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IV.  Ergebnisse

IV.1. Onkose durch exogene reaktive Sauerstoff- und Stickstoffspezies in Endothelzellen

IV.1.1. Reaktive Sauerstoffderivate

Prinzipiell galten Radikale als zu reaktiv und unselektiv um eine zielgerichtete Interaktion mit zellulären Strukturen oder Molekülen eingehen zu können. Daher standen zunächst schädigende Wirkungen reaktiver Sauerstoffspezies und Stickstoffspezies im Mittelpunkt zahlreicher Untersuchungen. Zellen scheinen allerdings grundsätzlich auf unterscheidbare Weise sterben zu können. Onkose bezeichnet die Todesform, bei der Zellen so geschädigt werden, daß sie ihre Membranintegrität verlieren und intrazelluläre Bestandteile austreten. Zu den entscheidenden Zielstrukturen reaktiver Sauerstoffderivate für toxische Prozesse zählen DNS, RNS, Proteine und vor allem Lipide. Wenn die Lipidmembran von Endothelzellen geschädigt wird steigt deren Permeabilität. Klassische Untersuchungen nutzen einen solchen Membranpermeabili-tätsanstieg zur Quantifizierung endothelialer Schädigungen (z.B. über einen Verlust von mit 51Cr beladenen Zellen, dem Verlust intrazellulärer Laktatdehydrogenaseaktivität oder der zytoplasmatischen Anfärbbarkeit mit nicht permeablen Farbstoffen). Ungesättigte Fettsäuren der Zytoplasmamembran reagieren mit reaktiven Sauerstoffderivaten und führen über komplexe Degradationen zu einer Fülle von Lipidperoxidationsprodukten, die wiederum biologisch aktiv sind. Zu den besser charakterisierten Produkten, die Endothelzellen somit auch sekundär schädigen können zählen u.a. 4-OH-Nonenal [200], Malondialdehyd [134], oder Isoprostan [281]. Bei der Exposition von unterschiedlichen Endothelzelltypen mit O2 - . generierenden, oder H2O2 generierenden Systemen scheinen toxische Wirkungen primär über einen Eisen- und H2O2-abhängigen Schritt zustande zu kommen [202, 461, 488]. Die meisten der endothelialen Untersuchungen benutzen als Hinweis auf einen solchen Mechanismus die protektive Wirkung von permeablen Metallchelatoren, oder Substanzen, von denen eine gewisse präferentielle Fängerfunktion gegenüber dem OH . -Radikal ausgehen.


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Abb. 1: Morphologische Veränderungen in Endothelzellen nach Exposition mit einem Superoxid-produzierenden Enzymsystem.

Links: nicht behandelte Kontrollkultur. Rechts: Mikrovaskuläre Endothelzellen wurden über 6 h mit Xanthinoxidase (10 mU/ml) in Anwesenheit von Hypoxanthin (1mM) inkubiert. Die Schwärzung zeigt Zellen, die mit Trypanblau anfärbbar sind und damit den Verlust der Membranintegrität.

Die Exposition von Endothelzellen mit reaktiven Sauerstoffderivaten führt in zahlreichen Untersuchungen zu Phosphorylierungen des Leichtketten-Myosins und damit zu einer Aktin-Reorganisation im Zytoskelett. Morphologisch hat dies unterschiedliche Veränderungen zur Folge. Interzelluläre Verbindungen werden gelöst und eine aktive Kontraktion erzeugt Lücken, die relevant für eine erhöhte endotheliale Permeabilität sein können [299, 462] (Abb. 1).

An der Zytoplasmamembran können Bläschen auftreten. Dieses sogenannte „membrane blebbing“ scheint morphologisch ähnlich den Abschnürungen von Endothelzellmembranteilen zu sein, die aufgrund apoptotischer Prozesse induzierbar sind (siehe Teil IV). Allerdings fehlen in den durch Zugabe von exogenen Peroxiden induzierten Membranblasen die typischen Veränderungen apoptotischer Zellen [487] (Abb. 2). Die zytoplasmatische Ca2+-Konzentration ([Ca2+]i) in Endothelzellen liegt im Bereich von etwa 100 nM, d.h. es besteht ein sehr hoher Gradient zur normalen extrazellulären Ca2+-Konzentration ([Ca2+]e). Hohe Konzentrationen von reaktiven Sauerstoffderivaten schädigen die DNS über Strangbrüche und Quervernetzungen und induzieren gleichzeitig Reparaturprozesse unter sehr hohem ATP-Verbrauch.


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Mit dem Verlust von ATP [442] und auch der Inaktivierung ATP-produzierender Systeme [221] brechen letztlich alle ATP-getriebenen Ionengradienten zusammen. Konsequenterweise können dann erhöhte [Ca2+]i -Werte gemessen werden [127, 112] (Abb. 3).

Abb.2: Intrazelluläre Änderung der Kalziumkonzentration und “membrane blebbing” in Endothelzellen nach Zugabe von O2 - . .

Mikrovaskuläre Endothelzellen der Rattenleber wurden auf Glasplättchen kultiviert und mit FURA-2, einem Ca2+-abhängigen Fluoreszenz-farbstoff beladen. Anschließend wurden die Zellen in eine spezielle Meßkammer überführt und die Fluoreszenz mit einer digitalen Kamera aufgenommen. In (A) sind in einer Falschfarbendarstellung die Ruhebedingungen wiedergegeben. 15 Minuten (B) nach Exposition mit 10 mU/ml XO (+1 mM HX) werden leichte Anstiege der zytoplasmatishen Ca2+-Konzen-tration erkennbar und nach 25 (C), 35 (D) und 45 Minuten (E) erkennt man kleine Blasenbildungen an der Zytoplasmamembran als Hinweis einer Schädigung (blebs, Pfeile). In diesen Blasen werden die höchsten Ca2+-Werte gemessen. In (F) wurde den Zellen ein DNA-Farbstoff zugegeben, der normalerweise nicht permeabel ist (Propidiumjodid) und zeigt, daß die Zytoplasmamembran zerstört ist.


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Abb. 3: Intrazelluläre Ca2+-Konzentration in Endothelzellen unter dem Einfluß toxisch wirkender reaktiver Sauerstoffderivate.

Dargestellt sind Messungen der FURA-2 Fluoreszenz über Einzelzellen nach der Inkubation mit XO (10mU/ml) in Anwesenheit von Hypoanthin (1mM). In sterbenden Zellen steigt die zytoplasmatische Ca2+-Konzentration langsam an. Der spätere Abfall der [Ca2+]i ist auf einen Verlust des zytoplasmatischen Farbstoffs zurückzuführen und geht mit der Lyse der Zellmembran einher.

Die schädigenden Wirkungen hoch dosierter reaktiver Sauerstoffderivate wurden häufig primär in mitochondrialen Strukturen gefunden [347, 22] obwohl dort besondere Schutzsysteme vorhanden sind [13]. In neuesten Untersuchungen an Rattenleberendothelien konnte in Mitochondrien eine auffallend hohe “freie” Eisenkonzentration visualisiert werden [371] (Rauen und deGroot, Essen, pers. Kommunikation). Gerade die mitochondriale Lipidmembran scheint für toxische Wirkungen also ein relevantes Ziel darzustellen. Passend hierzu finden sich auch früh in endothelialen Mitochondrien deutliche Strukturveränderungen nach Exposition mit reaktivem Sauerstoff (Abb. 4). Eine mitochondriale genomische Schädigung in HUVEC nach wenigen Minuten kann so deutlich werden [29].


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Abb. 4: Mitochondriale Schädigung nach Exposition mit toxischen Konzentrationen reaktiver Sauerstoffderivate.

Links wurden ECV 306 Zellen mit dem lipophilen kationischen Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin 1,2,3 (30 min, 0,5 µg/ml) inkubiert. Im rechten Bild erkennt man deutlich typische mitochondriale Strukturveränderungen nach Exposition von 1 mM H2O2 über 20 Minuten.

Onkotische Prozesse gehen im Gegensatz zur Apoptose eher mit einer Volumenzunahme einher. Werden Endothelzellen mit hohen Konzentrationen reaktiver Sauerstoffderivate inkubiert, so nimmt deren Volumen, gemessen am intrazellulären Wassergehalt, katalasesensitiv innerhalb einer Stunde zu [199] (Abb.5). Diese Veränderungen sprechen damit auch gegen einen apoptotischen Prozess.

Abb. 5:Volumenänderungen in Endothelzellen nach Inkubation mit O2 - . .

Monolayer wurden über die angegebene Zeit mit Xanthinoxida-se (XO, 5 mU/ml) in Anwesenheit von 1mM Hypoxanthin inkubiert (Ÿ). Bereits nach 1 h steigt der Wassergehalt der Zellen an. Bei nicht behandelten Kontroll-kulturen (¨) oder bei Koinkubation mit Katalase (50 U/ml, ¡) treten diese Volumenzunahmen nicht auf.


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IV.1.2.  Reaktive Stickstoffderivate und Kombinationen

Zu den zellulären Zielstrukturen für toxische Reaktionen von primär gebildetem NO . zählt die Inhibition der Cytochrom C Oxidase über die Bindung an Eisen II der Hämgruppe [85], die Inhibition der Katalase [137] und direkte Schäden an der DNS [519]. Bei Experimenten mit chemischen NO . -Donatoren wie z.B. Nitroprussid (NP), S-Nitroso-N-acetyl-penicillamin (SNAP), 3-morpholino-sydnonimine-N-ethylcarbamid (SIN-1) und anderen Substanzen sind toxische Wirkungen auch von den Umgebungsbedingungen abhängig. Zu diesen Umgebungsbedingungen zählt z.B. der Sauerstoffpartialdruck. Werden Endothelzellen unter hypoxischen Bedingungen NO . -Donatoren ausgesetzt, so kann eine erhöhte Toxizität von Nitroprussid und SNAP, nicht aber von SIN-1 festgestellt werden (Abb. 6) [229].

Abb. 6:Einfluß einer Hypoxie auf toxische Wirkungen von NO . - Donatoren.

Nitroprussid (NP), SNAP und SIN-1 wur-den über 6 h mit Endo-thelzellen inkubiert (weisse Balken). Toxizi-tät wurde über die Frei-setzung von LDH-Akti-vität quantifiziert, wobei 100% der Aktivität ly-sierter Zellen entspricht. Hypoxische Bedingun-gen (graue Balken) wur-den über einen Aus-tausch von begastem Puffer (CO2:N2, 1:19) und nachfolgender Be-gasung alle 2 h erreicht. (* P<0,01 vs. normoxi-sche Kontrolle).

Die Arbeitsgruppe von de Groot konnte über Elektronenspinresonanz-Messungen von cheletropischen NO . -Fängern weiterhin zeigen, daß unter hypoxischen Bedingungen sowohl aus NP, als auch aus SNAP mehr NO . freigesetzt wird [227]. Von SIN-1 war bereits bekannt, daß für die Freisetzung von NO . [Seite 29↓]molekularer Sauerstoff notwendig ist [140]. Hält man allerdings die Syntheseraten von NO . gleich, sinkt die Toxizität unter hypoxischen Bedingungen, sodaß in Anwesenheit von O2 die Reaktion von O2 mit NO . über die Bildung von NO2 . bedeutsam werden kann.

Bei der sogenannten chemischen Hypoxie wird die mitochondriale Atmungskette blockiert. Zu den hierfür oft benutzten Substanzen zählt CN-, das Cytochromoxidasen in der dreiwertigen Stufe inhibiert, Antimycin A, das den Elektronentransport im Ubichinon-Cytochrom bc1 des Komplex III inhibiert und Rotenon, das den Elektronentransfer vom Eisen-Schwefel Zentrum des NADH-Dehydrogenasekomplexes zu Ubichinon im Komplex I blockiert. Unter diesen Bedingungen wird die endotheliale Toxizität von SNAP und auch NP deutlich verstärkt (Abb. 7).

Abb. 7:Toxizität von NO . -Donatoren unter Hemmung der mitochondrialen Atmungskette.

Oben:Endothelzellen wurden über 6 h mit NP, oder zusätzlich KCN, Antimycin A oder Rotenon in der angegebenen Konzentration inkubiert.
Unten: Endothelzellen wur-den über 6 h mit SNAP, oder zusätzlich KCN, Antimycin A oder Rotenon in der angegebenen Konzentration inkubiert. Angegeben sind LDH-Aktivitäten (% ± SEM) als Maß für die Toxizität nach jeweils 5 unabhängigen Versuchen . (* P<0,01 ANOVA vs. Donator alleine).


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Exogenes und auch endogen produziertes NO . hemmt in sehr geringen Konzentrationen die mitochondriale Cytochrom C Oxidase [86, 282], wobei dies allein zu toxischen Prozessen beitragen könnte. Die Hemmung der ATP-Produktion nach Blockade der Atmungskette hemmt natürlich endogene energieabhängige Reparaturprozesse, darüber hinaus wird auch mehr Superoxid produziert, da der Elektronentransport nur inkomplett abläuft [223]. Geht man von einer vermehrten O2 - . –Produktion aus, so führt die Zugabe von NO . wahrscheinlich sehr schnell zu OONO-. Da die Reaktionskonstante der OONO--Bildung aus O2 - . und NO . etwa dreimal so schnell verläuft, wie die Reaktion von O2 - . mit SOD [220] betrachten einige Toxikologen die chemischen Wirkungen von OONO- bedeutsamer als eine metallkatalysierte HO . -Radikalbildung [262].

Konsequenterweise zeigen die NO . -Donatoren SNAP und NP mit einem Superoxid produzierenden System (XO/HX) additive Toxizität (Abb. 8). Inkubiert man nun aber zusätzlich mit SOD im Überschuß unter der Vorstellung das vorhandene O2 - . in H2O2 zu dismutieren, so wird diese additive Toxizität nur unwesentlich reduziert. Der Zusatz von Katalase hingegen führt zu einem deutlichen protektiven Effekt (Abb. 9). Mit der Reduktion des gebildeten H2O2, nicht aber von O2 - . scheint also ein Schutzeffekt verbunden zu sein.

Abb. 8:Synergistische Wirkung der Toxizität von NO . und reaktivem Sauer-stoff.

Endothelzellen wurden mit NP, SNAP, XO in Anwesenheit von Hypo-xanthin (1mM), oder kombiniert über 6 h in-kubiert. Die kombinierte Gabe der NO . -Donato-ren und des O2 - . -produ-zierenden Systems ist deutlich verstärkt. Frei-setzung von LDH-Akti-vität aus 4 unabhän-gigen Versuchen be-stimmt und angegeben sind Mittelwert ± SEM. (* P<0,01 ANOVA)


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Abb. 9:H2O2 verstärkt die toxi-schen Wirkungen von NO . -Donatoren.

Endothelzellen, die mit NO . und O2 - . -produ-zierenden Systemen über 6 h inkubiert werden, werden in Anwesenheit von SOD im Gegensatz zur Katalase nicht ge-schützt. Toxizität wurde über die Freisetzung von LDH-Aktivität aus mindestens 4 unabhän-gigen Versuchen be-stimmt und angegeben sind Mittelwert ± SEM. (* P<0,01 ANOVA)

SIN-1 produziert in Anwesenheit von Sauerstoff nicht nur NO . , sondern auch O2 - . und wird daher als ONOO-/ONOOH Donator benutzt. Toxische Wirkungen, die SIN-1 in Endothelzellen ab etwa 500µM produziert, werden kaum durch SOD, deutlich allerdings durch Katalase inhibiert (Abb. 10).

Abb. 10:Reduktion der ONOO-/ONOOH induzierten Toxi-zität durch Katalase.

Endothelzellen wurden über 6 h mit SIN-1, oder zusätzlich mit SOD, oder Katalase inkubiert. Toxizi-tät wurde über die Freiset-zung von LDH-Aktivität aus 3 unabhängigen Versu-chen bestimmt und angege-ben sind Mittelwert ± SEM. (*P<0,01; ANOVA).


