3. Einfluss von Zytokinen verschiedener Zelltypen der Haut auf Differenzierung und Funktionen der Mastzelle

3.1. Wirkung von aus Hautfibroblasten freigesetzten Faktoren

Fibroblasten sind direkte Nachbarzellen der Mastzellen im Bindegewebe. Wechselwirkungen zwischen diesen beiden Zelltypen sind schon seit vielen Jahren bekannt (57). Nachdem zunächst nach Ko-Kulturen von diesen beiden Zelltypen (Mastvorläufer auf Fibroblasten feeder layer) und Kulturen mit Zellüberständen (58, I, III, IV, XII)) eine Mastzelldifferenzierung beschrieben wurde, sind in den letzten Jahren viele Zytokine identifiziert wurden, welche die Reifung der ins Gewebe eingetretenen Vorläuferzelle bewirken bzw. deren Funktion beeinflussen.

Abb. 2: A: Mastzellen und Fibroblasten im dermalen Bindegewebe, B; C: Mastzellen in der Epidermis. Semidünnschnitt einer Biopsie von einem Patienten mit Atopischer Dermatitis (während Mastzellen in Normalhaut fast ausschließlich im dermalen Bindegewebe lokalisiert sind, findet man sie bei einigen Patienten mit Atopischer Dermastitis und Psoriasis auch in der Epidermis: eigene unveröffentliche Ergebnisse)
Färbung mit Alcianblau


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3.1.1.  Stem Cell Factor (SCF)

Als einer der wichtigsten Faktoren für Mastzellen wurde in Kulturüberständen Stem Cell Factor (SCF) identifiziert (II). Er wird außer von Fibroblasten u.a. auch von Hepatozyten, Keratinozyten, Stromazellen, einigen Tumorzellen, Endothelzellen, Langerhanszellen, Melanozyten und Mastzellen selbst produziert (II, VI, XIII). Die biologischen Funktionen des SCF werden über das Protein des c-kit Protoonkogen, einer membrangebundenen Tyrosinkinase mit strukturellen Homologien zu den Rezeptoren von PDGF, CSF-1 und FGF (59, 60) vermittelt. Dieser Rezeptor wird in der Haut nur von Mastzellen und Melanozyten exprimiert, jedoch auch von Epithelzellen, Spermatogonien, CD34+ Knochenmarksstammzellen und verschiedenen Tumorzellen (II).

SCF spielt fast in jeder Phase der Entwicklung und auch in vielen Funktionen der Mastzelle eine Rolle. Je nach Kompartiment in Synergismus mit verschiedenen weiteren Faktoren (61) und je nach Expression der Rezeptoren auf der Zelle, welche wiederum durch das unmittelbare Umfeld der Zelle beEinflusst werden, hat SCF sehr unterschiedliche Wirkungen.

Im Knochenmark finden die frühesten Schritte der Haematopoese statt. Hier bewirkt SCF hauptsächlich eine Proliferation der hämatopoetischen Stammzellen. Als Einzelfaktor sind jedoch nur hohe Dosen biologisch wirksam (5). In Kombination mit koloniestimulierenden Faktoren wie GM-CSF, M-CSF, G-CSF, EPO und Zytokinen wie IL-3, IL-6, IL11 und NGF wird der proliferative Effekt erhöht, nicht jedoch die Reife dieser Stammzellen beeinflusst (62, 63). Darüberhinaus kann SCF reversibel die Expression von CD34+, dem Marker für die hämatopoetischen Stammzellen beeinflussen (64). Aus dem Knochenmark tritt die Zelle in die Zirkulation im peripheren Blut über. Dabei wird die Expression von c-Kit (I) und CD34+ herunterreguliert und Adhäsionsprozesse gefördert (65, 66). Auch diese Prozesse werden von SCF beeinflusst, hier u.a. in Kombination mit dem Stromal-Derived Factor (SDF)1(67).

Im peripheren Blut sind die Mastzellvorläuferzellen c-Kit negativ, so dass hier SCF zunächst auf die Zellen wenig Einfluss hat. Werden in pathologischen Situationen c-Kit stimulierende Faktoren freigesetzt, in entzündlichen Reaktionen z.B. durch bestimmte Lymphozyten-Populationen, kann aus den betroffenen Geweben freigesetzter SCF chemotaktisch auf den Vorläuferzellpool wirken und diese ins


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Gewebe locken. Die Ergebnisse der in vitro Kulturexperimente lassen diesen Ablauf vermuten (I-V). In einer Kultur von hochreinen CD14+ Zellen mit SCF wurde keine Entwicklung in Richtung Mastzelle nachgewiesen.

In dem etablierten Modell der Kultur von Vorläuferzellen aus dem Blut konnte außerdem gezeigt werden, dass eine Kultur dieser Zellen mit SCF allein in serumfreiem Medium kaum eine Hochregulation von c-Kit und gar keine Mastzelldifferenzierung auslösen kann (II). Die Kombination von SCF mit Serum (am besten geeignet Pferdeserum) und Kulturüberständen von Fibroblasten in der Kultur dagegen reguliert die Expression von c-Kit hoch und löst in Folge davon eine Entwicklung der Zellen Richtung Mastzelle aus (I, XII). Dies kann durch eine direkte Wirkung von anderen Zytokinen, welche in Fibroblastenüberständen enthalten sind, ausgelöst werden. Pferdeserum, welches als guter Zellstimulus bekannt ist, kann die in der Kultur enthaltenen Lymphozyten stimulieren, welche dann die Expression des c-Kit-Rezeptors hochregulieren. Auch könnten die Mastzellvorläuferzellen, ebenfalls stimuliert durch die Lymphozyten oder das Serum, autokrin Differenzierungsfaktoren freisetzen.

Die c-Kit positive Mastzellvorläuferzelle kann nun durch das in den Geweben durch verschiedene Zellen (Fibroblasten, Keratinozyten, Endothelzellen) produzierte SCF in das Gewebe gelockt werden (68), was auch in vivo gezeigt werden konnte (69), wobei weitere Chemokinrezeptoren hochreguliert werden (70).

Hier reifen die Zellen aus und verbleiben als residente Zellen im Bindegewebe. Beide Prozesse werden durch SCF beeinflusst (I, 71).

