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2  Material und Methoden

2.1 Versuch der Induktion eines duktalen Pankreaskarzinoms

In einer Pilot-Studie wurde zunächst untersucht, ob eine Reproduktion des von Pour (186,187) beschriebenen Tiermodells eines chemisch induzierten duktalen Adenokarzinoms des Pankreas anhand der Angaben in der Literatur möglich ist. Hierbei war neben der Histologie auch die Induktionsrate sowie die Letalität nach erfolgter Tumorinduktion von Interesse.

Ferner sollte durch diese Studie evaluiert werden, ob neben den Primärtumoren auch Lebermetastasen eines duktalen Pankreaskarzinoms auftreten, oder ob es sich bei den hepatischen Tumoren möglicherweise um primäre Lebertumore, wie cholangiozellulläre Karzinome, handelt.

2.1.1 Haltung der Tiere

12 acht Wochen alte männliche Syrische Goldhamster (Fa. Charles River, Sulzfeld, Deutschland) wurden unter standardisierten Bedingungen (Raumtemperatur 21+5°C, Luftfeuchtigkeit 70+10%, 10 Luftwechsel pro Stunde, 12h/12h Tag- / Nachtzyklus) in Einzelkäfigen gehalten.

2.1.2 Ernährung

Alle Tiere erhielten eine Futtermischung, in der der Rohfettanteil (Soja-Öl) 3% betrug (ssniff Spezialdiäten GmbH, Deutschland) (Tab.2). Die Tiere hatten Zugang zu Futter und Trinkwasser ad libitum.


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Tab. 2: Zusammensetzung der Diät

Bestandteile

Anteil in %

N-freie Extrakte

44,0

Fett (Soja-Öl)

α-Linolensäure

3,0

0,0

Protein (Soja, Korn)

19,5

H20

14,0

Fasern

7,0

Asche

7,0

Kalzium

1,2

Kalium

1,1

Phosphor

0,8

Magnesium

0,3

Natrium

0,3

Lysin

1,3

Methionin

0,5

2.1.3 Tumorinduktion

Zur Induktion des duktalen Adenokarzinoms des Pankreas wurden den Tieren über einen Zeitraum von 16 Wochen 10mg/kg Körpergewicht N-Nitrosobis-2-oxopropylamin (BOP, Ash Stevens Chemicals Ltd., USA) wöchentlich subkutan interskapulär injiziert. BOP wurde dazu jeweils unmittelbar vor der Anwendung in 0,9%iger Natriumchlorid-Lösung (B. Braun GmbH, Deutschland) im Verhältnis von 3mg pro 1ml gelöst. Alle Injektionen fanden unter einer kurzen Äthernarkose (Hoechst / Marion-Roussel GmbH, Deutschland) statt.

2.1.4 Obduktion

In der 16. Woche nach Versuchsbeginn wurden die Tiere unter einer Narkose mit Ursotamin (Serumwerk Bernburg GmbH, Deutschland) getötet. Das Körpergewicht und die Gewichte von Pankreas und Leber wurden erhoben. Zur Obduktion wurde eine mediane Laparotomie vom Processus xiphoideus bis zum Penisansatz durchgeführt.


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Nach Inspektion aller Bauchorgane wurden Leber und Pankreas entnommen. Die Organe wurden für die histologische Untersuchung in 10%iges gepuffertes Formaldehyd (Sigma Chemicals Ltd., Großbritannien) gegeben.

2.1.5 Histologische Untersuchung

Die bei der Obduktion in Formaldehyd gegebenen Proben wurden nach Umbettung in Metallkassetten (Shandon Ltd., Großbritannien) im Entwässerungsautomaten Histokinette 2000 (Reichert-Jung GmbH, Deutschland) entwässert und anschließend auf der Gießstation TBS 88 (medite AG, Deutschland) mit Paraffin (Merck AG, Deutschland) überschichtet. Die nunmehr in Gewebskapseln (Shandon Ltd., Großbritannien) eingebetteten Paraffinblöcke wurden mit dem Rotationsmikrotom HM 350 (Microm GmbH, Deutschland) geschnitten. Hierbei wurde für das Lebergewebe eine Schnittdicke von 50μm gewählt. Bei Nachweis von Metastasen wurde eine Schichtdicke von 10μm gewählt. Das Pankreasgewebe wurde mit einer Schichtdicke von 5μm geschnitten. Anschließend erfolgte das Aufziehen auf Objektträger (Menzel Gläser KG, Deutschland) im Paraffin-Streckbad TFB 35 (medite AG, Deutschland). Die Objektträger wurden dann bei 75°C für 30min im Brutschrank Modell 200 (Memmert GmbH, Deutschland) getrocknet. Daraufhin wurden die Schnitte unter dem Abzug Hyperclean (Shandon Ltd., Großbritannien) durch zweimaliges jeweils fünfminütiges Xylolbad (Baker, Niederlande) entparaffiniert. Nach Dehydrierung in absteigender Alkoholreihe (Sigma Chemicals Ltd., Großbritannien) und Waschung in Aqua bidest erfolgte die Färbung mit Hämatoxylin und Eosin (Merck AG, Deutschland) in typischer Technik. Nach nochmaliger Waschung in Aqua bidest wurde die abschließende Entparaffinierung in aufsteigender Alkoholreihe (Sigma Chemicals Ltd., Großbritannien) durchgeführt. Nach anschließendem Xylolbad (Baker, Niederlande) wurden die Schnitte mit Kanadabalsam (Merck AG, Deutschland) aufgehellt und die Deckgläser (Menzel Gläser GmbH, Deutschland) plaziert. Die histologische Beurteilung fand mit dem

Lichtmikroskop Kolleg SHB 45 (Eschenbach GmbH, Deutschland) statt.

Die Klassifizierung der tumorverdächtigen Pankreasläsionen folgte den Kriterien nach Meijers et al. (158). In die Berechnung der Induktionsrate wurden nur Tiere eingeschlossen, die ein invasives duktales Adenokarzinom des Pankreas aufwiesen.

Bei Klassifizierung der bei der Obduktion entnommenen Proben aus hepatischen [Seite 37↓]Raumforderungen als Metastasen eines duktalen Adenokarzinoms wurden diese in die Berechnung der Inzidenz von Lebermetastasen und der durchschnittlichen Größe der Lebermetastasen einbezogen. Die Durchführung der histologischen Untersuchungen erfolgte mit Unterstützung von Herrn Prof. Dr. Guski am Institut für Pathologie der Charité Campus Mitte.

2.1.6 Statistik

Die Daten sind als Mittelwert + Standardabweichung dargestellt. Die Daten der unterschiedlichen Gruppen wurden mittels des Kruskal-Wallis-Test für kontinuierliche Daten und mit dem Fisher Test für kategoriale Daten verglichen. Das Signifikanzniveau wurde mit p>0,05 festgelegt.

