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3.  Ergebnisse und Schlussfolgerungen

3.1. Kontraktile Funktion und biochemische Veränderungen unter aeroben Kontrollbedingungen im hypertrophierten Myokard

Das “Remodeling“ nach Myokardinfarkt beinhaltet die Entwicklung kardialer Hypertrophie (Pfeffer et al., 1992, Zimmer et al, 1990), linksventrikuläre Dilatation und verschiedene biochemische und molekulare Veränderungen, die die kontraktile Funktion des Herzens beeinflussen (Pfeffer & Braunwald, 1990, Laser et al., 1996). Über Veränderungen im Energiestoffwechsel, in antioxidativ wirksamen Schutzsystemen, an Proteinen des kardialen Ca2+ -Zyklus und deren Auswirkungen auf die kontraktile Funktion war zu Beginn meiner eigenen Arbeiten weniger bekannt. Wir untersuchten die kontraktile Funktion in der akuten (nach 15 Stunden) und in der chronischen Phase (6 Wochen) nach Myokardinfarkt (MI). Die Infarkte wurden experimentell an Ratten durch Ligatur der linken Koronararterie induziert; bei scheinoperierten Tieren (SO) erfolgte ein vergleichbarer operativer Eingriff ohne dass die Ligatur um die Koronararterie geschlossen wurde (Stauss et al., 1994). Die Infarktgröße betrug 15 Stunden nach Koronarligatur bei diesem experimentellen Vorgehen ca. 31% der endokardialen Zirkumferenz. Herz- und Körpergewichte waren vergleichbar, da sich die kardiale Hypertrophie langsam entwickelt (Wagner et al., 2001). Kontraktions- und Relaxationsgeschwindigkeit isolierter linksventrikulärer Papillarmuskeln waren in MI höher als bei SO, das Verhältnis von Kontraktions- zu Relaxationsgeschwindigkeit vermindert, d.h. die Relaxation wurde stärker beschleunigt als die Kontraktion. Dieser typische positiv lusitrope Effekt ist durch erhöhte Katecholaminspiegel nach MI zu erklären (Gross et al., 1989). Die Relaxationsgeschwindigkeit wird wesentlich von der Aktivität der Ca2+ -ATPase des sarkoplasmatischen Retikulums (SR) bestimmt (SERCA2). Deren Aktivität steigt bei Phosphorylierung des regulatorischen Proteins Phospholamban über cAMP/ Proteinkinase A (PKA) Signalwege unter Katecholaminwirkung an (MacLennon et al., 1997, Brittsan & Kranias, 2000). cAMP/ PKA Stimulierung steigert außerdem die Expression von Hitzeschockproteinen (HSPs) (Pizurki & Polla, 1994, Osaki et al., 1998). Entsprechend konnten wir im Western Blot eine Erhöhung von HSP25 und HSP72 nachweisen. Diese korrelierte gut mit der Relaxationsgeschwindigkeit des Myokards.

6 Wochen nach Infarktinduktion waren die Herzgewichte in MI im Vergleich zu SO als Ausdruck der kardialen Hypertrophie signifikant erhöht (Wagner et al., 1998). Die Tiere mit Myokardinfarkt wiesen in vivo eine höhere Herzfrequenz und erhöhten linksventrikulären enddiastolischen Druck, verminderte maximale Druckentwicklung sowie geringere Druckanstiegs- und Druckabfallgeschwindigkeiten auf (Theres et al., 2000). Da linksventrikuläre Papillarmuskeln ebenfalls in der chronischen Phase nach Infarkt hypertrophiert waren, konnten sie als repräsentativ für linksventrikuläres Myokard angesehen werden und an ihnen wurde in vitro die kontraktile Funktion gemessen (Wagner et al., 1998). Die maximale isometrische Kraftentwicklung der Papillarmuskeln war in MI und SO vergleichbar, Kontraktions- und Relaxationsgeschwindigkeiten waren in MI vermindert. Das errechnete „Vmax -Äquivalent“, das mit der Geschwindigkeit des [Seite 14↓] Querbrückenzyklus korreliert (Jacob et al., 1976) war in MI als Ausdruck einer Isomyosinverschiebung von der „schnellen“ V1 zur „langsamen“ V3 Untereinheit, die für dieses Hypertrophiemodel beschrieben ist (Mercadier et al., 1981) ebenfalls vermindert. Diese mögliche Isomyosinverschiebung erklärt auch die geringere Kontraktionsgeschwindigkeit in MI. Verlängerte intrazelluläre Ca2+ Transienten, die an Kardiomyozyten nach Infarkt gemessen wurden (Litwin & Morgan, 1992), können die Grundlage für die reduzierte Relaxationsgeschwindigkeit darstellen. Da die Ca2+ Rückbindung im Rattenmyokard hauptsächlich von der Aktivität der SR Ca2+ ATPase abhängt (Bers, 1997), untersuchten wir die SERCA- Aktivität in vitro . Diese war in MI vs. SO möglicherweise durch verminderte SERCA Expression (Zarain-Herzberg et al., 1996) signifikant vermindert. Eine vergleichbare Stimulation der SERCA- Aktivität durch PKA in beiden Gruppen weist auf eine vergleichbare in vivo Phosphorylierung hin. Die verminderte SERCA- Aktivität kann als entscheidender Faktor für die verlangsamte Relaxation in der chronischen Phase nach Myokardinfarkt angesehen werden.