Die Funktionen der Mastzelle im Bindegewebe, wie Freisetzung von Zytokinen und anderen Mastzellmediatoren wie Histamin, werden ebenfalls durch SCF moduliert, je nach Mastzelltyp und Herkunft direkt oder indirekt nach Präinkubation durch Regulation von Rezeptorexpression (II, IX, 72-74). Durch eine Injektion von SCF in Ratten konnte in vivo gezeigt werden, dass eine c-Kit abhängige Aktivierung der Mastzellen erfolgt, welche eine Entzündungsreaktion auslöst. (75).

Auch der letzte Schritt im biologischen Progamm einer Mastzelle, der Zelltod, wird durch SCF reguliert (76). Dabei verhindert SCF Mastzellapoptose. Schon ein kurzzeitiger Entzug von SCF (5-6 Stunden) leitet die Signalkaskade ein, welche im Absterben der Zelle endet (61). Dies hat in der Pathologie verschiedener Hauterkrankungen und auch einigen physiologischen Prozessen eine große Bedeutung. So wurde in unserer Arbeitsgruppe in Patienten mit Urtikaria


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pigmentosa, eine Erkrankung mit stark erhöhten Mastzellzahlen vor allem in der Haut, eine gain-of-function Mutation im c-Kit nachgewiesen (77). Diese bewirkt eine ständige Aktivierung des c-Kit Rezeptors, was über die verschiedenen biologischen Wirkungen von SCF, u.a. Schutz vor Apoptose, zu einer Akkumulation der Mastzellen in der Haut und bei systemischen Erkrankungen auch in anderen Organen führt (77). In der Wundheilung bzw. Narbenbildung (IX) konnte eine erhöhte Expression des SCF-Proteins und, in Abhängigkeit vom Zeitpunkt, auch eine erhöhte Zahl der Mastzellen gezeigt werden.

Es ist zu vermuten, dass SCF auch in anderen mastzellassoziierten Erkrankungen (z.B. in Tumorerkrankungen ,VI) eine Rolle spielt.

3.1.2. Nerve Growth Factor (NGF)

SCF ist jedoch nicht der einzige Faktor, welcher von Fibroblasten freigesetzt wird und auf Mastzellen wirkt. Dies ist ein Ergebnis aus einer Untersuchung, in welcher die HMC-1 Zellinie mit Fibroblastenüberständen kultiviert wurde. Nach 10 Tagen Kultur konnte eine deutliche Entwicklung von Mastzellcharakterisika in den ansonsten sehr unreifen Mastzellen nachgewiesen werden (III). Die Zellinie, welche von einem Patienten mit einer Mastzelleukämie etabliert wurde, hat jedoch, wie bei den Patienten mit Urtikaria pigmentosa nachgewiesen, eine gain-of-function Mutation im c-Kit, so dass nicht SCF die Differenzierung Richtung Mastzelle bewirkt haben kann (79, III). Ähnliche Ergebnisse zeigten auch Kulturen mit Überständen von Keratinozyten (80). Die Untersuchung der biologisch wirksamen Fraktionen (Chromatographische Fraktionierung) von Fibroblastenüberständen nach Kandidaten (III), welche sowohl von Fibroblasten als auch Keratinozyten produziert werden, rückte den Nerve Growth Factor (NGF) in den weiteren Mittelpunkt unserer Untersuchungen. Dieser Faktor erschien auch deshalb interessant, weil er ein Verbindungsglied sein könnte, welches die neurogene Komponente vieler mastzellassoziierter Erkrankungen, wie Atopische Dermatitis und Psoriasis, durch Vermittlung der Interaktionen zwischen Mastzellen und Nervenzellen erklärt (81, 82).

NGF, ursprünglich beschrieben als Überlebens- und Differenzierungsfaktor für Neurone (83), wird außer von verschiedenen Zelltypen des Nervensystems und der Haut (84-87) auch von Mastzellen synthetisiert, gespeichert und nach Stimulation


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freigesetzt (88-90). Es wurde beobachtet, dass Zellkulturüberstände von HMC-1 das Wachstum von sensiblen Ganglien in Kultur stimulieren können und dass dieser Effekt durch einen Antikörper gegen NGF blockiert werden kann (90). NGF könnte somit dafür verantwortlich sein, dass in der Haut von Patienten mit AD als Erkrankung mit stark erhöhten Mastzellzahlen auch eine höhere Dichte von Nervenfasern und eine höhere Zahl von freien Nervenenden nachgewiesen wurde (91).

Zum Einfluss von NGF in Mäusen- bzw. Ratten wurden verschiedene Studien durchgeführt. Dabei konnte gezeigt werden, dass NGF auf die Entwicklung, Überleben und Funktion von Mastzellen wirkt (92-97).

Wir konnten zeigen, dass das NGF auch im humanen System die Differenzierung und Funktion von Mastzellen beeinflusst. Die Expression vom hochaffinen IgE Rezeptor, Trypase, Chymase und Histamin werden hochreguliert. Dies konnte sowohl für die humane Mastzellinie HMC-1 (IV), als auch im in vitro-Kulturmodell mit Zellen aus dem Nabelschnurblut (CBMC) (V) demonstriert werden. Die Expression des hochaffinen NGF Rezeptors TrkA konnte auf allen Vorläuferzellen, HMC-1 und Mastzellen gezeigt werden. Der NGFR p75, welcher hauptsächlich auf Nervenzellen exprimiert ist, konnte in PBMC und Mastzellen, in den anderen Zellen nur sehr schwach auf mRNA-Ebene gezeigt werden (IV, V, 98)

Abb. 3: Immunhistochemische Färbung (APPAP) (I, IX) von PBMC-Zellen (Zytospin, I) unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers gegen TrkA. Zellen isoliert aus dem peripheren Blut eines Normalspenders (A) oder eines Patienten mit Atopischer Dermatitis


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Dieses in vitro Kulturmodell wurde im Vergleich zur Literatur insoweit verändert, als wir wie bei den PBMC nur mit den adhärenten Zellen der mononukleären Fraktion gearbeitet haben. Kultiviert man die gesamte Fraktion, dauert es ca. 8-10 Wochen bis als später Marker Chymase exprimiert wird, in unserem System ist sie nach 5-6 Wochen nachweisbar (V). Parallele Ergebnisse sind im PBMC-Kulturmodell zu beobachten. Auch hier kann man zwar die Gesamtfraktion kultivieren, um die Zellen Richtung Mastzelle zu differenzieren. Dieser Prozess dauert dann aber viel länger. In den adhärenten Fraktionen sind die Vorläuferzellen schon weiter Richtung Mastzelle differenziert.