2.2 Versuch der Steigerung der Lebermetastasierung durch eine Modifikation der enteralen Fettsäurekombination aus α-Linolensäure und Linolsäure beim duktalen Pankreaskarzinom

2.2.1 Haltung der Tiere und Versuchsgruppen

60 acht Wochen alte männliche Syrische Goldhamster (Fa. Harlan-Winkelmann, Deutschland) wurden unter standardisierten Bedingungen (Raumtemperatur 21+5°C, Luftfeuchtigkeit 70+10%, 10 Luftwechsel pro Stunde, 12h/12h Tag- / Nachtzyklus) in Einzelkäfigen gehalten und in 4 Gruppen á 15 Hamster randomisiert:

Tab. 3: Tumorinduktion und Ernährung der Versuchsgruppen 1-4

Gruppe

Tier-Anzahl

Tumorinduktion

Ernährung

1

15

Nein

Standarddiät (SD)

2

15

Ja

Standarddiät (SD)

3

15

Nein

Hochfettdiät (HF)

4

15

Ja

Hochfettdiät (HF)


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2.2.2  Ernährung

Die Tiere der Gr. 1 und 2 erhielten eine Standarddiät (SD), die 1,8% LA und 0,3% ALA (ssniff Soest, Deutschland) enthielt. Die Tiere der Gr. 3 und 4 wurden mit einer Hochfettdiät (HF) bestehend aus 11% LA und 2% ALA (ssniff Soest, Deutschland) ernährt (Tab.4).

Tab. 4: Bestandteile der Standarddiät und Hochfettdiät in %

Bestandteile

Standarddiät [%]

Hochfettdiät [%]

Fett (Soja-Öl)

3,5

21,4

Linolsäure

1,8

11,0

α-Linolensäure

0,3

2,0

Arachidonsäure

0,07

0,4

Palmitinsäure

0,3

2,0

Stearinsäure

0,2

1,0

Ölsäure

0,7

4,4

Protein (Soja, Korn)

20,0

16,5

H20

13,0

12,0

Fasern

8,0

4,9

Asche

6,5

5,7

Kalcium

1,2

1,2

Kalium

1,1

1,1

Phosphor

0,8

0,8

Magnesium

0,3

0,3

Natrium

0,3

0,3

Lysin

1,3

1,3

Methionin

0,5

0,5


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2.2.3  Tumorinduktion

Zur Induktion des duktalen Adenokarzinoms des Pankreas wurden den Tieren der Versuchsgruppen 2 und 4 über einen Zeitraum von 13 Wochen 10mg/kg Körpergewicht N-Nitrosobis-2-oxopropylamin (BOP, Ash Stevens Chemicals Ltd., USA) wöchentlich subkutan interskapulär injiziert. BOP wurde dazu jeweils unmittelbar vor der Anwendung in 0,9%iger Natriumchlorid-Lösung (B. Braun GmbH, Deutschland) im Verhältnis von 3mg pro 1ml gelöst. Alle Injektionen fanden unter einer kurzen Äthernarkose (Hoechst / Marion-Roussel GmbH, Deutschland) statt. Die Tiere der Gr. 1 und 3 erhielten zu den gleichen Zeitpunkten eine subkutane Injektion 0,5ml 0,9% NaCl.

2.2.4 Obduktion

In der 25. Woche nach Versuchsbeginn wurden die Tiere unter einer Narkose mit Ursotamin (Serumwerk Bernburg GmbH, Deutschland) getötet. Das Körpergewicht und die Gewichte von Pankreas und Leber wurden erhoben. Zur Obduktion wurde eine mediane Laparotomie vom Processus xiphoideus bis zum Penisansatz durchgeführt. Nach Inspektion aller Bauchorgane wurden Leber und Pankreas entnommen. Die Organe wurden für die histologische Untersuchung in 10%iges gepuffertes Formaldehyd (Sigma Chemicals Ltd., Großbritannien) gegeben.

2.2.5 Histologische Untersuchungen

Die bei der Obduktion in Formaldehyd gegebenen Proben wurden nach Umbettung in Metallkassetten (Shandon Ltd., Großbritannien) im Entwässerungsautomaten Histokinette 2000 (Reichert-Jung GmbH, Deutschland) entwässert und anschließend auf der Gießstation TBS 88 (medite AG, Deutschland) mit Paraffin (Merck AG, Deutschland) überschichtet. Die nunmehr in Gewebskapseln (Shandon Ltd., Großbritannien) eingebetteten Paraffinblöcke wurden mit dem Rotationsmikrotom HM 350 (Microm GmbH, Deutschland) geschnitten. Hierbei wurde für das Lebergewebe eine Schnittdicke von 50μm gewählt. Bei Nachweis von Metastasen wurde eine Schichtdicke von 10μm gewählt. Das Pankreasgewebe wurde mit einer Schichtdicke von 5μm geschnitten. Anschließend erfolgte das Aufziehen auf Objektträger (Menzel Gläser KG, Deutschland) im Paraffin-Streckbad TFB 35 (medite AG, Deutschland). Die Objektträger wurden dann bei 75°C für 30min im Brutschrank Modell 200 (Memmert [Seite 40↓]GmbH, Deutschland) getrocknet. Daraufhin wurden die Schnitte unter dem Abzug Hyperclean (Shandon Ltd., Großbritannien) durch zweimaliges jeweils fünfminütiges Xylolbad (Baker, Niederlande) entparaffiniert. Nach Dehydrierung in absteigender Alkoholreihe (Sigma Chemicals Ltd., Großbritannien) und Waschung in Aqua bidest erfolgte die Färbung mit Hämatoxylin und Eosin (Merck AG, Deutschland) in typischer Technik. Nach nochmaliger Waschung in Aqua bidest wurde die abschließende Entparaffinierung in aufsteigender Alkoholreihe (Sigma Chemicals Ltd., Großbritannien) durchgeführt. Nach anschließendem Xylolbad (Baker, Niederlande) wurden die Schnitte mit Kanadabalsam (Merck AG, Deutschland) aufgehellt und die Deckgläser (Menzel Gläser GmbH, Deutschland) plaziert. Die histologische Beurteilung fand mit dem Lichtmikroskop Kolleg SHB 45 (Eschenbach GmbH, Deutschland) statt.

Die Klassifizierung der tumorverdächtigen Pankreasläsionen folgte den Kriterien nach Meijers et al. (158). In die Berechnung der Induktionsrate wurden nur Tiere eingeschlossen, die ein invasives duktales Adenokarzinom des Pankreas aufwiesen.

Bei Klassifizierung der bei der Obduktion entnommenen Proben aus hepatischen Raumforderungen als Metastasen eines duktalen Adenokarzinoms wurden diese in die Berechnung der Inzidenz von Lebermetastasen und der durchschnittlichen Größe der Lebermetastasen einbezogen. Die Durchführung der histologischen Untersuchungen erfolgte mit Unterstützung von Herrn Prof. Dr. Guski am Institut für Pathologie der Charité Campus Mitte.

2.2.6 Biochemische Untersuchungen

2.2.6.1 Chemikalien und Geräte

Die Bestimmung der GSHPX-Aktivität folgte dem Prinzip von Paglia und Valentine (177). Es wurde der Testkit RANSEL (Randox Ltd., Großbritannien) verwendet, der als Mischsubstrat Xanthin und I.N.T. [(2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenol)-5-phenyltetrazoliumchlorid] sowie einen 50mM CAPS-EDTA-Puffer und Xanthinoxidase (80U/l) enthielt.

