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8.  Zusammenfassung und Wertung

Die Jet-Injection Technologie für den nicht-viralen in vivo Gentransfer in Tumoren

In den Abschnitten 3.1. – 3.4. wurde die Etablierung der Jet-Injection-Technologie beschrieben, die eine wesentliche Voraussetzung für die lokale nicht-virale Tumorgentherapie darstellt. Vergleichende Analysen verschiedener Jet-Injection-Systeme ermöglichten dabei die gezielte Auswahl und weitere Anwendung des Low-Volume Jet-Injectors. Im Rahmen der Evaluation der Effizienz des Gentransfers mit Hilfe der Jet-Injection wurden die Reportergen-Systeme LacZ und GFP im Lewis-Lung-Karzinom, B16-Melanom der Maus sowie in xenotransplantierten humanen Mammakarzinom-Modell und Kolonkarzinom-Modell in der Nude-Maus getestet. Es wurde gezeigt, dass der Jet-Injector-Prototyp in allen Tumormodellen zur effizienten Expression der Reportergene führt und dass sowohl Eindringtiefen, als auch Verteilung der Jet-Injection optimal für einen effizienten Gentransfer sind. Diese Untersuchungen zeigten darüber hinaus, dass mit Hilfe der Jet-Injection simultan zwei Genkonstrukte effektiv transfiziert und zur Expression gebracht werden können. Dies ermöglicht den einfachen, kombinierten Einsatz verschiedener therapeutischer Gene zur Behandlung von Tumoren. Die in vivo-Untersuchungen ergaben weiterhin, dass die Jet-Injection für den Transfer des TNF-α -Gens erfolgreich eingesetzt werden kann, wobei die Verteilung und die Höhe der Genexpression mit etablierten Gentransfer-Technologien, wie z.B. der in vivo-Lipofektion, vergleichbar ist. Ergänzende Untersuchungen konnten die molekularbiologischen sowie technologischen Rahmenbedingungen für einen reproduzierbaren in vivo-Gentransfer definieren. Aus allen Untersuchungen kann geschlussfolgert werden, dass die Jet-Injection eine sichere und auch effiziente Technologie für den intratumoralen und lokalen Gentransfer unter Verwendung nackter DNA darstellt, die das Potential für eine klinische Anwendung besitzt.

Untersuchungen zum retroviralen und liposomalen Gentransfer von Tumorzellen

Obwohl das vorrangige Ziel der bisher vorgestellten Arbeiten die nicht-virale Tumorgentherapie ist, wurden auch Untersuchungen mit retroviralen und liposomalen Transfersystemen durchgeführt. Dabei fokussierte sich Abschnitt 4.1. auf den liposomalen in vitro- und in vivo-Gentransfer, der auf einem neuartigen Lipoplex basiert. Abschnitt 4.2. jedoch beschäftigt sich vor allem auf den retroviralen Gentransfer des [Seite 33↓] TNF-α -Gens und dessen Einfluss auf intrazelluläre Expressionen spezifischer Gene. Beide Arbeiten können diese komplexen Gebiete der Gentherapie nur streifen, geben aber interessante Auskunft über die Effizienz, Wirkung und die Potenzen dieser Strategien. Bei beiden Systemen besteht der im Vergleich zur Jet-Injection-Techologie wesentlich höhere Aufwand der DNA-Formulierung für den Gentransfer, dem jedoch effiziente Transferraten gegenüberstehen. In diesem Kontext sollen die Abschnitte 4.1. und 4.2. als Ergänzung zu den vorhergehenden Arbeiten dienen, die die sehr unterschiedlichen Bemühungen auf dem Gebiet der Tumorgentherapie wiederspiegeln.

