2  Experimentelle Studien

Abriss der eingesetzten Methoden

Den in den Vorarbeiten eingesetzten Wachstumsfaktoren IGF-I und TGF-β1 kommt eine bedeutende Rolle während der Frakturheilung zu [13]. Obwohl Wachstumsfaktoren (WF) aufgrund ihrer Wirkung als Regulatoren des Knochenstoffwechsels [25],[50],[59],[62], bei der enchondralen Ossifikation [13,24], bei der Zunahme des Knochengewebes während des Wachstums [66] und der Knochenheilung [14],[57,60,98], große Aufmerksamkeit geschenkt wird, sind die Kenntnisse bezüglich ihrer zellspezifischen Wirkungen während der Frakturheilung noch unzureichend. Die beschleunigte Frakturheilung, die mit dem Einsatz der Wachstumsfaktoren IGF-I und TGF-β1 in vivo erreicht wurde [84,88], warf die Frage nach den noch weitgehend unklaren Wirkungsmechanismen der WF in der Frühphase der Ossifikation auf. Auch ist die Ursache des beobachteten positiven Effekts der Poly(D,L-Laktid)-Beschichtung auf die beteiligten Zelltypen noch nicht geklärt. Ergänzend zu qualitativen und semiquantitativen Studien sollten mit in vitro-Versuchen an Osteoblasten und Osteoklasten die Wirkung der Wachstumsfaktoren und der Poly(D,L-Laktid)-Beschichtung untersucht werden.

Frakturmodell

Das in diesem Projekt verwendete standardisierte Frakturmodell an der Ratte (weibliche Sprague Dawley, 5 Monate alt) ist seit langem in der Arbeitsgruppe etabliert[88]. Unter standardisierten Bedingungen wurde eine geschlossene Fraktur der rechten Tibia und Fibula erzeugt. Die Tiere wurden in drei Versuchsgruppen aufgeteilt und die Frakturen wie folgt mit Titan-Kirschner-Drähten (ø: 1mm) stabilisiert:

1. Implantat unbeschichtet
2. Implantat beschichtet mit PDLLA
3. Implantat beschichtet mit PDLLA + rh-IGF-I (50µg) + rh-TGF-ß1 (10µg)

Die Entnahme der Tibia zur weiteren Aufarbeitung erfolgte 5, 10 und 15 Tage nach der Fraktur.

Osteotomiemodell

Unter standardisierten Bedingungen wurde das Rattenfemur osteotomiert (0,6 mm Spalt) und mit einer Titan-4-Loch-Platte stabilisiert. In Anlehnung an das Frakturmodell wurden die Platten mit gleicher Wachstumsfaktorenkonzentration beschichtet.

1. Platte unbeschichtet
2. Platte beschichtet mit PDLLA
3. Platte beschichtet mit PDLLA + rh-IGF-I (50µg) + rh-TGF-ß1 (10µg)

Die Entnahme der Femura zur biomechanischen Testung und histologischen Aufarbeitung erfolgte 42 Tage nach Osteotomie.

Zellkultur

Primäre humane osteoblastenartige Zellen

Osteoblastenartige Zellen wurden durch enzymatischen Aufschluss aus dem vitalen trabekulären Knochengewebe gewonnen (Abb. 4a). Die Charakterisierung erfolgte durch Nachweis der alkalischen Phosphatase-Aktivität, Mineralisationseigenschaften und auf Grund ihrer Morphologie.

Primäre humane osteoklastenartige Zellen

Die Isolierung mononukleärer Zellen aus periphervenösem Blut erfolgte durch Zentrifugation mit Hilfe eines Dichtegradienten. Die so gewonnenen Zellen ließen sich durch Kultivierung in Gegenwart von Receptor Activator NF κ B Ligant (RANKL) und Macrophage-Colony Stimulating Factor (M-CSF) zur Fusion und Ausbildung von Osteoklasten anregen. Die Charakterisierung der so erhaltenen Osteoklasten erfolgte anhand ihrer Morphologie und durch Färbung der osteoklastenspezifischen tartratresistenten sauren Phosphatase (TRAP) mit Fast Red Violet (Abb. 4b). Die Resorptionsfähigkeit der Osteoklasten wurde durch Anfärbung der Resorptionslakunen auf Elfenbein-Chips mit Toluidin-Blau-Lösung nachgewiesen (pit formation assay).

	Abb. 4: a) Osteoblasten isoliert aus humanem Knochengewebe kultiviert für 10 Tage. b) Osteoklast fusioniert aus Monozyten und gefärbt mit TRAP, scale bar: 65µm.