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Diese Ergebnisse deuten auf eine Toxizität gegenüber Endothelzellen, die aus einer Kombination zwischen H2O2 und NO . entsteht und weniger aus einem primär Peroxynitrit bedingten Prozess [498]. Kürzlich konnte die Arbeitsgruppe von de Groot ebenfalls zeigen, daß Peroxynitrit mit NADH reagiert und H2O2 bildet [250]. NO . kann mit H2O2 dem OH . ähnliche Moleküle bilden unabhängig von der Anwesenheit von Eisen und auch unabhängig von O2 - . [338]. Synergistische Toxizität zwischen Peroxiden und NO . kann in RBEC [169], in HMLEC [339] und in BAEC [428] gefunden werden. Andererseits können NO . Donatoren eine H2O2 induzierte Toxizität in RAEC [102], RLMEC [75] und in PPAEC [189] mindern. Die Ursache dieser unterschiedlichen Ergebnisse könnte auf unterscheidbare konzentrationsabhängige Reaktionspräferenzen hinweisen. Dies würde bedeuten, daß NO . in hohen Konzentrationen eher mit anderen reaktiven Sauerstoffderivaten mit O2 über NO2 . [227], mit H2O2 über HO . [338] oder mit O2 - . zu OONO- [39] zu toxischen Reaktionen führt, wohingegen NO . in niedrigen Konzentrationsbereichen über die Reaktion mit Lipidperoxiden (LOO . ) oder die Bindung an Eisen zu Nitrosyl-Komplexen, oder eine verminderte Eisenfreisetzung [410] schützend wirkt (Abb. 11). Kürzlich publizierte Untersuchungen an einer Rattenhepatomzellinie würden diese Hypothese stützen [237].

Abb. 11:Interaktionen reaktiver Sauerstoff- und Stickstoff-derivate für endotheliale Toxizität.

Angegeben sind Hauptreak-tionen für bekannte zyto-toxische (rechts) und zyto-protektive (links) Wirkun-gen von Stickstoffmonoxid gegenüber Endothelien im Zusammenspiel mit reak-tiven Sauerstoffderivaten.
SOD = Superoxiddismu-tase; MPx = Myeloperoxi-dase; Kat = Katalase; GPx = Glutathionperoxidase


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Die Beurteilung endothelialer Schäden durch reaktive Sauerstoff- und Stickstoffderivate wird in Anwesenheit von neutrophilen Granulozyten, die potente Superoxidproduzenten sein können, noch komplexer. Aktivierte Neutrophile sezernieren Myeloperoxidase, die in der Lage ist NO2 - in NO2 . zu überführen. Gleichfalls sezernierte Bleiche, das HOCl, könnte ebenfalls effektiv HO . -Moleküle in Anwesenheit von O2 - . bilden [125, 69]. Darüber hinaus zeigen neutrophile Granulozyten erhöhte Produktionskapazitäten für O2 - . und H2O2, wenn sie mit NO . Donatoren präinkubiert werden [10]. Die Summe aller möglichen Interaktionen ist also nur schwer vorhersagbar [368].

Bisher auch nur in Ansätzen geklärt sind die komplexen Möglichkeiten bei der endogenen Produktion reaktiver Sauerstoff- und Stickstoffderivate, die in ihrer jeweiligen subzellulären Mikroumgebung deutliche Konzentrationsunterschiede aufweisen können. Eine endogene Produktion von NO . inhibiert bereits physiologischerweise den Komplex IV der mitochondrialen Atmungskette. Ein zusätzliche Hemmung kann somit den normalen Elektronentransport abbrechen und eine Überproduktion von O2 - . ähnlich wie Rotenon induzieren. Die Summe einer solchen Wirkung ist wahrscheinlich eine OONO- bestimmte Reaktion und kann zu Toxizität führen [41].

Genauso unklar sind die Reaktionen auf einen subtoxischen Reiz mit der Produktion von Schutzsystemen. Subletale Schäden an der DNS können energieverbrauchende Reparaturenzyme aktivieren (z.B. Poly-ADP-Ribose-Polymerase) und das Tumorsuppressorgen p53 einschalten. p53 blockiert den Zellzyklus wahrscheinlich um Zeit für die Reparatur zu gewinnen. Wenn nun diese energieverbrauchende Reparatur überlebt wird, kann eine nachfolgende Synthesesteigerung von z.B. Superoxiddismutase, Ferritin oder der Hämoxygenase (HO-1) [147, 326, 530] gegenüber einer erneuten Schädigung durch reaktive Sauerstoff- und Stickstoffderivate schützen. Eine Behandlung zur Induktion von Hitzeschockproteinen mit Wärme schützt ebenfalls vor einer nachfolgenden Schädigung durch H2O2 [165]. Ähnliche Prozesse sind beispielsweise als ischämische Präkonditionierung aus Untersuchungen am Myokard bekannt und ebenfalls in Endothelzellen über eine Anoxie mit nachfolgender Reoxygenierung aufgezeigt worden [74, 38].


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IV.1.3.  Endotheliale Onkose in der Sepsis ?

Die Bedeutung dieser Toxizitätsuntersuchungen für Patienten mit Sepsis ist schwer zu beurteilen. In tierexperimentellen Studien können strukturelle Schäden an Endothelzellen gefunden werden. Vor allem in den 70er Jahren wurden zahlreiche Untersuchungen publiziert, die endotheliale Toxizität nach LPS-Exposition beschreiben. Die generalisierte Schwarzmannreaktion wurde beispielsweise als Konsequenz einer endothelialen Schädigung nach LPS-Exposition betrachetet [159]. Endotheliale Ödeme als Vorstufe des nekrotischen Todes können im Myokard nach intraperitonealer Applikation von E. coli auftreten [438]. Mikrovaskuläre endotheliale Nekrosen sind tierexperimentell in der Leber [355], der Skelettmuskulatur [195], der Aorta und der Lunge [456] nach LPS-Behandlungen beschrieben. In anderen Arbeiten wurden die Effekte von LPS auch völlig unabhängig von einer toxischen Desquamation beschrieben [396]. Direkte toxische Effekte scheinen in Abhängigkeit von der Dosierung von LPS und v.a. der benutzten Tierspezies zu sein. Eine Übertragung dieser Untersuchungen auf Menschen ist schwierig. Einerseits scheint eine Endotoxinämie bei septischen Patienten nur sehr selten aufzutreten und ist schwer interpretierbar [87], andererseits ist die Exposition menschlicher Gefäße mit LPS nicht notwendigerweise mit strukturellen Veränderungen verbunden [44]. Die postmortal vorliegenden Untersuchungen an Menschen, die in einer Sepsis verstarben zeigen wahrscheinlich nicht eine generalisierte Zerstörung der Endothelzellen [210].


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IV.2.  Apoptose durch reaktive Sauerstoff- und Stickstoffspezies in Endothelzellen

IV.2.1. Endotheliale Apoptose durch reaktive Sauerstoff- und Stickstoffderivate

Die Apoptose bezeichnet eine Form des Sterbens, die geregelt, möglicherweise nach einem festen Programm, abläuft. Ein Suizidprogramm also, das unter bestimmten Bedingungen eingeschaltet werden kann. Sie steht der Onkose gegenüber, die oft als zellbiologischer Unfall betrachtet wird. Beide Formen münden letztlich in Nekrose [307, 285, 286]. Apoptotische Zellen schrumpfen isoosmotisch über einen K+-Ausstrom [52], kondensieren ihr Chromatin (Pyknose), zeigen nukleäre Fragmentation (Karyorhexis) und eine reguläre DNS-Fragmentierung (Endonukleolyse). Die Zytoplasmamembran bleibt charakteristischerweise erhalten, sodaß wenig der intrazellulären Bestandteile zu inflammatorischen Reaktionen führen. Teile der Zytoplasmamembran können abgeschnürt (apoptotische Körperchen ähnlich wie Membranbläschen) und von Narchbarzellen über Phagolysosome aufgenommen werden. Die Asymmetrie der Zytoplasmamembran wird in apoptotischen Zellen aufgehoben. Die Bindung von Annexin V an das normalerweise nicht in der äußeren Lipidschicht vorhandene Phosphatidylserin kann eine solche Asymmetrie anzeigen. Onkose und Apoptose stellen extreme Pole eines zellulären Sterbekontinuums dar, das heißt, daß eine exakte Differenzierung nicht immer möglich ist. Zu den frühen Charakteristika der Apoptose zählt ein Abfall des mitochondrialen Membranpotentials (ΔΨm) und ein Anstieg der Produktion reaktiver Sauerstoffderivate [539]. Es kann sich dann ein sehr großer mitochondrialer Kanalkomplex, die sogenannte Mitochondrial Permeability Transition Pore (MPTP), öffnen und entläßt u.a. das APAF-1 (apoptosis protease-activating factor 1) bindende Cytochrom C [291]. Möglicherweise wird über das Apoptosom [291] die Aktivierung der Caspasen induziert, die weitere Proteasen und DNAsen aktivieren, die dann wiederum die typische DNS Fragmentierung und Chromatinverdichtung bedingen. Eine Reihe von Proteinen kann Apoptose in bestimmten Fällen über eine mitochondriale Wirkung regulieren. Hierzu zählen z.B. die Antagonisten Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w und auch Agonisten wie Bax, Bak, Bcl-XS, und Bad. Eine fast [Seite 36↓]unüberschaubare Anzahl apoptose-induzierender Faktoren sind für Endothelzellen beschrieben, zu denen klassischerweise auch der Entzug von Wachstumsfaktoren gehört [14].

Die Exposition von reaktiven Sauerstoffderivaten führt in einigen Endothelzellen zu Apoptose (Tabelle 3) und mit der Demonstration zahlreicher Antioxidantien als antiapoptotisch wirksame Substanzen wird oft der Einfluß reaktiver Sauerstoffderivate im Prozeß der Apoptose untermauert [268].

Tabelle 3: Exogene reaktive Sauerstoffderivate können endotheliale Apoptose induzieren

Zelltyp

Stimulus

Dauer

Apoptose

Onkose

Literatur

      

HUVEC

HX(100) / XO(10)

18 h

2,6 %

0 %

[110]

HUVEC

HX(30) / XO(20)

6 h

0 %

49 %

[301]

HUVEC

400 µM tBH

16 h

1,4 %

44 %

[487]

HUVEC

100 µM tBH

16 h

0,7 %

-0,2 %

[487]

HUVEC

500 µM H2O2

24 h

4,2 %

n.u.

[453]

HUVEC

200 µM H2O2,

18 h

6,2 %

0 %

[201]

BAEC*

100 µM H2O2

4 h

36 %

-3 %

[283]

HX = Hypoxanthin (µM); XO = Xanthinoxidase (mU/ml); tBH = tert-Butyl-Hydroperoxid; *Zellen wurden in Suspension gemessen; n.u. = nicht untersucht

Zellen, die ihren normalen Kontakt mit der extrazellulären Matrix verlieren, zeigen eine Form der Apoptose, die als Anoikis bezeichnet wird. Dieser Prozess kann in Endothelzellen durch endogene Produktion reaktiver Sauerstoffderivate aktiviert werden [289] und erklärt möglicherweise den relativ hohen Anteil apoptotischer Zellen, die in Suspension gefunden wurden [283]. Die überwiegende Anzahl der Untersuchungen zeigt einen sehr geringen apoptotischen Anteil der insgesamt behandelten Zellen an. Bei toxischen Dosen reaktiver Sauerstoffderivate überwiegt das Auftreten der Onkose. Interessanterweise scheinen Zellen, die mit toxischen Dosen von reaktivem Sauerstoff behandelt wurden apoptotische Charakteristika anzunehmen wenn ihr Energieverlust aufgehalten wird. So kann der Anteil apoptotischer Endothelzellen über die Inhibition der Popy-ADP-[Seite 37↓]Ribosyl-Synthetase (PARP) [502] oder über den Zusatz von Glutamin deutlich zunehmen [283]. In der letztgenannten Untersuchung waren 25% der basal vorhandenen ATP-Konzentration nötig, um den Prozess der Apoptose aufrecht erhalten zu können.

Der Einfluß von NO . -Donatoren auf endotheliale Apoptose ist uneinheitlich. Direkte NO . vermittelte Apoptose sind nach hohen Donatordosen in humanen [426], bovinen [328], murinen [483] und Rattenendothelien [452] beschrieben. Auch wurden sekundäre NO . -vermittelte Apoptoseinduktionen nach Exposition mit 2-Methoxy-Östradiol in BCAEC [479], nach Stimulation mit natriuretischen Peptiden in mikrovaskulären Rattenendothelzellen [452] und auch nach Stimulation mit Angiotensin II in HUVEC [111] beschrieben. Entgegen dieser proapoptotischen Funktion können NO . Donatoren in weitaus geringeren Dosen apoptotische Prozesse in SPAEC [73], in PAEC [104], in RAEC [455], und auch in HUVEC [107] inhibieren. Die antiapoptotische Wirkung konnte in HUVEC über eine NP-induzierte Cystein-Nitrosylierung der Protease Caspase-3 erklärt werden [109, 405]. Für diese insgesamt widersprüchlichen Angaben gibt es bisher keine schlüssige Erklärung.


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IV.2.2.  Endotheliale Apoptose durch proinflammatorische Mediatoren

Zu den gut bekannten Mediatoren im Rahmen einer Sepsis zählen Induktoren der Apoptose zählen LPS, TNF-α, IL-1, die ebenfalls als klassische Induktoren der Apoptose fungieren. TNF-α bindet Endothelzellen über p55 Rezeptortrimere und induziert divergente Signale: zum einen ein proapoptotisches Signal und gleichzeitig ein NF-κB abhängiges antiapoptotisches Signal [88, 142]. IL-1 wirkt hauptsächlich über den zur Toll-Rezeptorfamilie gehörigen IL-1-Rezeptor Typ 1 und aktiviert eine Phosphorylierungskaskade zur Aktivierung von NF-κB. Die bekannten Signale für LPS in Endothelzellen benötigen zunächst zirkulierendes CD14 und wahrscheinlich auch Toll-ähnliche Rezeptoren, die die gleiche Phosphorylierungskaskade einschließen [541, 543]. Untersuchungen zur endothelialen Apoptose wurden vorwiegend zu TNF-α (Tabelle 4) und LPS (Tabelle 5) durchgeführt.

Tabelle 4: TNF-α induzierte Apoptose in unterschiedlichen Endothelzellen.

Typ

Dosis

Dauer

Apoptoseanstieg

Literatur

HUVEC

300 U/ml

18 h

ca. 6 %

[109]

HUVEC

400 U/ml

18 h

ca. 2 %

[110]

HUVEC

300 U/ml

18 h

4,2 %

[201]

HUVEC

400 U/ml*

24 h

0-2 %

[3]

HUVEC

4000 U/ml*

24 h

0 %

[541]

HUVEC

800 U/ml*

18 h

0 %

[377]

HUVEC

1000 U/ml*

24 h

0 %

[504]

HUVEC

1000 U/ml

20 h

0 %

[525]

HUVEC

500 U/ml

6 h

0 %

[449]

HUVEC

50 U/ml

6 h

0 %

[437]

HUVEC

100 U/ml

24 h

0 %

[434]

HUVEC

3600 U/ml*

24 h

33 %

[443]

HSMEC

500 U/ml

6 h

0 %

[449]

HCAEC

4000 U/ml*

24 h

22 %

[290]

HCAEC

4000 U/ml*

24 h

12 %

[207]

BAEC

200 U/ml

12 h

0 %

[27]

PAEC

4000 U/ml*

6 h

0 %

[437]

RBEC

200 U/ml*

48 h

2,6 %

[166]

BGEC

1000 U/ml*

24 h

25 %

[319]

MBMEC

100 U/ml*

72 h

35 %

[302]

* Werte wurden aus ng/ml in U/ml gemäß WHO Standard umgerechnet.