Um die Bedeutung des aktivierten Renin-Angiotensin-Systems für Veränderungen der kontraktilen Funktion nach Myokardinfarkt (Holtz, 1993) zu charakterisieren, führten wir Untersuchungen an Renin-Angiotensinogen transgenen Ratten (TGR) durch. Diese Tiere tragen das komplette humane Angiotensinogen Gen mit 1,6 Kilobasen (kB) 5’-flankierender und 3,5 kB 3’-flankierender Region sowie das komplette humane Renin Gen mit 10 Exons, 9 Introns, 3 kB Promoter Sequenz und 1,2 kB 3’-flankierender Region als Transgen (Bohlender et al., 1997). Gegenüber Kontrolltieren haben TGR eine 7-fach erhöhte Plasma Renin Aktivität (Bohlender et al., 2001), einen massiv erhöhten Blutdruck und entwickeln eine morphometrisch nachgewiesene (Bohlender et al., 1997) Herzhypertrophie, die sich auch in der erhöhten Ratio von linksventrikulärem Gewicht zu Körpergewicht widerspiegelt. Interessanterweise hypertrophiert aber trotz massiv erhöhten Reninspiegeln nur der linke nicht aber der rechte Ventrikel (Wagner et al., 2002). Die an isometrisch kontrahierenden linksventrikulären Papillarmuskeln gemessene Kontraktionsgeschwindigkeit war bei Wildtyptieren und TGR vergleichbar, die Relaxationsgeschwindigkeit aber niedriger. Dies korrespondierte wiederum mit einem verminderten SERCA2 Protein und geringerer Adenylatzyklase. Die im RNase Protektion Assay bestimmte SERCA2 mRNA war allerdings zwischen Kontrolltieren und TGR nicht verschieden. Erhöhung der extrazellulären Ca2+ Konzentration bewirkte in beiden Gruppen eine Zunahme der isometrischen Maximalkraft und der Kontraktionsgeschwindigkeit, die Relaxationsgeschwindigkeit wurde aber nur bei den Kontrolltieren beschleunigt, was ebenfalls auf die Rolle der verminderten SERCA bei TGR hinweist (Bohlender et al., 2001). Außerdem konnten wir bei TGR eine verminderte Ansprechbarkeit des β -adrenergen Rezeptors nachweisen. Stimulation der Papillarmuskelkontraktion mit Isoproterenol bewirkte bei TGR einen signifikant geringeren Anstieg der entwickelten Maximalkraft, sowie der Kontraktions- und Relaxationsgeschwindigkeit. Dieser Defekt ist nicht primär auf den Rezeptor zurückzuführen, da sowohl β1 - als auch β2 -Rezeptoren quantitativ vergleichbar im Western Blot nachweisbar waren. Allerdings konnte gezeigt werden, dass die inhibitorischen G-Proteine Gi α 2 und Gi α 3 verstärkt exprimiert werden, während am [Seite 15↓] stimulatorischen G-Protein Gs α kein Unterschied feststellbar ist. Diese abnorme β -adrenerge Funktion bei TGR stimmt mit den Befunden für verschiedene Formen kardialer Hypertrophie überein (Bristow et al., 1982, Castellano & Böhm, 1997). Eine gestörte Relaxation, die in der chronischen Phase nach Myokardinfarkt im hypertrophierten Herzen auftritt ist auch bei direkter transgener Überexpression von Komponenten des Renin-Angiotensin Systems nachweisbar. Interessanterweise sind auch die Befunde hinsichtlich der SR Ca2+ ATPase vergleichbar. Inwieweit diese beobachteten Veränderungen Folge der Hypertrophieentwicklung oder ein direkter Effekt der Aktivierung des Renin- Angiotensin- Systems sind, lässt sich aus den durchgeführten Untersuchungen nicht feststellen, da auch bei TGR eine signifikante linksventrikuläre Hypertrophie auftritt.

Anlagen zu 3.1.

Bohlender, J., Hildenbrand, U., Wagner, K.D., Günther, J., Hempel, P., Schlegel, W.P., Luft, F.C., Krause, E.G., Bartel, S. Myocardial adrenergic dysfunction in rats with transgenic, human renin-dependent hypertension. J. Hypertens. 19:1453-1463,2001.
Wagner, K.D., Essmann, V., Mydlak, K., Wirth, M., Gmehling, G., Bohlender, J., Stauss, H.M., Günther, J., Schimke, I., Scholz, H. Decreased susceptibility of cardiac function to hypoxia-reoxygenation in renin-angiotensinogen transgenic rats. Am. J. Physiol. Regulatory Integrative Comp. Physiol. 283:R153-R160,2002.
Wagner, K.D., Geil, D., Schimke, I., Stauss, H.M., Lammerich, A., Theres, H., Pfitzer, G., Vetter, R., Günther, J. Decreased susceptibility of contractile function to hypoxia/reoxygenation in chronic infarcted rat hearts. J. Mol. Cell. Cardiol. 30:2341-2353,1998.
Wagner, K.D., Gmehling, G., Günther, J., Stauss, H.M., Mydlak, K., Theres, H., Scholz, H., Schimke, I. Contractile function of rat myocardium is less susceptible to hypoxia/reoxygenation after acute infarction. Mol. Cell. Biochem. 228:49-55, 2001.


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3.2.  Kontraktile Funktion während Hypoxie / Reoxygenierung und assoziierte biochemische Parameter

Da klinische Beobachtungen gezeigt haben, dass das hypertrophierte Myokard einem erhöhten Risiko des Auftretens von Ischämie- und Reperfusionsschäden ausgesetzt ist (Cooley et al., 1972), untersuchten wir, welchen Einfluss Hypoxie und Reoxygenierung als Hauptkomponenten von Ischämie/Reperfusion auf die kontraktile Funktion des Myokards nach Infarkt bzw. bei transgener Aktivierung des Renin- Angiotensin- Systems haben. Als mögliche Ursache einer veränderten kontraktilen Funktion während Hypoxie und Reoxygenierung bestimmten wir die Aktivitäten der antioxidativen Enzyme Glutathionperoxidase (GSH-Px), Superoxiddismutase (SOD), die Expression von Hitzeschockproteinen und Kreatinkinase (CK) – Isoenzyme. Die Aktivität der antioxidativen Enzyme haben wir überprüft, da bekannt ist, dass erhöhte Enzymaktivität mit besserer Ventrikelfunktion während Ischämie / Reperfusion korreliert (Maulik et al., 1995a, Maulik et al., 1995b). GSH-Px knockout Mäuse zeigen dagegen eine stark verminderte kardiale Ischämietoleranz (Yoshida et al., 1997). Überexpression von Hitzeschockproteinen führte zu erhöhter Ischämietoleranz und bewirkte eine Verringerung der Infarktgröße (Marber et al., 1995, Hutter et al., 1996).