Die Bestimmung der SOD-Aktivität basierte auf der Methode nach Beauchamp und Fridovich (23). Hier wurde der Testkit RANSOD (Randox Ltd., Großbritannien) verwendet, in welchem das Reagenz (Glutathion + Glutathionreduktase + NADPH), ein 50mM Phosphat-EDTA-Puffer, 0,18mM Cumenhydroperoxid und Verdünnungsmittel [Seite 41↓]enthalten waren. Für die Proteinbestimmung nach Lowry (147) wurden folgende Chemikalien verwendet:

Für die Bestimmung der Lipidperoxidations-Produkte als Thiobarbitursäure-reaktive Substanzen (TBARS) wurden die folgenden Chemikalien verwendet:

Die photometrischen Aktivitätsbestimmungen der GSHPX und der SOD und die Ermittlung der Proteingehalte wurden mit dem UV-VIS Scanning Spektrophotometer UV-2101 PC (Shimadzu, Japan) durchgeführt. Die Messung der TBARS-Konzentration fand am Spektrofluorophotometer RF-5001 PC (Shimadzu, Japan) statt.


[Seite 42↓]

Weiterhin wurden verwendet:

2.2.6.2 Homogenatherstellung

Die bei der Obduktion unverzüglich nach der Entnahme eingefrorenen Proben von metastatischem und metastasenfreiem Lebergewebe mußten vor den biochemischen Untersuchungen homogenisiert werden. Für die TBARS-Bestimmung wurde das Probenmaterial mit 0,01% Butylhydroxyanisol enthaltender eiskalter 140mmol/l-Natriumchlorid-Lösung (Sigma Chemicals, Großbritannien) unter Kühlung 4mal je 15 Sekunden homogenisiert. Für die GSHPX- und die SOD-Bestimmung wurde das Probenmaterial mit eiskaltem 0,1mol/l-Phosphatpuffer unter Kühlung 4mal je 15 Sekunden homogenisiert. Die so erhaltenen Homogenate wurden bei –80°C gelagert und vor den Messungen jeweils 15 Sekunden rehomogenisiert.

2.2.6.3 Proteinbestimmung nach Lowry

2.2.6.3.1 Prinzip

Verbindungen mit mindestens zwei Peptidbindungen ergeben mit Cu2+-Ionen in alkalischer Lösung einen violetten Komplex. Dieses Verfahren, die sogenannte Biuret-Methode, weist jedoch nur eine mäßige Sensitivität auf. Außerdem wird hierbei sehr umfangreiches Probenmaterial benötigt. Daher wurde nach Lowry eine Kombination der Biuret-Methode mit einer Reduktion von Phosphorwolfram- und Phosphormolybdän-säure (Folins Reagenz) zu Wolfram- respektive Molybdänblau durch die aromatischen Seitenketten des im Kupferkomplex gebundenen Tyrosins und Tryptophans angewendet (149).

2.2.6.3.2 Durchführung und Auswertung

Zunächst wurde die Gebrauchslösung hergestellt. Um 50ml zu erhalten, wurden 0,5ml Kupfersulfat-Lösung, 0,5ml Kalium-Natrium-Tartrat-Lösung und 49ml Natriumkarbonat-


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Lösung zusammengegeben. Anschließend wurden 25μl des vorher 1:100 verdünnten Gewebehomogenates mit 225μl Aqua bidest versetzt und mit 1,5ml Gebrauchslösung 10 Minuten inkubiert. Dann wurden unter starkem Schütteln 150μl Folins Reagenz dazugegeben. Nach einstündiger Inkubation wurden die Proben bei folgenden Parametern gemessen: 750nm Wellenlänge, 25°C Temperatur, 0,5cm Küvettenschichtdicke, Leerwert als Vergleichsprobe. Die Auswertung erfolgte über eine Kalibrierfunktion.

2.2.6.4 Bestimmung der GSHPX-Aktivität

2.2.6.4.1 Prinzip

Die Methode basiert auf dem Prinzip von Paglia und Valentine (177). Die GSHPX katalysiert hierbei die Oxidation von Glutathion durch Cumenhydroperoxid, so daß durch Bildung einer Disulfidbrücke das oxidierte Glutathion (GSSG) entsteht. Bei gleichzeitiger Anwesenheit von reduziertem Glutathion und NADPH wird GSSG sofort reduziert, dabei wird NADPH oxidiert. Diese Abnahme der NADPH-Extinktion wird bei der hier verwendeten Methode gemessen.

2.2.6.4.2 Durchführung und Auswertung

Das Pipettieren erfolgte direkt in die Meßküvette und nach guter Durchmischung wurden die Proben bei folgenden Parametern gemessen: 340nm Wellenlänge, 37°C Temperatur, 3 Minuten Reaktionszeit, 0,5cm Küvettenschichtdicke, Luft als Vergleichsprobe.

Tab. 5: Pipettierschema für die GSHPX-Aktivitätsmessung

 

Leerwertmessung

Probenmessung

Probe [ μ l]

0

10

Aqua bidest [ μ l]

50

40

Reagenz [ μ l]

500

500

Cumenhydroperoxid [ μ l]

20

20

Der Berechnung der Ergebnisse liegt das Lambert-Beersche Gesetz zugrunde: ΔE=c*d*ε, wobei ΔE die Extinktionsänderung, c die Konzentration und d die Küvettenschichtdicke darstellt. Der Wert des Extinktionskoeffizienten ε beträgt


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6,22*103l/mol*cm und ist konstant. Demzufolge wurde das Lambert-Beersche Gesetz nach c umgestellt und somit die Konzentration in der Probe berechnet. Eingefügt wurde der Verdünnungsfaktor. Die Ergebnisse wurden auf mg Proteingehalt korrigiert.

2.2.6.5 Bestimmung der SOD-Aktivität

2.2.6.5.1 Prinzip

Der auf der Methode von Beauchamp und Fridovich (23) beruhende hier angewandte Testkit verwendet Xanthin und Xanthinoxidase zur Bildung von Superoxidradikalen, welche mit I.N.T. zu einem roten Formazanfarbstoff reagieren. Da die SOD ihrerseits die Dismutation von Superoxidradikalen zu molekularem Sauerstoff und Wasserstoffperoxid katalysiert, kann ihre Aktivität über den Grad der Hemmung der oben genannten Reaktion bestimmt werden.

2.2.6.5.2 Durchführung und Auswertung

Die Proben wurden mit Aqua bidest soweit verdünnt, daß die Messwerte zwischen 30% und 60% Hemmung lagen. Das Pipettieren erfolgte direkt in die Küvette. Nach guter Durchmischung wurden die Messungen unter folgenden Bedingungen durchgeführt: 505nm Wellenlänge, 37°C Temperatur, 3 Minuten Reaktionszeit, 0,5cm Küvettenschichtdicke, Luft als Vergleichsprobe.

Die Meßwerte wurden als Extinktionsänderung*103/min angegeben. Zur Umrechnung in die prozentuale Hemmung der Formazanreaktion wurde folgende Gleichung angewandt: %Hemmung=100-[(ΔE*min-1 Probe*100)/ΔE*min-1 Leerwert]. Zur Angabe der Aktivität in units wurde definiert, daß 1U SOD-Aktivität 50% Hemmung entsprechen soll. Die so erhaltenen Werte wurden auf mg Proteingehalt korrigiert.