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Tabelle 5: LPS induzierte Apoptose in Endothelzellen

Typ

Dosis

Dauer

Apoptoseanstieg

Literatur

HUVEC

1 µg/ml

24 h

0 %

[541]

HUVEC

0,1 µg/ml

24 h

0 %

[504]

HMEC-1

0,1 µg/ml

15 h

0 %

[218]

HUVEC

1 µg/ml

18 h

ca. 2 %

[191]

MLEC

10 µg/ml

4 h

vorhanden

[214]

PAEC

2,5 µg/ml

8 h

0 %

[60]

BAEC

0,1 µg/ml

24 h

25 %

[115]

BGEC

0,03 µg/ml

24 h

45 %

[319]

SPAEC

0,1 µg/ml

4 h

22 %

[73]

SPAEC

0,1 µg/ml

4 h

vorhanden

[481]

SPAEC

0,1 µg/ml

4 h

vorhanden

[215]

BAVEC

1 µg/ml

24 h

0 %

[298]

Generell haben sowohl LPS, als auch IL-1 und TNF-α nur wenig direkte toxische Effekte auf die meisten der untersuchten Endothelzellen. Konsistente Ausnahmen bilden hiervon lediglich Rinder- und Schafendothelien [376]. Wahrscheinlich wird bei diesen Mediatoren in der überwiegenden Zahl der Fälle ein NF-κB abhängiges Signal induziert, das die Produktion von Caspaseinhibitoren wie z.B. bcl 2 anregt und somit die Apoptose aufhalten kann.

Ein weiteres proinflammatorisches Zytokin, das IFN-γ, scheint insgesamt etwas potenter als Apoptoseinduktor in frisch isolierten Endothelzellen zu wirken (Tabelle 6).

Tabelle 6: Apoptoseinduktion in Endothelzellen durch IFN-γ

Typ

Dosis

Dauer

Apoptoseanstieg

Literatur

HUVEC

10 U/ml

8 h

42 %

[306]

HUVEC

2 ng/ml

24 h

24 %

[504]

HDMEC

1000 U/ml

48 h

20 %

[422]

HUVEC

1000 U/ml

48 h

vorh.

[361]

HDMEC

1000 U/ml

48 h

vorh.

[361]


[Seite 40↓]

Allerdings kann auch hier eine beträchtliche Zelltypenabhängigkeit festgestellt werden. Während IFN-γ und auch Kombinationen mit TNF-α und IL-1 in frisch isolierten humanen Saphenaendothelzellen nicht zu einer toxischen Reaktion führen, findet man zu etwa 9 % der mit IFN-γ (1000 U/ml), TNF-α (10ng/ml) und IL-1 (5ng/ml) behandelten ECV 306 Zellen nach 48 h tote Zellen (Die Exposition mit den jeweils einzelnen Komponenten führte nicht zu toxischen Effekten). Eine DNS-Schädigung ist nach dieser Zeit in weitaus höherem Maße nachweisbar (Abb. 12).

Abb 12: TUNEL-Färbung von ECV 306 Zellen nach proinflammatorischer Stimulation.

Links: 3 % der Kontrollkulturen zeigen eine nukleäre Schwärzung als Ausdruck einer Nukleotid-Polymerisierung nach DNS-Fragmentbildung.
Rechts: 45 % der Zellen, die mit TNF-α (10ng/ml), IFN-γ (1000 U/ml) und IL-1 (5ng/ml) über 48 h behandelt wurden, weisen eine deutliche Schwärzung auf.
Die Schwärzung wurde nach Inkubation mit terminaler Desoxyribonukleotidyltransferase in Anwesenheit von Digoxygenindesoxyuridintriphosphat und nachfolgender Inkubation mit anti-Digoxygeninantikörpern und sekundärem peroxidasegekoppeltem Antikörper mit DAB als Substrat gefärbt.

Darüber hinaus zeigen so vorbehandelte ECV-zellen erhöhte zytoplasmatische Ca2+-Konzentrationen, eine vermehrte Histon-Bindung der DNS (Abb. 13) und auch einen Abfall des Membranpotentials ΔΨ (Abb. 14). Eine Schädigung nach dieser Behandlung wird also deutlich, eine Apoptoseinduktion wahrscheinlich.


[Seite 41↓]

Abb. 13: Proinflammatorisch stimulierte Endothelzellen haben erhöhte zytoplasmatische Ca2+-Werte und zeigen vermehrt DNS-Fragmente.

In (A) wurden zytoplasmatische Ca2+-Werte in Endothelzellen unstimuliert (Kontrolle) und nach Stimulation mit TNF-α (10ng/ml), IFN-γ (1000 U/ml) und IL-1 (5ng/ml) (=Cytomix) über 48 h gemessen. In (B) sind Enzymimmunoassay-Werte von histongebundenen DNS-Fragmenten analog behandelter Zellen angegeben. Dargestellt sind jeweils Mittelwert ± S.E.M. aus drei unabhängigen Versuchen.

Abb. 14: Membranpotentialänderung in Endothelzellen nach dem Einfluß von Interferon-γ, IL-1 und TNF-α.

Das mitochondriale Membranpotential wurde semiquantitativ über eine Fluoreszenz-intensitätsänderung von Rhodamin 1,2,3 erfasst. Links: Kontrollkultur nach 24 h. Rechts: Fluoreszenzaufnahme nach Exposition mit TNF-α (10ng/ml), IFN-γ (1000 U/ml) und IL-1 (5ng/ml).


[Seite 42↓]

IV.2.3.  Endotheliale Apoptose in der Sepsis ?

Die theoretischen Überlegungen einer endothelialen Apoptose fußen im wesentlichen auf den vorgenannten Untersuchungen in vitro und auch auf tierexperimentellen Daten. So konnte eine massive endotheliale Apoptose in Mäusen nach LPS-Applikation i.p. aufgezeigt werden [192]. Nutzt man dagegen ein CLP-Modell finden sich lediglich in der Lunge Zeichen für endotheliale Apoptose [209]. Die bisher wenigen Daten, die postmortal bei septischen Patienten haben erhoben werden können, zeigen auffälligerweise apoptotische Veränderungen in einigen Parenchymzellen, vor allem des lymphatischen Systems, nicht aber in Endothelzellen [210]. Daher bleibt die Annahme einer endothelialen Apoptose relevanten Ausmaßes bei septischen Patienten spekulativ [448].


[Seite 43↓]

IV.3.  Signaleigenschaften reaktiver Sauerstoff- und Stickstoffspezies in Endothelzellen

IV.3.1. Extrazelluläre Stimulation mit reaktiven Sauerstoffderivaten

Die exogene Stimulation mit reaktiven Sauerstoffderivaten in niedrigen Dosierungen führt nicht notwendigerweise zu toxischen Veränderungen. Sowohl reversible ATP-Abfälle, als auch reversible morphologische Veränderungen sind in Endothelzellen möglich [484]. Daneben ist eine Fülle von Zielstrukturen für andere regulatorische Wirkungen in Endothelzellen bekannt, die als Signalprozess mit der Aktivierung unterschiedlicher second-messenger Systeme verbunden sind.

Zu den wichtigsten second-messenger Systemen zählt die zytoplasmatische Ca2+-Konzentration [Ca2+]i, die in sehr engen Grenzen reguliert wird. ATP-abhängige Ca2+-Pumpen sorgen für Gradienten gegenüber dem endoplasmatischen Retikulum, den Mitochondrien und auch dem Extrazellulärraum. Zahlreiche rezeptorvermittelte Stimulatoren führen G-Protein-abhängig zur Aktivierung einer Phospholipase C, die wiederum Diazylglycerol (DAG) und Inositoltrisphosphat (IP3) freisetzt. IP3 ist ein wesentlicher Mediator für die Freisetzung von Ca2+ aus intrazellulären Speichern (vorwiegend dem ER). Ein Abfall der endoplasmatischen [Ca2+] führt zu einem Öffnen von Ca2+-Kanälen in der Zytoplasmamembran. Wie dieser Mechanismus aktiviert wird ist noch immer unklar [388]. Neben dieser hochselektiven Ca2+-Kanalfamilie existieren in Endothelzellen u.a. auch unselektive Ca2+-permeable Kationenkanäle, Na+-Ca2+-Austauscher und andere Ionenkanäle, die in ihrer Summe den letztlich vorhandenen Ca2+-Einstrom determinieren [343].


[Seite 44↓]

Abb. 15: Reaktive Sauerstoff-derivate induzieren Ca2+-Signale in Einzelzellen.

LEC (A,B) wurden mit XO (2 mU/ml) in Anwesenheit von HX (1mM) stimuliert. Nach einem Waschschritt erfolgte eine erneute Stimulation der selben Zellen mit ATP (10 µM, A) oder Histamin (100 µM, B). ECV (C,D) wurden ebenfalls mit HX/XO und nach einem Waschschritt mit ATP (10 µM, A) oder Histamin (100 µM, B) stimuliert. Angegeben sind jeweils Verläufe der [Ca2+]i in Einzelzellen.

Niedrig dosierte enzymatische O2 - . produzierende Systeme können reversible [Ca2+]i -Änderungen innerhalb von Sekunden in Endothelzellen induzieren (Abb. 15). Es kommt zu einem transienten Anstieg der vorwiegend zytoplasmatischen Ca2+-Konzentration, der in charakteristischer Weise denjenigen bekannter, rezeptorvermittelter Wirkungen von ATP oder Histamin entspricht. Rezeptorliganden-vermittelte Ca2+-Signale können nach Vorinkubation mit toxischen Konzentrationen von ter-Butylhydroperoxid (t-buOOH) oder auch H2O2 reduziert sein [513, 126]. Entgegen dieser Beschreibungen beeinträchtigt eine Stimulation mit niedrig dosiertem HX/XO allerdings nicht eine nachfolgende Stimulation mit ATP oder Histamin (Abb. 15). In Schweine- und Rinderaortenendothelien können induzierte Ca2+-Signale sogar verstärkt werden, wenn mit niedrig dosierten Superoxiddonatoren prästimuliert wird [178, 247]. Es gibt also eine Ca2+-signalgebende Wirkung reaktiver Sauerstoffderivate, die sich klar von oxidativem Stress im Sinne einer Zellschädigung trennen lässt. Die das Ca2+-Signal initiierende Spezies wurde in unseren Untersuchungen über folgende Ansätzen auf H2O2 [Seite 45↓]eingrenzt: (i) das O2 - . generierende System HX/XO führt in Anwesenheit von Katalase nicht mehr zu einem Ca2+-Signal, wohingegen SOD das HX/XO induzierte Signal nicht aufhebt, (ii) das H2O2 produzierende System G/GO führt katalase-sensitiv ebenfalls zu einem Ca2+-Signal und (iii) die Anwesenheit von intrazellulären Fe-Chelatoren hat keinen Einfluss auf ein durch HX/XO oder G/GO induziertes Ca2+-Signal [495] (Abb. 16). Solche differentiellen Effekte stehen im Gegensatz zu Untersuchungen in HUVEC, bei denen etwa fünffach höhere “Superoxidmengen” benutzt wurden, die wahrscheinlich toxisch sind [117]. Ca2+-Reaktionen waren in diesen Ansätzen O-phenanthrolin- (ein Eisen-Chelator) und SOD-sensitiv, d.h. die Bildung von OH . kann bei höheren Konzentrationen eine Rolle spielen [117, 24].

Abb. 16: Die durch reaktive Sauerstoffderivate induzierten Ca2+-Signale in Endothelzellen sind von H2O2 getragen.

In (A) wurden ECV in Anwesenheit von Katalase (50 U/ml) mit HX/XO (2mU/ml) und nachfolgend mit ATP (10 µM) stimuliert. In (B) erfolgte die Stimulation mit HX/XO (2mU/ml) nach Vorinkubation mit SOD (50 U/ml). In (C) wurde das primär H2O2 produzierende System G/GO (2 mU/ml) benutzt und in (D) erfolgte die Stimulation mit G/GO in Anwesenheit von Katalase (50 U/ml), sowie nachfolgend mit ATP (10 µM).


[Seite 46↓]

Da die transienten [Ca2+]i-Anstiege nach Stimulation mit G/GO auch nachweisbar sind, wenn extrazelluläre Ca2+-Ionen abgepuffert werden, kann man von einer primären Entleerung intrazellulärer Speicher ausgehen. Blockiert man die Wiederaufnahme von zytoplasmatischem Ca2+ in das endoplasmatische Retikulum mit Thapsigargin, so entleeren sich zunächst langsam diese Ca2+-Speicher [161]. Nach der Entleerung dieser Thapsigargin-sensitiven Speicher lassen sich durch G/GO keine Ca2+-Transienten mehr induzieren (Abb. 17). Der primäre Angriffspunkt der H2O2 induzierten Ca2+-Signalkaskade scheint proximal einer Phospholipase C lokalisiert, da es durch U73122 hemmbar ist [435]. Nachfolgende Arbeiten zeigen in menschlichen aortalen Endothelzellen Ca2+-Oszillationen nach Stimulation mit 100 µM H2O2 [217]. Mittlerweile ist auch bekannt, daß zahlreiche Ionenkanäle in Endothelzellen durch H2O2 direkt geregelt werden können [62].

Abb. 17: H2O2 entleert Thapsigargin-sensitive intrazelluläre Ca2+- Speicher.

Das primär H2O2 produzierende System G/GO (2 mU/ml) kein Ca2+-Signal in Endothelzellen nach Vorbehandlung mit Thapsigargin (1 µM). Die jeweilige Zugabe ist durch einen Pfeil gekennzeichnet.


[Seite 47↓]

Die exakten Ziele der durch reaktive Sauerstoffderivate induzierten Ca2+-Signale in Endothelzellen bleiben allerdings unklar und wahrscheinlich nicht auf Membrannähe begrenzt, denn H2O2 und O2 - . können Lipidmembranen durchdringen [172, 24, 304]. Regulatorische Wirkungen reaktiver Sauerstoffderivate an Proteinen können prinzipiell über direkte Oxidationen von Thiolgruppen erfolgen, oder aber indirekt über gemischte Disulfidbildung mit z.B. oxidiertem Glutathion (GSSG) [92, 144, 18, 252]. Thioredoxin scheint an der Reversibilität solcher Gleichgewichtsreaktionen an Proteinen beteiligt zu sein [421]. t-buOOH führt zu einem Anstieg des zytoplasmatischen Gehalts an oxidiertem Glutathion (GSSG) und kann damit einen unselektiven Kationenkanal in pulmonalarteriellen Kälberendothelzellen [256] oder einen den Trp-Proteinen homologen Kanal in Schweineaortenendothelzellen [30] aktivieren.

Die mit diesem sehr schnellen Ca2+-Signal in Verbindung stehenden funktionellen Änderungen können vielfach beschriebene Reaktionen erklären. Hierzu zählen beispielsweise das Auflösen der filamentären Struktur von Vimentin und Tubulin [484], die Sekretion des in Weibel-Palade-Körperchen gespeicherten von-Willebrandt–Faktors [492] oder die Freisetzung von t-PA [423].