Experimentelle Myokardinfarkte wurden wie unter 3.1. beschrieben induziert. 15 h bzw. 6 Wochen nach Infarkt führten wir die Messungen an isometrisch kontrahierenden Papillarmuskeln durch; sofort nach Herzentnahme wurden Ventrikelproben für die biochemischen Messungen in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Nach Messung der kontraktilen Funktion unter aeroben Kontrollbedingungen induzierten wir eine Hypoxie durch Äquilibrierung des Organbades mit N2 (pO2  3 kPa), anschließend erfolgte die Reoxygenierung durch Äquilibrierung mit O2 (pO2  80 kPa). Hypoxie führte 15 h nach MI bzw. in der scheinoperierten Kontrollgruppe (SO) innerhalb von 20 min zu einem Abfall der isometrischen Maximalkraft auf ca. 10% des aeroben Kontrollniveaus (Wagner et al., 2001, Wagner et al., 2002), der wahrscheinlich auf eine verminderte Ca2+ Sensitivität der Myofilamente durch intrazellulären Anstieg anorganischen Phosphats bei der schnellen Spaltung energiereicher Phosphate zurückzuführen ist (Allen & Orchard, 1987). Der Anstieg von (dF/dtmax )/PF weist darauf hin, dass die Kontraktionsgeschwindigkeit weniger hypoxieempfindlich ist als die Maximalkraft-entwicklung. Die Relaxationsgeschwindigkeit zeigte die geringste Hypoxietoleranz. Nach Reoxygenierung erholten sich Kontraktions- und Relaxationsgeschwindigkeit in MI besser als in SO. Diese bessere Erholung korrelierte mit einer erhöhten Aktivität der GSH-Px und einer verstärkten Expression des kleinen Hitzeschockproteins HSP25 nach Infarkt. Die Expression von HSP72 war in den Papillarmuskeln nach Infarkt ca. 3-fach erhöht, die SOD- Aktivität und Isoenzymverteilung weder im rechts- noch im linksventrikulären Myokard verändert. Die verstärkte HSP Expression ist möglicherweise durch lokale Ischämie des Papillarmuskels bei der Infarktentstehung zu erklären (Kilgore et al., 1996, Yu et al., 1999) und kann durch PKA / cAMP abhängige Signalwege vermittelt werden (Pizurki & Polla, 1994, Osaki et a., 1998). Zusammenfassend stellen die verstärkte HSP Expression und die höhere Aktivität der antioxidativ wirksamen GSH-Px wesentliche adaptive Mechanismen für eine erhöhte Toleranz des [Seite 19↓] Myokards gegenüber Hypoxie / Reoxygenierung in der akuten Phase nach Myokardinfarkt dar. Allerdings ist zu berücksichtigen, dass in vivo bei Ischämie und Reperfusion weitere Mediatoren die kontraktile Funktion beeinflussen. So wurde am Rattenherz bei kardialer Hypertrophie eine verstärkte Hypoxie- und verminderte Ischämietoleranz beschrieben (Anderson et al, 1990), während an Humanmyokard simulierte Ischämie (zusätzliche Azidose während Hypoxie) einen protektiven Effekt hatte (Lammerich et al, 1996).

In der chronischen Phase 6 Wochen nach MI ist wie in der akuten Phase die Toleranz der kontraktilen Funktion gegenüber Hypoxie / Reoxygenierung erhöht (Wagner et al, 1998). Die Aktivität der GSH-Px als auch der SOD ist im hypertrophierten Myokard in MI höher als in SO. Zusätzlich zu den Veränderungen in der akuten Phase nach MI war eine reduzierte SR Ca2+ ATPase Aktivität und eine Verschiebung des Kreatinkinase- Isoenzymmusters zu den „fetalen“ Isoenzymen CK-MB und CK-BB, das auch von anderen beschrieben wurde (Laser et al., 1996), nachweisbar. Diese biochemischen Modifikationen hatten charakteristische Auswirkungen auf die kontraktile Funktion während Hypoxie / Reoxygenierung. Im Gegensatz zu SO kam es in MI nach Einsetzen der Hypoxie zu einem initialen Anstieg der isometrischen Kraftentwicklung und während der ersten 10 min Hypoxie zu einem langsameren Kraftabfall. Diese Phänomene können durch die CK-Isoenzymverschiebung erklärt werden. Eine besonders rasche Kreatinphosphatspaltung bewirkt eine milde intrazelluläre Alkalose (Do et al., 1995) und dadurch einen positiv inotropen Effekt (Kentish, 1986). Außerdem ist der Phosphoryltransfer von Kreatinphosphat auf ATP durch den niedrigeren Km -Wert von CK-MB und CK-BB beschleunigt (Younes et al., 1994). Auch der verminderte Beitrag der SR Ca2+ -ATPase zur Ca2+ Homöostase im chronisch infarzierten Herz kann zur erhöhten Hypoxietoleranz beitragen, da die SR Ca2+ -ATPase eine besonders hohe freie Energie der ATP Hydrolyse benötigt (Kammermeier, 1987), die durch das geringere ATP/ADP Verhältnis unter Hypoxie aber reduziert ist (Allen & Orchard, 1987). Der hohe Beitrag der SR Ca2+ -ATPase für die Ca2+ Rückbindung im Rattenmyokard bei SO führt damit unter Hypoxie zu einer schnelleren Störung der Ca2+ Homöostase als in MI. Für die bessere Erholung der kontraktilen Funktion nach Reoxygenierung in MI vs. SO spielt wahrscheinlich wie auch in der akuten Phase nach MI eine geringere Schädigung durch freie Sauerstoffradikale aufgrund der erhöhten antioxidativen Kapazität eine entscheidende Rolle.

Um die Bedeutung des aktivierten Renin- Angiotensin- Systems nach Myokardinfarkt für die veränderte Empfindlichkeit der kontraktilen Funktion gegenüber Hypoxie / Reoxygenierung sowie die assoziierten biochemischen Veränderungen zu charakterisieren, nutzten wir wiederum die Renin- Angiotensinogen transgenen Ratten. Von besonderem Vorteil an diesem Modell ist es, dass die Aktivierung des Renin- Angiotensin- Systems systemisch erfolgt, eine Hypertrophieentwicklung aber nur im linken Ventrikel auftritt. Damit lassen sich Veränderungen der biochemischen Parameter unterscheiden, die in direkter Abhängigkeit des Renin- Angiotensin- Systems auftreten bzw. hypertrophieassoziiert sind. Die maximale isometrische Kraftentwicklung war in TGR unter Hypoxie besser erhalten als in Papillarmuskeln von Kontrolltieren und erholte sich bei Reoxygenierung vollständig. (Wagner et al., 2002). Das traf auch auf Kontraktions- und [Seite 20↓] Relaxationsgeschwindigkeiten zu. Chronische Hemmung des Angiotensin- konvertierenden Enzyms (ACE) an Kontrolltieren (1 mg/kg/die Ramipril für 3 Wochen) hatte eine entgegengesetzte Wirkung auf die kontraktile Funktion während Hypoxie / Reoxygenierung, d.h. isometrische Maximalkraft, Kontraktions- und Relaxationsgeschwindigkeiten erholten sich nach Reoxygenierung signifikant schlechter als bei unbehandelten Kontrolltieren. Akute Angiotensin II Gabe hatte keinen Effekt auf die kontraktile Funktion der isolierten Papillarmuskeln. Verschiebungen des Kreatinkinase- Isoenzymmusters zu den „fetalen“ Isoenzymen waren nur im linksventrikulären Myokard von TGR nachweisbar, was für eine Hypertrophieassoziation spricht. Das gleiche Phänomen war für HSP25 nachweisbar. Eine erhöhte Aktivität der GSH-Px konnte sowohl in links- als auch in rechtsventrikulärem Myokard von TGR nachgewiesen werden. Damit ist eine Induktion durch das Renin- Angiotensin- System wahrscheinlich. Die SOD- Aktivität und die HSP72 Expression waren weder in rechten noch in linken Ventrikeln von TGR signifikant verändert, was für eine komplexere Regulation spricht.

