3  Zusammenfassende Diskussion

Zur Behandlung von Knochenbrüchen und -defekten stehen eine Vielzahl von Osteosynthesesystemen mit ausgereiften biomechanischen Eigenschaften zur Verfügung. Trotzdem kommt es noch zu einer relativ hohen Zahl an Komplikationen. Um diese Rate weiter zu reduzieren, werden verschiedenste Ansätze zur „Biologisierung“ von Osteosynthesen erforscht. Neben Oberflächenveränderungen wie Rauhigkeitsmodifikationen oder Hydroxylapatitbeschichtungen sind auch die ersten Wachstumsfaktoren in der orthopädischen Chirurgie zugelassen (OP-1, Stryker Biotech, USA; rhBMP-2/ACS, Wyeth, USA). Außer diesen beiden Faktoren aus der TGF-ß Superfamilie sind noch verschiedene weitere Faktoren an der Knochenbildung und -heilung beteiligt und derzeit Gegenstand intensiver Forschung [18,20,58,109]. Ein weiteres Forschungsfeld stellt die Applikationsmethode der Wachstumsfaktoren dar. Um den klinischen Ansprüchen Rechnung zu tragen, müssen die Applikationssysteme leicht zu handhaben sein, möglichst keine weiteren Eingriffe benötigen und eine gute Verträglichkeit ohne große Gewebsreaktionen aufweisen [54].

Das Ziel der vorliegenden Arbeiten war die Untersuchung der lokalen Applikation von Wachstumsfaktoren sowie der Biokompatibilität der Polymerbeschichtung mit speziellem Augenmerk auf die Frühphase der Heilung. Neben den in vivo Studien wurde in vitro der Effekt auf verschiedene frakturassoziierte Zelltypen analysiert.

Frühere Arbeiten konnten zeigen, dass die lokale Applikation von Wachstumsfaktoren (IGF-I, TGF-ß1, BMP-2) aus einer biodegradierbaren Polymerbeschichtung von Implantaten die Knochenheilung am Klein- und Großtiermodell beschleunigt [47,48,84,88,89,90,91]. Mittels Dosisfindungsstudien wurde die beste Wirkung der eingesetzten Wachstumsfaktoren bei der mittleren getesteten Konzentration (5% IGF-I und 1% TGF-ß1 in der Beschichtungsmasse) ermittelt [46]. Der Einsatz einer geringeren Konzentration hatte einen weniger stimulierenden Effekt, wobei die höhere Konzentration der mittleren nicht überlegen war. Die Untersuchung der Einzelfaktoren im Vergleich zur Kombination von IGF-I und TGF-ß1 ergab einen synergistischen Effekt auf die Knochenheilung [90]. Die Kombination war der Wirkung der einzelnen Faktoren deutlich überlegen. Die signifikanten Effekte der Wachstumsfaktoren auf die biomechanische Stabilität und histologische Kallusreifung nach 28 und 42 Tagen [88] [Seite 30↓]lassen eine Beeinflussung zellulärer Prozesse während der frühen Heilungsphase vermuten. Auf Grund dieser Überlegung wurden in den ersten zwei Publikationen der vorliegenden Arbeit die zellulären Prozesse der frühen Frakturheilung näher analysiert. Die beiden darauffolgenden Arbeiten hatten die Analyse des Wachstumsfaktoreneinflusses auf isolierte Zellen (Osteoblasten und Osteoklasten) zum Ziel. Ein weiterer wichtiger Aspekt beim Einsatz von Wachstumsfaktoren in der orthopädischen Chirurgie stellt das Risiko der ektopen Ossifikation dar. Daher wurde die Sicherheit des Applikationssystems hinsichtlich der Gefahr ektoper Ossifikationen durch Wachstumsfaktoren im Weichgewebe untersucht. Die letzte Studie hatte die Übertragung der Wachstumsfaktorenapplikation zur Beeinflussung der Knochenheilung von einer extramedullären Platte im Rattenmodel zum Ziel.