Zahlreiche Studien zeigen einen wachstumsfaktortypischen Aktivierungsprozess in Endothelzellen nach Exposition mit subtoxischen Konzentrationen von reaktivem Sauerstoff, ohne daß dies auch einen Proliferationsreiz darstellen muß. Protein-Phosphorylierungskaskaden (=Kinasenaktivität) scheinen in der Summe gegenüber Dephosphorylierungsreaktionen (=Phosphatasenaktivität) zu überwiegen [240]. Tyrosin-Phosphatasen haben alle reaktive Cystein-Reste in den katalytischen Zentren, die über eine Oxidation inhibiert werden, sodaß Tyrosin-phosphorylierungen überwiegen können [145]. Arterielle Rinderendothelzellen zeigen erhöhte Phospholipasenaktivität nach Stimulation mit 100 µM H2O2, die vermutlich von einer Proteinkinase C und Tyrosinkinaseaktivität abhängt [340, 54]. 100 µM H2O2 aktiviert in Schweineaortenendothelzellen und BPAEC Phosphorylierungsreaktionen (Tyrosin- und auch Serin-/Threonin-Kinasen) [34, 71]. Die gleiche Dosis aktiviert in Schweineaortenendothelzellen die Transkriptionsfaktoren NF-κB und AP-1 [34], nicht aber in HUVEC [53]. [Seite 48↓]Mittlerweile verdichten sich ebenfalls Hinweise darauf, daß der Transkriptionsfaktor NF-κB kein direktes Ziel für reaktive Sauerstoffderivate darstellt, sondern vielmehr Phosphorylierungsreaktionen an IκB, das unter Ruhebedingungen die nukleäre Translokation verhindert [493, 70]. Die noch unklaren Ziele für Endothelzellen konzentrieren sich auf die kleinen GTP-bindenden Proteine ras und rac1 als auf die große Familie der mitogen-activated-protein (MAP)- Kinasen [378, 42]. Ebenfalls scheint die Lipidperoxidation ein wichtiger Zwischenschritt bei der Aktivierung zu sein [53, 56].

BAEC zeigen angiogenetische Eigenschaften nach Stimulation mit nur 1 µM H2O2 [533]. Aus Endothelzellen des Rattenherzens kann H2O2 den Wachstumsfaktor VEGF [83] und aus humanen venösen Endothelzellen M-CSF freisetzen [205]. Dennoch kann das Wachstum von BAEC durch H2O2 gehemmt [394] oder stimuliert sein [412].

Oft wird eine endotheliale Aktivierung über ein verändertes Expressionsverhalten von Adhäsionsmolekülen beschrieben. Die Expression von ICAM-1 kann im Gegensatz zu VCAM-1, E-Selectin und P-Selektin auf unterschiedlichen Endothelzelltypen nach exogener Stimulation mit reaktiven Sauerstoffderivaten regelhaft erhöht gemessen werden [274, 273]. Die meisten der beschriebenen Aktivierungsmerkmale benötigen eine Neosynthese, die von redoxsensitiven Transkriptionsfaktoren abhängt. Die in diesem Zusammenhang am besten untersuchten Faktoren sind NF-κB und AP-1. In der Tabelle 7 sind einige Ergebnisse nach direkter Stimulation mit H2O2 in unterschiedlichen Endothelzellen aufgezeigt. Grundsätzlich kann also nicht davon ausgegangen, daß ein aktiviertes NF-κB vorliegt, obwohl NF-κB abhängige Gene wie z.B. IL-8 oder MCP-1 nach exogener Stimulation mit reaktiven Sauerstoffderivaten von Endothelzellen produziert werden können.


[Seite 49↓]

Tabelle 7: Die redoxsensitiven Transkriptionsfaktoren NF-κB und AP-1 sind in Endothelzellen durch exogene Stimulation mit reaktivem Sauerstoff nicht grundsätzlich induzierbar

Zelltyp

Stimulation

NF-κB

AP-1

Antwort

Autor

HUVEC

200 µM H2O2

-

n.unt.

-

[53]

HUVEC

100 µM H2O2

n.unt.

n.unt.

IL-8 -, ICAM-1↑

[273]

HUVEC

50 µM H2O2

-

n.unt.

HLA I↑, ICAM-1↑

[55]

HUVEC

500 µM H2O2

-

n.unt.

-

[236]

HOEC

500 µM H2O2

+

+

IL-8↑

[431]

ECV

200 µM H2O2

+

n.unt.

-

[53]

Ea.hy 926

100 µM H2O2

n.unt.

n.unt.

IL-8↑,

[273]

HMEC-1

100 µM H2O2

-

-

IL-8 -

[274]

HMEC-1

100 µM H2O2

-

-

MCP-1↑, ICAM-1↑

[400]

PAEC

100 µM H2O2

+

+

pp60src↑

[34]

RHEC

500 µM H2O2

+

+

VEGF↑

[83]

HPAEC

100 µM H2O2

n.unt.

n.unt.

IL-8 -

[273]

BAEC

GO*

n.unt.

+

eNOS ↑

[300]

- = nicht nachweisbar; + = nachweisbar. GO* = 1mU/ml Glukoseoxidase + 10 mM Glukose; ICAM-1 = Intercellular Adhesionmolecule 1; HLA = Human Leukocyte Antigen; MCP-1 = Monocyte Chemoattractant Protein 1; VEGF = Vascular Endothelial Growth Factor.


[Seite 50↓]

IV.3.2.  Extrazelluläre Stimulation mit reaktiven Stickstoffderivaten

In Analogie zu den Stimulationen mit exogenen reaktiven Sauerstofderivaten reagieren Endothelzellen mit einem Ca2+-Signal nach Stimulation mit NO . -Donatoren. Sowohl Nitroprussid (NP) als auch S-Nitroso-N-acetyl-penicillamin (SNAP) induzieren Ca2+-Transienten in Einzelzellen ohne dabei eine nachfolgende Stimulation mit ATP zu beeinträchtigen (Abb. 18).

Abb. 18: [Ca2+]i Verläufe in Einzel-zellen nach Stimula-tion NO . Donatoren.

In (A) wurden Endothelzellen mit Nitroprussid (100 µM) und in (B) mit SNAP (100 µM) stimuliert. Die sel-ben Zellen wurden nach einem Wasch-schritt mit ATP (10 µM) stimuliert und zeigen unveränderte transiente Ca2+-Re-aktionen im Ver-gleich zu nicht vor-inkubierten, oder mit ATP vorinkubierten Zellen.

Oxyhämoglobin geht mit NO . eine nahezu irreversible sehr schnelle Bindung ein. Eine Koinkubation mit Oxyhämoglobin als Fänger für freiwerdendes NO . verhindert eine Ca2+-Transiente in Endothelzellen nach Stimulation mit NO . Donatoren reversibel (Abb. 19).


[Seite 51↓]

Abb. 19: NO . ist der Mediator für Ca2+ -Sig-nale in Einzelzellen nach Stimulation mit Nitro-prussid und SNAP.

In (A) wurden Endothel-zellen mit Nitroprussid (100µM) und in (B) mit SNAP (100µM) in Anwe-senheit von Oxyhämo-globin (50µM) stimuliert. Oxyhämoglobin geht un-ter adäquaten Bedingun-gen in vitro eine sehr schnelle und feste Bin-dung mit NO . ein. Nach Auswaschen der Sub-stanzen wurden die selben Zellen erneut mit Nitro-prussid (100 µM) oder SNAP (100µM) stimu-liert. Die Liberation von NO . aus Nitroprussid ist komplex und ist ver-bunden mit der Frei-setzung von CN-. Kon-trollstimulationen mit KCN (10mM) und Kali-umferrozyanid (10mM) führten nicht zu tran-sienten Ca2+-Änderungen.

Direkte reversible NO . induzierte [Ca2+]i-Anstiege sind bisher in Beta-Zellen des Pankreas [516], in Hypophysenvorderlappenzellen [122], in einer Mäusemakrophagenzellinie [258], in Caco-2BBe-Zellen [475], in Fibroblasten und Muskelzellen [451, 139], in interstitiellen Zellen des Kaninchenkolons [385] und auch kuerzlich in PAEC [43] beschrieben worden. NO. hat zahlreiche Einflüsse auf intrazelluläre Ca2+-regulierende Systeme. In Abb. 20 sind die bekannten Strukturen schematisch zusammengefaßt, die auch in Endothelzellen eine Rolle spielen können.


[Seite 52↓]

Abb. 20: Zielstrukturen, über die NO . die intrazelluläre [Ca2+] regeln kann.

Eine direkte S-Nitrosylierung von kritischen Cystein-Resten für die Regulation von spannungs-abhängigen Ca2+-Kanälen (VOC: [454] [68]), Ca2+-abhängigen K+- Kanälen [48, 186], Ryanodinrezeptoren (RyR : [528]), Ca2+-ATPasen des sarkoplasmatischen und endoplasmatischen Retikulums (SERCA: [491] [472]) und G-Proteine [277] sind beschrieben. Second messenger Systeme, die abhängig von Phospholipasen, Proteinkinase C [175] oder Proteinkinase A [373] sind, können ebenfalls direkt durch NO . geregelt werden. Ebenso sind klassische, cGMP-abhängige, Phosphorylierungsreaktionen am IP3-Rezeptor [257] oder an der Regulation des Ca2+ -Einstroms [46] möglich.

Die Charakterisierung des durch NO . in Endothelzellen induzierten Ca2+-Signals zeigt, daß primär intrazelluläre Speicher entleert werden, da das Puffern mit EGTA im Extrazellulärraum das Ca2+-Signal in seiner initialen Phase nicht inhibiert. Ryanodinsensitive endoplasmatische Ca2+-Speicher sind in unterschiedlichen Endothelzellen beschrieben worden [360]. Bisher kennt man drei strukturell ähnliche multimere Ryanodinrezeptortypen in Säugerzellen, die über cGMP-abhängige Kinasen und über Thiol-Nitrosylierungen in ihrer Aktivität reguliert werden können [135]. Diese Rezeptortypen können durch hohe Konzentrationen von Ryanodin (100µM; [320]), Dantrolen (100µM; [367]) und auch Caffein (20mM; [510]) [Seite 53↓]gehemmt werden. Unter diesen Bedingungen waren nur minimale Reduktionen der durch NP induzierbaren Ca2+-Signale in den von uns untersuchten Endothelzellen erkennbar, eine primäre Entleerung Ryanodin-sensitiver Speicher scheint daher eher unwahrscheinlich. Die durch NP entleerbaren Ca2+-Speicher sind allerdings Cyclopiazonsäure- und Thapsigargin-sensitiv, das heißt, daß die Freisetzung eher aus dem endoplasmatischen Retikulum über IP3 abhängige Wege erfolgt. Da die meisten der bekannten NO . -Wirkungen über die Aktivierung der sehr sensitiven Guanylatzyklase (IC50 ca. 100 nM [518]) und nachfolgender cGMP Synthese und cGMP-abhängigen G-Kinasen erfolgt wurde weiterhin geprüft, ob cGMP von Bedeutung für die beschriebenen NO . -induzierten Signale ist. Inkubiert man Endothelzellen vor der Stimulation mit Hemmstoffen der löslichen Guanylatzyklase, wie z.B. Methylenblau oder LY83583, so findet man keine Inhibition der NP induzierten Ca2+-Signale. Auch die Zugabe eines membranpermeablen cGMP-Analogons, das 8-Br-cGMP induziert keine Ca2+-Transiente [500].

Mit der Entleerung Thapsigargin- und Cyclopiazonsäure-sensitiver Speicher können auch in Endothelzellen Ca2+-Kanäle in der Plasmamembran geöffnet werden [138], die allerdings in ihren elektrophysiologischen Charakteristika enorm differieren [343]. Ungeachtet dessen wird mit der durch NP induzierten Entleerung intrazellulärer Speicher auch ein Ca2+-Einstrom über die Plasmamembran induziert, der sich nicht durch den spannungsabhängigen Ca2+-Kanalblocker Diltiazem hemmen läßt.

Auch hier kann also zusammenfassend festgehalten werden, daß die exogene Zugabe von NO . -Donatoren in Endothelzellen Ca2+-Signale induziert, die wie rezeptorvermittelte Ca2+-Verläufe aussehen. Die Menge des freigesetzten NO . entspricht unter den benutzten Bedingungen für NP und SNAP (100 µM) etwa 50-150 nM [228, 331, 427] und erreicht damit Konzentrationen, die von Endothelzellen in vitro nach einer Stimulation erreicht werden können [476].

Die exogene Zugabe von unterschiedlichen NO . -Donatoren führt in Endothelzellen in der überwiegenden Zahl der publizierten Untersuchungen zu einer [Seite 54↓]Inhibition NF-κB-abhängiger Prozesse [441, 440, 245, 540] kann allerdings in transformierten Mäuseherzendothelien eine NF-κB Aktivität verstärken [483]. Andererseits kann aber die Sekretion von Interleukin-8 durch NO . Donatoren in Endothelzellen [489] induziert werden. Unsere Untersuchungen über NO . -induzierte Ca2+-Signale in Endothelzellen legen also nahe, daß intrazelluläre Ca2+-Änderungen an der Synthese von Interleukin-8 in Endothelzellen beteiligt sind. Hierzu wurden Endothelzellen über 24 h mit NP oder SNAP inkubiert und im Überstand vorhandenes IL-8 gemessen.

Abb. 21:
Einfluß von TNF-α und NO . -Donatoren auf eine endotheliale IL-8-Pro-duktion.

Die im Überstand nach 24 h vorhandene Menge IL-8 wurde über einen ELISA (Milenia®, DPC Biermann, Deutschland) bestimmt. In (A) wurden ECV 306 Zellen mit Nitroprussid (100 µM), oder SNAP (100 µM) in Gegenwart von TNF-α (10 ng/ml) und/oder einem intrazellulären Ca2+-Puf-fer (MAPT-AM, 15 µM) wie angegeben inkubiert. In (B) wurde ECV 306 Zellen mit Nitroprussid (100 µM), TNF-α (10 ng/ ml) sowie den span-nungsunabhängigen Ca2+-Antagonisten SKF 96365 (50 µM) oder TMB-8 (100 µM) wie angegeben inkubiert. Dargestellt sind jeweils Mittelwerte ± SEM aus 4 Ansätzen.


[Seite 55↓]

Interessanterweise läßt sich eine NP-induzierte IL-8 Synthese über die Koinkubation mit MAPT-AM, eines membrangängigen Ca2+-Puffers, kaum, eine SNAP-induzierte IL-8 Synthese aber deutlich inhibieren (Abb. 21). Die kombinierte Stimulation mit TNF-α und beiden NO . -Donatoren wird in Anwesenheit von MAPT-AM allerdings deutlich reduziert. SKF 96365 kann den kapazitativen Ca2+-Einstrom in Endothelzellen hemmen [177] und inhibiert sowohl die NP induzierte IL-8 Synthese als auch die IL-8 Synthese der kombinierten Stimulation mit TNF-α und NP (Abb. 21). Mit etwas geringerer Potenz reduziert TMB-8, das die Freisetzung von Ca2+ aus intrazellulären Speichern hemmt [531], die IL-8 Synthese durch NP und auch die kombinierte NP und TNF-α Stimulation. Es zeigt sich also, daß eine NO . -induzierte IL-8 Synthese in Endothelzellen über [Ca2+]i-Änderungen reguliert werden kann [496].


[Seite 56↓]

IV.3.3.  Reaktive Sauerstoffderivate als second messenger

Mit der Möglichkeit der Modulation von Proteinfunktionen durch reaktive Sauerstoffderivate liegt die Vermutung nahe, daß reaktiver Sauerstoff auch als second messenger von Zellen benutzt wird. Nachdem erstmals über resonanzspektroskopische Methoden eine O2 - . Produktion in Schweineaortenendothelzellen nachgewiesen wurde [403] sind in der Folge zahlreiche Untersuchungen publiziert worden, die eine solche These stützen. Endothelzellen, die auf ganz unterschiedliche Weise stimuliert werden, können mit einer vermehrten endogenen Produktion von reaktiven Sauerstoffderivaten reagieren. Hierzu zählen auch mechanische Bedingungen (zyklische Dehnung, Schubspannung), die über die Produktion von reaktivem Sauerstoff unterschiedliche Funktionen regeln (Tabelle 8).

Tabelle 8: Endogene Produktion reaktiver Sauerstoffderivate in Endothelzellen

Typ

Stimulus

Nachweis

Funktion

Literatur

PAEC

-

DMPO-EPR

-

[403]

BAEC

-

HRP/PHPA

-

[363]

BAEC

-

HVM-Dim.