Im Nabelschnurblut kann man viele noch CD34 und zum Teil c-Kit positive Vorläuferzellen finden (99). Die Zahl dieser Vorläuferzellen ist in der nichtadhärenten Phase höher als in der adhärenten mit den weiter entwickelten dann CD34 negativen Vorläuferzellen.

Interessanterweise fanden sich Unterschiede im Nabelschnurblut von Kindern deren Eltern eine Erkrankung des atopischen Formenkreises haben. Diese positive Familienanamnese erhöt die Wahrscheinlichkeit, dass sie selbst eine atopische Erkrankung bekommen, im Vergleich zu Kindern mit nichtatopischen Eltern (99). Die adhärenten Nabelschnurzellen von Kindern mit atopischer Familienanamnese exprimieren mehr SCF und c-Kit und auch schon den hochaffinen IgE Rezetor, als einen frühen Marker der Differenzierung Richtung Mastzelle (99). Diese Kinder scheinen somit mehr schon weiter entwickelte Mastzellvorläuferzellen im Nabelschnurblut zu haben. Das ist deshalb relevant, weil viele Kinder mit atopischer Diathese schon in den ersten Lebensmonaten an Atopischer Dermatitis erkranken. In späterem Alter bekommen diese Kinder dann oft allergisches Asthma (Kleinkind-Schulkindalter) oder allergische Konjunktivitis (Pubertätsalter). Ist eine hohes Risiko für diese „Karriere“ schon zum Zeitpunkt der Geburt bekannt, können einige protektive Maßnahmen (längeres Stillen, Vermeiden bestimmter Allergene) möglichst intensiv durchgeführt werden.

In unserem in vitro Kulturmodell der Nabelschnurzellen konnten wir zeigen, dass NGF fast mit gleicher Wirkamkeit wie SCF die Differenzierung Richtung Mastzelle initiiert (V). Eine Kombination beider Faktoren beschleunigt diese Prozesse noch. Auch hier konnten, wie bei der Kultur der PBMC oder HMC-1, in einer ganz definierten Reihenfolge die Mastzellcharakteristika nachgewiesen werden: c-Kit, FcεRIα, Tryptase, Chymase (V).


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Diese Ergebnisse zeigen, dass NGF ebenso wie SCF Mastzelldifferenzierung stimulieren kann. Für die Relevanz dieser Ergebnisse sprechen in vivo Untersuchungen. Abb. 4 zeigt eine deutliche Hochregulation von NGF-Rezeptoren in der Haut von Patienten mit einer Atopischen Dermatitis, welche mit stark erhöhten Mastzellzahlen einhergehen (Siehe auch Abb.1) Auch NGF selbst ist bei diesen Patienten hochreguliert (hier nicht gezeigt). P75 (Abb. 4D) ist besonders stark in Nervenfasern exprimiert. Da NGF auch von Mastzellen selber freigesetzt wird (88), könnte NGF ein wichtiger Mittler zwischen Mastzellen und Nerven besonders in chronischen Erkrankungen mit neurogener Komponente sein.

Abb. 4: Immunhistochemische Färbung (APAAP, I, IX) von Schnitten aus Hautbiopsien von Normalpersonen (A, C) und Patienten mit Atopischer Dermatitis (B, D) unter Verwendung von Antikörpern spezifisch für TrkA (A, B) und p75 (C, D).

3.1.3. Granulozyten-Makrophagen Coloniestimulierender Faktor (GM-CSF)

GM-CSF wurde ebenso wie NGF in unseren Fibroblastenüberständen, welche SCF- unabhängige Mastzelldifferenzierung auf HMC-1 Zellen verursachten, nachgewiesen und wird außer von Fibroblasten auch von Keratinozyten produziert. Er wurde deshalb ebenso als Kandidat für die Regulation der Mastzelldifferenzierung in den zur Verfügung stehenden in vitro Modellen untersucht (VIII, 100).


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GM-CSF ist als Proliferations- und Wachstumsfaktor für hämatopoetische Stammzellen und sehr frühe Vorläuferzellen bekannt (101, 102). In etwas reiferen Zellen wurden in der Literatur inhibierende Effekte beschrieben, so im Maussystem auf Zellen aus dem Knochenmark und auf Mastzellen, welche aus Leberstammzellen generiert wurden (103, 104).

Es konnte gezeigt werden, dass GM-CSF in allen Kulturmodellen, unter verschiedenen Kulturbedingungen (Kultur mit Fibroblastenüberständen, SCF oder NGF) dosis- und zeitabhängig die Differenzierung hemmt. Alle untersuchten Mastzellcharakteristika wurden entweder in geringerem Maße herunterreguliert (c-Kit, Histamin, Tryptase) oder die Expression war vollständig unterdrückt (FcεRIα) (VIII, 100). Dieser Effekt wird durch einen neutralisierenden GM-CSF Antikörper aufgehoben. Die Expression des GM-CSF Rezeptor wird mit fortschreitender Differenzierung herunterreguliert und auch der Ligand selber hemmt die Expression (VIII).

Diese Ergebnisse lassen sich jedoch nur begrenzt auf in vivo Verhältnisse anwenden. Bei einer Patientin mit systemischer Urtikaria pigmentosa konnte zwar eine Hemmung der Differenzierung von Mastzellen aus Vorläuferzellen des Knochenmarkes mit GM-CSF in vitro gezeigt werden. Die subkutanen Injektionen von GM-CSF hemmten zunächst (für vier Wochen) auch Symptome wie Juckreiz. Jedoch kam es danach zu einer Leukozytose, welche nach 10 Wochen auch die Zahl von Vorläuferzellen in der Haut ansteigen ließ (105). Diese Zellen exprimierten c-Kit (starker Anstieg der Zahl der c-Kit positiven dermalen Zellen), jedoch nur ein Teil von ihnen Tryptase, und nach Abzug der CD1a-positiven Langerhanszellen noch weniger den FcεRIα.

