[Seite 6↓]

1.  Einleitung

1.1. Grundlagen der Tumorgentherapie

Die Erkenntnisse zu den molekularen Mechanismen der Tumorentstehung, die Identifizierung von Genen, die ursächlich in das Geschehen der malignen Transformation und des malignen Wachstums involviert sind, machen es erstmals möglich, Angriffspunkte für eine Tumortherapie auf molekularer Ebene zu finden und zu nutzen. Da Tumorerkrankungen eine hohe Inzidenz besitzen, sind sie für die Gentherapie von besonderem Interesse. Die Zahl von 376 Tumorgentherapie-Protokollen, die mehr als 60% aller Gentherapie-Protokolle ausmachen und in denen mehr als 2300 Patienten involviert sind (Stand September 2001), spiegelt die großen Aktivitäten auf dem Gebiet wieder.

Die Gentherapie stellt eine Therapieform dar, die Nukleinsäuren wie DNA oder RNA als pharmakologische Agenzien nutzt. Dabei sind die therapeutischen Strategien entweder auf das Einbringen von Genkonstrukten gerichtet, die für therapeutisch wirksame Proteine/Enzyme kodieren oder die gezielt in die genetische Regulation jener Prozesse eingreifen, die für die z.B. Tumorgenese und Progression verantwortlich sind. Obwohl die Intention der Gentherapie im ursprünglichsten Sinne des Wortes primär die Therapie defekter Gene vor allem bei genetisch bedingten Erbkrankheiten (z.B. Mukoviszidose, Hämophilie) zum Ziel hatte, ist die große Potenz dieser Therapieform für die Behandlung von Tumorerkrankungen schnell erkannt worden (Anderson 1992 ). Hierbei steht besonders die somatische Gentherapie im Vordergrund, bei der therapeutisch aktive Genkonstrukte in Tumorzellen transduziert werden. In der Tumorgentherapie werden hauptsächlich drei Wege beschritten: 1. die Gensubstitution; 2. die additive Geninsertion und 3. die Gensuppression und/oder Antisense-Gentherapie.

Bei der Gensubstitution wird durch das Einbringen der funktionalen Wildtyp-Genkopie der in den Tumorzellen manifeste Gendefekt behoben. In vitro konnte gezeigt werden, dass durch diese Strategie der maligne Phänotyp beeinflussbar ist (Bishop 1991 , Roth et al. 1999 ). Problematisch jedoch ist hierbei die Notwendigkeit, möglichst alle Tumorzellen dieser Gensubstituton zu unterziehen – eine Voraussetzung, die noch immer klinisch schwer realisierbar ist. Derzeit laufen bereits klinische Studien, die z.B. mit Hilfe lokaler Applikation retroviraler oder adenoviraler Vektoren das Wildtyp-p53 Tumorsuppressorgen z.B. in nicht-kleinzellige Lungentumoren einbringen (Roth et al. 1996, Swisher et al. 1997 ). Die bisherigen Ergebnisse zeigen zwar einen erfolgreichen Gentransfer, weisen aber nur partiell antitumorale Wikungen auf.


[Seite 7↓]

Aus diesem Grunde wird noch immer die additive Geninsertion für die Tumorgentherapie favorisiert, bei der Gene in die Tumorzellen transferiert werden, die für therapeutisch wirksame Proteine kodieren. So werden zur Stimulation der antitumoralen Immunantwort Zytokingene (IL-2, IL-12, GM-CSF, IFN-γ , TNF-α ) oder Gene kostimulatorischer Moleküle (z.B. HLA-B7) transferiert. Die Immun-Gentherapie macht derzeit noch immer den größten Anteil bei den entsprechenden klinischen Studien aus, denn in ca. 28% aller Tumorgentherapie-Studien werden kostimulatorische Moleküle und in 33% der Studien Zytokingene transferiert.