Charakterisierung und Nutzung Therapie-induzierbarer Promotoren für eine konditionelle Tumorgentherapie

Die Abschnitte 5.1. – 5.6. wurden die Arbeiten zur Generierung eines Theapie-induzierbaren Vektorsystems dargestellt, in denen vor allem die Induktionseigenschaften des humanen mdr1 Promotors erstmals gezielt genutzt wurden. Es konnte die Zytostatika-und auch Hitze-Induzierbarkeit der mdr1-Promotor gesteuerten Genexpression in verschiedenen Tumormodellen in vitro und in vivo erfolgreich demonstriert werden, wobei vor allem die Nutzung einer Mutationsvariante des mdr1-Promotors als besonders effiziente Regulationseinheit eingesetzt wurde. Die Zytostatika- und Hitze-Induktion des mdr1-Promotors erwies sich als reproduzierbar zeit- sowie konzentrationsabhängig, so dass die Expression des jeweiligen Fremdgens auf die spezifischen therapeutischen Bedingungen z.B. der Chemotherapie oder Hyperthermie eingestellt werden kann. Die niedrige Basalaktivität und signifikant hohe Induktion des mdr1-Promotors sowohl in vitro als vor allem in vivo weisen das System als einen effizienten konditionellen Regulator aus. Wesentlich für die gentherapeutische Nutzung des mdr1-Promotors sind die Befunde der Induzierbarkeit durch Zytostatika, wie Doxorubicin, Vincristin oder Taxol, die in der Chemotherapie von Tumorerkrankungen breiten Einsatz finden. Dies ist eine essentielle Voraussetzung für das Konzept der kombinierten Applikation von Chemotherapie und konditioneller Tumorgentherapie. Die tierexperimentellen Untersuchungen konnten bestätigen, dass vor allem eine Zytostatika-induzierte Gentherapie im Kontext der Chemotherapie zu einer besseren Tumortherapie beiträgt. Die Kombinations-Experimente im Kontext einer Hyperthermie geben erste Hinweise, dass auch hier die therapeutische Effektivität gesteigert werden kann.

Die Charakterisierung des MVP/LRP-Promotors bietet erste Anhaltspunkte, dass dieses System ebenfalls für die Konstruktion konditioneller Vektoren nutzbar ist und somit die Palette derartiger Regulationseinheiten wertvoll erweitern kann.


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Chemosensitivierung als Strategie für die Gentherapie von Tumoren

Im Rahmen des Konzepts der kombinierten Gen- und Chemotherapie von Tumoren ist in den Arbeiten der Abschnitte 6.1. 6.4. vor allem auf das chemosensitivierende Potential von Zytokinen gesetzt worden. Besonders für TNF-α , IL-2 sowie IFN-γ konnten experimentelle Daten dafür geliefert werden, dass diese Zytokine zu einer Modulation MDR-assoziierter Gene, wie dem mdr1, MVP/LRP und auch MRP1 in der Lage sind. In Bezug auf die Gene mdr1 und MVP/LRP ist die signifikante Reduktion der Expression auf mRNA- und Proteinebene nachgewiesen worden, die nicht nur zur intrazellulären Akkumulation MDR-assoziierter Zytostatika, sondern auch zur Chemosensitivierung in verschiedenen Tumormodellen führt. Diese Befunde bilden eine wichtige Rationale für den Einsatz von Zytokingenen, die im Rahmen der Tumorgentherapie zur Überwindung der MDR eingesetzt werden können. Gentransferexperimente mit TNF-α - und IL-2-exprimierenden Vektoren konnten analog zur Applikation rekombinanter Zytokine die Modulation der Gene mdr1 und MVP/LRP zeigen, die mit der Erhöhung der Sensitivität gegenüber Zytostatika wie Vincristin oder Adriamycin assoziiert ist. Wesentliche Zusammenhänge zwischen dem Niveau der Zytokingen-Expression und dem Ausmaß der Modulation von mdr1 und MVP/LRP konnten klar definiert werden. Die experimentellen Arbeiten zeigen die Möglichkeit auf, mit Hilfe des Transfers von Zytokingenen deren Potential der MDR-Modulation für definierte Tumorentitäten im Rahmen einer Tumorgentherapie zu nutzen.


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24.05.2004