3.  Zusammenfassung

Bakterielle R/M-Systemegreifen solche DNA endonukleolytisch an, die nicht die spezifische Markierung der eigenen Wirtszelle trägt, und restringieren auf diese Weise den DNA-Transfer in die Wirtszelle. Es wird allgemein diskutiert, dass die biologische Funktion der R/M-Systeme in der Abwehr von viralen Infektionen besteht. Dieser Funktion entsprechend, erkennen die dimeren TypII-Restriktionsendonukleasen kurze spezifische, unmethylierte Basensequenzen, die sie in Anwesenheit von Mg²⁺ Ionen an einer definierten Position endonukleolytisch spalten. Die Spaltung des DNA-Doppelstranges erfolgt nach spezifischer DNA-Erkennung und Aktivierung der beiden katalytischen Zentren ^_ eines pro monomerer Enzym-Untereinheit.

Unsere Untersuchungen an der Restriktionsendonuklease EcoRII haben erstmals gezeigt, dass Enzyme existieren, die in ihren Eigenschaften von der engen Definition dieser sogenannten orthodoxen TypII-Restriktionsendonukleasen abweichen. Sie brauchen die koordinierte Wechselwirkung mit zwei Kopien ihrer Erkennungssequenz, um katalytisch aktiv sein zu können. Durch den Anspruch, dass DNA-Spaltung nur dann möglich ist, wenn gleichzeitig zwei Erkennungsorte zur Verfügung stehen, erscheint EcoRII für die Aufgabe der Abwehr von Virus-Infektionen deutlich weniger geeignet als die orthodoxen TypII-Restriktionsendonukleasen und es entstand die interessante Frage nach anderen zusätzlichen zellulären Funktionen von EcoRII. Möglicherweise ist die Abhängigkeit von zwei DNA-Erkennungsorten als eine Art Sicherheitsmechanismus zu betrachten, der die zelluläre DNA beim Vorliegen einzelner unmethylierter Erkennungssequenzen vor suizidaler Restriktion schützt.

Inzwischen haben biochemische und vor allem strukturelle Daten eindrucksvoll belegt, dass die große Gruppe der TypII-Restriktionsendonukleasen weitaus heterogener ist als einmal angenommen. EcoRII war das erste Enzym, das nachweislich mit zwei Kopien seiner Erkennungssequenz wechselwirkt. Inzwischen kennt man mehr als zehn Vertreter solcher Enzyme, die jetzt als TypIIE-Restriktionsendonukleasen bezeichnet werden.

Eine monomere EcoRII-Untereinheit besteht aus zwei stabilen Proteindomänen ^_ einer C-terminalen katalytisch aktiven Endonuklease-Domäne und einer N-terminalen (zusätzlichen) [Seite 37↓]DNA-Bindungsdomäne, die beide spezifisch mit der DNA wechselwirken. Die DNA-Bindungsdomänen beider EcoRII-Monomere binden zunächst einen der beiden EcoRII-Erkennungsorte in der DNA, den Aktivator oder allosterischen Effektor. Diese Bindung geht mit Konformationsänderungen des Proteins einher und aktiviert die beiden Endonuklease-Domänen, den zweiten EcoRII-Erkennungsort (Substrat) zu binden und zu spalten. Die beiden nicht identischen Substratbindungsorte im EcoRII-Dimer können mit der gleichen DNA-Sequenz wechselwirken. Die aktive Form des Enzyms besteht aus der dimeren EcoRII-Restriktionsendonuklease und zwei DNA-Erkennunungsorten. Im aktiven Komplex ist der DNA-Erkennungsort, der an die beiden C-terminalen Endonuklease-Domänen von EcoRII gebunden ist, das Substrat und wird gespalten.

Die C-terminale Domäne von EcoRII (EcoRII-C), separat in E. coli exprimiert und aufgereinigt, liegt in Lösung als Dimer vor. Die trunkierte Endonuklease spaltet DNA spezifisch und unabhängig von einem zweiten EcoRII-Erkennungsort. Die Reaktion verläuft deutlich schneller als die des kompletten EcoRII-Proteins. Mit diesen Arbeiten konnten wir erstmals zeigen, daß durch die Verkürzung einer Restriktionsendonuklease deren Spezifität gezielt verändert werden konnte ^_ von 5‘CCWGG-(X)_n-CCWGG (EcoRII-WT) auf 5‘CCWGG (EcoRII-C). Die Ergebnisse lassen die Vermutung zu, dass die Trunkierung von Restriktionsendonukleasen, die die Wechselwirkung mit zwei Erkennungsorten benötigen, eine generelle experimentelle Strategie sein könnte, um deren katalytische Aktivität zu verbessern.

Da die C-terminale Endonuklease-Domäne von EcoRII an sich die DNA spezifisch spalten kann wie eine orthodoxe TypII-Restriktionsendonuklease, stellt sich die Frage nach der Funktion der N-terminalen DNA-Bindungsdomäne. Denkbar wäre, daß eine „Vorläufer-Endonuklease“ von EcoRII im Verlauf der Evolution eine zusätzliche DNA-Bindungsdomäne akquiriert hat. Diese zweite DNA-Bindungsdomäne attenuiert einerseits die endonukleolytische Aktivität der „Vorläufer-Endonuklease“, ermöglicht nun aber andererseits die gleichzeitige Wechselwirkung mit zwei DNA-Erkennungsorten.

Die Eigenschaft von EcoRII mit zwei Erkennungssequenzen in der DNA gleichzeitig zu interagieren sowie die Identifizierung konservierter funktioneller Aminosäuren in EcoRII und der Familie der Integrasen macht eine evolutionäre Verbindung zwischen diesen Enzymen wahrscheinlich. Konservierte Restriktionsendonuklease-ähnliche Strukturen wurden auch in [Seite 38↓]einer Reihe von Enzymen gefunden, die an Prozessen wie DNA-Transposition, -Rekombination und -Reparatur in Prokaryoten, Eukaryoten und Archaea beteiligt sind. Die Akquirierung einer zusätzlichen DNA-bindenden Domäne durch EcoRII könnte ein Schritt auf dem Weg zu neuen Proteinfunktionen sein. Neben der Spaltung von Phosphodiesterbindungen könnte EcoRII dann auch die Verbreitung der EcoRII-codierenden DNA-Sequenz in neue Populationen, ähnlich einem transponiblen Element, realisieren.