Alternativ können im Rahmen der additiven Geninsertion Suizidgene in Tumorzellen gebracht werden, die zur direkten Abtötung der Zellen führen sollen. Derartige Suizidgene kodieren z. B. für virale oder bakterielle Enzyme, die selektiv in den genetisch modifizierten Tumorzellen nichttoxische Prodrugs in toxische, antitumoral aktive Metabolite umwandeln. Besonders intensiv wird die Herpes-Simplex Thymidinkinase und die Cytosindeaminase für diese Suizidgen-Strategien eingesetzt und auch in klinischen Gentherapie-Studien untersucht (Alvarez et al. 1997, Mullen et al. 1992 ). Als vorteilhaft bei der Suizidgentherapie hat sich der sogenannte Bystander-Effekt erwiesen, da durch dieses Phänomen nicht nur unmittelbar Suizidgen-transduzierte Tumorzellen, sondern auch benachbarte nicht-transduzierte Tumorzellen eliminiert werden (Pope et al. 1997 ).

Eine andere Strategie in der Tumorgentherapie verfolgt das Ziel, die fehlerhafte oder inadäquate Expression von Onkogenen in den Tumorzellen auszuschalten. Diese als Gensuppression bezeichnete Vorgehensweise versucht z.B. spezifisch die Transkription der mRNA solcher Gene zu stören oder direkt diese mRNA-Moleküle durch Degradation zu zerstören (Gerwitz et al. 1998, Kijima et al. 1995 ). Noch vor einigen Jahren war diese Strategie im experimentellen Stadium und zeigte ermutigende in vitro-Ergebnisse. Inzwischen aber hat diese Strategie auch die Ebene der klinischen Studien erreicht, da z.B. durch chemische Modifikationen der nur 13 bis 25 Basen langen Oligonukleotide deren Bioverfügbarkeit und Stabilität gegenüber Nukleasen verbessert werden konnte (Luger 2000 ). Klinische Studien, in denen Antisense-Oligonukleotide systemisch z.B. gegen das c-raf-1 Onkogen oder das BCL-2 Protoonkogen eingesetzt werden, zeigen in gewissem Umfang ein Ansprechen der Tumoren bei diesen Patienten (O'Dwyer et al. 1999, Webb et al. 1997 ). Nicht zuletzt deshalb werden für diese Strategie der Gensuppression inzwischen Phase II Studien in Angriff genommen.


[Seite 8↓]

1.2.  Vektoren und regulierbare Genexpression in der Tumorgentherapie

Neben den verschiedenen Strategien des Gentransfers und der stets wachsenden Zahl an therapeutisch aktiven Genen werden parallel große Anstrengungen unternommen, geeignete sichere und effiziente Gentransfersysteme zu entwickeln. Noch immer werden in den meisten Studien hierzu retrovirale Vektoren genetisch modifizierter RNA-Viren (Retroviren) verwendet, nicht zuletzt wegen ihrer hohen Effizienz des Gentransfers und der langen experimentellen Erfahrungen mit diesen Systemen (Walther et al. 2000 ). Jedoch werden die retroviralen Vektoren auch immer mehr von den gleichfalls effizienten Adenovirus-Vektoren und Herpes Virus-Vektoren (modifizierte DNA-Viren) ergänzt. Intensive Bemühungen werden unternommen, um diese Vektoren sicherer zu gestalten. Dazu wird vor allem am Tumor-spezifischen Targeting der Virusinfektion (Design der Virushülle) und der Zelltyp-spezifischen Expression (spezifische Promotoren) der therapeutischen Gene gearbeitet (Nettelbeck et al. 2000 ). Nicht-virale Gentransfer-Systeme, wie z.B. Liposomen, Lipoplexe, die in vivo-Elektroporation (Elektrotransfer), Gene-Gun (Particle Bombardment) oder die in vivo-Jet-Injection gewinnen an Bedeutung und haben für bestimmte gentherapeutische Anwendungen Vorteile gegenüber viralen Vektoren (Niidome, Huang 2002 ) (siehe 3.).