Die histologische und immunhistologische Untersuchung der Frühphase der Frakturheilung sollte Aufschluss über Veränderungen in der Kallusmorphologie, Zellproliferation und -differenzierung geben. Zusätzliches Augenmerk wurde auf die Expression verschiedener Proteine wie Wachstumsfaktoren und deren Genexpression und eine mögliche Fremdkörperreaktion gelegt.

Für die Untersuchung der zugrunde liegenden zellulären Mechanismen wurden die Zeitpunkte 5, 10 und 15 Tage nach Fraktur gewählt.

Anhand histologischer Analysen wurde die Kallusmorphologie zu den verschiedenen Zeitpunkten und in den drei Versuchsgruppen untersucht. Hierbei lag das Hauptaugenmerk auf der Zusammensetzung des Frakturkallus. Die oben beschriebenen Phasen der Frakturheilung sind durch ihre Gewebszusammensetzung und mögliche Umbauprozesse gekennzeichnet. Veränderungen dieser Zusammensetzungen und Phasen sollten Rückschlüsse auf die Wirkung der Wachstumsfaktoren ermöglichen.

Neben der histologischen Betrachtung wurde anhand zwei verschiedener immunhistologischer Methoden die Zellproliferation während der normalen Heilung beurteilt und eine geeignete Nachweismethode etabliert. Im zweiten Schritt erfolgte die Untersuchung der beeinflussten Frakturheilung im Vergleich zur unbeeinflussten.

Wildemann B, Schmidmaier G, Ordel S, Stange R, Haas NP, Raschke M

Cell proliferation and differentiation during fracture healing are influenced by locally applied IGF-I and TGF-beta1: comparison of two proliferation markers, PCNA and BrdU. J Biomed Mater Res. 2003, 65B(1):150-156.

Vor der Quantifizierung von Proteinen im Knochen stand die Etablierung einer geeigneten Methode zur Aufarbeitung mineralisierten Gewebes. Anschließend wurden frakturassoziierte Konzentrationsschwankungen der Wachstumsfaktoren IGF-I und TGF-ß1 während der Frühphase der Frakturheilung mittels ELISA quantifiziert. Die gemessene Wachstumsfaktorenkonzentration konnte dann mit dem Knochengewicht korreliert werden. Des weiteren wurde durch die Bestimmung der Proteingesamtkonzentration eine weitere Bezugsgröße ermittelt.

Anhand der Kontrollgruppe mit unbeschichtetem Implantat wurde die Quantität der Wachstumsfaktoren während der Heilung bestimmt. In der Gruppe mit kombinierter Wachstumsfaktorgabe konnten auf die Kontrollgruppe bezugnehmend die möglichen Veränderungen analysiert werden. Interessant war hierbei, inwiefern sich die endogene Freisetzung und Freisetzungskinetik der Wachstumsfaktoren durch die lokale Applikation beeinflussen lässt.

Neben der Quantifizierung der Wachstumsfaktoren war auch deren zelluläre Expression von Interesse. Daher wurden im Folgenden die Genexpression und Proteinlokalisation der Wachstumsfaktoren IGF-I und TGF-ß1 im Kallus zu den verschiedenen Zeitpunkten untersucht.

Wildemann B, Schmidmaier G, Brenner N, Hüning M, Stange R, Haas NP, Raschke M Quantification, localization and expression of IGF-I and TGF-beta1 during growth factor stimulated fracture healing. Calcified Tissue International 2004, 74:388-397

Die in vivo-Untersuchungen ermöglichen nicht die Analyse des Effekts der Wachstumsfaktoren auf einzelne Zelltypen aufgrund des komplexen Zusammenspiels verschiedener Gewebetypen, Zellarten und systemischer Faktoren, die sich Gegenseitig beeinflussen. Daher bietet die Untersuchung an isolierten Zellen unter Kulturbedingungen hier eine Alternative. Durch die Isolierung und Kultivierung von Primärzelltypen können diese in einem geschlossenen System unter definierten Bedingungen untersucht werden. Somit ist es möglich, den Effekt von Substanzen auf individuelle Zelltypen zu analysieren. Zur weiteren Untersuchung der Wirkung von Wachstumsfaktoren wurden zwei knochenspezifische Zelltypen verwendet: Osteoblasten, die für den Knochenaufbau notwendig sind und Osteoklasten, die Knochen resorbieren.

In dieser Studie sollten zwei Fragen untersucht werden:

1) Welchen Effekt haben die eingesetzten Wachstumsfaktoren auf osteoblastenartige Zellen?

