Fluoreszenzfarbstoffs Propidiumjodid [495] wurden hierfür benutzt.

Messung der intrazellulären Ca2+-Konzentration

Intrazelluläre Ca+2-Konzentrationen wurden über eine Fluoreszenzmessung von FURA2 durchgeführt. Die Beladung der Zellen erfolgte über 30 Minuten bei 37°C mit 1 µM FURA2-AM. Die Einzelzellemissionsmessungen erfolgten entweder an einem Inversionsmikroskop (Leica, Bensheim, Deutschland) mit einer wechselfiltergesteuerten Fluoreszenzquelle (30 Hertz) und einer Quantifizierung über einen Photomultiplier [345], oder an einem Inversionsmikroskop (DMIRB, Leica) mit über einen Monochromator erzeugten Fluoreszenz, wobei die Emission über eine CCD-Kamera digital mit 2 Hertz registriert wurde (T.I.L.L. Photonics, Planegg, Deutschland) [495].

Reaktive Sauerstoffderivate

Die Exposition mit reaktiven Sauerstoffderivaten erfolgte mit enzymatischen und nicht-enzymatischen Systemen. Zur Produktion von Superoxid wurde das Hypoxanthin-Xanthinoxidasesystem benutzt [498, 495]. Zur Produktion [Seite 22↓]von H2O2 wurde Glukoseoxidase in Anwesenheit von Glukose [498] oder Wasserstoffperoxidlösung benutzt. Zur Messung der Produktion reaktiver Sauerstoffderivate auf Einzelzellniveau wurde eine mikrofluorimetrische Methode unter Verwendung von Dichlorodihydrofluorescein-Diacetat benutzt [198, 408, 494, 497]. Die Quantifizierung der Fluoreszenz erfolgte über ein digitales Bildanalysesytem einer CCD-Kamera (T.I.L.L. Photonics).

Reaktive Stickstoffderivate

Die Exposition der Zellen mit reaktiven Stickstoffderivaten erfolgte über chemische NO . -Donatoren SNAP, SIN-1, NP, GSNO und SNOG. Die Quantifizierung einer NO . Produktion erfolgte über die Messung von NO2 - anhand der Griess-Reaktion und über eine Mikrofluoreszenztechnik [255, 337].

Messung von MCP-1, IL-6 und IL-8

Kommerziell erhältliche Enzymimmunoassays wurden benutzt um MCP-1 (Quantikine® human MCP-1, R&D systems, DPC Biermann GmbH, Bad Nauheim, Germany), IL-6 (Milenia® IL-6, DPC Biermann GmbH), IL-8 (Milenia® IL-8, DPC Biermann GmbH) im Überstand nach den Angaben des Herstellers zu messen.

Statistische Angaben

Um gemessene Werte verschiedener Gruppen miteinander zu vergleichen wurden deskriptive Parameter (Mittelwert, Standardabweichung und Standardfehler) berechnet. Unterschiede wurden nach Tests zur Normalverteilung einer Varianzanalyse unterzogen. Der Student-Newman-Keuls Test wurde benutzt um individuelle Ergebnisse mit der jeweiligen Kontrolle zu vergleichen. P-Werte < 0,05 wurden als signifikant betrachtet.


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12.08.2004