Dies unterstützt zum einen unsere in vitro-Ergebnisse zum Ablauf der Mastzelldifferenzierung nach einem festgeschriebenen Programm, unabhängig vom Kompartiment in dem sie stattfindet. Andererseits zeigt dies auch, dass die unterschiedlichen Effekte von GM-CSF nicht gleichmäßig gewichtet sind. Der proliferationsfördernde Effekt auf die hämatopoetischen Vorläuferzellen fällt stärker ins Gewicht, als der hemmende auf die Ausdifferenzierung der Zellen. GM-CSF verhindert einerseits die Differenzierung der Zellen in der Haut, dafür nimmt die Zahl der einwandernden unreifen Vorläuferzellen zu. Da auch diese einige funktionell wichtige Mastzellcharakteristika haben (z.B. Expression von Histamin und Zytokinen), kann dies die Symptome der Urtikaria pigmentosa nach einer


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zeitweiligen Verbesserung eher verschlechtern (105). Möglicherweise könnte ein anderes Zeitmanagement oder die Kombination mit anderen Therapeutika trotzdem den Einsatz von GM-CSF in der Behandlung der Mastozytose möglich machen. Der in vivo Einsatz von Zytokinen, welche vielfältige und zum Teil je nach Körperkompartiment gegensätzliche Wirkungen haben, bleibt in jedem Falle schwierig.

3.1.4. Weitere von Fibroblasten produzierte Faktoren

Außer den bisher beschriebenen Faktoren wurden in unseren in vitro Kultursystemen weitere Faktoren getestet, welche sowohl von Fibroblasten, als auch Keratinozyten produziert werden und von denen schon gewisse biologische Effekte auf myeloische Zellen beschrieben wurden (106). Der Einfluss von TGF-ß (Transforming growth factor ß), bFGF (basic Fibroblast growth factor) und PDGF (Platelet derived growth factor) auf die Expression von Mastzellcharakteristika ist getestet worden (IV). Auf HMC-1-Zellen konnten keine signifikanten Effekte auf die untersuchten Marker gezeigt werden, außer eine geringe Hochregulation von FcεRIα-spezifischer mRNA (bisher nicht veröffentlicht), obwohl die Zellen Rezeptoren für alle untersuchten Faktoren exprimieren. Ein Grund dafür könnte z.B. sein, dass Mastzellen selbst in der Lage sind diese Faktoren in größeren Mengen zu produzieren (107). Eine weitere externe Zugabe wird daher kaum biologische Effekte erzielen können. Ansätze mit inaktivierenden Antikörpern oder Antisense-Proben wären für diese Fragestellung sinnvoll. Aus in vivo Daten können jedenfalls Effekte dieser Faktoren auf Mastzellfunktionen in bestimmten Prozessen wie Haarzykluskontrolle und Wundheilung vermutet werden (108, IX).

3.2. Melanozyten als Quelle des Wachtumsfaktors SCF

Der Rezeptor des Mastzellwachstumsfaktors SCF, c-Kit, wird in der Haut außer von Mastzellen nur noch von Melanozyten exprimiert (II). Auch auf Melanozyten, welche in der Basalmembran der Epidermis zu finden sind, hat der SCF vielfältige biologische Wirkungen: Induktion von Proliferation, Differenzierung, Überleben, Integrinexpression, Migration und Synthese des Melanins (II, 109-110).


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Melanozyten, wie Fibroblasten in der Haut sehr eng den Mastzellen benachbart, da diese oft direkt unter der Basalmembran in der Dermis detektiert werden können, sind ebenfalls in der Lage, SCF selbst zu produzieren (VI, 109) und zwar beide Formen von SCF. Lösliches SCF, SCF-1 oder sSCF (soluble SCF), wird freigesetzt durch eine proteolytische Spaltung an der Aminosäure 165 in der Nähe der Transmembrandomäne. Die abgespaltene Form kann dann ihre biologischen Wirkungen auf andere Zellen ausüben. In einer alternativ gespliceten mRNA fehlt die Sequenz des Exons 6. Dieses Exon codiert genau für die Stelle, welche die proteolytische Spaltstelle enthät. SCF kann deshalb nicht abgespalten werden und bleibt membranständig (SCF-2, mSCF) (II, VI, 112). Beide SCF-Formen haben unterschiedliche biologische Wirkungen auf Melanozyten. Während SCF-1 Funktionen in der Migration von Melanozytenvorläuferzellen haben, wirkt SCF-2 auf Differenzierung und Überleben in der Haut (113).

Auch in verschiedenen malignen Melanomen konnten SCF und c-Kit Expressionen gezeigt werden, wobei diese zunächst schwer mit prognostischer Bedeutung vereinbar waren (114). Wir konnten in einer Studie an 11 verschiedenen Melanomzellinien in vitro und an einem Tiermodell zeigen, dass nur Zellen, welche sowohl die Fähigkeit verloren haben SCF-2 als auch c-Kit zu exprimieren, metastasieren (VI). Deshalb ist für SCF eine juxtakrine Funktion vorstellbar.

Juxtakrine Faktoren vermitteln sowohl löslich biologische Effekte und interagieren membranständig mit Nachbarzellen, welche den Rezeptor für diesen Faktor exprimieren. Solange noch einer der Oberflächenproteine (c-Kit oder SCF-2) gebildet wird, kann die Zelle im Melanomverband verbleiben, verliert sie beide, fängt sie an zu metastasieren (VI).