2) Wie lange bleiben die Wachstumsfaktoren in der Polymerbeschichtung aktiv?

Diese Frage stellt einen wichtigen Aspekt beim Einsatz von Wachstumsfaktoren in der Klinik dar.

Zur Beantwortung dieser Fragen wurden zu Kulturen primärer osteoblastenartiger Zellen unterschiedlich lange gelagerte Implantatbeschichtungen (5 und 14 Monate) gegeben und der Effekt der Beschichtung und der Wachstumsfaktoren analysiert.

Wildemann B, Lübberstedt M, Haas NP, Raschke M, Schmidmaier G

IGF-I and TGF-beta 1 incorporated in a poly(D,L-lactide) implant coating maintain their activity over long term storage, Cell culture studies on Primary human osteoblast like cellsBiomaterials 2004, 25:3639-3644

Da neben den knochenaufbauenden Osteoblasten auch die knochenresorbierenden Osteoklasten bei der Knochenheilung eine bedeutende Rolle spielen, sollten diese in der Zellkultur untersucht werden. Vorläuferzellen von Osteoklasten können aus mononukleären Zellen des periphervenösen Blutes gewonnen werden. Diese Zellen lassen sich durch Kultivierung in Gegenwart von Receptor Activator NF κ B Ligand (RANKL) und Macrophage Colony Stimulating Factor (M-CSF) zur Fusion und Ausbildung von Osteoklasten anregen. Der Einfluss der Beschichtung und der Wachstumsfaktoren wurde anhand der Fusions- und Resorptionseigenschaften der Osteoklasten untersucht.

Wildemann, B., Lübberstedt M., Kadow-Romacker A., Haas, N.P., Raschke, M., Schmidmaier, G. Differences in the fusion and resorption activity of human osteoclasts after stimulation with different growth factors and a Polylactide Carrier Transactions of the Orthopaedic Research Society 50 ^th Meeting 2004, San Francisco USA

In verschiedenen Tiermodellen wurde durch die Gabe von BMP-2 die ektope Knochenbildung induziert. Dies stellt für die klinische Anwendung von Wachstumsfaktoren zur Beeinflussung der Knochenheilung ein Risiko dar. Das Ziel der Studie war daher, die Untersuchung der möglichen ektopen Ossifikation aufgrund der lokal aus der PDLLA-Beschichtung freigesetzten Wachstumsfaktoren zu untersuchen. Da bisherige Studien primär an Mäusen und Ratten erfolgten, die Wirkung in dieser Studie jedoch an einer dem Menschen näher verwandten Tierspezies erfolgen sollte, wurden unterschiedlich beschichtete Implantate in die Muskulatur von Schafen eingebracht und nach einer Standzeit von 84 Tagen auf mögliche Ossifikation untersucht.

Wildemann B, Kandziora F, Krummrey G, Palasdies N, Haas NP, Raschke M and Schmidmaier G

Local and controlled release of growth factors (combination of IGF-I and TGF-beta I, and BMP-2 alone) from a polylactide coating of titanium implants do not lead to ectopic bone formation in sheep muscle

Journal of Controlled Release 2004, 95:249-256

Die vorherigen Studien zeigten einen Einfluss der lokal applizierten Wachstumsfaktoren IGF-I und TGF-ß1 auf die frühe Phase der Frakturheilung und auf Osteoblasten und Osteoklasten in Kultur. In den in vivo -Untersuchungen wurde ein Rattenmodell verwendet, an welchem auch biomechanische und histologische Untersuchungen zu verschiedenen Zeitpunkten durchgeführt wurden [88,90,92]. In diesem Modell wurde die Fraktur durch einen intramedulären Kraftträger versorgt. In der Klinik ist neben der Marknagelung auch die Stabilisierung mittels einer Platte ein gängiges Verfahren. Daher sollte in dieser Studie die lokale Applikation von Wachstumsfaktoren von einer Plattenosteosynthese untersucht werden. Es wurde hierzu ein Rattenosteotomiemodell etabliert und eine beschichtete oder unbeschichtete Titanplatte zur Stabilisierung verwendet. Nach einer Standzeit von 42 Tagen erfolgte die biomechanische Torsionstestung und die histologische und histomorphometrische Auswertung des Osteotomiekallus.

Wildemann B, Bamdad P, Holmer C, Haas NP, Raschke M, Schmidmaier G.

Local delivery of growth factors from coated plates increases osteotomy healing in rats

BONE, 2004, 34:862-868