Für eine erfolgreiche Gentherapie ist die Auswahl der therapeutischen Gene und der Vektoren als Expressionsvehikel von essentieller Bedeutung. In zunehmendem Maße werden für Gentherapie-Studien Vektorkonstrukte verwendet, deren Expression über bestimmte Faktoren reguliert werden kann. Hierzu werden induzierbare, konditionelle Promotoren in den Vektorkonstrukten eingesetzt, die u.a. durch Modalitäten der Tumortherapie, wie Chemotherapie, Radiotherapie oder Hyperthermie regulierbar sind. Derartige Systeme einer konditionellen Expression therapeutischer Gene haben den Vorteil, das Genprodukt nach Bedarf in seiner Expression so zu induzieren, dass es für einen bestimmten Zeitraum in therapeutisch relevanten Konzentrationen zur Verfügung steht. Auf diese Weise ist eine direkte Kombination der Wirkungen des induzierenden Agens (Bestrahlung, Zytostatika, Hyperthermie etc.) und dem entsprechenden, zur Expression gelangenden therapeutischen Gen möglich.

Ein Beispiel für Therapie-induzierbare Vektorsysteme bietet die Verwendung des humanen Heat-Shock-Protein-70 (HSP70)-Promotors zur Regulation der Expression der Herpes-Simplex-Virus Thymidinkinase/Cytosindeaminase (HSV-TK/CD) Fusions-Suizidgene in einem adenoviralen Vektorsystem. Es konnte gezeigt werden, dass Hyperthermie die HSP70-Promotor-vermittelte Expression steigert und nach Gabe der Prodrug 5-Fluorocytosin zu einer Steigerung der zytotoxischen Wirkung in PC-3 Prostatakarzinomzellen führt (Blackburn et al. 1998 ). In einem anderen Modell (SKOV-[Seite 9↓] 3) konnte durch Kopplung der Gene p53 oder Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α ) an den HSP70-Promotor ebenfalls die Hyperthermie-induzierte Expression dieser Gene in transfizierten Tumorzellen gezeigt werden (Luna et al. 2000 ). Aktuelle in vivo-Studien, die im adenoviralen Vektor die TNF-α -Expression mit Hilfe des HSP70-Promotors bei einer Hyperthermie regulieren, zeigen beachtenswerte therapeutische Effekte im Maus-Melanommodell (Huang et al. 2000 ).

Ein Beispiel eines weiteren induzierbaren Promotors ist das des Early Growth Response (Egr-1) Gens. Die Expression dieses Gens wird bei Bestrahlung in den betroffenen Zellen stimuliert, wobei ein Strahlen-responsibles Element diese Expressionsregulation vermittelt, das gezielt für die Expression von Fremdgenen, wie z. B. dem TNF-α , in viralen Vektoren eingesetzt worden ist. Es konnte in in vitro- und in vivo-Untersuchungen mit dem Egr-1-Promotor gezeigt werden, dass nach Bestrahlung transfizierter Tumoren die Expression des TNF-α -Gens signifikant gesteigert ist und somit zu einer verbesserten therapeutischen Wirkung von TNF-α im Kontext mit der Bestrahlung führt (Hallahan et al. 1995) .

In das Konzept der Verwendung solcher ”Therapie-induzierbarer” Vektoren in der Tumorgentherapie ordnet sich auch die Nutzung des Promotors des humanen Multidrug-Resistenz-Gen 1 (mdr1) ein. Es ist seit langem bekannt, dass die Expression des mdr1-Gens in Tumorzellen durch MDR-assoziierten Zytostatika, Hitzeschock, Arsenit, UV-Strahlung induzierbar ist und neben anderen regulatorischen Sequenzen auch über Zytostatika- und auch Hyperthermie-responsible Elemente verfügt (Kohno et al. 1989, Chin et al. 1990, Stein et al. 1996, Stein et al. 2001) . Die Analyse definierter Abschnitte des mdr1-Promotors im Chloramphenicol-Azetyltransferase (CAT)-Reporter-Assay ergab, dass MDR-assoziierte Zytostatika (Vincristin, Actinomycin-D, Doxorubicin) und auch Hyperthermie in der Lage sind, die CAT-Expression zu induzieren. Die Verwendbarkeit des mdr1-Promotors für die Zytostatika- oder Hyperthermie-induzierte Expression therapeutisch relevanter Gene ist sowohl in vitro als auch in vivo gezeigt worden (Walther et al. 1997, Walther et al. 2000 ).