Hier ist auch eine Rolle von Mastzellen, in unmittelbarer Nähe zu Melanozyten lokalisiert, vorstellbar, welche sowohl c-Kit als auch SCF-2 exprimieren (XIII). Auf eine Wirkung des Mastzell-SCF auf Melanozyten deutet auch die verstärkte Pigmentierung in Erkrankungen mit erhöhten Mastzellzahlen, wie Mastozytom und Urtikaria Pigmentosa. Zudem wurde gezeigt, dass die Mastzellzahlen in der Umgebung von Melanomen erhöht sind (115). Für eine funktionelle Bedeutung spricht das Symptom Juckzeiz, eventuell ausgelöst vom durch Mastzellen ausgeschütteten Histamin, welches als Begleiterscheinung bei Melanomen bekannt ist. Die Melanomzellen könnten selbst, solange sie das lösliche SCF-1 freisetzen, an der Erhöhung der Mastzellzahlen in ihrer Umgebung beteiligt sein, welche dann,


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durch Synthese von angiogenen Faktoren wie VEGF (116), Gefäßneubildung im Tumor fördern und damit zur Versorgung des Tumors beitragen können.

Außer dem SCF/c-Kit System gibt es weitere Zytokine, wie z.B. IL-8, welche die biologischen Funktionen von Mastzellen und Melanozyten in Verbindung bringen und in der Pathogenese verschiedener Erkrankungen eine Rolle spielen (117).

3.3. Wechselwirkungen von Keratinozyten und Mastzellen

Nach Fibroblasten und Melanozyten sind epitheliale Zellen einschließlich der in der Haut vorkommenden Keratinozyten die am nächsten liegenden Nachbarn für die Mastzellen. Keratinozyten sind, wie die Fibroblasten, Quelle vieler Zytokine und Wachtumsfaktoren (2, 4). Diese können viele physiologische und pathologische Prozesse autokrin beeinflussen, wie epidermale Differenzierung, Wundheilung und Immunabwehr, aber auch direkt oder indirekt auf benachbarte Zellen wirken. Dabei gibt es oft interessante Unterschiede zwischen den undifferenzierteren Keratinozyten in der Nähe der Basalschicht und den differenzierten Zellen in den oberen Schichten, welche Schlussfolgerungen auf biologische Funktionen erlauben.

Unser besonderes Interesse galt zunächst wieder SCF. Es konnte gezeigt werden, dass auch Keratinozyten SCF exprimieren und freisetzen (VII). Um Unterschiede hinsichtlich des Differenzierungsstadiums untersuchen zu können, wurde eine spontan immortalisierte Zellinie (HaCaT) verwendet, welche noch viele Funkionen normal differenzierender Keratinozyten hat (118). Diese und auch die normalen Keratinozyten exprimieren SCF konstitutiv, die Freisetzung wird jedoch nach Stimulation (Ca-Ionophore) um das 10-fache erhöht. In pathologischen Prozessen, insbesondere bei Entzündung, können diese erhöhten SCF-Konzentrationen die Vorläuferzellen der Mastzellen in die Haut locken, diese sind auch überwiegend unterhalb der Basalschicht oder sogar in direktem Kontakt zu finden. Ein Eindringen in die Epidermis ist nur in sehr seltenen Fällen zu beobachten, wie z.B. bei Atopischer Dermatitis (Abb. 5).


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Abb. 5: Immunhistochemische Färbung (APAAP, I, IX) einer Biopsie von einem Patienten mit Atopischer Dermatitis (epidermale Mastzellen) unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers gegen Mastzelltryptase (V, VIII).

Die Proteine der Basalmembranzone, wie z.B. Kollagen IV, bilden normalerweise eine Barriere, durch welche die Mastzellen nicht eindringen können. Bei der Atopischen Dermatitis scheint dies bei einigen Patienten aufgehoben zu sein, möglicherweise durch die Freisetzung und Wirkung der mastzellspezifischen Proteasen in einer veränderten Zusammensetzung (119). Mastzellen exprimieren neben den Serinproteasen Tryptase, Chymase und Carboxypeptidase auch Matrixmetalloproteasen, welche u.a. Kollagene proteolytisch spalten (119). In der Folge wandern die Mastzellen durch die zerstörte Basalmembran ein. In direktem Kontakt mit den Keratinozyten können sie dann die pathologischen Prozesse weiter beeinflussen und verstärken. Das Einwandern der Mastzellen könnte möglichweise auch durch eine erhöhte Expression der schon erwähnten SCF-Splice-Variante, des membranständigen SCF, gefördert werden, welche in den differenzierteren Zellen höher exprimiert ist und mit den c-Kit-positiven Zellen als Juxtakrin interagieren könnte.

Eine Modulation des SCF könnte somit ein Therapieansatz sein. Wir konnten zeigen, dass Retinoide und Dexamethason in der Lage sind, SCF-Expression und Freisetzung aus Keratinozyten zu hemmen (120). Eine Wirksamkeit von Glukokortikoiden wie Dexamethason in allergisch-entzündlichen Erkrankungen ist schon länger bekannt, jedoch ist über die Mechanismen bisher wenig bekannt. Die Hemmung der SCF-Expression und Freisetzung könnte ein Funktionsmechanismus sein.

Ebenso wie für die Fibroblasten konnte am Modell der SCF-unabhängigen Differenzierung der HMC-1 Zellinie auch für die Keratinozyten gezeigt werden, dass


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sie außer dem SCF weitere Mastzelldifferenzierungsfaktoren produzieren können (80). Die biologische Wirkung von NGF und TGF-ß wurde dabei schon bei aus Fibroblasten freigesetzten Faktoren demonstriert (IV, V).

3.4. Der Einfluss weiterer Zelltypen der Haut auf die Differenzierung und Funktion von Mastzellen

Neben Mastzellen spielen auch Lymphozyten eine wichtige Rolle bei allergischen und entzündlichen Prozessen. Die Wechselwirkungen sind dabei vielfältig (121). Mastzellen produzieren präformiert und nach Stimulation eine große Zahl von Faktoren, welche einerseits chemotaktisch auf Lymphozyten wirken und deshalb ihr Einwandern aus den Kapillaren in die Gewebe beeinflussen, andererseits die Reifung und Funktion beeinflussen. Mastzellen können u.a. TNF-α präformiert exprimieren und nach Stimulation sofort freisetzen (122). Sie produzieren außerdem Interleukine (IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, and IL-16), Monocyte Chemotactic Protein-1 (MCP-1), Macrophage Inflammatory Proteins (MIP-1, MIP-2) und RANTES, welche bei der Aktivierung von T-Zellen eine Rolle spielen. Da auch diese oft präformiert gespeichert sind (wie z. B. IL-6, IL-8, IL-16) (122, 123) können sie im akuten Prozess unmittelbar ausgeschüttet werden und den Entzündungsprozess in Gang bringen. Von Mastzellen freigesetztes TNF-alpha kann die Expression von IL-3, RANTES und Interferon-gamma in Lymphozyten auslösen, IL-6 T-Zell-Proliferation bewirken und IL-4 Differenzierung von T-Zell-Subpopulationen beeinflussen (121, 124).