Tab. 6: Pipettierschema für die SOD-Aktivitätsmessung

 

Leerwertmessung

Probenmessung

Probe [ μ l]

0

95-5

Aqua bidest [ μ l]

100

5-95

Mischsubstrat [ μ l]

340

340

Xanthinoxidase [ μ l]

50

50


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2.2.6.6  Bestimmung der Lipidperoxidations-Produkte

2.2.6.6.1 Prinzip

Das Prinzip dieser Messung wurde von Ohkawa beschrieben (175). Lipidperoxidationsprodukte bilden hierbei mit Thiobarbitursäure (TBA) einen roten Polymethinfarbstoff, dessen Konzentration fluorimetrisch bestimmt werden kann. Die diese Reaktion eingehenden Lipidperoxidationsprodukte werden als Thiobarbitursäure-reaktive Substanzen (TBARS) bezeichnet. Die teilweise kritischen Aspekte dieser Meßmethode im Hinblick auf Art der Probengewinnung und –aufbewahrung sowie die nicht unproblematische Spezifität des Tests sind uns bekannt (111). Allerdings gehen wir nach Erfahrungen mit vorhergehenden Untersuchungen davon aus, daß artefizielle Veränderungen des TBARS-Levels durch strenge Standardisierung aller Arbeitsschritte (z.B. sehr schnelles Einfrieren der Gewebe nach Entnahme, Aufbewahrung der Proben in Flüssigsticksoff, Homogenisierung und Analyse in Gegenwart von Antioxidatien) verhindert werden können.

2.2.6.6.2 Durchführung und Auswertung

Die benötigte Menge Homogenat wurde mit Aqua bidest zu 150μl ergänzt, mit 300μl Azetatpuffer (pH=3,5), 40μl SDS und 300μl TBA versetzt und für 90 Minuten ins Wasserbad (90°C) gestellt. Nach 5minütiger Abkühlung in Eiswasser wurden 200μl Aqua bidest und 1ml n-Butanol hinzugefügt. Die Mischung wurde 20 Minuten geschüttelt und anschließend 10 Minuten bei 2000U/min zentrifugiert. Daraufhin erfolgte die Messung in der überstehenden n-Butanolphase bei folgenden Parametern: 515nm Wellenlänge für Exzitation, 553nm Wellenlänge für Emission, 25°C Temperatur, 0,5cm Küvettenschichtdicke, Leerwert als Vergleichsprobe. Die Auswertung erfolgte über eine Kalibrierfunktion.

Die Durchführung der biochemischen Untersuchungen erfolgte mit Unterstützung von Herrn Prof. Dr. Schimke (Medizinische Klinik für Kardiologie) in der Charité Campus Mitte.


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2.2.6.7  Statistik

Die Daten sind als Mittelwert + Standardabweichung dargestellt. Die Daten der unterschiedlichen Gruppen wurden mittels des Kruskal-Wallis-Test für kontinuierliche Daten und mit dem Fisher Test für kategoriale Daten verglichen. Das Signifikanzniveau wurde mit p<0,05 festgelegt.

2.3 Einfluß von Octreotid und Tamoxifen auf das Tumor-wachstum und die Lebermetastasierung beim Pankreaskarzinom

2.3.1 Haltung der Tiere und Versuchsgruppen

60 acht Wochen alte männliche Syrische Goldhamster (Fa. Harlan-Winkelmann, Deutschland) wurden unter standardisierten Bedingungen (Raumtemperatur 21+5°C, Luftfeuchtigkeit 70+10%, 10 Luftwechsel pro Stunde, 12h/12h Tag- / Nachtzyklus) in Einzelkäfigen gehalten und nach 1 Woche Akklimatisierungszeit randomisiert den in Tabelle 1 dargestellten Gruppen á 15 Hamster zugeordnet.

Tab. 7: Therapie der Versuchsgruppen 1-4

Gruppe

Tier-Anzahl

Tumorinduktion

Therapie

1

15

ja

Keine

2

15

ja

Octreotid

3

15

ja

Tamoxifen

4

15

ja

Octreotid und Tamoxifen

2.3.2 Ernährung

Alle Tiere erhielten ein Spezialfutter, in dem der Rohfettanteil auf 21,4% angehoben wurde (ssniff Spezialdiäten GmbH, Soest, Deutschland, Tab.8). Die verwendete Hochfettdiät hatte in eigenen Vorstudien zu einer höheren Lebermetastasierung im Vergleich zur mit Standardfutter ernährten Kontrollgruppe geführt (261). Alle Tiere hatten Zugang zu Futter und zu Trinkwasser ad libitum.


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Tab. 8: Bestandteile der Hochfettdiät

Bestandteil

Anteile

Rohprotein

16,5%

Rohfett

21,4%

Rohfaser

4,9%

Rohasche

5,7%

Kalzium

1,0%

Phosphor

0,7%

Natrium

0,15%

Magnesium

0,2%

Kalium

1,0%

Lysin

1,1%

Glycin

1,0%

Leucin

1,5%

Arginin

1,4%

Phenylalanin

1,0%

Asparaginsäure

2,0%

Glutaminsäure

3,9%

Valin

1,0%

Mangan

80mg/kg

Kupfer

12mg/kg

Zink

75mg/kg

Jod

2mg/kg

Eisen

220mg/kg

Selen

0,2mg/kg

Kobalt

2mg/kg

Vitamin A

15.000IE/kg

Vitamin D3

1.000IE/kg

Vitamin E

100mg/kg

Cholin

1.600mg/kg

Nikotinsäure

60mg/kg

Inosit

50mg/kg


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Die gaschromatographisch ermittelten Anteile (ssniff Spezialdiäten GmbH, Soest, Deutschland) derjenigen Fettsäuren mit den höchsten Anteilen in der Hochfettdiät sind in Tab.9 dargestellt.

Tab. 9: Anteile bedeutender Fettsäuren in der Hochfettdiät in %

Name (Trivialname)

Kurzformel

Anteil in Hochfettdiät [%]

Palmitinsäure

C16:0

2,0

Stearinsäure

C18:0

1,0

Ölsäure

C18:1

4,4

Linolsäure

C18:2

11,0

Linolensäure

C18:3

2,0

Arachidonsäure

C20:4

0,4

Eicosapentaensäure

C22:5

0,3

Sonstige Fettsäuren

C8:0 bis C22:6

jeweils <0,3

2.3.3 Tumorinduktion

Zur Induktion des duktalen Adenokarzinoms des Pankreas wurden den Tieren der Versuchsgruppen 1-4 über einen Zeitraum von 12 Wochen 10mg/kg Körpergewicht N-Nitrosobis-2-oxopropylamin (BOP, Ash Stevens Chemicals Ltd., USA) wöchentlich subkutan interskapulär injiziert. BOP wurde dazu jeweils unmittelbar vor der Anwendung in 0,9%iger Natriumchlorid-Lösung (B. Braun GmbH, Deutschland) im Verhältnis von 3mg pro 1ml gelöst. Alle Injektionen fanden unter einer kurzen Äthernarkose (Hoechst / Marion-Roussel GmbH, Deutschland) statt.