Zahlreiche in vitro- und in vivo-Studien belegen, dass Wachstumsfaktoren wie Insulin-like Growth Factor-I (IGF-I) und Transforming Growth Factor-ß1 (TGF-ß1) einen stimulierenden Effekt auf osteo- und chondrogene Zellen aufweisen und somit die Knochenheilung stimulieren können [62,71,72].

Beide Faktoren zeigten gemeinsame Effekte auf den Knochenstoffwechsel, wodurch ein synergistischer Effekt denkbar ist [82], welcher auch in eigenen Versuchen gezeigt werden konnte [90]. In vitro- und in vivo-Versuche ergaben eine dosisabhängige Wirksamkeit von IGF-I und TGF-β1 einzeln und kombiniert [100]. Die kombinierte Applikation verfügte über einen größeren stimulierenden Effekt auf die Zunahme der Knochenmatrix als die jeweilige Einzelapplikation [82]. Beide Faktoren stimulieren die Proliferation von Osteoprogenitorzellen und Osteoblasten während der Frakturheilung [69].

Zur Analyse der zellulären Effekte der lokal applizierten Wachstumsfaktoren erfolgten daher histologische und immunhistochemische Untersuchungen der frühen Zeitpunkte der Frakturheilung am Rattenmodell. Diese Studien zeigten eine fortgeschrittene Kallusreifung, die mit einem veränderten Proliferationsmuster verschiedener frakturassoziierter Zelltypen einherging. Das Proliferationsmuster der unbeeinflussten Heilung stellte sich wie folgt dar: es zeigte sich am Tag 5 nach der Fraktur eine starke Proliferation im Bindegewebe des sich bildenden Kallus. Am 10. Tag nach der Fraktur war eine starke Proliferationsaktivität in Chondrozyten im Randbereich des [Seite 31↓]knorpeligen Kallus und Osteoblasten im neu gebildeten Geflechtknochen detektierbar. Diese war am 15. Tag insgesamt geringer. Es waren aber immer noch PCNA-postitive Zellen im Bindegewebe, im Knorpelrandbereich und am Geflechtknochen zu sehen.

Vergleichbares konnte bereits in einer Arbeit von Iwaki et al. gezeigt werden [42]. Durch die lokale Applikation der Wachstumsfaktoren kam es zu einer früheren Kallusreifung mit dem Auftreten von proliferierenden Chondrozyten am Tag 5, weniger PCNA-positiven Osteoblasten am Tag 10 und einem früheren Auftreten knochenmarkähnlicher Strukturen sowie einer damit einhergehenden Proliferationsaktivität am Tag 15. Diese Ergebnisse deuten auf einen mitogenen Einfluss der WF auf die frühe Phase der Heilung hin und sind in Übereinstimmung mit früheren Arbeiten, die eine Bedeutung der Faktoren während der initialen Heilung, der Chondrogenese und der Knochenbildung beschrieben haben [22,39,40,44,45]. Als wichtiger Aspekt für die Biokompatibilität waren in den Untersuchungen keine Unterschiede aufgrund der Polymerbeschichtung und der Wachstumsfaktoren bezogen auf Fremdkörperreaktionen zu erkennen. Dies ist von großer Bedeutung, da für einige Biomaterialien auf Polymerenbasis negative Effekte wie vermehrte Makrophagenansammlung oder Bildung eines Resorptionssaums beschrieben worden sind [80]. Die verwendete PDLLA-Beschichtung zeigte jedoch keine unerwünschten Wirkungen in der Implantatumgebung. Die Lokalisation der Wachstumsfaktoren in den Gewebsschnitten auf Ebene der mRNA und des Proteins zeigte ein hohe Übereinstimmung zwischen den verwendeten Methoden. Diese Ergebnisse stimmen mit dem in der Literatur beschriebenen Expressionsmuster überein [2,30,75,96,97,111]. Durch die exogene Gabe der Faktoren waren in diesen Untersuchungen keine Änderungen der mRNA und Proteinexpression zu detektieren. Die Quantifizierung der Wachstumsfaktoren mittels ELISA ist stark von der Aufarbeitungsmethode des Gewebes abhängig. Aufgrund der Bindung der WF an Bindungsproteine oder Liganden und deren Freisetzung im sauren Milieu wurde die Gewebsaufarbeitung bei saurem pH-Wert durchgeführt. Die Dimension der gemessenen IGF-I- und TGF-ß1-Mengen im Gewebe sind mit denen anderer Arbeitsgruppen vergleichbar [33,52,102]. Die Untersuchungen wiesen deutliche Unterschiede in der Quantität der Wachstumsfaktoren im zeitlichen Verlauf auf.
TGF-ß1 zeigte vom Tag 5 an eine ca. 50%ige Erhöhung im frakturierten Knochen gegenüber dem unfrakturierten. Diese Erhöhung blieb bis zum Tag 15 erhalten. IGF-I [Seite 32↓]hingegen war am Tag 5 noch nicht erhöht, stieg aber vom Tag 10 bis zum Tag 15 stetig an.