1.3. Strategien zum nicht-viralen Gentransfer

In alternativen Ansätzen der Gentherapie wird versucht, die Nachteile vor allem der viralen Transfermethoden zu umgehen, gleichzeitig aber deren Transfereffizienzen zu erreichen. In diesem Zusammenhang gewinnt der Transfer unmodifizierter, also nackter DNA vor allem im Kontext der lokalen Gentherapie an Bedeutung (Mölling 1997, Li et al. 2000) . Der Vorteil dieser Vorgehensweise besteht darin, dass bei der Verwendung nackter DNA keine infektiösen viralen Partikel verwendet werden, somit z.B. keine Immunreaktion auf virale Proteine auftreten kann und nicht die Gefahr der viralen [Seite 10↓] Rekombination besteht. Weiterhin ist der präparative Aufwand zum Transfer nackter DNA weitaus geringer, da z.B. keine spezifischen Verpackungen der DNA (z.B. Helferzellen für virale Verpackung, liposomale Verkapselung) vorgenommen werden müssen.

Für den nicht-viralen Transfer werden neben verschiedenen Varianten des liposomalen Gentransfers vor allem physikalische Technologien zum Einbringen von DNA in das Zielgewebe genutzt. Innerhalb des Vergleichs der Transfermethoden in der Gentherapie machen liposomale Technologien 23%, Gene-Gun und andere physikalische Methoden 9% aller Gentherapie-Protokolle weltweit aus. Zu den physikalischen Technologien zählt das Particle-Bombardment (Gene-Gun), mit dem DNA-beladene Micropartikel verschossen werden, die in vivo-Elektroporation, die Jet-Injection sowie die einfache Nadelinjektion von DNA. Bei allen diesen Methoden wird vorrangig nackte DNA für den Gentransfer in das Zielgewebe verwendet.

Derzeit wird in einer Vielzahl von Studien das Prinzip des Particle-Bombardments verwendet. (Yang et al. 1990). Die kommerzielle Verfügbarkeit solcher Particle-Bombardment Geräte ermöglicht den immer breiteren Einsatz dieser Methodik vor allem für DNA-Vakzinierungs-Strategien (Sun et al. 1998) .

Die in vivo-Elektroporation hingegen nutzt den Effekt der kurzzeitigen Permeabilisierung von Zellmembranen im elektrischen Feld, die den Transfer von Fremd-DNA in das Gewebe ermöglicht (Heller et al. 2000, Aihara et al. 1998, Nishi et al. 1996) . Es konnte gezeigt werden, dass der Transfer nackter DNA in Gewebe mit Hilfe der in vivo-Elektroporation oder dem Particle-Bombardment für die Gentherapie geeignet ist. Mit Hilfe dieser Techniken konnten effektiv u.a. Zytokingene (TNF-α , IL-7, IL-12) in Tumoren appliziert und zur Expression gebracht werden, die dann zu einer Reduktion des Tumorwachstums führten (Rackmilevich et al. 1996) . Selbst die einfache Applikation nackter DNA mittels der Nadelinjektion führt zur Expression des injizierten Gens, ist jedoch nicht für alle Gewebetypen geeignet (Wolff et al. 1997, Zhang et al. 2000) . So ist diese Methode vor allem für die DNA-Immunisierung durch Injektion nackter DNA in das Muskelgewebe angewendet worden. Darüber hinaus wurde die einfache Nadelinjektion auch klinisch für den Gentransfer des Wildtyp-p53 Tumor-Suppressorgens für die Gentherapie von Hepatozellulären-Karzinomen eingesetzt (Habib et al. 1996) .

Eine andere Methode der Transduktion nackter DNA in Gewebe ist die Jet-Injection. Bei dieser Technik wird die DNA-Lösung als hochbeschleunigter Flüssigkeitsstrahl (High-Speed-Jet) unmittelbar in das Zielgewebe appliziert. Es konnte gezeigt werden, dass diese Methode effektiv Gene transferieren kann und für verschiedene Gewebearten anwendbar ist (Furth et al. 1992, Kerr et al. 1996) . Jet-[Seite 11↓] injizierte Gewebe exprimieren das entsprechende Gen bereits 24 - 48 Stunden nach dem Transfer (Furth et al. 1995) . Bisherige Jet-Injection-Geräte konnten zwar für den Gentransfer in vivo eingesetzt werden, hatten jedoch noch konstruktiv bedingte Nachteile, wie z.B. ein zu großes Ejektionsvolumen verbunden mit zu hohen DNA-Verlusten (Vahlsing et al. 1994) . Die Entwicklung neuerer Geräte-Prototypen ermöglicht es, bei gleicher Transfereffizienz geringere Volumina an DNA-Lösungen applizieren zu können und machen diese Technologie somit auch für den klinischen Einsatz im Rahmen der Gentherapie anwendbar.