Lymphozyten sind ihrerseits in der Lage die Akkumulation und Funktion von Mastzellen zu beeinflussen. In den in vitro Mastzelldifferenzierungsmodellen konnte gezeigt werden, dass aufgereinigte Mastzellvorläuferkulturen nicht zu reifen Zellen differenzieren, jedoch Kulturen mit einem Anteil an Lymphozyten (I). Von Lymphozyten freigesetzte Faktoren, vorzugsweise im Zell-Zell-Kontakt (124) mit den Vorläuferzellen, können den zunächst nicht exprimierten c-Kit Rezeptor hochregulieren und damit den Prozess der Differenzierung starten.

Weiterhin können von Lymphozyten freigesetzte Zytokine die Funktionen von Mastzellen beeinflussen. Es konnte gezeigt werden, dass diese Faktoren direkt Mastzelldegranulation auslösen oder verstärken können. Der direkte Zell-Zell-Kontakt durch heterotypische Aggregation von Mastzellen mit aktivierten, nicht aber


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durch nichtaktivierte T-Zellen, über das Adhäsionsmolekülsystem LFA-1/ICAM-1 induziert bzw. verstärkt dabei die IgE-Rezeptorabhängige Degranulation (124).

Mastzellen interagieren im Entzündungsprozess außer mit T- auch mit B-Zellen. Von Mastzellen freigesetztes IL-4 und Mastzellchymase erhöhen die Produktion von IgE aus Plasmazellen (125). Andererseits konnte gezeigt werden, dass IgE die Differenzierung von Mastzellen verstärkt, die Expression des hochaffinen IgE Rezeptors erhöht und die Zellen vor Apoptose schützt (126, 127), was besonders in der Pathogesese von Erkrankungen mit erhöhten IgE-Serumspiegeln, wie der Atopischen Dermatitis oder Psoriasis, von Bedeutung ist.

Ein weiterer Mittler der Wechselwirkungen zwischen Mastzellen und Lymphozyten ist GM-CSF. GM-CSF wird einerseits sowohl von Mastzellen selbst als auch TH1-Lymphozyten produziert und vermittelt andererseits bei beiden Zelltypen über einen spezifischen GM-CSF-Rezeptor verschiedene biologische Effekte (128, 129).

Von Mastzellen freigesetztes GM-CSF kann Lymphozytenvorläuferzellen rekrutieren und ihre Proliferation erhöhen. Auch frühe Mastzellvorläuferzellen im Knochenmark proliferieren unter Einfluss von GM-CSF. Auf spätere Entwicklungsstufen im peripheren Blut und in der Haut hat GM-CSF überwiegend inhibierende Effekte (VIII, 38), die Differenzierung und Mastzellfunktionen werden gehemmt.

GM-CSF wird, wie auch Interferon-Gamma, IL-2 und TNF-alpha von TH1-Zellen freigesetzt, während Th2-Zellen überwiegend IL-4 und IL-5 freisetzen (129-131). TH2-Zellen setzen damit eher mastzellhemmende Faktoren und Th2-Zellen mastzellaktivierende Faktoren frei. Eine Verschiebung des Gleichgewichts der von Th1- und Th2-Lymphozyten freigesetzen Zytokine in Richtung mastzellaktivierender (IL-4) zu Ungunsten mastzellhemmender (GM-CSF, Interferon gamma) Faktoren kann deshalb die Ursache für die Initiierung von atopischen Erkrankungen sein (VIII, 130, 131).

Auch in den frühen Phasen der Wundheilung konnte eine Beteiligung von GM-CSF und seinem Rezeptor parallel zum Anstieg der Zahlen von unreifen Mastzellen gezeigt werden (IX, 78), was für eine Beteiligung der Mastzellen an der Rekrutierung des für die Wundheilung beschriebenen frühen entzündlichen Infiltrates spricht. Für andere mastzellmodulierende Faktoren wie SCF, TGF-ß und NGF wurden Effekte über den gesamten Prozess der Wundheilung demonstriert (IX). Diese können sowohl Mastzellzahlen, als auch Funktionen modulieren.


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Eine wichtige Funktion der Mastzellen in Wechselwirkung mit Endothelzellen im Remodelling in der Wundheilung ist die Förderung von angiogenetischen Prozessen. Mastzellen sind in der Haut vermehrt in der Nähe von Endothelien zu finden (Abb. 6). Sie können angiogenesefördernde Faktoren wie VEGF, bFGF, TGF-ß, TNF-α und IL-8 produzieren (5, 116, 122, 132), Heparin zum Binden an Zelloberflächen und Extrazelluläre Matrix freisetzen, durch Lipidmediatoren mikrovaskuläre Permeabilität induzieren und chemotaktische Wirkstoffe für Angiogenesefaktor-freisetzende Zellen exprimieren. Außerdem ist beschrieben, dass in Kontakt mit Lymphozyten Mastzellen Matrixmetalloproteinasen (u.a. MMP-9) produzieren, welche die Bindegewebsmatrix aufbrechen können und damit die Vorraussetzungen für Neoangiogenese schaffen können (133).

Abb. 6: Immunhistochemische Färbungen (A, C, D – APAAP, I, IX, B Doppelfluoreszenzfärbung mit Cy-2 und Cy-3 und Overlay) von Mastzellen und Endothel. A: Tryptase-positive Mastzellen um Gefäße in der Haut eines Patienten mit Atopischer Dermatitis. B: Endothelmarker CD31(grün) und c-Kit-positive Mastzellen (rot), C: Nachweis von Neoangiogenese durch Färbung CD105 positiver Endothelzellen (Marker für proliferierende Endothelzellen) D: Serienschnitt von C – tryptasepositve Mastzelle in direktem Kontakt mit neugebildeten Endothelien.