2.3.4 Therapie

Nach der Tumorinduktion erfolgte eine 12-wöchige Therapiephase. In diesem Zeitraum erhielten die Tiere der Gr. 1 (Kontrollgruppe) 0,5 ml 0,9% NaCl subkutan pro Woche, während den Tieren der Gr. 2 (Octreotid-Gruppe) 0,4 ml Octreotid 4-wöchentlich subkutan injiziert wurden (LAR 20mg-Octreotid-retard, Novartis, Switzerland). Darüberhinaus erhielten die Tiere der Gr. 3 (Tamoxifen-Gruppe) 10 mg Tamoxifen 3mal pro Woche oral als Beimengung zum Futter. Die Tiere der Gr. 4 (Kombinationsgruppe)


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wurden mit der Kombinationstherapie aus Octreotid und Tamoxifen in o.g. Dosierung behandelt.

2.3.5 Obduktion

In der 25. Woche nach Versuchsbeginn wurden die Tiere unter einer Narkose mit Ursotamin (Serumwerk Bernburg GmbH, Deutschland) getötet. Das Körpergewicht und die Gewichte von Pankreas und Leber wurden erhoben. Zur Obduktion wurde eine mediane Laparotomie vom Processus xiphoideus bis zum Penisansatz durchgeführt. Nach Inspektion aller Bauchorgane wurden Leber und Pankreas entnommen. Die Organe wurden für die histologische Untersuchung in 10%iges gepuffertes Formaldehyd (Sigma Chemicals Ltd., Großbritannien) gegeben.

2.3.6 Histologische Untersuchungen

Die histologischen Untersuchungen erfolgten analog der unter 2.2.5 aufgeführten Methodik mit Unterstützung von Herrn Prof. Dr. Guski am Institut für Pathologie der Charité Campus Mitte.

2.3.7 Nachweis von Rezeptoren

2.3.7.1 Somatostatinrezeptoren

Da bislang ungeklärt war, ob Octreotid über einen direkten rezeptorvermittelten Mechanismus das das Lebermetastasenwachstum beeinflußt, wurden die Lebermetastasen eines chemisch induzierten Adenokarzinoms des Pankreas des Syrischen Goldhamsters im Institut für Pathologie der Universität Bern (Schweiz) durch Herrn Prof. Dr. C. Reubi auf Somatostatin-Rezeptoren mittels einer Autoradiographie hin untersucht (201-203,269).

2.3.7.2 Östrogenrezeptoren

Zudem haben wir untersucht, ob eine mögliche Inhibition des Tumorwachstums durch Tamoxifen rezeptorvermittelt ist. Hierfür erfolgte die Bestimmung der Östrogen-Rezeptoren (ER) im Zytosol des zu untersuchenden Tumorgewebes anhand eines Testkits (ABBOTT GmbH, Deutschland) durch die Universitätsklinik für Strahlentherapie (Prof. Dr. Possinger) der Charité Campus Mitte.


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Der ER-EIA monoklonal ist ein Festphasen-Enzymimmunoassay, der entsprechend des „Sandwich-Prinzips“ aufgebaut ist. Hierbei werden mit anti-ER (Ratte, monoklonal) beschichtete Kugeln mit Proben (Tumorgewebszytosole), Standards und Kontrollen inkubiert. Während dieser Inkubation werden in den Proben, Standards und Kontrollen die vorhandenen Östrogen-Rezeptoren an die Festphase (Kugeloberfläche) gebunden. Das ungebundene Material wird durch Waschen der Kugeln entfernt. Anschließend werden die Kugeln mit anti-ER (Ratte, monoklonal), das mit Meerettich-Peroxidase konjugiert ist, inkubiert.

Falls ER in der Zytosolprobe vorhanden sind, wird das ER-Konjugat an den auf den Kugeln befindlichen ER gebunden. Das ungebundene Konjugat wird durch Waschen der Kugeln entfernt.

Danach werden die Kugeln mit einer Enzym-Substratlösung (Wasserstoffperoxid und Ortho-Phenylendiamin) inkubiert, dies führt zu einer gelb-orangen Verfärbung. Die Farbintensität ist innerhalb des Arbeitsbereiches des Tests proportional zur ER-Konzentration in der Probe. Die Enzymreaktion wird durch Zugabe von 1N Schwefelsäure inhibiert, und die Intensität der entstandenen Färbung wird mit einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 492nm gemessen. Der Cut-off Wert für einen positiven Rezeptorbefund beträgt 15 fmol/mg Zytosol-Protein (3,20,119,169,102,268).


[Seite 51↓]

2.4  Einfluß von Octreotid auf die Lebermetastasierung und die hepatische Lipidperoxidation beim duktalen Pankreaskarzinom

2.4.1 Haltung der Tiere und Versuchsgruppen

90 männliche Syrische Goldhamster im Alter von 8 Wochen (Fa. Harlan - Winkelmann, Deutschland) wurden unter standardisierten Bedingungen (Raumtemperatur 21+5°C, Luftfeuchtigkeit 70+10%, 10 Luftwechsel pro Stunde, 12h/12h Tag- / Nachtzyklus) in Einzelkäfigen gehalten und nach 1 Woche Akklimatisierungszeit randomisiert den in Tab. 2 aufgeführten Gruppen zugeordnet.

Tab. 10: Ernährung, Tumorinduktion und Therapie der Versuchsgruppen 1-6

Gruppe

Tier-Anzahl

Ernährung

Tumorinduktion

Octreotidtherapie

1

15

Standardfutter (SF)

Nein

Nein

2

15

SF

Ja

Nein

3

15

SF

Ja

Ja

4

15

Hochfettdiät (HF)

Nein

Nein

5

15

HF

Ja

Nein

6

15

HF

Ja

Ja

2.4.2 Ernährung

Die mit Standardfutter ernährten Tiere der Versuchsgruppen 1-3 erhielten über den gesamten Versuchszeitraum Hamsterstandardfutter mit einem Rohfettanteil von 3% (ssniff Spezialdiäten GmbH, Soest, Deutschland). Die Tiere der Versuchsgruppen 4–6 hingegen wurden mit einer Hochfettdiät ernährt, in dem der Rohfettanteil auf 21,4% angehoben wurde (ssniff Spezialdiäten GmbH, Soest, Deutschland).

Die verwendete Hochfetternährung hatte in eigenen Vorstudien zu einer signifikant höheren Lebermetastasierung im Vergleich zur mit Standardfutter ernährten Kontrollgruppe geführt (261). Die mit Standardfutter ernährten Tiere dienten als Kontrollgruppen für die biochemischen Parameter. Alle Tiere hatten Zugang zum Futter und zu Trinkwasser ad libitum.


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Die gaschromatographisch ermittelten Anteile (ssniff Spezialdiäten GmbH, Soest, Deutschland) derjenigen Fettsäuren mit den höchsten Anteilen in der Hochfettdiät und im Standardfutter sind in Tab.11 dargestellt, weitere wichtige Bestandteile sind in Tab. 12 aufgeführt.