-

[248]

RAEC/BAEC

-

CytC

-

[450]

BAEC

-

CytC

Proliferation

[15]

 

Zyklische Dehnung (Längenänderung, Frequenz)

HAEC

10%, 0,9 Hz

CytC

eNOS ↑

[90]

HUVEC

12%, 1Hz

DCF

ICAM-1↑

[78]

HUVEC

12%, 1Hz

Lucig. CL

MCP-1↑

[523]

HUVEC

12%, 1Hz

DCF

PAI-1↑

[77]

PAEC

20%, 1Hz

TBARS, HRP/PHPA

NADH ox.

[212]

 

Schubspannung (dyn/cm2, Dauer)

HUVEC

20, 12h

Lucig. CL

ICAM-1

[80]

HUVEC

5-40, 120 min

DCF

c-fos↑

[216]

HUVEC

+/- 5, 24 h

DHE

HO-1↑,SOD↑

[100]

BAEC

20, 30 min

oxProt

rac-1/MAPK

[534]

DMPO-EPR = Dimethylpyrrolinoxid- Elektron Paramagnetische Resonanzspektroskopie; HRP/PHPA = Meerrettichperoxidase vermittelte p-Hydroxyphenylacetosäureoxidation; HVM-Dim.= Homovanillinmandelsäredimerisierung; CytC = SOD inhibierbare Ferricyto-chrom C Reduktion; DCF = Dichlorodihydrofluoreszein-Fluoreszenz; Lucig. CL = Lucige-nin verstärkte Chemilumineszenz; TBARS = Thiobarbitursäre reaktive Substanzen; DHE = Dihydroethidium-Fluroeszenz; oxProt= oxidierte Proteine; ET-1 = Endothelin 1; ICAM-1= Intercellular Adhesion Molecule 1; MCP-1= Monocyte Chemoattractant Protein 1; HO-1 = Hämoxygenase 1; MAPK = Mitogen aktivierte Proteinkinasen.


[Seite 57↓]

Ähnlich, wie die exogene niedrig dosierte Stimulation mit reaktiven Sauerstoffderivaten zu wachstumsfaktortypischen Signalen führt, so werden durch Wachstumsfaktoren in Endothelzellen reaktive Sauerstoffderivate produziert. Eine solche Produktion ist für TGF-β in BAEC [468] und Angiotensin II in HUVEC [544] nachgewiesen. In diesem Zusammenhang sei darauf hingewiesen, daß zahlreiche Wachstumsfaktoren in anderen als Endothelzellen über eine vermehrte Produktion reaktiver Sauerstoffderivate zu Tyrosin-Phosphorylierungen führen [414, 230, 144]. Interessanterweise konnte kuerzlich auch in einem Migrationsmodell in aortalen Mäuseendothelzellen gezeigt werden, daß die Produktion reaktiver Sauerstoffderivate notwendig ist, um eine adäquate Aktinpolymerisierung zu gewährleisten [322].


[Seite 58↓]

IV.3.4.  Endotheliale Signale reaktiver Sauerstoffderivate durch proinflammatorische Mediatoren

In Endothelzellinien kann nach proinflammatorischer Stimulation über redoxaktive Fluoreszenzfarbstoffe ebenfalls eine vermehrte Produktion reaktiver Sauerstoffderivate gezeigt werden (Abb. 22). In Tabelle 9 ist eine Übersicht einiger Untersuchungen gegeben, die zu sehr unterschiedlichen und widersprüchlichen Ergebnissen führen. So scheint beispielsweise LPS nur hochdosiert über mindestens 24 h quantifizierbar einen oxidativen Stress zu induzieren, TNF-α eine hohe Zelltypenabhängigkeit zu besitzen und auch unabhängig von einer quantifizierbaren Erhöhung reaktiver Sauerstoffderivate zu einer endothelialen Aktivierung zu führen [12]. In aller Regel finden sich in publizierten Ergebnissen bei kombinierten Stimulationen die intensivsten Produktionsraten.

Abb. 22: Endogene Produktion reak-tiver Sauerstoffderivate in Endothelzellen.

In (A) wurden ECV 306 Zellen unbehandelt, in (B) mit IL-1 (5 ng/ml), IFN-γ (1000 U/ml) und TNF-α (10 ng/ml), in (C) zusätz-lich mit dem Antioxidans Tiron (10 mM) und in (D) mit Tempol (1 mM) über 48 h inkubiert. Dargestellt sind Fluroreszenzaufnahmen re-präsentativer Populationen nach Inkubation mit Di-chlorodihydrofluoreszeindi-acetat (20 µM, 30 min). Ei-ne Zunahme der Helligkeit korreliert dabei mit ver-mehrter Produktion reakti-ver Sauerstoffderivate


[Seite 59↓]

Tabelle 9: Proinflammatorische Mediatoren können in Endothelzellen über die endogene Produktion reaktiver Sauerstoffderivate Funktionsänderungen regeln.

Zelltyp

Stimulus

    
 

(Menge, Dauer)

Methode

Produktion

Funktion

Literatur

      

HUVEC

LPS (10µg/ml,2h)

CytC

-

 

[310]

BAEC

LPS (1µg/ml,12h)

Pterinox.

-

 

[407]

RDMEC

LPS (10µg/ml, 24h)

CytC

+

 

[333]

RLMEC

LPS (10µg/ml, 24h)

CytC

+

 

[333]

      

HUVEC,

TNF-α (100U/ml, 0,5h)

CytC

+

VCAM-1↑

[511]

HPAEC

TNF-α (100U/ml,1h)

DCF

+

E-Selectin↑

[392]

HPAEC

TNF-α (100U/ml,1h)

DCF

+

ICAM-1↑

[391]

ECV

TNF-α (400U/ml, 0,5h)

DCF

-

NF-κB↑

[53]

ECV

TNF-α (400U/ml, 48h)

DCF

-

 

[497]

EA.hy

TNF-α (300U/ml, 1h)

Lucig.

-

  
  

NBT

-

  
  

CytC

-

  
  

DCF

-

ICAM-1↑

[12]

RPAEC*

TNF-α (6nM, 1h)

CytC

+

 

[332]

PPAEC

TNF-α (100U/ml, 21h)

DCF

+

Apoptose

[470]

PPAEC

TNF-α (100U/ml, 21h)

DCF

+

Permeabilität ↑

[469]

PAEC

TNF-α (100U/ml, 1,5h)

HVA

+

E-Selectin↑

[141]

BAEC

TNF-α (1000U/ml,12h)

Pterinox.

-

 

[407]

      

HUVEC

IL-1 (0,5U/ml,2h)

CytC

+

 

[310]

HUVEC

IL-1 (0,5U/ml,1h)

CytC, amp.

(+)**

 

[384]

ECV

IL-1 (5ng/ml,48h)

DCF

-

 

[497]

ECV

IL-1 (10ng/ml, 0,5h)

DCF

-

NF-κB↑

[53]

      

HUVEC

IFN-γ (100U/ml,2h)

CytC

+

 

[310]

RDMEC

IFN-γ (25U/ml, 24h)

CytC

+

 

[333]

RLMEC

IFN-γ (25U/ml, 24h)

CytC

+

 

[333]

ECV

IFN-γ (1000U/ml, 48h)

DCF

-

 

[497]

      

RDMEC

IFN-γ (25U/ml, 24h)

    
 

+ LPS (10µg/ml, 24h)

CytC

+

 

[333]

HAEC*

LPS (10 ng/ml)

    
 

+TNF-α (10U/ml,4h)

Lucig.

+

VCAM-1↑

[474]

ECV

IFN-γ (100 U/ml)+ TNF-α (400U/ml)

    
 

+ IL-1 (5ng/ml)

DCF

+

IL-6,MCP-1↑

[497]

RLMEC

IFN-γ (25U/ml, 24h)

    
 

+LPS (19µg/ml, 24h)

CytC

-

 

[333]

- = negativer Produktionsnachweis; + = Nachweis einer Produktion. Pterinox. = Katalase sensitive Pteridinoxidation; CytC = SOD inhibierbare Ferricytochrom C Reduktion; Lucig. = Lucigenin-verstärkte Chemilumineszenz; HVA = Homovanillinsäureoxidation; DCF = Dichloro-, oder Dichlorodihydrofluoreszein-fluoreszenz; amp. = amperometrisch; VCAM-1 = Vascular Cell Adhesion Molecule 1; ICAM-1 = Intercellular Adhesion Molecule 1; MCP-1 = Monocyte Chemoattractant Protein 1; NF-κB = Nuclear Factor κ B. * Zellen in Suspension. ** Transiente Produktion für ca. 1h.


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Der am besten untersuchte Enzymkomplex zur Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies ist der NADPH-Oxidase-Komplex phagozytierender Zellen [26]. Teile dieses Komplexes sind auch in Endothelzellen nachweisbar [235, 37, 25]. Die Aktivität dieses Komplexes wird u.a. über eine große Proteinfamilie kleiner GTPasen geregelt, von denen ras und rac-1 kritische Komponenten darstellen [230, 144, 534]. Als Quelle für die vermehrt gebildeten reaktiven Sauerstoffderivate nach Exposition mit IL-1, TNF-α und IFN-γ in ECV Zellen ist eine NADH-Oxidase wahrscheinlich, da das Fluoreszenzsignal durch NADH verstärkt wird, nicht aber durch NADPH, oder Xanthin. Eine vermehrte Superoxidproduktion über NOS ist unwahrscheinlich, da auch die Mehrproduktion über L-NMA hemmbar sein müßte [330]. Der endotheliale NAD(P)H-Oxidase-Komplex enthält auch ein Flavoprotein, das über Diphenyliodonium hemmbar ist. Eine Koinkubation mit Diphenyliodonium inhibiert deutlich die DCF-Fluoreszenz (Abb. 23).

Abb. 23: Die Quelle der vermehrten Produktion reaktiver Sauerstoffderivate in ECV 306-Zellen kann ein NADH-Oxidase-Komplex sein.

In (A) wurden ECV 306-Zellen mit IL-1 (5 ng/ml), IFN-γ (1000 U/ml) und TNF-α (10 ng/ml) über 48 h inkubiert und wie angegeben zusätzlich mit NADH (100 µM), NADPH (100 µM), oder Xanthin (100 µM). In (B) wurde zusätzlich der Flavo-proteinhemmer Diphenyliodoni-um (DPI 100µM), oder der unspezifische NOS-Inhibitor L-NMMA (100 µM) inkubiert. Angegeben sind jeweils relative Fluoreszenzintensitätsänderun-gen (± SEM) im Vergleich zu Kontrollinkubationen.


[Seite 61↓]

Die benutzten Zellen produzieren nach der kombinierten proinflammatorischen Stimulation IL-6 und MCP-1. Beide Zytokine werden durch Tiron und Tempol in ihrer Synthese inhibiert, wobei Tiron potenter erscheint (Abb. 24). Auch L-NMMA hemmt, wenn auch weniger potent eine kombiniert stimulierte Zytokinsekretion. Diese Ergebnisse legen also nahe, daß eine endogene Produktion reaktiver Sauerstoffderivate in Endothelzellen zur Synthese von IL-6 und MCP-1 beiträgt, wobei der Einfluß einer Peroxynitritbildung unter den benutzten Bedingungen nicht ausgeschlossen ist, da auch L-NMMA hemmende Wirkung zeigt [497]. Zusammenfassend kann also festgestellt werden, daß eine durch proinflammatorische Stimulation induzierte Produktion reaktiver Sauerstoffderivate in Endothelzellen zelltyp-, und stimulationsabhängig nachweisbar ist. Die Bedeutung dieser Produktion für die Regelung von endothelialen Funktionen ist bisher nur in Ansätzen beschrieben. Ebenso erscheint es möglich, daß eine Ruheproduktionsrate ausreicht um beispielsweise die Aktivität von NF-κB, die Expression von Adhäsionsmolekülen, oder die Sekretion von Endothelin-1 zu regeln. Ob hierfür eine Interaktion mit NO . von Bedeutung ist, bleibt weiteren Untersuchungen vorbehalten.

Abb. 24: Endotheliale Synthese von IL-6 und MCP-1 nach proinflammatorischer Stimulation.

In (A) wurde im Überstand vorhandenes MCP-1 und in (B) IL-6 nach proinflammatorischer Stimulation wie in Abb. 20 be-stimmt. Angegeben sind jeweils Mittelwerte und Standardabwei-chungen aus drei unabhängigen Ansätzen, bei denen zusätzlich Tiron (10mM), Tempol (1mM), oder L-NMMA (100µM) inkubiert wurde.


[Seite 62↓]

IV.3.5.  Reaktive Stickstoffderivate als second messenger

Aus Endothelzellen wurde erstmals eine NO-Synthase isoliert und kloniert. Die mit diesem Enzymsystem verbundene Produktion von NO . ist allerdings sehr komplex und unter anderem von einer Reihe von Kofaktoren abhängig, die ebenfalls reguliert werden. In Tabelle 10 sind publizierte Daten zusammengestellt, die sehr heterogene NO . -Produktionsraten erkennen läßt. Es wird offensichtlich, daß ganz unterschiedliche Mengen sowohl im „Ruhezustand“, als auch unter Stimulationsbedingungen produziert werden können. Diese Probleme ergeben sich zum Teil aus methodischen Gründen, die für die Quantifizierung von reaktiven Sauerstoffderivaten natürlich ebenso gilt. Beispielsweise können akkumulierende Methoden (Griess, Chemilumineszenz, Oxyhämoglobin) nur ungenügend die dynamischen NO . Produktionen erkennen, die mit amperometrischen Methoden innnerhalb von Sekunden erfasst wurden. Ebenso, wie mechanische Stimulationen reaktiven Sauerstoff produzieren können (Tabelle 8) reagieren Endothelzellen vor allem auf Schubspannung mit einer vermehrten NO . -Produktion. Physiologischerweise scheint dies der relevanteste Stimulus in vivo überhaupt zu sein. Erhöhte Schubspannung führt intravital in koronaren Endothelzellen des Kaninchens wahrscheinlich unabhängig von [Ca2+]i-Änderungen zur Freisetzung von EDRF [329]. Schubspannungsinduzierte NO . -Produktion kann in bovinen oder humanen Endothelzellen eine erhöhte eNOS bedingen [482, 346]. Gleichzeitig kann damit auch die Expression der SOD hochreguliert werden [522, 110]. Neben der Regulation des Gefäßtonus und der Hemmung der Thrombozytenaggregation kann so produziertes NO . das Wachstum glatter Muskelzellen hemmen. Diese Ergebnisse bilden u.a. die Grundlage der vaskulären Remodellierung. Dabei wird davon ausgegangen, daß eine Erhöhung der Schubspannung über „gesunden“ Endothelien vermehrt NO . produziert, und einem Intimawachstum entgegensteuert [411].


[Seite 63↓]

Tabelle 10: Aus Endothelzellen freigesetztes NO . .

Typ

Methode

Basalproduktion

Stimulus

Zuwachs

Literatur

      

PAEC

Amp.

-

Bradykinin (2nM)

450 nM

[308]

HUVEC

Amp.

260 nM

Bradykinin (100 nM)

+22 %

 
   

Ionomycin (4 µM)

+92 %

[476]

HUVEC

Amp.

35 nM

IGF (20 ng/ml)

+400 %

[477]

HUVEC

Amp.

-

Histamin (10µM)

60 nM

[383]

HUVEC

Amp.

5 nM

Histamin (10µM)

+800 %

[280]

BAEC

Amp.