Zwischen der unbeeinflussten Heilung und der durch WF stimulierten Heilung waren keine signifikanten Unterschiede in den IGF-I- und TGF-ß1-Konzentrationen messbar. Lediglich am Tag 15 war in der mit WF-behandelten Gruppe die IGF-I Konzentration bezogen auf das Gesamtprotein erhöht. Dies hängt mit dem Abfall der Proteingesamtmenge im Kallus am Tag 15 in der WF-Gruppe zusammen. Die Unterschiede in der Quantität der einzelnen Faktoren während der Heilung lassen auf ihre Bedeutung während der Heilung rückschließen. Die frühere und gleichmäßige Hochregulierung von TGF-ß1 deutet auf eine Bedeutung schon in der sehr frühen Heilung hin, wobei IGF-I erst zu einem späteren Zeitpunkt hochreguliert wird und somit scheinbar nicht bei der initialen Kallusbildung mitwirkt.

Die Untersuchungen der Frakturheilung zeigten einen positiven Einfluss von IGF-I und TGF-ß1. Die in vivo-Situation erlaubt jedoch keine direkten Rückschlüsse bezüglich der Wirkung der Wachstumsfaktoren auf individuelle Zelltypen. Die gesehenen Effekte könnten direkt durch die Wachstumsfaktoren beeinflusst sein oder aber das Ergebnis von Interaktionen lokaler wie systemischer Effekte sein. Daher wurden im Folgenden Zellkulturversuche mit primär isolierten Osteoblasten und fusionierten Osteoklasten durchgeführt.

In der Osteoblastenkultur kam es durch die Zugabe der Wachstumsfaktoren IGF-I und TGF-ß1 zu einer signifikant gesteigerten Kollagen 1-Synthese. Die Proliferation blieb weitgehend unbeeinflusst. Die reine Polymerbeschichtung zeigte keinen Effekt auf die Osteoblasten. Der Effekt von IGF-I und TGF-ß1 konnte auch in anderen Studien gezeigt werden [27,28,43,56,112]. Ein wichtiger Aspekt dieser Studie war die Untersuchung der Haltbarkeit der Wachstumsfaktoren in der Beschichtung. Es zeigte sich kein Unterschied in der Wirksamkeit zwischen den 5 und den 14 Monaten gelagerten Implantaten.

Da neben den knochenaufbauenden Osteoblasten den knochenresorbierenden Osteoklasten eine wichtige Funktion im Knochen und während der Heilung zukommt, wurde der Effekt der Wachstumsfaktoren auf diesen Zelltyp in vitro untersucht. Die [Seite 33↓]Aktivität der Osteoklasten wurde anhand von zwei Parametern betrachtet: der Fusionsrate von Monozyten zu mehrkernigen TRAP-positiven Zellen und der Resorptionsaktivität fusionierter Zellen (pit formation assay).