Tab. 11: Anteile bedeutender Fettsäuren in der Standard- und Hochfettdiät in %

Fettsäure

Kurzformel

Anteil in Standarddiät [%]

Anteil in Hochfettdiät [%]

Palmitinsäure

C16:0

0,3

2,0

Stearinsäure

C18:0

0,2

1,0

Ölsäure

C18:1

0,7

4,4

Linolsäure

C18:2

1,8

11,0

Linolensäure

C18:3

0,3

2,0

Arachidonsäure

C20:4

0,07

0,4

Eicosapentaensäure

C22:5

0,05

0,3

sonstige Fettsäuren

C8:0 bis C22:6

jeweils <0,05

jeweils <0,3


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Tab. 12: Inhaltsstoffe der Standarddiät und Hochfettdiät

Inhaltsstoff

Standarddiät

Hochfettdiät

Rohprotein

20,0%

16,5%

Rohfett

3,5%

21,4%

Rohfaser

8,0%

4,9%

Rohasche

6,5%

5,7%

Kalzium

1,0%

1,0%

Phosphor

0,7%

0,7%

Natrium

0,15%

0,15%

Magnesium

0,2%

0,2%

Kalium

1,0%

1,0%

Lysin

1,1%

1,1%

Glycin

1,0%

1,0%

Leucin

1,5%

1,5%

Arginin

1,4%

1,4%

Phenylalanin

1,0%

1,0%

Asparaginsäure

2,0%

2,0%

Glutaminsäure

3,9%

3,9%

Valin

1,0%

1,0%

Mangan

80mg/kg

80mg/kg

Kupfer

12mg/kg

12mg/kg

Zink

75mg/kg

75mg/kg

Jod

2mg/kg

2mg/kg

Eisen

220mg/kg

220mg/kg

Selen

0,2mg/kg

0,2mg/kg

Kobalt

2mg/kg

2mg/kg

Vitamin A

15.000IE/kg

15.000IE/kg

Vitamin D3

1.000IE/kg

1.000IE/kg

Vitamin E

100mg/kg

100mg/kg

Cholin

1.600mg/kg

1.600mg/kg

Nikotinsäure

60mg/kg

60mg/kg

Inosit

50mg/kg

50mg/kg


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2.4.3  Tumorinduktion

Zur Induktion des duktalen Adenokarzinoms des Pankreas wurden den Tieren der Versuchsgruppen 2, 3, 5 und 6 über einen Zeitraum von 12 Wochen 10mg/kg Körpergewicht N-Nitrosobis-2-oxopropylamin (BOP, Ash Stevens Chemicals Ltd., USA) wöchentlich subkutan interskapulär injiziert. BOP wurde dazu jeweils unmittelbar vor der Anwendung in 0,9%iger Natriumchlorid-Lösung (B. Braun GmbH, Deutschland) im Verhältnis von 3mg pro 1ml gelöst.

Die Tiere der Versuchsgruppen 1 und 4 erhielten im Induktionszeitraum wöchentlich 0,5ml 0,9%ige Natriumchlorid-Lösung (B. Braun GmbH, Deutschland) ebenfalls subkutan interskapulär injiziert.

Alle Injektionen fanden unter einer kurzen Äthernarkose (Hoechst / Marion-Roussel GmbH, Deutschland) statt.

2.4.4 Therapie

An die 12wöchige Tumorinduktionsphase schloß sich die Therapiephase an, deren Dauer ebenfalls 12 Wochen betrug. Während dieser Phase wurden die Tiere der Versuchsgruppen 3 und 6 mit 20mg LAR (Octreotid-Monatsdepot, Novartis AG, Schweiz) alle 4 Wochen subkutan therapiert.

Den Tieren der Versuchsgruppen 1, 2, 4 und 5 wurden im selben Zeitraum hingegen 0,5ml 0,9%ige Natriumchlorid-Lösung (B. Braun GmbH, Deutschland) ebenfalls alle 4 Wochen subkutan injiziert. Auch diese Injektionen fanden unter einer Äthernarkose (Hoechst / Marion-Roussel GmbH, Deutschland) statt.

2.4.5 Obduktion

In der 25. Woche nach Versuchsbeginn wurden die Tiere unter einer Narkose mit Ursotamin (Serumwerk Bernburg GmbH, Deutschland) getötet. Zur Obduktion wurde eine mediane Laparotomie vom Processus xiphoideus bis zum Penisansatz durchgeführt. Nach Inspektion aller Bauchorgane wurde die Leber entnommen.

Da die Versuchsgruppen 1 und 4 kein BOP erhalten hatten, war nicht mit dem Auftreten von Pankreaskarzinomen und Lebermetastasen in diesen Gruppen zu rechnen.Von


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den Tieren dieser Versuchsgruppen wurde standardisiert eine Probe aus dem Lobus sinister lateralis hepatis exzidiert (41,4+10,5mg) und unverzüglich bei –80°C für die biochemischen Untersuchungen eingefroren.

Bei den mit BOP behandelten Tieren wurde nach Entnahme der Leber auch das Pankreas entnommen und sowohl makroskopisch wie auch auflichtmikroskopisch (neoLab Stereomikroskop, Eschenbach GmbH, Deutschland) auf solide Raumforderungen kontrolliert. Aus tumorverdächtigen Läsionen wurden Proben entnommen und für die histologische Untersuchung in 10%iges gepuffertes Formaldehyd (Sigma Chemicals Ltd., Großbritannien) gegeben. Die Leber jedes Tieres der mit BOP behandelten Versuchsgruppen wurde sofort nach der Entnahme mit einem Skalpell lamelliert (18-24 Lamellen in ca. 2mm-Abständen) und sowohl makroskopisch wie auch auflichtmikroskopisch auf solide Raumforderungen untersucht. Die Anzahl aller in einer Leber als metastasenverdächtig angesehenen Herde wurde erhoben und die Größe wurde unter dem Auflichtmikroskop zweidimensional vermessen, so daß für jedes betroffene Tier die Metastasenanzahl und deren durchschnittliche Größe angegeben werden konnte. Erstreckten sich Raumforderungen über mehr als eine Lamelle, wurde die zweidimensionale Ausdehnung an jeder einzelnen Lamelle gemessen und anschließend der Mittelwert bestimmt. Aus jedem metastasenverdächtigen Herd wurde eine Probe entnommen und für die Histologie in 10%iges gepuffertes Formaldehyd (Sigma Chemicals Ltd., Großbritannien) gegeben. Anschließend wurden bei den unter 2.3 beschriebenen Versuchsgruppen die verdächtigen Herde aus der Leber exzidiert, gesammelt (23,5+12,1mg) und für die biochemischen Untersuchungen unverzüglich bei –80°C eingefroren. Von makroskopisch und auflichtmikroskopisch unveränderten metastasenfernen Leberanteilen wurden 39,1+6,9mg pro Tier entnommen und ebenfalls unverzüglich bei –80°C eingefroren.

2.4.6 Histologische Untersuchung

Die bei der Obduktion in Formaldehyd gegebenen Proben wurden histologisch mit Unterstützung von Herrn Prof. Dr. Guski am Institut für Pathologie der Charité Campus Mitte entsprechend der unter 2.2.5 beschriebenen Methodik untersucht.


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2.4.7  Biochemische Untersuchungen

Die Proteinbestimmung, die Bestimmung der Lipidperoxidation (TBARS), sowie der Aktivitäten der Lipidperoxidations-Schutzenzyme GSHPX und SDO erfolgte mit Unterstützung von Herrn Prof. Dr. Schimke (Medizinische Klinik für Kardiologie) in der Charité Campus Mitte entsprechend der unter 2.2.6 beschriebenen Methodik.