Adaptive Veränderungen, die zu einer erhöhten Toleranz der kontraktilen Funktion gegenüber Hypoxie / Reoxygenierung führen, treten also schon in der akuten Phase nach Myokardinfarkt auf, werden im Verlauf der Hypertrophieentwicklung modifiziert und sind zumindest teilweise auf die Aktivierung des Renin- Angiotensin- Systems zurückzuführen. Für einige biochemische Veränderungen im hypertrophierten Myokard (z.B. SOD Expression) konnte bisher noch kein möglicher Stimulus identifiziert werden.

Anlagen zu 3.2.

Wagner, K.D., Essmann, V., Mydlak, K., Wirth, M., Gmehling, G., Bohlender, J., Stauss, H.M., Günther, J., Schimke, I., Scholz, H. Decreased susceptibility of cardiac function to hypoxia-reoxygenation in renin-angiotensinogen transgenic rats. Am. J. Physiol. Regulatory Integrative Comp. Physiol. 283:R153-R160, 2002. [s. Anlagen zu 3.1]
Wagner, K.D., Geil, D., Schimke, I., Stauss, H.M., Lammerich, A., Theres, H., Pfitzer, G., Vetter, R., Günther, J. Decreased susceptibility of contractile function to hypoxia/reoxygenation in chronic infarcted rat hearts. J. Mol. Cell. Cardiol. 30:2341-2353, 1998. [s. Anlagen zu 3.1]
Wagner, K.D., Gmehling, G., Günther, J., Stauss, H.M., Mydlak, K., Theres, H., Scholz, H., Schimke, I. Contractile function of rat myocardium is less susceptible to hypoxia/reoxygenation after acute infarction. Mol. Cell. Biochem. 228:49-55,2001. [s. Anlagen zu 3.1]


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3.3.  Elektrophysiologische Veränderungen an Kardiomyozyten bei kardialer Hypertrophie

Neben der gestörten Kontraktilität nach Myokardinfarkt treten im hypertrophierten Herzen auch elektrophysiologische Veränderungen auf. Bei verschiedenen Hypertrophiemodellen konnte gezeigt werden, dass Arrhythmien häufiger vorkommen als im normalen Myokard (Pye & Cobbe, 1992, Aronson & Ming, 1993, Hart, 1994). Der exakte Mechanismus, über den es zum verstärkten Auftreten von Arrhythmien im hypertrophierten Myokard kommt, ist bisher unbekannt, mechanisch-induzierte Störungen der elektrophysiologischen Funktion sind aber eine mögliche Erklärung (Lab, 1996, Nazir & Lab, 1996). Der sogenannte mechano-elektrische Feedback Mechanismus (Lab, 1968) kann für das Auftreten von Arrhythmien verantwortlich sein, indem mechanische Veränderungen (z.B. Dehnung oder Dilatation des Myokards) die elektrische Aktivität des Herzens modulieren. Das Auslösen von Rhythmusstörungen über diesen Mechanismus ist sowohl für ventrikuläres (Hansen et al., 1991, Franz, 1996, Lab, 1996) als auch atriales Myokard beschrieben (Nazir & Lab, 1996). Auch im humanen Myokard scheint dem mechano-elektrischen Feedback eine Bedeutung zuzukommen, da z.B. eine enge Korrelation zwischen atrialem Druck und gehäuftem Auftreten von Vorhofflattern besteht (Ravelli et al., 1994). Unter pathophysiologischen Bedingungen ist der mechano-elektrische Feedback Mechanismus möglicherweise empfindlicher. Es wurde gezeigt, dass bei experimentell induziertem Herzversagen die Schwelle zur Auslösung von Kammerflimmern vermindert ist (Pye & Cobbe, 1992). Inwieweit diesem Phänomen eine wirkliche Verstärkung des mechano-elektrischen Feedbacks zugrunde liegt oder ob es auf die größere Inhomogenität (Gallagher et al., 1986, Kramer et al., 1993, Qin et al., 1996) der elektrischen Eigenschaften der Kardiomyozyten im hypertrophierten Herzen zurückzuführen ist, bleibt allerdings fraglich.

Wir untersuchten deshalb, ob die Funktion des mechano-elektrischen Feedback Mechanismus in hypertrophierten Herzen nach Myokardinfarkt verstärkt ist, darüber potentiell arrhythmogene elektrophysiologische Veränderungen ausgelöst werden können und ob diese durch dehnungsaktivierte Ionenkanäle vermittelt sind. Zur Beantwortung dieser Fragestellung kam abermals das oben beschriebene Tiermodell mit experimentell induziertem Myokardinfarkt zum Einsatz. In der chronischen Phase nach Myokardinfarkt wurden Aktionspotentiale in multizellulären Präparaten der Infarktrandzone (Kiseleva et al., 2000), des rechten Vorhofs (Kamkin et al, 2000) und linksventrikulärer Papillarmuskeln (Wagner et al., 2000) gemessen. Die Untersuchung des mechano-elektrischen Feedback Mechanismus erfolgte durch Dehnung der Präparate bei gleichzeitiger fortlaufender Registrierung der Aktionspotentiale an den Präparaten aus der Infarktrandzone des linken Ventrikels und an den rechten Vorhöfen. Eine Blockade von nichtselektiven dehnungsgesteuerten Ionenkanälen ließ sich durch Applikation von Gadolinium (Gd3+ ) erreichen (Ward & White, 1994).

In der chronischen Phase nach Myokardinfarkt ließ sich eine Hypertrophie der linken Ventrikel, der linksventrikulären Papillarmuskeln und auch der rechten Atria nachweisen. Die [Seite 24↓] Ruhemembranpotentiale waren bei rechtsatrialen Kardiomyozyten und Zellen der linksventrikulären Papillarmuskeln nach MI nicht signifikant von der scheinoperierten Kontrollgruppe (SO) verschieden. Das Ruhemembranpotential der ventrikulären Myozyten aus dem Infarktrandbereich war negativer als in der entsprechenden Kontrollgruppe. Bei den verschiedenen Lokalisationen zeigte sich übereinstimmend eine Zunahme der Repolarisationsdauer in MI gegenüber SO, die auf eine beschriebene Reduktion des Kaliumausstroms (Qin et al., 1996) und eine gesteigerte Aktivität des Na+ /Ca2+ -Austauscher (Yoshiyama et al., 1997) nach Myokardinfarkt zurückzuführen ist. Die Frequenz der spontanen Kontraktionen war bei den rechtsatrialen Präparaten in MI im Vergleich zu SO reduziert. Mechanische Dehnung der Präparate hatte in allen Gruppen keinen Einfluss auf das Ruhemembranpotential und die Frequenz der Spontankontraktionen. Bei SO trat bei einer Dehnung der rechten Vorhöfe von 1,75 mN eine Verkürzung der Aktionspotentialdauer bei 50% Repolarisation (APD50) und eine Verlängerung der Aktionspotentialdauer bis zu 90% Repolarisation (APD90) durch das Einsetzen von Nachdepolarisationen auf. Weitere Dehnung führte zur Generierung von Extra-Aktionspotentialen, wenn die dehnungsinduzierten Nachdepolarisationen das Schwellenpotential erreichten. Nach Myokardinfarkt konnten die beschriebenen induzierten Nachdepolarisationen bereits bei einer 10-fach niedrigeren Dehnung der atrialen Präparate als in SO beobachtet werden. Extra-Aktionspotentiale wurden ebenfalls bei signifikant niedrigerer externer Dehnung ausgelöst und führten ausschließlich in MI zum Vorhofflimmern. All diese beschriebenen Effekte waren nach Entdehnung der Präparate reversibel, was eine Myokardschädigung durch Überdehnung ausschließen lässt. Die Unterschiede zwischen MI und SO waren qualitativ auch bei den Präparaten aus dem linksventrikulären Infarktrandbereich nachweisbar. Allerdings war hierbei auffällig, dass ohne zusätzliche externe Dehnung bereits 90% der Präparate in MI kontraktile Spontanaktivität aufwiesen, die in den ventrikulären Präparaten in SO nie zu beobachten war.