Die Ergebnisse beider Auswertmethoden zeigten eine Reduktion der Zellzahl und der Fusionslakunen durch die Applikation von PDLLA-beschichteten Titan-Proben mittels Tissue-Membranen. Dieser Effekt auf die Fusion wurde durch die Gabe IGF-I+TGF-ß1 beschichteter Proben wieder aufgehoben. BMP-2 steigerte die Resorptionsaktivität der Osteoklasten, jedoch nicht deren Fusionsverhalten. Diese Studie zeigte einen entwicklungsabhängigen Effekt der eingesetzten Wachstumsfaktoren. IGF-I und
TGF-ß1 wirken primär während der Osteoklastogenese während BMP-2 Einfluss auf die Resorptionsaktivität hat. In vivo-Studien mit PDLLA-beschichteten Schrauben konnten eine Reduktion der Osteoklastenanzahl und eine höhere Knochendichte in der PDLLA-Gruppe im Vergleich zur Titan-Gruppe messen [79] und stützen somit die Ergebnisse der in vitro-Studie. Zu der Wirkung der Wachstumsfaktoren sind in der Literatur positive Effekte von IGF-I, TGF-ß1 und BMP-2 auf Osteoklasten beschrieben [36,49,68,77,83], welche mit den hier vorgestellten Ergebnissen einhergehen. Bei den bisherigen Studien wurde jedoch weder die Abhängigkeit vom Entwicklungsstadium der Osteoklasten berücksichtigt noch der Effekt mehrerer Wachstumsfaktoren gleichzeitig untersucht.

Da bei der Kontrollgruppe keine Tissue-Membran zugegeben wurde, muss in weiteren Studien eine mögliche störende Interaktion der Membran mit den Zellen geklärt werden.

In zahlreichen in vivo-Studien an Maus und Ratte konnte eine ektope Ossifikation durch die Gabe von BMP-2 im Muskelgewebe induziert werden [15,74,76,106,110]. Ektope Ossifikationen stellen jedoch einen unerwünschten Effekt dar und sollten bei einem geeigneten Applikationssystem und durch die Wahl der Wachstumsfaktorenkonzentration nicht auftreten. In einem Großtiermodell wurde eine potentielle ektope Ossifikation durch die lokale Applikation von Wachstumsfaktoren im Muskelgewebe untersucht. Dazu wurden polymerbeschichtete Titanplättchen mit Wachstumsfaktoren in den Muskel implantiert. Die Applikation der Wachstumsfaktoren (BMP-2 und Kombination von IGF-I und TGF-ß1) mittels der Polymerbeschichtung [Seite 34↓]induzierte keine ektopen Ossifikationen im Schafsmuskel nach 84 Tagen. Es zeigte sich jedoch über den WF-beschichteten Seiten der Plättchen eine vergrößerte fibröse Kapsel, die auf den Einfluss der WF zurückzuführen ist. Der Applikationszeitraum (84 Tage) wurde in Anlehnung an andere Studien gewählt und hatte dort zu ektopen Ossifikationen nach BMP-2 Gabe geführt [70,76,110]. Es ist daher nicht anzunehmen, dass es zu einem späteren Zeitpunkt zu Ossifikationen kommen würde. In dem untersuchten Gewebe waren auch keine Knorpelzellen zu finden, welche in anderen Studien vor der Ossifikation im Gewebe detektierbar waren [70]. Erklärungen für das Fehlen ektoper Ossifikationen im Muskelgewebe nach BMP-2 Applikation könnten zum einen die Applikationsform und Dosierung und zum anderen die verwendete Tierspezies sein. Es ist bekannt, dass WF einen dosisabhängigen Effekt haben. Die eingesetzte Beschichtung von Implantaten setzt ca. 50% der eingearbeiteten Faktoren initial in den ersten 48 Stunden frei (IGF-I: 25µg, TGF-ß1: 5µg, BMP-2: 25µg) gefolgt von einer kontinuierlichen Freisetzung weiterer 30% in den folgenden 40 Tagen [93]. Es ist möglich, dass diese Dosierung keinen osteoinduktiven Effekt auf mesenchymale Vorläuferzellen hat. Auch in anderen Studien konnte eine dosisabhängige ektope Ossifikation gesehen werden [51,74]. Geringe Dosen von BMP-2 appliziert von Calciumphosphat-Trägermaterial oder Kollagen führten zu keiner Ossifikation, wobei höhere Dosierungen Ossifikationen bewirkten. Dieses Studien wurden an Makaken-Affen und Ratten durchgeführt.