-

Schubsp. (10 dyn/cm2)

140nM

[241]

HUVEC

Hb

270 nM

Histamin (10µM)

+80 %

[383]

PAEC

Hb

-

A23187 (10µM)

0,65 nmol/h/106

[334]

PAEC

Hb

0,28 nmol/h/106

Bk (100 nM)

+180 %

[243]

HUVEC

Griess

70 nM

Histamin (10µM)

+300 %

[383]

HUVEC

Griess

3,3 nmol/mg/h

Schubsp. (25 dyn/cm2)

+3000 %

 
   

Bk (20 nM)

+500 %

[270]

HUVEC

Griess

70 pmol/min/106

VEGF

+100 %

[429]

HAEC

Griess

2 pmol/min/106

  

[532]

ECV

Griess

150 pmol/min/106

VEGF

+55 %

[429]

HUVEC

Griess

60 pmol/min/106

VEGF

+120 %

[429]

RAEC

CL

0,5 pmol/µg/h

Angiotensin II (100 nM)

+60 %

[386]

PCAEC

CL

8,3 nmol/µg

A23187 (3µM)

+70 %

[529]

BPAEC

14C-Ar.

129 pmol/h/mg

  

[532]

BAEC

DAF

50 nmol/h/mg

Bradykinin (1µM)

+200 %

[337]

BAEC

DAF

-

Östradiol (100 nM)

+ 120%

[170]

BAEC

DAF

-

Ceramid (5 µM)

+ 100%

[224]

Amp.= amperometrisch, wobei z.B. porphyrinbasierte Redoxpotentiale gemessen werden; Hb = Oxyhämoglobin, das über NO . zu Methämoglobin wird und eine Absorptionsänderung zeigt; Griess = NO2 - . wird in einen Diazofarbstoff überführt; CL = Chemilumineszenz, bei der NO2 - und andere Nitrosoverbindungen in NO . überführt und in der Gasphase mit einer Ozonreaktion nachweisbar ist; 14C-L-Arg. = Enzymatischer Umbau von L-Arginin zu Citrullin durch NOS; IGF = insulin-like growth factor; Schubsp. = Schubspannung; VEGF = 20 ng/ml vascular endothelial growth factor.


[Seite 64↓]

IV.3.6.  Endotheliale Signale reaktiver Stickstoffderivate durch proinflammatorische Mediatoren

Die zelltypenabhängigen Aktivitätsunterschiede der NO . produzierenden Enzyme sind enorm [532]. Auch ist nicht regelhaft mit einer Aktivitätssteigerung nach Stimulation mit proinflammatorischen Zytokinen in Endothelzellen zu rechnen [404, 179], sodaß die meisten Untersuchungen hochdosierte Zytokinkombinationen über längere Zeiträume nutzen (Tabelle 11).

Tabelle 11: Endothelial freigesetztes NO . nach proinflammatorischer Stimulation

Typ

Methode

Basalproduktion

Stimulus

Zuwachs

Literatur

      

Ea.hy926

Hb

0,3 nmol/mg/min

Cytomix1

+330 %

[157]

Ea.hy926

Griess

5,6 µM

Cytomix*52

+375 %

[156]

BAEC

Griess

< 100 nM

Cytomix*3

10,4 µM

[187]

BCoEC

Griess

10 pmol/106

Cytomix*4

+7100 %

[106]

RDMEC

Griess

3 nM

Cytomix*5

+950 %

[333]

RLMEC

Griess

5 nM

Cytomix*5

+200 %

[333]

HUVEC

CL

-

+Cytomix6

+0%

[404]

HUVEC

CL

 

+Cytomix6/Histamin

+200%

[404]

HUVEC

14C-Ar.

0,6 pmol/mg/min

+Cytomix6

+66%

[404]

HAEC

14C-Ar.

6 pmol/h/mg

+Cytomix7

+66%

[532]

Ea.hy926

DAF

-

Cytomix8

+120 %

Abb. 25

Hb = Oxyhämoglobin, das über NO . zu Methämoglobin wird und eine Absorptionsänderung zeigt; Griess = NO2 - . wird in einen Diazofarbstoff überführt; CL = Chemilumineszenz, bei der NO2 - und andere Nitrosoverbindungen in NO . überführt und in der Gasphase mit einer Ozonreaktion nachweisbar ist; 14C-L-Arg. = Enzymatischer Umbau von L-Arginin zu Citrullin durch NOS; Cytomix1 = 48 h 200 U/ml TNF-α + 200 U/ml IFN-γ + 2 µg/ml LPS; Cytomix2 = 24 h 100 U/ml TNF-α + 25 U/ml IL-1; Cytomix3 = 48 h 200 U/ml IFN-γ + 5000 U/ml TNF-α; Cytomix4 = 48 h 100 U/ml IFN-γ + 100 U/ml TNF-α + 1 µg/ml LPS; Cytomix5 = 48 h 25 U/ml IFN-γ + 10 µg/ml LPS; Cytomix6 = 200 U/ml TNF-α + 5 U/ml IL-1 + 200 U/ml IFN-γ; Cytomix7: 6 h 0,1 µg/ml LPS, 500 U/ml IFN-γ, 20 ng/ml IL-1, 10 ng/ml TNF-α; Cytomix8: 48 h 1000U/ml IFN-γ, 5 ng/ml IL-1, 10 ng/ml TNF-α.

Ganz offensichtlich scheinen Endothelzellen auf gleiche Stimuli sowohl reaktive Sauerstoffderivate als auch NO . zu produzieren. Eine solche Gleichzeitigkeit ist für eine ganze Reihe von Agonisten gezeigt worden [260, 386]. Diese Gleichzeitigkeit führt theoretisch zu sehr komplexen Interaktionen, sodaß zahlreiche Mediatoren auch als Balancemodulatoren verstanden werden können. So kann eine [Seite 65↓]vermehrte NO . Produktion durch Östradiol über eine verminderte Superoxidproduktion erklärt werden [33]. Umgekehrt kann eine vermehrte Superoxidproduktion nach Hemmung der endogenen NO . Produktion gefunden werden [330] oder der Mangel an Tetrahydrobiopterin die NO-Synthase zur Superoxidproduktion, statt der NO . -Produktion anregen [91]. Untersuchungen zu kompartimentierten intraendothelialen Produktionsstätten von sowohl reaktiven Sauerstoffderivaten als auch reaktiven Stickstoffderivaten (z.B. Caveolae) erlauben ebenfalls eine Regulation [370]

Es ist also klar geworden, daß eine feine Balance besteht, die eine Reihe von Möglichkeiten zuläßt, die Menge beider Molekülgruppen zu regeln und damit auch einem dramatischen Überproduktionskollaps entgegenzuwirken. Ein quantifizierbares Summenmaß für ein Gleichgewicht fehlt allerdings.

Abb. 25: Fluoreszenzaufnahme von Ea.hy 926 Zellen nach Beladung mit dem NO . sensitiven Farbstoff DAF-2.

In der oberen Reihe sind digitale Fluoreszenzaufnahmen (FL) von Zellen nach Behandlung nur mit dem Kulturmedium, nach kombinierter Zytokinstimulation (10 ng/ml TNF-α, 5 ng/ml IL-1 und 100 U/ml IFN-γ), sowie zusätzlicher Inkubation mit LNMA (100 µM) über 48 h gezeigt. In der unteren Reihe sind die dazugehörigen Phasenkontrastaufnahmen (PK) dargestellt.


[Seite 66↓]

IV.4.  Reaktive Sauerstoff- und Stickstoffderivate regeln endotheliale Funktionen im Rahmen einer Sepsis

Sepsis ist definiert worden als die systemische Reaktion auf eine Infektion [50]. In der überwiegenden Zahl der Fälle wird die Infektion von Bakterien verursacht, wobei sich gram positive und gram negative Keime in etwa die Waage halten. Die potentesten Initiatoren für die Aktivierung einer ganzen Reihe von Mediatorkaskaden scheinen Lipopolysaccharide der Zellmembran gram negativer Bakterien, bzw. Lipoteicholsäure und Peptidoglykan gram positiver Bakterien, oder auch sezernierte Toxine zu sein. All diese bakteriellen Produkte sind isoliert in der Lage in tierexperimentellen Modellen Aspekte septischer Patienten zu induzieren. Zu den charakteristischen klinischen Veränderungen im Verlaufe einer Sepsis zählen hyperdyname Phasen mit Tachykardie und hohem Herzzeitvolumen, generalisierte Ödembildungen, eine Aktivierung des Gerinnungssystems bis hin zu diffusen Blutungen, Bewußtseinsstörungen und über zunehmende Organfunktionsstörungen schließlich zum Mehrorganversagen.

Es ist nunmehr unbestritten, daß Endothelzellen enorm wichtig für die kritische Balance eines Vasomotorentonus, der Adhärenz und Abhalten zirkulierender Zellen, Pro- und Antikoagulation, Permeabilität und auch des Sauerstoffverbrauchs sind. All diese Funktionen scheinen bei der Sepsis gestört, wobei unklar bleibt, ob eine endotheliale Dysfunktion Usache oder Folge klinisch faßbarer Störungen, wie z.B. die der Blutung, der Ödembildung und des Organversagens, darstellt. Wie eng Endothelzellen mit septischen Veränderungen über eine Dysbalance reaktiver Sauerstoff- und Stickstoffderivate verbunden sind soll in den folgenden Kapiteln aufgezeigt werden


[Seite 67↓]

IV.4.1.  Endotheliale Infektion und Produktion reaktiver Sauerstoff- und Stickstoffderivate

Nahezu alle relevanten bakteriellen Keime, Viren, Parasiten und Pilze können Endothelzellen infizieren [499]. In den meisten der untersuchten Fälle geht eine solche Infektion mit einer endothelialen Aktivierung (vermehrte Expression von Adhäsionsmolekülen, prothrombotische Oberfläche, Zytokinsekretion) einher. Einige Bakterien können H2O2 produzieren und damit Einfluß auf endotheliale Funktionen nehmen. Streptolysin S, ein Hämolysin von Streptokokken, oder Pyochelin von P. aeruginosa steigert die Toxizität von H2O2 [167, 57]. RBMEC können nach Inkubation mit S. pneumoniae vermehrt O2 - . produzieren [253] und eine Infektion von EA.hy 926 und HUVEC mit R. rickettsii führt zu einem Abfall von Glutathion, einem Abfall der Glutathionperoxidaseaktivität und einem Anstieg intrazellulärer Peroxide [204]. Bakterien können über Denitrifikationen NO . bilden und auch eine eigene NOS besitzen [81]. Bakterielle Sekretionsprodukte sind gleichfalls in der Lage in Endothelzellen eine vermehrte Produktion reaktiver Sauerstoffderivate und Stickstoffderivate zu bilden. Neben den am besten untersuchten Lipopolysacchariden gram negativer Bakterien können auch andere Sekretionsprodukte wie z.B. E. coli-Hämolysin [458] eine endotheliale NO . Produktion verstärken. Gram positive Bakterien scheinen ebenfalls über Zellwandbestandteile [149], oder die Sekretion von Toxinen [458] dazu in der Lage.

Für Menschen mit Sepsis kann davon ausgegangen werden, daß sowohl eine vermehrte Produktion reaktiver Sauerstoffderivate, als auch reaktiver Stickstoffderivate vorhanden ist (Tabelle 10). Allerdings bleibt völlig unklar, welche zellulären Quellen dafür verantwortlich sind, ob das Vorhandensein den pathologischen Prozeß unterhält, oder als Reaktion der Erkrankung gefunden wird.


[Seite 68↓]

Tabelle 12: Indikatoren für reaktive Sauerstoff- und Stickstoffderivate in Patienten mit Sepsis

Literatur

Patienten

Klinische Form

Indikator

[174]

16

septischer Schock

Retinol↓, Tocopherol↓, β-Carotin↓, TBARS↑

[93]

15

schwere Sepsis

* Antioxidatives Potential ↓

[158]

26

Sepsis

TBARS ↑

[154]

14

Sepsis

XOD ↑, Ascorbylradikal ↑, Lipidperoxide↑

[153]

8

Sepsis

Vitamin C↓, Bleomycin-detektierbares Eisen↑

[155]

30

Sepsis

Vitamin C↓, Lipidperoxide↑

[349]

17

Sepsis

NO2-/NO3- ↑

[136]

12

septischer Schock

NO2-/NO3- ↑

[128]

23

Sepsis, septischer Schock

NO2-/NO3- ↑

[173]

29

septischer Schock

NO2-/NO3- ↑

[16]

13

septischer Schock

NO2-/NO3- ↑

[465]

20

Sepsis

NO2-/NO3- ↑

[114]

53

Sepsis (Kinder)

NO2-/NO3- ↑

[439]

46

SIRS, Sepsis (Kinder)

NO2-/NO3- ↑

[120]

30

Sepsis (Kinder)

NO2-/NO3- ↑

[521]

31

Sepsis (Kinder)

NO2-/NO3- ↑

[266]

22

septischer Schock (Kinder)

NO2-/NO3- ↑

[23]

11

septischer Schock

NO2-/NO3- ↑

[259]

11

Sepsis

endotheliale Nitrotyrosine ↑

[151]

3

septischer Schock

NO2-/NO3-, plasmatische Nitrotyrosine ↑

[261]

3

Sepsis

endotheliale Nitrotyrosine ↑

*Antioxidative Kapazität ist definiert worden als die Fähigkeit des Plasmas eine H2O2 induzierte Ferryl-myoglobin-Produktion von Metmyoglobin zu bilden; TBARS, Thiobarbitursäre reaktive Substanzen; XOD, Xanthinoxidase.

Proinflammatorische Mediatoren, die im Rahmen der Sepsis eine bedeutende Rolle spielen, können in Endothelzellen ebenfalls vermehrt reaktiven Sauerstoff produzieren (Tabelle 9). Die meisten Hinweise für die Bedeutung reaktiver Sauerstoffderivate bei der Regulation eines aktivierten endothelialen Phänotyps existieren werden mit dem inhibitorischen Potential unterschiedlicher Antioxidantien begründet [392, 12, 98, 327]. Bei aller Komplexität scheinen die meisten Untersuchungen darauf hinzuweisen, daß eine vermehrte NO . -Produktion nur nach hochdosierter kombinierter Stimulation erfolgt (Tabelle 11).


[Seite 69↓]

Ob mit einer geänderten endogenen Produktionsrate reaktiver Sauerstoff- und Stickstoffderivate protektive, oder schädigende Wirkungen verbunden sind ist kontrovers. Beispielsweise schützt eine subtoxische Exposition mit Peroxynitrit eine nachfolgende Schädigung durch TNF-α in BPAEC [380]. Als protektive Wirkung können beispielsweise in transformierten Mausendothelien nach einer kombinierten proinflammatorischen Stimulation mit IFN-γ und TNF-α (und IL-1) über eine vermehrte NO . -Synthese R. conorii [503] und S. mansoni [358] abgetötet werden.

Die Regulation der in Endothelien vorhandenen NO-Synthasen scheint gleichfalls komplex. LPS führt in BAEC zu einer vermehrten Expression von eNOS [239], wohingegen TNF-α eNOS in BAEC [275, 344] und in HUVEC reduziert [536]. LPS und TNF-α können in BAEC, PAEC und in ECV 306 Zellen eine Erniedrigung der NO . Produktion induzieren [179, 342, 101]. Die Regulation der iNOS, die zu wesentlich höheren NO . -Produktionsraten fähig ist unterliegt dem Einfluß zahlreicher proinflammatorischen Stimuli mit erheblichen Zelltyp-variabilitäten [148]. Von allen die Endothelien umgebenden Zellen ist mittlerweile bekannt, daß auch sie in der Lage sind über nur unvollständig verstandene Regulationswege sowohl NO . als auch reaktive Sauerstoffderivate zu produzieren. Das gilt insbesondere für glatte Muskelzellen, die unter Umständen weitaus potenter als Endothelzellen sein können. Die alleinige Präsenz von iNOS reicht nicht, eine veränderte NO . Produktion anzunehmen [63]. Eine ganze Reihe von Cofaktoren, wie SOD, NADH, Calmodulin, Tetrahydrobiopterin, und Arginin bestimmen die Synthesefähigkeit dieses Enzyms [91]. Endothelien sind daneben in der Lage einen endogenen Inhibitor, das asymmetrische Dimethylarginin, zu produzieren [233]. Darüber hinaus ist eine vermehrte Expression von iNOS unter bestimmten Bedingungen durchaus sinnvoll und kann mit protektiven Effekten verbunden sein [369]. Mit einer ganzen Reihe von neueren selektiveren iNOS-Inhibitoren können beispielsweise auch Wundheilungsstörungen erwartet werden [445]. Bei Patienten mit Sepsis kann zwar in zirkulierenden Zellen eine erhöhte Expression [478] aber ohne Funktion [398] gefunden werden. Da grundsätzlich NO-Synthasen in der Lage sind auch O2 - . [381, 420, 526, 527] oder H2O2 [263] zu produzieren, kann auch eine erhöhte NOS zu erhöhten Superoxidproduktionen beitragen und umgekehrt eine Inhibition dieses Enzymsytems die Superoxidproduktion reduzieren [330].