Applikation von 40 µM Gd3+ , eine Dosis die üblicherweise zur Unterdrückung von dehnungsinduzierten elektrophysiologischen Veränderungen benutzt wird (Ward & White, 1994, Hu & Sachs, 1997), führte 10 min nach Einbringen in die Perfusionskammer zum vollständigen Verschwinden von dehnungs-induzierten Nachdepolarisationen und Extra-Aktionspotentialen. Damit lässt sich auf eine Beteiligung von dehnungsabhängigen Ionenkanälen an den beobachteten Phänomenen schließen. Allerdings wurde gezeigt, dass Gd3+ an isolierten Kardiomyozyten ebenfalls spannungsabhängige Ca2+ Kanäle blockieren kann (Lacampagne et a., 1994). Dehnungsinduzierte Arrhythmien waren nur durch Gd3+ , nicht aber durch organische Ca2+ Kanal-Blocker zu unterdrücken (Hansen et al., 1991). Unsere Untersuchungen, in denen Gd3+ die dehnungsinduzierten elektrophysiologischen Veränderungen unterdrückte, machen eine Beteiligung von dehnungsaktivierten Ionenkanälen wahrscheinlich, ein Einfluss anderer Ionenkanäle für diese Phänomene ist nicht auszuschließen. Die Befunde werden durch andere Studien gestützt, in denen die Existenz von nichtselektiven dehnungsaktivierten Ionenkanälen an Kardiomyozyten gezeigt werden konnte (Craelius et al., 1988, Bustamante et al., 1991, Hu & [Seite 25↓] Sachs, 1994). In einer neueren Arbeit konnte ein vergrößerter Strom durch nichtselektive dehnungsabhängige Ionenkanäle bei verschiedenen Modellen kardialer Hypertrophie im Vergleich zu unbeeinflussten Kontrolltieren nachgewiesen werden (Kamkin et al., 2000).

Zusammenfassend lässt sich schlussfolgern, dass der mechano- elektrische Feedback Mechanismus im hypertrophierten Myokard verstärkt ist. Er kann zu dem erhöhten Risiko von Arrhythmien nach Myokardinfarkt beitragen und ist möglicherweise über die Aktivierung dehnungsabhängiger Ionenkanäle vermittelt. Der molekulare Mechanismus, über den eine verstärkte Aktivierung von dehnungsabhängigen Ionenkanälen im hypertrophierten Myokard geschieht, ist z. Zt. vollkommen unklar. Denkbar ist eine erhöhte Leitfähigkeit der Kanäle, eine veränderte Krafttransmission zum Kanalprotein oder aber eine verstärkte Kanalexpression. Dies zu untersuchen ist schwierig, da nichtselektive dehnungsabhängige Ionenkanäle bislang noch nicht molekular charakterisiert sind.

Anlagen zu 3.3.

Kamkin, A., Kiseleva, I., Wagner, K.D., Leiterer, K.P:, Theres, H., Scholz, H., Günther, J., Lab, M.J. Mechano-electric feedback in right atrium after left ventricular infarction in rats. J. Mol. Cell. Cardiol. 32:465-477, 2000.
Kiseleva, I., Kamkin, A., Wagner, K.D., Theres, H., Ladhoff, A., Scholz, H., Günther, J., Lab, M.J. Mechanoelectric feedback after left ventricular infarction in rats. Cardiovasc. Res. 45:370-378, 2000.
Wagner, K.D., Kamkin, A., Kiseleva, I., Theres, H., Scholz, H., Günther, J. Effects of metoprolol and ramipril on action potentials after myocardial infarction in rats. Eur. J. Pharmacol. 388:263-266,2000.


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3.4.  Elektrophysiologische Charakteristika kardialer Fibroblasten

Neben den Kardiomyozyten sind in letzter Zeit auch kardiale Fibroblasten als ein mögliches zelluläres Substrat für einen gesteigerten mechano-elektrischen Feedback Mechanismus im hypertrophierten Herz in den Blickpunkt des Interesses gerückt. Fibroblasten sind die zahlreichsten nichtmyozytären Zellen im Herzen. Im Sinusknotenbereich machen sie ca. 70% des Gesamtzellvolumens aus (Shiraishi et al., 1992). Im sogenannten „Remodeling“ bei der Entwicklung kardialer Hypertrophie kommt es zur Proliferation und zur Veränderung des Phänotyps der Fibroblasten (Whittaker, 1995). Während die vielfältige Bedeutung der Fibroblasten für biochemische und strukturelle Adaptation während der Herzentwicklung und im Remodeling gut untersucht ist (Dostal & Baker, 1999, Meszaros et al., 2000), war ihre elektrophysiologische Funktion bis vor einiger Zeit weitgehend unbekannt. Im Gegensatz zu Fibroblasten in anderen Organen (z.B. der Niere, De Roos et al., 1997) sind kardiale Fibroblasten elektrisch nicht erregbar (Kiseleva et al., 1987, Kohl et al., 1994, Kamkin et al., 1999). Sie haben im Vergleich zu Kardiomyozyten ein deutlich positiveres Ruhemembranpotential (E0 ) von -22± 2 mV bei der Ratte (Kamkin et al., 2002) und -16± 2 mV im humanen Gewebe (Kamkin et al., 1999). Der Membranwiderstand ist mit 510± 10 MΩ bei der Ratte und 4.4± 0.1 GΩ bei humanen kardialen Fibroblasten signifikant höher als der von Kardiomyozyten. Mechanische Kompression der Fibroblasten während der Myokardkontraktion führt zu einer typischen phasischen Abnahme von E0 . Diese mechanisch-induzierten Potentiale (MIP’s) unterscheiden sich in ihrer Form deutlich vom Aktionnspotential der Kardiomyozyten (Kiseleva et al., 1998). MIP’s weisen im Gegensatz zu Aktionspotentialen keine schnelle Depolarisation und keinen overshoot auf. Sie beginnen verzögert nach dem Aktionspotential, folgen streng dem Kontraktionsverlauf und sind nur in kontrahierendem Myokard nachweisbar (Kiseleva et al., 1998). Applikation von Gd3+ zur Hemmung nichtselektiver dehnungsabhängiger Ionenkanäle reduziert die MIP Amplitude, was darauf hinweist, dass MIP’s über Aktivierung von mechanosensitiven Kanälen bei Kompression der Fibroblasten während der Myokardkontraktion generiert werden (Kamkin et al., 2002). Dies konnte kürzlich an isolierten kardialen Fibroblasten bestätigt werden (Kamkin et al, 2003).