Ebenso wurde keine ektope Knochenbildung durch BMP-2 in einem anderen Schafsmodell nachgewiesen, wobei die gleiche Applikation im Nager zur ektopen Knochenbildung führte [61]. Hier könnte ein spezies-spezifischer Effekt vorliegen.

In der Literatur sind bisher keine Studien veröffentlicht, die Osteoinduktionen in nicht- skelettalem Gewebe durch die Gabe von IGF-I beschreiben. In lediglich einer Studie konnten durch die TGF-ß1-Gabe ektope Ossifikationen bei Primaten hervorgerufen werden [29].

Die Wirksamkeit der lokal applizierten WF auf die Knochenheilung wurde jedoch in früheren Schafsstudien gezeigt. Hier bewirkte die lokale Applikation von WF aus der Polymerbeschichtung eine signifikant verbesserte Wirbelkörperfusion bei Schafen [47,48], so dass die Wirkung der Faktoren auf die Knochenheilung im Schaf bestätigt ist.

Die vorherigen Studien untersuchten den Einfluss der lokal von intramedullären Kraftträgern applizierten Wachstumsfaktoren auf die Knochenheilung. Da auch die Plattenosteosynthese ein gängiges Verfahren in der Klinik darstellt, sollte die Applikation der Wachstumsfaktoren von einer extramedullär angebrachten Plattenosteosynthese im Rattenmodell untersucht werden. Nachdem ein Kleintiermodell zur Plattenosteosynthese etabliert werden konnte, wurde der Effekt der Wachstumsfaktoren auf die Heilung untersucht. Die Konzentration der Wachstumsfaktoren und die Auswertmethoden waren identisch mit denen der Marknagelung und ließen somit einen Vergleich zu [88]. Nach 42 Tagen zeigte sich eine verbesserte Osteotomieheilung anhand der biomechanischen und histomorphometrischen Untersuchungen. Das maximale Drehmoment und die Mineralisation des Kallus waren durch die Wachstumsfaktorengabe signifikant erhöht.

Vergleicht man beide Modelle, so zeigte sich in der Kontrollgruppe, dass die Fraktur mit Marknagelung schneller verheilt als die Osteotomie mit Plattenosteosynthese. Sowohl die biomechanische Stabilität als auch die histomorphometrischen Parameter wiesen auf eine bessere Heilung der Fraktur hin.

Die lokale Applikation der Wachstumsfaktoren IGF-I und TGF-ß1 führte in beiden Modellen zu einer signifikanten Beschleunigung der Heilung, während der Heilungsfortschritt auch hier bei der Marknagelung deutlicher war.

Dieser Effekt kann durch die Unterschiede im Knochenheilungsmodell erklärt werden. Zum einen wies das Osteotomiemodell einen Spalt von 0,6 mm auf, wobei es beim Frakturmodell zu keinem Spalt kam. Hier kann eine Ursache für die langsamere Heilung in der Kontrollgruppe des Osteotomiemodells liegen. Auch die Applikationsform der Wachstumsfaktoren kann die Unterschiede erklären. Bei der Marknagelung wurden die Faktoren zirkulär im gesamten Markraum freigesetzt. Aufgrund der Freisetzung von der Platte kam es zu einer unilateralen Applikation von der Knochenaußenseite aus, wodurch keine gleichmäßige Verteilung erreicht wurde.

Trotz der Unterschiede in der Heilung zwischen den Modellen konnte gezeigt werden, dass eine Stimulation der Knochenheilung durch lokale Applikation von Wachstumsfaktoren von einer Plattenosteosynthese möglich ist.