In einigen Patienten mit Atopischer Dermatitis konnten neben Mastzellen auch neugebildete Gefäße in direktem Kontakt durch Serienschnitte und Doppelmarkierungen (Abb. 6) gezeigt werden. Hier ist auch von Bedeutung, dass Mastzellen durch die Fähigkeit Matrixmetalloproteinasen zu produzieren in der Lage sind, die Basallamina (Hauptbestandteil Kollagen IV) aufzubrechen und somit


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Neoangiogenese zu ermöglichen. Außer MMP-9 konnten, neben einer Reihe von weiteren MMPs auch MMP-2 in Mastzellen nachgewiesen werden, beides Enzyme, welche Kollagen IV spalten können (Tab.1, Ergebnisse eines Gene Expression Arrays). Eine Stimulation der Mastzellen erhöht die Expression der meisten MMPs (Tab.1, P2 Signal)

Tab. 1: Differential Gene Expression Assay der HMC-1 Mastzellinie (Incyte Genomics and BioCat GmbH, Heidelberg). P1- Zellen unstimuliert, P2 – Zellen stimuliert für 24 h mit PMA, Mittelwert einer Doppelbestimmung, Positives Signal > 2, 0 (Signalintensität der spezifischen mRNA im Verhälnis zur Expression verschiedener Housekeeping Gene)

P1

P2

GeneName

AccessionNum

Locus

16,7

22.3

matrix metalloproteinase 15 (membrane-inserted)

NM_002428

16q13-16q21

11,3

14.3

matrix metalloproteinase 2 (gelatinase A, 72kD gelatinase, 72kD type IV collagenase)

J03210

16q13-q21

10,2

13.7

matrix metalloproteinase 14 (membrane-inserted)

AW628280

14q11-q12

7,0

10.2

matrix metalloproteinase 16 (membrane-inserted)

U79292

8q21

6,2

7.6

matrix metalloproteinase 9 (gelatinase B, 92kD gelatinase, 92kD type IV collagenase)

AX011001

20q11.2-q13.1

5,3

9.2

matrix metalloproteinase 11 (stromelysin 3)

AI189375

22q11.23

4,3

4.8

matrix metalloproteinase 1 (interstitial collagenase)

AK024818

11q22.3

4,2

5.0

matrix metalloproteinase 10 (stromelysin 2)

NM_002425

11q22.3

3,9

4.7

matrix metalloproteinase 23B

AI347985

1p36.3

3,7

4.2

matrix metalloproteinase 19

U38320

12q14

3,3

4.3

matrix metalloproteinase 7 (matrilysin, uterine)

X07819

11q21-q22

2,2

2.5

matrix metalloproteinase 12 (macrophage elastase)

U78045

11q22.2-q22.3

1,9

1.7

matrix metalloproteinase 13 (collagenase 3)

NM_002427

11q22.3

Der Nachweis von CD105 (Endoglin) als Marker für proliferierende Endothelzellen in direktem Kontakt mit Mastzellen (Abb. 6) zeigt die direkte funktionelle Bedeutung von Mastzellen in der Neoangiogenese. Dies ist nicht nur für die Prozesse der Wundheilung und Gewebsregeneration von Bedeutung. Auch in der Umgebung von Tumoren konnten erhöhte Mastzellzahlen nachgewiesen werden (VI, 134, 135).


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3.5.  Wechselwirkungen zwischen Nerven und Mastzellen in der Haut

Es ist seit längerem bekannt, dass einerseits verschiedene Erkrankungen der Haut, welche mit erhöhten Mastzellzahlen einhergehen wie Atopische Dermatitis (AD) oder Psoriasis, auch durch das Nervensystem beeinflusst werden, zum anderen Mastzellen eine Funktion in vielen neuroinflammatorischen Erkrankungen spielen. Mittler dieser Wechselwirkungen könnten neben verschiedenen Neuropeptiden auch Neurotrophine sein, eine Familie strukturell und funktionell verwandter Polypeptide (X, XI, 98).

Neurotrophine (oder neurotrophe Faktoren) umfassen eine Familie strukturell und funktionell verwandter Polypeptide mit bis zu 50 % Aminosäuresequenzhomologie. Sie induzieren Proliferation und neuronale Differenzierung, beeinflussen synaptische Funktionen und regulieren Mechanismen der Apoptose während der verschiedenen Phasen der Entwicklung des zentralen und peripheren Nervensystems (deshalb auch Neuropoietine) (136, 137).

Bekannte Neurotrophine sind NGF (nerve growth factor), BDNF (brain-derived neurotrophic factor), NT-3 (neurotrophin 3), NT-4, NT-5, NT-6, NT-7, CNTF (ciliary neurotrophic factor), GDNF (glia cell line-derived neurotrophic factor) und LIF (leukemia inhibitory factor) = CNDF (cholinergic differentiation factor). BDNF, NGF und NT-3 werden auch als NGF-Familie bezeichnet (138-140). Wachstumsfaktoren wie z.B. EGF (epidermal growth factor), HBNF (heparine-binding neurite-promoting factor), IGF-2 (insuline-like growth factor), a und b FGF (fibroblast growth factor), TGF-ß (transforming growth factor), PDGF (platelet-derived growth factor), NSE (neuron-specific enolase) und Activin A werden nicht primär als Neurotrophine bezeichnet, können aber neben vielen anderen Funktionen auch neurotrophe Wirkungen haben. Antiproliferative Effekte auf Nervenzellen wurden für NAP (neural antiproliferative protein), Astrostatine und GGIF (glia growth inhibitory factor) beschrieben (136).

Viele dieser Faktoren vermitteln ihre biologischen Aktivitäten über eine Tyrosin-spezifische Proteinkinase, welche im trk-gene codiert ist (X, XI, 141). Es wurde zunächst gezeigt, dass die meisten dieser Faktoren in Gliazellen oder Neuronen gebildet werden und ihre Funktionen im zentralen und peripheren Nervensystem in zahlreichen Studien belegt (136). In den letzten Jahren gab es aber vermehrt Hinweise, dass diese Faktoren außer in einigen physiologischen Prozessen, wie z.B:


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dem Haarzyklus (XI), auch in einer Reihe von allergischen, entzündlichen und in Autoimmunreaktionen eine Rolle spielen (137).