2.4.8 Statistik

Alle Werte wurden als prozentuale Häufigkeiten oder als Mittelwert+Standardab-weichung angegeben. Bei quantitativen Daten erfolgte ein Normalitätstest nach Shapiro und Francia.

Bei normalverteilten Parametern wurden die Mittelwertvergleiche zwischen den Versuchsgruppen als Einfaktorielle Multivarianzanalyse (ANOVA) durchgeführt. Beim Vorliegen von vergleichbaren Varianzen in den Versuchsgruppen erfolgte die Post-Hoc-Korrektur nach dem Bonferroni-Modell. Lagen hingegen zwischen den Gruppen ungleiche Varianzen vor, wurde als Post-Hoc-Korrektur das Dunnett´s-T3-Modell gewählt.

Bei nicht normalverteilten Parametern erfolgten die Mittelwertvergleiche zwischen den Gruppen mittels Kruskal-Wallis-Test. Bei Ablehnung der globalen Nullhypothese fanden die folgenden Einzelvergleiche zwischen den Gruppen als Mann-Whitney-U-Test mit Bonferroni-Korrektur zur Vermeidung der α-Fehlerkumulierung statt.

Die Vergleiche innerhalb einer Versuchsgruppe zwischen metastatischen und nicht-metastatischen Werten wurden bei Normalverteilung als T-Test für gepaarte Stichproben durchgeführt. Bei nicht normalverteilten Parametern fanden diese Vergleiche als Wilcoxon-Vorzeichen-Rangsummen-Test statt.

Die kategoriellen Daten wurden angesichts der kleinen Umfänge mit dem Fisher-Test verglichen.

Das Signifikanzniveau wurde grundsätzlich mit 95% (p<0,05) definiert. Alle Berechnungen fanden mit Hilfe des Statistikprogramms SPSS 9.0® für Windows98® statt.


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2.5  Einfluß der antioxidativen Vitamine A, C sowie E auf die Lebermetastasierung und die hepatische Lipidperoxidation in Lebermetastasen und metastasenfreien Leberanteilen beim duktalen Pankreaskarzinom

2.5.1 Haltung der Tiere und Versuchsgruppen

120 männliche Syrische Goldhamster (Fa. Harlan–Winkelmann, Deutschland) im Alter von 8 Wochen wurden in Einzelkäfigen unter standardisierten Verhältnissen gehalten. Die Lufttemperatur betrug 21±5 °C, weiterhin wurden eine Luftfeuchtigkeit von 70±10% sowie 12 Luftwechsel / Stunde und ein 12h / 12h Tag / Nachtzyklus gewährleistet. Die Tiere wurden in folgende 8 Gruppen mit je 15 Syrischen Goldhamstern randomisiert (Tab.13).

Tab. 13: Tumorinduktion und Therapie der Versuchsgruppen 1-8

Gruppe

1

2

3

4

5

6

7

8

Tumorinduktion

Nein

Nein

Nein

Nein

Ja

Ja

Ja

Ja

Therapie

Keine

Vit. A

Vit. C

Vit. E

Keine

Vit. A

Vit. C

Vit. E


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2.5.2  Ernährung

Alle Tiere hatten freien Zugang zu Trinkwasser. Ebenso erhielten alle Tiere eine spezielle Experimentaldiät, die sich vom Standardfutter durch eine abweichende Zusammensetzung unterschied (sniff GmbH, Soest, Deutschland, Tab.14).

Tab. 14: Zusammensetzung der Standard- und Hochfettdiät

Bestandteile

Standarddiät (%)

Hochfettdiät (%)

Sojaöl

3,5

21,4

α-Linolensäure

0,3

2,0

Linolsäure

1,8

11,0

Arachidonsäure

0,07

0,4

Palmitinsäure

0,3

2,0

Stearinsäure

0,2

1,0

Ölsäure

0,7

4,4

Proteine

20,0

16,5

Wasser

14,0

14,0

Rohfasern

8,0

4,9

Rohasche

6,5

5,7

Calcium

1,2

1,2

Kalium

1,1

1,1

Phosphor

0,8

0,8

Magnesium

0,3

0,3

Natrium

0,3

0,3

Lysin

1,3

1,3

Methionin

0,5

0,5

Im Gegensatz zur Standarddiät mit einem Rohfettanteil von 3,5% liegt in der Hochfettdiät der Anteil an Rohfett mit 21,4% wesentlich höher. Das Experiment wurde nach den UKCCCR Richtlinien ausgeführt (123).


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2.5.3  Tumorinduktion

Den Tieren der Kontrollgruppen 1- 4 wurden über einen Zeitraum von 3 Monaten jeweils wöchentlich 0,5ml 0,9%ige NaCl-Lösung subkutan injiziert.

Zur Induktion eines duktalen Adenokarzinoms des Pankreas in den Gruppen 5-8 wurden den Tieren über einen Zeitraum von 3 Monaten 10mg/kg KG N-Nitrosobis-2-oxopropylamin (BOP, Ash Stevens Chemicals, USA) wöchentlich subkutan interskapulär injiziert. BOP wurde dazu kurz vor der Anwendung in 0,9%iger NaCl-Lösung (B.Braun, Deutschland) auf 3mg/ml gelöst. Alle Injektionen wurden unter kurzer Äthernarkose (Hoechst, Deutschland) durchgeführt.

2.5.4 Therapie

Direkt nach der 12wöchigen Tumorinduktionsphase wurde eine Therapie mit Vitamin A, C bzw. E (Sigma, Großbritannien) begonnen. Hierbei erhielten die Tiere der Gruppen 2 und 6 Vitamin A (0,25mg/kg KG/die), die Tiere der Gruppen 3 und 7 erhielten Vitamin C (9mg/kg KG/die) und die Gruppen 4 und 8 wurden mit Vitamin E (4mg/kg KG/die) per os behandelt. Die Verabreichung der Vitamine erfolgte über einen Zeitraum von 12 Wochen.

2.5.5 Obduktion

In der 24. Woche nach Versuchsbeginn wurden die Tiere mittels einer Narkose mit Ursotamin (Serumwerk Bernburg, Deutschland) getötet. Zuvor verstorbene Tiere wurden nicht in die Auswertung einbezogen. Nach Tötung der Tiere wurde eine Obduktion durchgeführt. Hierbei wurden das Pankreas und die Leber entfernt und deren Gewicht festgestellt. Gewebsstücke von makroskopisch freien Leberanteilen (67±19mg) wurden dem Lobus sinister lateralis der Leber entnommen und unverzüglich für die biochemische Analyse bei -80°C eingefroren. Die Leber der BOP-behandelten Tiere der Gruppen 5 bis 8 wurden in 1,0mm Schritten lamelliert. Danach wurde die Anzahl der makroskopisch sichtbaren Lebermetastasen pro Tier, sowie die zweidimensionale Ausdehnung der jeweils größten Leberläsion bestimmt. Für biochemische Analysen wurden Teile der Lebermetastasen (26,3±14mg) umgehend bei -80°C eingefroren. Für die Kontrollhistologie wurden nun das gesamte Pankreas sowie Gewebestücke der Lebermetastasen in 10%iges Formaldehyd gegeben (Sigma, Großbritannien).