1.4. Gentherapie im Kontext konventioneller Tumortherapien

Moderne Ansätze in der Gentherapie von malignen Erkrankungen setzen immer mehr auf solche Vektoren, die in ihrem Design den Spezifika der zu behandelnden Tumorerkrankungen Rechnung tragen. Das heißt, es werden für bestimmte Tumorlokalisationen und ihre jeweiligen Behandlungen (Strahlentherapie, Chemotherapie, Hyperthermie) spezifische Vektoren zu Verfügung stehen, deren Ziel die effiziente Kombination der Gentherapie mit der jeweiligen Tumortherapie ist.

Die Stellung der Tumorgentherapie im Gesamtkontext der Behandlung von Tumorpatienten hat sich in den letzten Jahren relativiert, nicht zuletzt durch die Erfahrungen aus bisher durchgeführten Phase I und II Gentherapie-Studien. Dabei zeichnet sich ab, dass die Tumorgentherapie nicht als alleinige Therapieform die gewünschten Ergebnisse erbringen wird, sondern ihr Potential in der Kombination mit konventionellen Therapien, wie der Chemotherapie, Radiotherapie, Hyperthermie oder Immuntherapie entfaltet. Diese Kombinationsstrategie zielt z.B. auf die Verbesserung der Wirksamkeit von Chemo- oder Strahlentherapie durch Transfer pro-apoptotischer und Tumor-sensitivierender Gene, wie p53, bax, bcl-Xs , APO/CD95 aber auch durch Transfer von Suizidgenen ab. Erste Schritte in diese Richtung sind bereits gemacht und es wird z.B. der Transfer des p53 Gens oder auch von Zytokingenen wie dem TNF-α oder IL-2 gezielt für die Chemo- oder auch Radiosensitivierung von Tumoren eingesetzt (Chang et al. 2000, Piche et al. 2001 ). Klinisch ist der p53 Gentransfer für die Sensitivierung von Lungenkarzinom-Patienten für den kombinierte Anwendung von Cisplatin genutzt worden (Roth et al. 1996 ). Parallel dazu konnte basierend auf in vitro- und in vivo-Untersuchungen auch das chemo- und radiosensitivierende Potential des bcl-Xs ,- bax- oder CD95-Gentransfers gezeigt werden. Neben der immunstimulatorischen Wirkung von Zytokinen ist seit einiger Zeit bekannt, dass Kombinationen von Zytokinen mit konventionellen Zytostatika und auch Hyperthermie additive oder synergistische Steigerungen der Antitumoraktivität bewirken können (Lin et al. 1996, Klostergaard et al. 1996 ).


[Seite 12↓]

Diese Daten zeigen, dass die Tumorgentherapie als eine zusätzlich therapeutische Modalität in Ergänzung bereits etablierter Therapien eingesetzt werden kann. Gerade für eine solche Strategie sind konditionelle Vektorsysteme von Interesse, die einerseits durch Chemotherapie, Strahlentherapie oder Hyperthermie regulierbar sind und andererseits Gene exprimieren, die diese Therapien in ihrer Wirksamkeit steigern können. Auf diese Weise gelingt es, die Chemotherapie, Strahlentherapie und Hyperthermie effizienter und möglicherweise ärmer an Nebenwirkungen zu gestalten sowie Therapieresistenzen zu überwinden.

Nach nur etwas mehr als zehn Jahren in der Anwendung der Gentherapie sind wesentliche Erkenntnisse erworben und wichtige Schritte in der Erarbeitung klinisch nutzbarer Konzepte gemacht worden. Es ist sicher zu erwarten, dass die Gentherapie auf dem Wege ist, sich seinen Platz in der modernen Behandlung von Tumorerkrankungen zu sichern.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 3.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
24.05.2004