[Seite 70↓]

IV.4.2.  Interaktionen zirkulierender Zellen mit Endothelzellen in der Sepsis

Für gewöhnlich wird jede zirkulierende Zelle von der endothelialen Oberfläche abgehalten. Verantwortlich dafür scheint die elektrische Nettoladung, biomechanische Charakteristika fließenden Blutes und natürlich die endotheliale Sekretion von NO. zu sein. Berühren zirkulierende Zellen eine Endothelzelle, so kann ein Ca2+-Signal induziert werden [547], wobei die funktionelle Konsequenz noch unklar ist. Aktivierte Endothelzellen sind potente Produzenten von Zytokinen und Chemoattraktoren über die eine Interaktion mit zirkulierenden Zellen eingeleitet werden kann [28]. Enorme Bedeutung für leukozytär-endotheliale Interaktionen ist die bekanntermaßen stimulus-, zelltyp-, zeit- und organspezifische Regulation zahlreicher Adhäsionsmoleküle auf der endothelialen Oberfläche [372, 362]. Eine Übersicht über die komplexe Regulation dieser Interaktion findet sich bei [183]. Darüber hinaus sind Adhäsionsmoleküle nicht nur passive Ankermoleküle, sondern auch als Rezeptoren biologisch aktiv. Sie sind Rezeptoren zur Signaltransduktion und Antagonisten im zirkulierenden Blut. Lösliche Formen von Adhäsionsmolekülen können auch bei Menschen mit Sepsis in erhöhtem Masse gefunden werden (Tabelle 13), die Interpretation ihrer Funktionalität bleibt spekulativ.

Tabelle 13: Lösliche Adhäsionsmoleküle bei Patienten mit Sepsis

Literatur

Patienten

Klinische Diagnose

Indikator

[325]

19

Sepsis, ARDS

sICAM-1↑

[95]

67

Sepsis

sE-Sel↑

[124]

16

schwere Sepsis

sE-Sel↑, sICAM-1↑

[242]

25

Sepsis

sE-Sel↑, sICAM-1↑

[480]

71

Sepsis, Malaria

sICAM-1, sVCAM-1, sE-Sel ↑

[160]

12

Mediteranean spotted fever

cEC↑

[47]

40

Sepsis

sICAM-1↑, sVCAM-1↑

sE-Sel = lösliches E-Selektin; sVCAM-1 = lösliches Vascular Cell Adhesion Molecule 1; sICAM-1 = lösliches Intercellular Adhesion Molecule 1; sEPCR = löslicher endothelialer Protein C Rezeptor; cEC = zirkulierende Endothelzellen


[Seite 71↓]

Die Interaktion von Neutrophilen mit Endothelzellen kann über die Produktion von reaktiven Sauerstoffderivaten toxisch sein und eine unkontrollierte Aktivierung neutrophiler Granulozyten ist durchaus in der Lage zu einer Gewebeschädigung beizutragen. Zahlreiche tierexperimentelle Modelle belegen eine direkte endotheliale Schädigung [438, 196] und spiegeln nur begrenzte Aspekte der klinischen Realität wider [76]. Eine endotheliale Apoptose kann in tierexperimentellen Modellen massiv auftreten [192], wobei dies allerdings bei Menschen nicht der Fall zu sein scheint [210]. Neuere experimentelle Ansätze zeigen, daß Leukozyten eine endotheliale Apoptose inhibieren können [354] und auch Endothelzellen in der Lage sind, leukozytäre Funktionen zu inhibieren [168]. Transmigrierende Neutrophile können zu einer Wiederversiegelung der endothelialen Integrität beitragen [284]. Es gibt kaum Daten über die endotheliale Vitalität in Patienten mit Sepsis. Ob eine unkontrollierte Überaktivierung neutrophiler Granulozyten bei septischen Patienten überhaupt vorliegt, kann bezweifelt werden und auch eine massive leukozytäre Extravasation in septischen Patienten ist fragwürdig [501].


[Seite 72↓]

IV.4.3.  Endotheliale Permeabilität in der Sepsis

Endothelzellen regeln den transvaskulären Austausch von Flüssigkeiten, Metaboliten und auch ganzen Zellen. Dafür können transzelluläre vacuoläre Kanäle oder auch parazelluläre Wege benutzt werden. Die parazelluläre Permeabilität, an der eine ganze Reihe von Proteinen beteiligt ist wird wahrscheinlich über einen aktiven Kontraktionsvorgang an Myosin geregelt. Die hierbei am besten untersuchten Regelwege zeigen generell, daß mit einer Erhöhung von cAMP kultivierte Endothelzellmonolayer dicht gehalten werden, wobei dem cGMP eine unterstützende Funktion in humanen aorten and dermalen Gefäßen zukommt [116]. Eine Retraktion kann über die Erhöhung der zytoplasmatischen Ca2+-Konzentration induziert werden, die allerdings von cAMP aufgehoben wird [323].

Anstiege der endothelialen Permeabilität können durch Exotoxine von S. aureus, P. multocida und P. aeruginosa [459, 133, 457] oder auch Endotoxine [107, 31, 32] und proinflammatorische Mediatoren [7, 254] induziert werden. Eine H2O2 induzierte Hyperpermeabilität kann über NO . Donatoren in PPAEC aufgehoben [460], in BPAEC verstärkt [352, 318] oder keinen Einfluß haben [94]. Die produzierten relativen Mengen und die Umgebungsbedingungen modulieren also wahrscheinlich die kombinierten Wirkungen reaktiver Sauerstoff- und Stickstoffderivate auch hinsichtlich der Permeabilität [351]. Zahlreiche tierexperimentelle Modelle können eine erhöhte vaskuläre Permeabilität in unterschiedlichen Gefäßbetten finden. Beispielsweise steigt in E. coli infundierten Ratten in venösen Gefäßen die Permeabilität, die über die Antioxidantien N-Acetyl-cystein oder Tirilazad Mesylat unterdrückbar ist [419, 418].

Klinisch ist das Auftreten von Ödemen bei Patienten mit Sepsis ganz offensichtlich und Untersuchungen mit der venösen Stauungsplethysmographie und über differentielle Distributionsvolumina von Glukose und Albumin weisen auch auf eine erhöhte Filtrationskapazität als Ausdruck einer sehr früh gestörten Endothelfunktion bei septischen Patienten hin [82][232].


[Seite 73↓]

IV.4.4.  Endotheliale Kontrolle der plasmatischen Gerinnung bei Sepsis

Die Aktivierung des plasmatischen Gerinnungssystems erfolgt in vivo prinzipiell über die Expression von TF. TF ist in der Lage über die Aktivierung von Faktor VII den Faktor X, oder Faktor IX zu aktivieren. Aktiverter Faktor X spaltet dann im Komplex mit Faktor V Prothrombin zu Thrombin, dem wahrscheinlich potentesten Gerinnungsaktivator, der das Fibrinogen in Fibrin überführt. Die Inhibition dieser Aktivatorkaskaden erfolgt unter normalen Umständen sofort über TFPI (tissue factor pathway inhibitor), der TF in seiner Funktion hemmt. Daneben kann das Thrombin über die Bindung an Thrombomodulin einen Komplex bilden, der das Protein C, wenn es an den endothelialen Protein C-Rezeptor gebunden hat aktiviert. Wahrscheinlich muss das aktivierte Protein C wieder dissoziieren um mit Protein S im Komplex die Faktoren Va und VIIIa zu inhibieren. Heparin und auch auf der endothelialen Oberfläche vorhandene Glycosaminoglykane binden Antithrombin, das zusammen mit dem ProteinC/S System das potenteste Thrombininhibitorsystem darstellt [132]. Die Auflösung einer Fibrinbildung läuft ebenfalls auf endothelialer Oberfläche ab. Das hierfür notwendige Plasmin entsteht vorwiegend aus Gewebe-Plasminogenaktivator (tPA), der von dem Plasminogen-Aktivatorinhibitor (PAI-1) inhibiert wird. Beide Faktoren, tPA und PAI-1, werden von Endothelzellen synthetisiert, wobei das tPA normalerweise im Überschuss vorhanden ist. Die wichtigsten Aktivatoren für Thrombozyten können aus Endothelien stammen. Hierzu zählt der Plättchen-Aktivierende Faktor (PAF) und der von Willebrandt-Faktor. Endothelzellen scheinen die einzig relevanten Produzenten des vWF zu sein. Dieser Faktor kann im Plasma den Faktor VIII vor proteolytischem Abbau schützen und an der zellulären Oberfläche über Glykoproteinrezeptoren Thrombozyten binden und miteinander vernetzen.

Prinzipiell bilden Endothelzellen über den extrazellulären Glycosaminoglykan-Antithrombin III -Komplex, Thrombomodulin, den tissue factor pathway inhibitor (TFPI), die Produktion von Adenosin über Ekto-ADPasen, die Sekretion von Protein S, Prostacyclin und natürlich auch NO . eine antithrombotische Oberfläche. Die NO . Produktion scheint dabei eine zentrale Rolle einzunehmen, da [Seite 74↓]beispielsweise das Heparansulfat [231] und auch die Prostacyclinsekretion [509] davon abhängen können. Ein geschädigtes Endothel führt in vitro fast regelhaft zu einer prothrombotischen Transformation. TF kann auf der endothelialen Oberfläche durch Bakterien, LPS, IL-1 und TNF-α in allen untersuchten Zelltypen erhöht werden. Proinflammatorische Stimulatoren einschließlich reaktiver Sauerstoffderivate können Endothelzellen zur Sekretion des PAF [288] und auch des vWF [492] anregen. Umgekehrt kann die Thrombomodulinexpression auf HUVEC über LPS, IL-1 und TNF-α erniedrigt werden [203, 254]. Vascular endothelial growth factor (VEGF) dagegen kann über NO . [269, 424] eine IL-1, TGF-β und LPS induzierte Suppression von Thrombomodulin antagonisieren [65]. IL-1 und TNF-α reduzieren endotheliales tPA und erhöhen PAI-1 [416]. Die Induktion des PAI-1 kann dabei über die endogene Produktion reaktiver Sauerstoffderivate erfolgen [350]. In der Summe würde zumindest in vitro die proinflammationsbedingte Inhibition der Fibrinolyse eine frühe Thrombenbildung unterstützen.

Tierexperimentelle Sepsis-Modelle können eindrucksvolle Aktivierungen des plasmatischen Gerinnungssystems erzeugen, wobei der endotheliale Beitrag unklar ist. Als Ausdruck einer endothelialen Beteiligung kann beispielsweise eine reduzierte Antithrombin III – Bindung and das Endothel im Intestinum im Nagermodell gezeigt werden (Abb. 26)[387].

Endothelzellen sind sicher nicht als einfache Initiatoren einer komplexen prokoagulatorischen Gesamtsituation in der Sepsis zu betrachten. Eine Dysbalance endothelialer Aktivator- und Inhibitorsysteme lässt sich wahrscheinlich aus der Summe der meisten Untersuchungen postulieren. In einer neueren Arbeit mit einem LPS-Primatenmodell konnte beispielsweise der endotheliale Protein C Rezeptor als Schutzsystem beschrieben werden [466].


[Seite 75↓]

Abb. 26: Endotheliale AT-Bindung als Ausdruck einer Schädigung.

Im linken Bild wurden Ratten mit NaCl und im rechten Bild mit LPS (50mg/kg, 4h) behandelt. Dargestellt sind intravitale Fluoreszenzaufnahmen eines FITC-markierten anti-AT Antikörpers (Centeon, Marburg), wobei ím rechten Bild keine AT-Bindung erkennbar ist.

Patienten mit Sepsis zeigen eine Aktivierung des plasmatischen Gerinnungssystems [312]. Die primäre Ursache einer aktivierten plasmatischen Gerinnung bei septischen Patienten bleibt allerdings unklar. Isolierte mikrovaskuläre Endothelzellen der Lunge aus Patienten, die an einem ARDS litten zeigen zwar eine erhöhte prokoagulatorische Aktivität [180], dennoch hat eine relevante Erhöhung von TF auf Endothelzellen bisher weder in tierexperimentellen Studien, noch bei Menschen mit Sepsis gezeigt werden können [131, 66, 357]. Ein endothelzellspezifischer Repressor scheint hierfür verantwortlich zu sein. Eine Aktivierung der plasmatischen Gerinnung kann entweder über die bakteriellen Oberflächen selbst, oder über aktivierte Monozyten erfolgen. Inhibitoren mit antikoagulatorischer Potenz (z.B. AT, TFPI) werden zwar zur Zeit in sehr großen multizentrischen Studien auf ihre Wirksamkeit bei septischen Patienten geprüft, ihre endotheliale Wirkung bleibt aber spekulativ.


[Seite 76↓]

Tabelle 14: Lösliche Marker für endotheliale Aktivierung im Gerinnungssystem von Patienten mit Sepsis

Literatur

Patienten

Klinische Diagnose

Indikator

    

[409]

45

Sepsis

svWF↑

[222]

60

Sepsis

sTM↑

[325]

19

Sepsis, ARDS

sTM↑, svWF↑

[242]

25

Sepsis

svWF↑

[265]

22

septischer Schock

sTM↑

[314]

32

SIRS

svWF↑

[129]

42

Sepsis, DIC

sTM ↑

[272]

16

Sepsis

s EPCR↑

[160]

12

Mediteranean spotted fever

sTM↑, svWF↑

[47]

40

Sepsis

sTM↑

[297]

32

Sepsis

sTM↑, t-PA↑, vWF↑

SvWF = löslicher von Willebrandt Faktor; sTM = lösliches Thrombomodulin, sEPCR = löslicher endothelialer Protein C Rezeptor; cEC = zirkulierende Endothelzellen


[Seite 77↓]

IV.4.5.  Endothelabhängige Vasoregulation in der Sepsis

Die größte Bedeutung von Endothelzellen für die vaskuläre Biologie liegt wahrscheinlich in ihrer Fähigkeit den Gefäßtonus zu regulieren. Neben der urspünglichen Potenz zur Bildung von Prostacyclin nimmt die endotheliale NO . Produktion ganz entscheidend an dieser Regulation teil. Mitte der 80er Jahre konnte zunächst von O2 - . gezeigt werden, daß es einen endothelabhängigen relaxierenden Faktor (EDRF) inaktiviert. Mittlerweile geht man auch von direkten vasoregu-latorischen Effekten unterschiedlicher reaktiver Sauerstoffspezies vor allem in der zerebralen und koronaren Zirkulation aus. Als klar wurde, daß NO . wahrscheinlich der potenteste EDRF ist, begann eine wahre Flut von Untersuchungen. Aber auch andere Moleküle können von Endothelzellen zur Vasorelaxierung produziert werden. Hierzu zählen EDHFs, von denen Epoxyeicosatriensäuren, Anandamid (der endoge-ne Cannabinoidrezeptorligand) oder einfach nur die abluminale Sekretion von K+ solche Faktoren sein können. Konzeptionell scheint in größeren Gefäßen die Schubspannung der wichtigste Stimulus für die Freisetzung von NO . zu sein, wohingegen die zyklische Dehnung physiologische EDHF-Freisetzung induziert. Neben diesen Relaxationsfaktoren sezernieren Endothelien Kontraktionsfaktoren wie z.B. das Endothelin, Thromboxan A2, Prostaglandin H2 oder Angiotensin II, die in ihrer Regulation gleichfalls bei septischen Patienten gestört sind.