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2.5.6  Histologische Untersuchungen

Die histologischen Untersuchungen von Pankreas und Leber erfolgten analog der unter 2.2.5 beschriebenen Methodik mit Unterstützung von Herrn Prof. Dr. Guski am Institut für Pathologie der Charité Campus Mitte.

2.5.7 Biochemische Untersuchungen

Die biochemischen Untersuchungen erfolgten analog der unter 2.2.6 beschriebenen Methodik mit Unterstützung von Herrn Prof. Dr. Schimke (Medizinische Klinik für Kardiologie) an der Charité Campus Mitte.

2.5.8 Statistik

Die zu messenden Parameter wurden als prozentuale Häufigkeiten oder Mittelwert±Standardabweichungen angegeben. Kontinuierliche Daten wurden mit Hilfe des Shapiro-Francia-Tests auf Normalverteilung überprüft. Bei Normalverteilungen wurden anschließend die Daten zwischen den Gruppen mit der Einfaktoriellen Multivarianzanalyse (ANOVA) verglichen. Post hoc-Tests wurden nach Bonferroni bei gleichen Varianzen oder mit Hilfe des Dunett’s T3-Tests bei ungleichen Varianzen durchgeführt.
Lag keine Normalverteilung vor, wurde zum Vergleich der Daten zwischen den Gruppen der Kruskal Wallis Test für die Globalhypothese angewandt. Der Mann-Whitney-Test mit Bonferroni-Korrektur wurde beim Vergleich der einzelnen Gruppen zur Vermeidung der Kummulierung des α-Fehlers herangezogen. Die Daten der tumorfreien Leberanteile vs. Lebermetastasen jeder Gruppe wurden mit Hilfe des Wilcoxon Rangsummentests verglichen. Kategorielle Daten wurden angesichts der kleinen Umfänge mit Hilfe des Fisher’s-Exakt-Tests überprüft. Das Signifikanzniveau wurde mit 95% (p<0,05) definiert. Alle Berechnungen fanden mit SPSS 9.2® für Windows97® statt.


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2.6  Einfluß von Celebrex (COX-2-Inhibitor) und Zyflo (5-LOX- Inhibitor) auf die Lebermetastasierung und die hepatische Lipidperoxidation beim duktalen Pankreaskarzinom

2.6.1 Haltung der Tiere und Versuchsgruppen

120 männliche Syrische Goldhamster (Fa. Harlan–Winkelmann, Deutschland) im Alter von 8 Wochen wurden in Einzelkäfigen unter standardisierten Verhältnissen gehalten. Die Lufttemperatur betrug 21±5 °C, weiterhin wurden eine Luftfeuchtigkeit von 70±10% sowie 12 Luftwechsel / Stunde und ein 12h / 12h Tag / Nachtzyklus gewährleistet. Alle Tiere hatten freien Zugang zu Trinkwasser und Futter ad libitum.

2.6.2 Ernährung

Alle Tiere erhielten eine Hochfettdiät (sniff GmbH, Soest, Deutschland), die in den Vorversuchen zu einer erhöhten Lebermetastasierung geführt hatte (263-265). In dieser Experimentaldiät war der Rohfett-Anteil von ursprünglich 3,5% (Standarddiät) auf 21,4% angehoben worden (2% ALA, 11% LA). Das Experiment wurde nach den UKCCCR Richtlinien ausgeführt (121).

2.6.3 Tumorinduktion

Die Tiere wurden in folgende 4 Kontrollgruppen (Gr.1-4) und 4 Tumorgruppen (Gr. 5-8) von jeweils 15 Hamstern randomisiert:

Tab. 15: Tumorinduktion und Therapie der Versuchsgruppen 1-8

Gruppe

1

2

3

4

5

6

7

8

Tumorinduktion

Nein

Nein

Nein

Nein

Ja

Ja

Ja

Ja

Therapie

Keine

COX-2

5-LOX

COX-2

5-LOX

Keine

COX-2

5-LOX

COX-2

5-LOX


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Während bei den Kontrollgruppen 1-4 eine subkutane Injektion von 0,5ml 0,9% Nacl über 16 Wochen erfolgte, erhielten die Gr. 5-8 wöchentlich 10mg BOP (Ash Stevens Chem., USA) /kg Körpergewicht subkutan im gleichen Zeitraum zur Induktion eines duktalen Adenokarzinoms des Pankreas. BOP wurde dazu kurz vor der Anwendung in 0,9%iger NaCl-Lösung (B.Braun, Deutschland) auf 3mg/ml gelöst. Alle Injektionen wurden unter kurzer Äthernarkose (Hoechst, Deutschland) durchgeführt.

2.6.4 Therapie

Direkt nach der 16wöchigen Tumorinduktionsphase wurde eine 16-wöchige Therapie durchgeführt. Hierbei erhielten die Gr. 2 und 6 täglich 7mg Celebrex (Pfizer, Zürich, Schweiz) oral, während die Gr. 3 und 7 mit 28mg Zyflo (Abbott, Chicago, USA) oral behandelt wurden. Die Gr. 4 und 8 erhielten eine Kombinationstherapie aus Celebrex und Zyflo.

2.6.5 Obduktion

In der 33. Woche nach Versuchsbeginn wurden die Tiere mittels einer Narkose mit Ursotamin (Serumwerk Bernburg, Deutschland) getötet. Nach Tötung der Tiere wurde eine Obduktion durchgeführt. Die Organentnahme erfolgte analog der unter 2.4.5 beschriebenen Methodik.

2.6.6 Histologische Untersuchungen

Die histologische Aufarbeitung erfolgte analog der 2.2.5 beschriebenen Methodik mit der Unterstützung von Herrn Prof. Dr. Guski am Institut für Pathologie der Charité Campus Mitte.

2.6.7 Biochemische Untersuchungen

Analog zu der unter 2.2.6 beschriebenen Methodik erfolgten die Bestimmung der TBARS-Konzentration sowie der Aktivitäten der Lipidperoxidations-Schutzenzyme GSHPX und SOD im Lebergewebe mit der Unterstützung von Herrn Prof. Dr. Schimke (Medizinische Klinik für Kardiologie) der Charité Campus Mitte.


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2.6.8  Statistik

Die Daten wurden im Falle der Normalverteilung als Mittelwert±Standardabweichungen angegeben. Kontinuierliche Daten wurden mit Hilfe des Shapiro-Francia-Tests auf Normalverteilung überprüft. Alle Daten waren normalverteilt, dementsprechend wurden die Daten zwischen den Gruppen mit der Einfaktoriellen Multivarianzanalyse (ANOVA) verglichen. Post hoc-Tests wurden nach Bonferroni bei gleichen Varianzen oder mit Hilfe des Dunett’s T3-Tests bei ungleichen Varianzen durchgeführt.

Der Vergleich zwischen extrametastatischen und intrametastatischen Werten jeder Gruppe wurde mit Hilfe des Wilcoxon-Tests durchgeführt. Kategorielle Daten wurden mit Hilfe des Fisher’s-Exakt-Tests überprüft. Das Signifikanzniveau wurde mit 95% (p<0,05) definiert. Alle Berechnungen fanden mit SPSS 9.2® für Windows97® statt.


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27.05.2005