Die Frage, über welche zellulären Mechanismen Kompression der Fibroblasten zur Aktivierung mechanosensitiver Ionenkanäle führt, war allerdings offen. Eine Möglichkeit ist die Übertragung der mechanischen Energie über Änderungen der Spannung der Lipid-Doppelschicht- Zellmembran (Sachs & Morris, 1998, Zhang et al., 2000). Alternativ ist es möglich, dass die Aktivierung dieser Ionenkanäle durch das Zytoskelett vermittelt wird. Um dies zu untersuchen, injizierten wir an spontan kontrahierenden rechtsatrialen Präparaten intrazellulär in Fibroblasten Cytochalasin D, was F-Aktin depolimerisiert bzw. Colchizin, das Tubulin degradiert. In beiden Fällen kam es zu einer Abnahme der Amplituden der mechanisch induzierten Potentiale, die allerdings auch bei Kombination beider Substanzen nicht vollständig unterdrückt wurden (Kamkin et al., 2001). Das kann darauf beruhen, dass entweder die Depolimerisation des Zytoskeletts durch die Pharmaka nicht vollständig war oder aber dass andere Zytoskelett- unabhängige Mechanismen eine Rolle für die Entstehung der MIP’s spielen. Die verringerte MIP Amplitude durch Cytochalasin D ließ sich [Seite 29↓] durch intrazelluläre Applikation von Mg-ATP aufheben. Von ATP ist bekannt, dass es die Polymerisation von F-Aktin begünstigt (Chhabra et al., 2000). Daraus lässt sich ebenfalls eine wichtige Rolle des Zytoskeletts für die Entstehung der mechanisch induzierten Potentiale schlussfolgern. Ähnliche Befunde zur Bedeutung des Zytoskeletts für die Transduktion mechanischer Energie zum Kanalprotein sind für andere dehnungsaktivierte Ionenkanäle und spannungsgesteuerte Kanäle beschrieben (Galli & DeFelice, 1994, Johnson & Byerly, 1993, Maltsev & Undrovinas, 1997).

Weiterhin untersuchten wir, ob die elektrophysiologischen Eigenschaften kardialer Fibroblasten im hypertrophierten Herzen nach Infarkt verändert sind und sie damit möglicherweise über einen verstärkten mechano- elektrischen Feedback Mechanismus zum gehäuften Vorkommen von Arrhythmien beitragen können. Eine wichtige Komplikation bei Patienten mit Myokardinfarkt ist das Auftreten von Bradyarrhythmien (Brady & Harrigan, 2001). An dieser pathologischen Verminderung der Herzfrequenz im hypertrophierten Myokard nach Infarkt können einerseits strukturelle und funktionelle Schäden der Schrittmacherzellen und des Erregungsleitungssystems (Aronson & Ming, 1993) und andererseits veränderte elektrophysiologische Eigenschaften der kardialen Fibroblasten beteiligt sein.

An rechtsatrialen Präparaten konnten wir zeigen, dass das Ruhemembranpotential der Fibroblasten in Abhängigkeit von der linksventrikulären Infarktgröße hyperpolarisierte (Kiseleva et al., 1998). Artifizielle Dehnung der Präparate führte in allen Versuchsgruppen zu einer Hyperpolarisation des Ruhemembranpotentials der Fibroblasten, die allerdings nach Myokardinfarkt signifikant verstärkt war (Kamkin et al., 2002). Der dehnungsinduzierte Abfall der Ruhemembranpotentiale korrelierte positiv mit der Infarktgröße. Ein Zusammenhang mit der Hypertrophieentwicklung konnte ausgeschlossen werden, da die Hypertrophie im Zeitverlauf nach Myokardinfarkt zunahm, die dehnungsinduzierte Hyperpolarisation des Ruhemembranpotentials aber ein Maximum 8 Tage nach Infarkt hatte und sich darauffolgend normalisierte. Die Hyperpolarisation des Ruhemembranpotentials der Fibroblasten korrelierte gut mit einer verminderten Herzfrequenz der untersuchten Tiere in vivo und einer reduzierten Frequenz der spontanen kontraktilen Aktivität der rechtsatrialen Präparate in vitro (Kamkin et al., 2002). Trotz dieser engen Korrelation lässt sich aus den durchgeführten Untersuchungen nicht ableiten, ob ein kausaler Zusammenhang zwischen der Hyperpolarisation des Ruhemembranpotentials der Fibroblasten und der Bradykardie besteht. Weiterhin ist bisher unklar, in welcher Weise Veränderungen des Membranpotentials der Fibroblasten die Spontanaktivität des Herzens beeinflussen. Falls es nach Myokardinfarkt zu einer effektiveren interzellulären Kopplung zwischen Schrittmacherzellen und Fibroblasten im rechten Vorhof kommt, sollte man eine Abnahme des Membranwiderstands der Fibroblasten erwarten. Diese konnte allerdings in unseren Experimenten nicht beobachtet werden (Kamkin et al., 2002). Frühere morphologische Studien mit Hilfe der Elektronenmikroskopie (De Maziere et al., 1992) konnten keinen Nachweis für die Existenz von gap junctions, die für eine effektive interzelluläre Kopplung zwischen Fibroblasten und Kardiomyozyten notwendig sind (Kohl & Noble, 1996), im Vorhof des Kaninchens darstellen, [Seite 30↓] während eine Kopplung in Zellkulturen von Rattenvorhöfen nachweisbar war (Rook et al., 1992). Kürzlich ließen sich allerdings mit einer Kombination von Immunhistochemie und konfokaler Mikroskopie die gap junction Proteine Connexin (Cx) 40, Cx43 und Cx45 zwischen Fibroblasten und Kardiomyozyten des Kaninchenvorhofs sichtbar machen (Camelliti et al., 2002). Damit ist es wahrscheinlich, dass Fibroblasten und Kardiomyozyten im Sinusknotenbereich tatsächlich über gap junctions elektrisch gekoppelt sind. Die Konstanz des Membranwiderstands der Fibroblasten in unseren Experimenten kann folglich als Hinweis dafür gewertet werden, dass sich nicht die Art bzw. das Ausmaß der Kopplung zwischen beiden Zelltypen ändert, sondern dass die Bradykardie möglicherweise eine direkte Folge der veränderten elektrophysiologischen Eigenschaften individueller Fibroblasten ist.