Ein charakteristisches Merkmal für die Sepsis ist die heterogene Verteilung von Vasokonstriktion und Vasodilatation in unterschiedlichen Organen, die in der Summe zu einem Abfall des totalen peripheren Widerstandes mit regionalen Maldistributionen des Blutflusses führt. Endothelabhängige Vasoregulation unter den Bedingungen einer Sepsis ist in weiten Teilen nur in tierexperimentellen Modellen untersucht worden. Bereits 1985 wurde ein endothelabhängiges Versagen der Vasoregulation vermutet [9, 8] und in einem Rattenmodell konnte eine verminderte Noradrenalin-induzierte Vasokonstriktion nach mechanischer Entfernung des Endothels aufgehoben werden [317]. In der Folge war in unterschiedlichen Spezies, einschließlich des Menschen mit unterschiedlichen Sepsismodellen an unterschiedlichen Gefäßen mit unterschiedlichen Stimuli [Seite 78↓]einheitlich ein endothelabhängiges Relaxationsdefizit nachweisbar (Tabelle 15).

Tabelle 15: Endothelabhängige Relaxation ist in Sepsismodellen gestört

Species

Modell

Unters. Gefäß

Stimulus

Referenz

     

Ratte

LPS i.v.

A. mesenterica

ACh↓, Bk↓, SP↓, Hist↓

[8]

Ratte

LPS i.v.

A. mesenterica

Reaktive Hyperämie ↓

[9]

Ratte

LPS

A. pulmonaria

+EC: ET-1 ↓ (COX+ETB-R dep.)

[97]

   

-EC: kein Effekt

 

Ratte

Faeces i.p.

A. coronaria

ADP ↓, SNP erh.

[508]

Ratte

Faeces i.p.

A. mesenterica

Clonidin↓, ADP↓, SNP+Pinacidil erh.

[67]

Ratte

CLP

Aorta

+EC: NE↓, -EC: NE erh.

[317]

Ratte

CLP

Aorta

ACh↓, SNP erh.

[505]

Ratte

CLP

Aorta, A. mesenterica

ACh ↓, NTG erh.

[506]

Ratte

CLP

Aorta

ACh ↓, NTG erh., NOS III↓

[545]

Meer.

LPS i.p.

Aorta, A. coronaria

ACh↓, ADP ↓

[364]

   

SP, A23187, SNP erh.

 

Meer.

LPS i.p.

Aorta

ADP↓, ACh ↓; SNP erh.

[366]

Meer.

LPS i.p.

Aorta

ACh ↓, A23187 erh.

[335]

Meer.

LPS i.p.

Aorta

ACh ↓, ATP erh.

[537]

Hase

Cytomix1

A. carotis

ACh-, SP-, A23187-EDHF↓

[244]

Hase

Cytomix1

A. coronaria

BK-, A23187-EDHF↓

[244]

Schwein

GBS

A. pulmonaria

BK↓

[515]

Schwein

P. aer.

A. pulmonaria

ACh↓, BK erh., SNP erh.

[238]

Schwein

LPS

A. coronaria

BK-EDHF↓

[267]

Schwein

LPS i.v.

A. coronaria

Fluß-induzierte Dilatation ↓

[271]

Hund

LPS i.v.

A. coronaria

ACh ↓, SNP, PGF2α, K+ erh.

[365]

Hund

LPS i.v.

A. fem., ren., mesent.

ACh ↓, SNP, K+ erh.

[524]

Katze

TNF-α

A. carotis

ACh ↓, SNP erh.

[11]

Mensch

LPS i.v.

V. dors. man.

BK ↓, AA ↓, GTN erh.

[44]

Mensch

Cytomix2

V. dors. man.

BK ↓, AA ↓, GTN erh.

[45]

Meer. = Meerschwein; +/-EC = An-, oder Abwesenheit des Endothels; NE = Norepinephrin; AA = Arachidonsäure; Ach = Acetylcholin; ADP = Adenosindiphosphat; P. aer. = P. aeruginosa; Cytomix1 = LPS,TNF-α,Ifn-γ; Cytomix2 = TNF-α, IL-1, IL-6; SP = Substanz P; A23187 = Ca2+-Ionophor; COX = Cycloogygenase; SNP = Nitroprussid; NTG = Nitroglycerin; ET = Endothelin; BK = Bradykinin; EDHF = Endothelium Derived Hyperpolarizing Factor; erh. = erhalten.

Kollektiv scheinen diese Untersuchungen zunächst auf einen gestörten rezeptorabhängigen intraendothelialen Signaltransduktionsprozess hinzuweisen, da in nahezu allen Fällen eine NO . -Donator-induzierte also endothelunabhängige Vasorelaxation erhalten blieb. Wo genau eine solche Signalstörung liegt und ob auch bei Menschen mit dem klinisch komplexen Syndrom einer Sepsis eine solche [Seite 79↓]Signalstörung vorliegt, bleibt weiteren Untersuchungen vorbehalten. Die schubspannungsvermittelte endotheliale NO . -Produktion zur Relaxation, die möglicherweise für physiologische Vorgänge bedeutsamer ist, unterliegt einer noch wenig bekannten Regulation [108]. Ob eine schubspannungsabhängige Dysregulation der eNOS-Phosphorylierung in Sepsismodellen oder in Patienten nachweisbar ist bleibt ebenfalls abzuwarten.

Eine ganze Reihe von tierexperimentellen Untersuchungen sind publiziert worden, die therapeutische Effekte hinsichtlich der endothelialen Funktion aufweisen. Für die endothelabhängige Relaxation scheinen nahezu alle publizierten Ansätze direkt, oder indirekt einen Einfluß auf die Produktion reaktiver Sauerstoff- und Stickstoffderivate zu haben (Tabelle 16).

Tabelle 16: Therapie der endothelialen Vasoregulationsstörung in Sepsismo-dellen

Spezies

Modell

Gefäß

Behandlung

Vermutete Wirkung

Literatur

      

Ratte

LPS

Aorta

NOS II antisense

NOS III ↑

[206]

Ratte

CLP

Aorta

Pentoxifyllin

ROS ↓

[507]

Ratte

CLP

Aorta

Heparin/GM1892

NO .

[324]

Ratte

LPS

Aorta

Tirilazad Mesylat

OH .

[316]

Ratte

LPS

A. mesent.

hSOD, Tirilazad Mesylat

O2- . ↓ /LPO ↓

[433]

Ratte

LPS

Aorta

3-Aminobenzamid

OONO-

[463]

Hase

LPS

Aorta

Perindopril

O2- .

[485]

CLP = Zökale Ligation und Punktion; LPO = Lipidperoxidation; ROS = Reaktive Sauerstoffspezies.


[Seite 80↓]

Um die endotheliale Funktion bei Menschen quantifizieren zu können sind einige Methoden verfügbar. Endothelabhängige Relaxationen nach pharmakologischer Stimulation oder über induzierte Flussänderungen können über hochauflösende sonographische Techniken, oder auch angiographisch quantifiziert werden [89]. Die Datenlage zu definitiven Funktionsmessungen bei Patienten mit einer Sepsis sind extrem dürftig. Die reaktive Hyperämie prüft wahrscheinlich eine endothelabhängige Vasorelaxation, wenn der Gefäßdurchmesser und der Fluß adäquat quantifiziert werden kann. Indirekte Messungen an Menschen unterstützen ein endothelabhängiges Relaxationsdefizit [194, 19, 20]. Darüber hinausgehende Messungen sind beim Menschen nicht bekannt.


[Seite 81↓]

IV.4.6.  Endothelabhängiger Sauerstoffverbrauch in der Sepsis

Frühe Untersuchungen zu globalen Messungen des Sauerstoffangebots und -verbrauchs bei Patienten mit Sepsis führten zu der Vorstellung einer Sauerstoffschuld [430]. Eine Sauerstoffschuld wurde begründet mit der Beobachtung, daß der Sauerstoffverbrauch selbst bei einer supranormalen Erhöhung des Sauerstoffangebotes ansteigt. Patienten mit Sepsis, die in der Lage sind nach unterschiedlichen Behandlungen ihren Sauerstoffverbrauch zu steigern, zeigten in zahlreichen Untersuchungen eine höhere Überlebenswahrscheinlichkeit. Leider konnten nachfolgende Studien, die eine supranormale Erhöhung des globalen Sauerstoffangebotes anstrebten, keine wesentliche Überlebenssteigerung erzielen [49]. Sobald eine schwere Sepsis vorliegt kann man definitionsgemäß auch von Zeichen einer Minderperfusion ausgehen (z.B. Hyperlaktatämie, metabolische Azidose). Dennoch scheint ein Sauerstoffmangel nicht notwendigerweise vorhanden zu sein, denn sowohl in tierexperimentellen Sepsismodellen, als auch in Patienten mit Sepsis können sogar erhöhte Gewebesauerstoffpartialdrücke gemessen werden [432]. Wenn also gleichzeitig normale Sauerstoffpartialdruckwerte und Zeichen einer Minderperfusion vorliegen, scheint ein Defekt der Sauerstoffverwertung vorzuliegen. Für eine solche Störung führte Fink den Begriff der zytopathischen Hypoxie ein [143].

Mit Hilfe ortsauflösender bildgebender Verfahren für Sauerstoff konnte die Arbeitsgruppe um Intaglietta feststellen, daß vor allem präkapillär der meiste Sauerstoff im Mesenterium der Ratte verbraucht wird. Dabei sind Endothelzellen die wahrscheinlichsten Verbraucher [473]. Endothelzellen sind am Sauerstoffverbrauch von Organen beteiligt. Werden Endothelzellen entfernt, so finden sich in Hundeextremitäten eine Reduktion des Sauerstoffverbrauchs um 33% [96].

Die exogene Zugabe von NO . -Donatoren hemmt reversibel unterschiedliche Komplexe der Atmungskette (Cytochrom C, Ubichinon). Endothelzellen regeln wahrscheinlich über die Produktion von NO . damit nicht nur [Seite 82↓]ihren eigenen Sauerstoffverbrauch [86], sondern auch den ganzer Organe [425]. Neuere Arbeiten an Mäusen, denen das e-NOS Gen ausgeschaltet wurde, belegen ebenfalls eine Reduktion des stimulierten Sauerstoffverbrauchs explantierter Herzen um 22% [296].

Die Exposition von isolierten Endothelzellen mit LPS senkt deren Sauerstoffverbrauch. Ebenso sinkt der Sauerstoffverbrauch septischer Mäuseherzen, bei normaler NO . -Produktionsfähigkeit, nicht aber in iNOS-defizienten Mäusen [296]. Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse auf eine NO . induzierte Störung des Sauerstoffverbrauchs hin, der zumindest tierexperimentell von einer iNOS-Induktion abhängt. Für zelluläre Betrachtungen kommen allerdings weitere Möglichkeiten für einen Sauerstoffverbrauchsdefekt in Betracht. Eine Entkopplung der Atmungskette könnte über einen NADH-Mangel oder über eine mitochondriale Schädigung möglich sein. Der NADH-Mangel könnte entweder aufgrund eines Substratmangels (modellhaft beschrieben für die Aufnahme von Glutamin), oder eines erhöhten Verbrauchs möglicherweise über eine aktivierte PARS vorhanden sein. Eine mitochondriale Schädigung könnte aufgrund eines starken nitrosativen oder oxidativen Stresses möglich sein, oder aufgrund einer Öffnung der mitochondrial permeability transition pore (MPTP). Letztlich bleibt aber auch die Möglichkeit einer echten Hypoxie bei Patienten mit Sepsis in Organen, deren Messfähigkeit bisher nicht möglich ist. Mikrovaskuläre Shunts, die unter den Bedingungen einer Sepsis sogenannte schwache, oder vulnerable Perfusionseinheiten aufweisen, können mit entsprechend sensitiven Methoden zumindest tierexperimentell nachgewiesen werden [226].


[Seite 83↓]

IV.4.7.  Endotheliale Toleranz in der Sepsis

Mit der Aktivierung einer inflammatorischen Reaktion werden physiologischerweise parallel Inhibitorsystme eingeschaltet. Für mindestens sechs zytokin-induzierte Aktivierungen ist eine ganze Familie von intrazellulären Signalinhibitoren bekannt [6]. Das Phänomen der sogenannten LPS-Toleranz, eine verminderte oder fehlende Reaktion auf LPS nach vorausgegangener LPS-Exposition, ist lange schon bekannt. Eine geminderte ex-vivo Aktivierungsfähigkeit ist für Lymphozyten, Neutrophile und vor allem für Monozyten septischer Patienten mehrfach nachgewiesen. Die ursprüngliche Vorstellung einer ausschließlichen Hyperinflammation bei septischen Patienten ist falsch und neuere Arbeiten belegen, daß für Patienten mit Infektionen ein Überwiegen antiinflammatorischer Zytokine prognosebestimmend ist [486, 171]. Endogene Schutzsysteme können in Endothelzellen nach subletalem Stress aktiviert werden. Gerade vor diesem Hintergrund mehren sich neueste Untersuchungen, die zeigen, daß nach Exposition mit unterschiedlichen Stressoren eine endotheliale Aktivierbarkeit abnimmt. HUVEC, die nur 5 Minuten 1 mM H2O2 ausgesetzt wurden zeigten nach TNF-α Exposition eine deutlich reduzierte Expression von ICAM-1 und E-Selectin, sowie eine deutliche Reduktion der IL-6 und IL-8 Sekretionskapazität [538]. Die späten zytotoxischen Wirkungen von TNF-α (nach 72 h) in BPAEC konnten nach Vorbehandlung mit Peroxynitrit ebenfalls deutlich gemindert werden [380]. In RBEC, die über 4 h mit TNF-α vorbehandelt werden, kann nach 24 h keine Erhöhung der ICAM-1 Expression induziert werden [166]. Auch LPS, das klassischerweise für Toleranzuntersuchungen benutzt wird, zeigt in HUVEC eine reduzierte E-Selektin-Expression nach Vorbehandlung über 4 h und eine deutliche Reduktion einer granulozytären Haftungsfähigkeit unter statischen und auch dynamischen Bedingungen [303]. Eine durch LPS, TNF-α und auch IL-1 induzierte TF-Expression zeigt nach 24 h eine Refraktärität [61]. Eine Aktivierbarkeit im Sinne einer antiinflammatorischen Präkonditionierung nimmt also auch in Endothelzellen nach Exposition mit unterschiedlichen Mediatoren ab. In Analogie mehren sich experimentelle Untersuchungen zu der enormen Adaptationsfähigkeit von Endothelzellen nach Exposition mit unterschiedlichen Stressoren [378]. Über die Bedeutung dieser Schutzsysteme in vivo existieren bisher nur tierexperimentelle [Seite 84↓]Daten. Intratracheale Injektion lebender P. aeruginosa erzeugt auch in Ratten eine Pneumonie und induziert Mukosaschäden im Gastrointestinaltrakt. Eine Vorbehandlung mit i.p. Injektionen von LPS kann diesen Mukosa-Schaden über eine Reduktion der Interaktion zirkulierender Zellen mit mukosalen Endothelien verhindern [341]. Eine LPS-induzierte endotheliale Hyperpermeabilität kann ebenfalls nach Vorbehandlung mit LPS verhindert werden [150].

Faßt man diese Untersuchungen zusammen, so kann auch für Endothelien des Menschen eine Refraktärphase nach Stressexposition postuliert werden. Für den oft prolongierten Verlauf einer Sepsis bei Menschen sollte ein solcher Zustand also ebenfalls möglich sein.


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12.08.2004