Seit längerer Zeit ist bekannt, dass verschiedene Erkrankungen der Haut eine neurogene Komponente haben, wie z. b. die AD, für welche auch, die in früheren Jahren umstrittene, Bezeichnung Neurodermitis verwendet wurde (142). Die AD ist eine chronische, mit starkem Juckreiz verbundene, entzündliche Hauterkrankung mit einer ständig steigenden Prävalenz insbesondere unter Kindern. Veröffentlichungen geben an, dass gegenwärtig mehr als 10 % aller Kinder während ihrer Entwicklung an einer AD erkranken (142). Zur Pathogenese gibt es zahlreiche offene Fragen. Ob die AD primär eine allergen-induzierte oder nur eine chronisch-entzündliche Hauterkrankung ist, kann bis heute nicht klar beantwortet werden.

In zahlreichen Studien konnte gezeigt werden, dass verschiedene Neuropeptide, welche durch sensorische Nerven freigesetzt werden wie substance P (SP), NKA und NKB (neurokinine A und B), CGRP (calcitonin gene-related peptide), VIP (vasoactive intestinal peptide) und SOM (somatostatine), direkt oder indirekt die Funktion von Zellen modulieren können, welche an der Pathogenese dieser Hauterkrankung beteiligt sind wie Keratinozyten, Langerhanszellen, Endothelzellen, infiltrierende Immunzellen und Mastzellen (143, 144).

Eine zentrale Rolle spielen dabei die Mastzellen und das durch die Zellen freigesetzte Histamin, ein biogenes Amin, welches eine Vielzahl von Effekten in allergischen und entzündlichen Prozessen in verschiedenen Zelltypen vermittelt, z.B. Kontraktion (Muskel), vasoaktive Wirkungen (Blutgefäße) und Juckreiz (Nervenzellen) (145). Mastzellen treten vermehrt in der Umgebung dieser Zelltypen auf, besonders in der Nähe von Nervenzellen. Es wurde gezeigt, dass sie einen bedeutenden Beitrag zur Entwicklung, Reifung und Degeneration des Nervensystems leisten (146).

Mastzellen stimulieren z.B. Astrozyten durch Freisetzung von TNF-α, höhere Mengen an zytotoxisch wirkendem NO (Stickstoffmonoxid) zu produzieren und sind somit wahrscheinlich an der Pathogenese chronischer neurodegenerativer bzw. –inflammatorischer Erkrankungen des Nervensystems beteiligt (147). Peritoneale Rattenmastzellen sind in der Lage nach Stimulation mit IgE/anti-IgE Neuronen zu depolarisieren und deren Membranresistenz zu verringern (148). Mastzellspezifische Proteasen wie Tryptase und Chymase können von Nervenzellen gebildete Neuropeptide prozessieren (149).


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Eine sehr wichtige Rolle in den Interaktionen zwischen Mastzellen und Nervenzellen spielt NGF (IV, V, X). Einige seiner biologischen Funktionen sind bereits in Kapitel 3.2.1. beschrieben. Der Überlebens- und Differenzierungsfaktor für Neurone wird außer von verschiedenen Zelltypen des Nervensystems und der Haut auch von den Mastzellen synthetisiert, gespeichert und nach Stimulation freigesetzt (90).

Gezeigt werden konnte aber auch, dass Mastzellen selbst Rezeptoren für Neurotrophine exprimieren. Für peritoneale Rattenmastzellen wurde die Expression von TrkA, aber nicht TrkB und C beschrieben (138), während auf der humanen Mastzellinie HMC-1 und isolierten humanen Lungenmastzellen alle drei Rezeptortypen Trk A, B und C gefunden wurden, jedoch nicht der NGFR p75 (IV, V).

In verschiedenen Maus- bzw. Rattenmodellen, z.B. dem Haarzyklus der Maus, konnte gezeigt werden, dass NGF Entwicklung, Überleben und Funktion von Mastzellen beeinflusst (X). Eine Ko-Kultur von Zellen der Rattenmastzellinie RBL mit sympathischen Neuronen führt zu einer Reifung der Mastzellen (150). Andere Autoren konnten zeigen, dass in NGF-überexprimierenden Mäusen die Mastzellzahlen deutlich erhöht sind (151).

Die potenzielle Rolle des NGF in der Verhinderung von Apoptose (programmierter Zelltod) wird u.a. mit der autokrinen Stimulierung von Überlebensfaktoren wie IL-3, IL-4, IL-10, TNF-α und GM-CSF erklärt (152). In Tiermodellen und klinischen Studien, in denen Neurotrophine wie NGF, BDNF und CNTF als neue Therapeutika für neurodegenerative Erkrankungen getestet wurden, fand man neben verschiedenen anderen Nebenwirkungen auch die Auslösung von Entzündungsprozessen in der Haut (137).

In in-vitro Untersuchungen wurde gezeigt, dass diese Neurotrophine die Histaminfreisetzung aus peritonealen Rattenmastzellen erhöhen (153). Andere Autoren berichten, dass zwar NGF in Ratten einen Einfluss auf Apoptose und Serotoninfreisetzung hat, nicht aber BDNF oder NT-3 (138).

In verschiedenen Studien konnte somit bewiesen werden, dass Mastzell-Nerven-Interaktionen (Neuroimmunologische Achse) sowohl in entzündlichen, immunologischen als auch neurologischen, physiologischen und pathologischen Prozessen von großer Bedeutung sind (IV, V, X, XI, 138, 145, 149). Detaillierte Untersuchungen darüber, welche Faktoren und welche anderen Zelltypen durch indirekte Effekte in diesen cross-talk einbezogen sind, stehen noch aus. Sie sind


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wichtig, um daraus Informationen zur Pathogenese von Hauterkrankungen mit neurogener Komponente wie AD einerseits und neuroinflammatorischer Erkrankungen wie Multipler Sklerose andererseits zu erhalten.


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18.11.2003