Anlagen zu 3.4.

Kamkin, A., Kiseleva, I., Wagner, K.D., Pylaev, A., Leiterer, K.P., Theres, H., Scholz, H., Günther, J., Isenberg, G. A possible role for atrial fibroblasts in postinfarction bradycardia. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 282:H842-H849,2002.
Kamkin, A., Kiseleva, I., Wagner, K.D., Scholz, H., Theres, H., Kazanski, V., Lozinsky, I., Günther, J., Isenberg, G. Mechanically induced potentials in rat atrial fibroblasts depend on actin and tubulin polimerisation. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 442:487-497, 2001.
Kiseleva, I., Kamkin, A., Pylaev, A., Kondratjev, D., Leiterer, K.P., Theres, H., Wagner, K.D., Persson, P.B., Günther, J. Electrophysiological properties of mechanosensitive atrial fibroblasts from chronic infarcted rat hearts. J. Mol. Cell. Cardiol. 30:1083-1093, 1998.


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3.5.  Untersuchungen zur Funktion des Wilms’ Tumor Suppressor Genprodukts

Eine wesentliche Herausforderung ist die Identifizierung von Genen, die eine Rolle für die Entwicklung kardialer Hypertrophie spielen. Dabei liegt natürlich ein besonderes Augenmerk auf solchen Genen, von denen eine Bedeutung für das normale Herzwachstum während der Entwicklung bereits bekannt ist. Eines dieser Gene ist das Wilms’ Tumor Suppressor Gen WT1.

WT1 kodiert einen Transkriptionsfaktor vom Zinkfingertyp (Bonetta et al., 1990, Call et al., 1990, Gessler et al., 1990), der eine GC- und TC-reiche DNA-Konsensussequenz bindet (Rauscher et al., 1990, Wang et al., 1993). Durch alternatives Spleißen von Exon 5 (+/- 17 Aminosäuren) und eine Spleißinsertion in Exon 9 (+/- KTS) werden mindestens 4 WT1 Isoformen gebildet (Haber et al., 1991). Die WT1 Spleißvarianten kodieren Proteine von unterschiedlicher DNA Bindungsspezifität und -affinität (Drummond et al., 1994). Weitere WT1 Transkripte resultieren aus einer Edition der primären WT1 mRNA (Sharma et al., 1994).

WT1 spielt eine zentrale Rolle bei der Entwicklung des Herzens, des Urogenitalsystems, der Keimdrüsen, mesothelialer Gewebe (Armstrong et al., 1993) und der Netzhaut (Wagner et al., 2002a). Homozygote Deletion von WT1 verursachte bei der Maus eine schwere Herzhypoplasie, Mesotheldefekte, sowie eine komplette Agenesie von Nieren und Gonaden (Kreidberg et al., 1993) und eine Entwicklungsstörung der Retina (Wagner et al., 2002a). Aufgrund des charakteristischen Expressionsmusters und wegen des Phänotyps der WT1 "Knockout" Mäuse wird dem WT1 Genprodukt eine wesentliche Rolle bei der Differenzierung von Mesenchym in epitheliales Gewebe zugeschrieben (Armstrong et al., 1993, Kreidberg et al., 1993, Pritchard-Jones et al., 1990, Moore et al., 1999). Der kardiale Phänotyp lässt sich ebenfalls in diesem Zusammenhang erklären. WT1 wird während der frühen Embryonalentwicklung im Epikard exprimiert (Moore et al., 1999). Die epikardialen Zellen sind in der Lage, zwischen mesenchymalen und epithelialen Eigenschaften zu wechseln (Moore et al., 1999). Sie lösen sich im Laufe der Embyronalentwicklung teilweise aus dem Epithelverband, wandern ins Myokard ein, und sind dort an der Ausbildung der Koronargefäße beteiligt (Moore et al., 1998, Moore et al., 1999). Unter physiologischen Bedingungen ist WT1 im adulten Herzen nur im Epikard nachweisbar.

Wichtige Informationen über die WT1 Funktion lassen sich aus der Identifizierung von Genen gewinnen, die durch WT1 reguliert werden. Mit Hilfe von Reportergenassays wurde nachgewiesen, dass WT1 u.a. die Promotoren von insulinähnlichem Wachstumsfaktor II (IGF-II) (Drummond et al., 1992), plättchenabgeleitetem Wachstumsfaktor Kette A (PDGF-A) (Gashler et al., 1992) und epidermalem Wachstumsfaktor Rezeptor (EGF-R) (Englert et al., 1995) inhibiert. Aufgrund dieser Befunde wurde spekuliert, dass WT1 das Zellwachstum und die Zellproliferation hemmt und dadurch epitheliale Differenzierung mesenchymaler Gewebe ermöglicht. Neuere Untersuchungen deuten auf einen komplexen Wirkungsmechanismus von WT1 Protein hin. Beispielsweise wurde eine Assoziation von WT1 +KTS Isoformen mit nukleären Spleißfaktoren nachgewiesen (Larsson et al., 1995). Möglicherweise beeinflußt WT1 deshalb neben seiner Funktion als Transkriptionsfaktor auch posttranskriptionelle Mechanismen der Genregulation. Weiterhin wurde [Seite 34↓] kürzlich gezeigt, daß WT1 nicht nur als Genrepressor, sondern auch als Transkriptionsaktivator wirken kann. Beispielsweise induzierte WT1 in Kotransfektionsexperimenten die Promotoren von Forkhead-Gen FREAC-4 (Ernstsson et al., 1996) und Syndecan-1 (Cook et al., 1996). Weiterhin stimuliert WT1 die Expression des Vitamin D Rezeptors (Wagner et al., 2001, Maurer et al., 2001) und vermittelt während der Embryonalentwicklung Vitamin-D-abhängige Apoptose, was zur normalen Nierenentwicklung beiträgt (Wagner et al., 2001). Eine Aktivierung des Pou4f2 Gens durch WT1 (Wagner et al., 2003a) ist für die normale Ausbildung der Retina wesentlich (Wagner et al., 2002a). Auch bei Retinoblastomzellen, die sich von pluripotenten retinalen Vorläuferzellen ableiten, spielt WT1 eine wichtige Rolle für neuronale Differenzierung (Wagner et al., 2000, Wagner et al., 2002b).

Diese Befunde sprechen dafür, dass WT1 für die Entwicklung und Differenzierung verschiedener Gewebe notwendig ist. Am Herzen war bisher nur die Bedeutung von WT1 für die normale Embryonalentwicklung beschrieben.

Da die Entwicklung kardialer Hypertrophie häufig mit der Reaktivierung eines fetalen Genexpressionsmusters verbunden ist, untersuchten wir die WT1 Expression in normalem und hypertrophiertem Myokard.

Die WT1 mRNA Expression bestimmten wir mittels RNase Protektion Assay in unbeeinflusstem Myokard, in rechts- und linksventrikulärem Gewebe nach Scheinoperation (SO) und Myokardinfarkt (MI), in Herzgewebe von spontan hypertensiven Ratten (SHR) und Renin-Angiotensinogen transgenen Tieren (TGR). Die WT1 Expression war innerhalb von 24 Stunden nach Myokardinfarkt im linksventrikulären Gewebe ca. 3-fach gegenüber SO vermehrt und blieb bis zu 9 Wochen nach Infarkt erhöht (Wagner et al., 2002c). In rechtsventrikulärem Gewebe sowie im Myokard von SHR und TGR konnten wir keine veränderte WT1 Expression gegenüber Kontrolltieren nachweisen. Dies sprach gegen die initiale Hypothese, dass eine Re-Expression bei Hypertrophieentwicklung auftritt. Eine Bedeutung des Renin-Angiotensin Systems für die verstärkte WT1 Expression nach MI konnte ebenfalls ausgeschlossen werden, da bei TGR kein Unterschied feststellbar war.

Die Lokalisation der verstärkten WT1 Expression nach MI wurde mittels Immunhistochemie und in-situ Hybridisierung untersucht. WT1 mRNA und Protein waren im Epikard von SO und MI sowie im linken Ventrikel, verstärkt in der Infarktrandzone bei MI nachweisbar. Mittels Immunfluoreszenz-Doppelmarkierungen konnten wir zeigen, dass es sich bei den WT1 exprimierenden Zellen um Endothel- und glatte Muskelzellen der Koronargefäße handelt. Die Lokalisation der WT1 Expression überlappt stark mit der von Proliferations- und Vaskulogenesemarkern wie z.B. dem nukleären Antigen proliferierender Zellen (PCNA), Plättchen- und Endothelzell- Adhäsionsmolekül-1 (PECAM-1) und dem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF). Der entscheidende Stimulus für die WT1 Expression nach Infarkt scheint der O2 -Mangel im Gewebe zu sein, da sich 3- bis 4-fach erhöhte WT1 mRNA auch an Herzen von Ratten nach systemischer normobarer Hypoxie (8% O2 ) bzw. CO Exposition (0,1%) nachweisen ließ. Im Gegensatz zu den Infarkttieren war nach Hypoxie- bzw. CO-Exposition WT1 in den Gefäßen beider Ventrikel nachweisbar, was [Seite 35↓] ebenfalls für die Bedeutung eines lokalen O2 -Mangels für die Induktion von WT1 spricht. Weitergehende Untersuchungen weisen darauf hin, dass die verstärkte WT1 Expression bei O2 -Mangel durch den hypoxie- induzierbaren Transkriptionsfaktor 1α vermittelt wird (Wagner et al., 2003b).

Normobare Hypoxie führte neben dem Herzen auch in der Niere zu einem Anstieg der WT1 mRNA, was wir mittels RNase-Protektions-Assay nachweisen konnten. In anderen Organen mit bekannter WT1 Expression (z.B. Milz und Gehirn) traten keine Unterschiede auf. Wie am Herzen war mittels Immunhistochemie ebenfalls in der Niere eine ektope WT1 Expression (in proximalen Tubuli) nachweisbar. In den Tubuli konnte bei hypoxischen Nieren auch eine verstärkte Expression des hypoxie- induzierbaren Transkriptionsfaktor 1α (HIF-1α ) und des anti-apoptotischen Proteins Bcl-2 gezeigt werden. Über diesen Signalweg kommt es an der Niere zur Verminderung des programmierten Zelltodes, was wir anhand einer geringeren Anzahl TUNEL- positiver Zellen und reduzierter Caspase-3/7- Aktivität demonstrieren konnten. Um zu prüfen, ob die Stimulation der WT1 Expression durch direkte transkriptionelle Aktivierung über HIF-1α erfolgt, führten wir transiente Ko-Transfektionsexperimente durch. Ko-Transfektion von HIF-1α Expressionsplasmid bewirkte eine ca. 20-fache Zunahme der WT1-Promoter-Aktivität. Weiterhin konnten wir im WT1 Promoter ein hypoxie- responsibles Element identifizieren. Gezielte Mutation dieses Elementes führte zu einem vollständigen Verlust der WT1-Induzierbarkeit durch HIF-1α . Mittels Gelelektrophorese-Mobilitäts-Shift-Assay ließ sich die direkte physikalische Bindung von HIF-1α Protein an die Sequenz dieses identifizierten Elementes nachweisen. Die Ergebnisse beweisen, dass WT1 in Herz und Niere durch HIF-1α stimuliert wird. Funktionell ergeben sich in den verschiedenen Organen unterschiedliche Konsequenzen; verstärkte WT1 Expression in der Niere geht mit verminderter Apoptose einher; am Herzen korreliert die WT1 Expression unter Hypoxie und nach Myokardinfarkt mit der von Vaskulogenesemarkern.

Die Befunde lassen vermuten, dass WT1 eine wichtige Rolle für die Ausbildung der Koronargefäße und die Neovaskulogenese unter pathophysiologischen Bedingungen spielt. Die molekularen Mechanismen, über die WT1 möglicherweise bei der Vaskulogenese im Herzen wirkt, sind zur Zeit allerdings noch unklar.

Anlagen zu 3.5.

Wagner, K.D., Wagner, N., Sukhatme, V.P., Scholz, H. Activation of the vitamin D receptor by the Wilms’ tumor gene product mediates apoptosis of renal cells. J. Am. Soc. Nephrol. 12:1188-1196,2001.
Wagner, K.D., Wagner, N., Vidal, V.P.I., Schley, G., Wilhelm, D., Schedl, A., Englert, C., Scholz, H. The Wilms’ tumor gene Wt1 is required for normal development of the retina. EMBO J. 21:1398-1405, 2002.
Wagner, N., Wagner, K.D., Schley, G., Coupland, S., Heimann, H., Grantyn, R., Scholz, H. The Wilms’ tumor suppressor Wt1 is associated with the differentiation of retinoblastoma cells. Cell Growth Diff. 13:297-305,2002.
Wagner, K.D., Wagner, N., Bondke, A., Nafz, B., Flemming, B., Theres, H., Scholz, H. The Wilms’ tumor suppressor Wt1 is expressed in the coronary vasculature after myocardial infarction. FASEB J 16:1117-1119, 2002.
Wagner, K.D., Wagner, N., Wellmann, S., Schley, G., Bondke, A., Theres, H., Scholz, H. Oxygen-regulated expression of the Wilms’ tumor suppressor Wt1 involves hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1 ). FASEB J, 2003, in press.


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19.03.2004