Matthias Glanemann: ,,Mechanische und pharmakologische Organkonditionierung im Rahmen warmer Leberischämie: Bedeutung für den Ischämie-Reperfusionsschaden und die hepatozelluläre Regeneration nach partieller Hepatektomie im Tiermodell‘‘ |
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,,Mechanische und pharmakologische Organkonditionierung im Rahmen warmer Leberischämie: Bedeutung für den Ischämie-Reperfusionsschaden und die hepatozelluläre Regeneration nach partieller Hepatektomie im Tiermodell‘‘
Habilitationschrift
zur Erlangung der Lehrbefähigung
für das Fach
Chirurgie
vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité - Universitätsmedizin Berlin
von
Dr. med. Matthias
Glanemann
geboren am 29.09.1969 in Münster/Westfalen
Dekane: Prof. Dr. med. Joachim W. Dudenhausen
Prof. Dr. med. Martin Paul
eingereicht am: August 2004
öffentlich-wissenschaftlicher Vortrag am: 23. Mai 2005
Gutachter:
1. Prof. Dr. Michael D. Menger, Homburg/Saar
2. Prof. Stefan Post, Mannheim
Inhaltsverzeichnis
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A. Einleitung
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1. Partielle Hepatektomie
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2. Ischämie/Reperfusionsschädigung
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3. Strategien zur Protektion vor Ischämie/Reperfusionsschädigung
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3.1. pharmakologische Präkonditionierung (Methylprednisolon)
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3.2. ischämische Präkonditionierung
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B. Fragestellung
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C. Material und Methoden
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1. Versuchstiere, -haltung
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2. Versuchsprotokolle
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2.1. Projekt 1 – IP-Zeitprotokoll
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2.2. Projekt 2 – warme Leberischämie
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2.3. Projekt 3 – warme Leberischämie und partielle Hepatektomie (70%)
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2.4. Projekt 4 – warme Leberischämie und partielle Hepatektomie (90%)
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3. Narkose, Operation
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4. Analysen (Parameter und Analysetechniken)
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4.1. Serumparameter (Albumin, Bilirubin, AST, ALT, GLDH)
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4.2. Histologische Färbung (Hepatozelluläre Schädigung, Mitose Index, Inflammatorisches Infiltrat)
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4.3. Immunhistochemie (TUNEL, Ki67)
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4.4. Myeloperoxidase (MPO)-Gewebskonzentration der Leber
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4.5. Hepatische Mikrozirkulation (Intravitalmikroskopie, Laserdopplerflowmetrie)
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4.6. Bestimmung der Proteinkonzentration
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4.7. Western Blot (Caspase 3)
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4.8. Reverse Transkriptase-Polymerase Ketten Reaktion (ICAM-1, Cytochrom C)
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4.9. Electrophoric Mobility Shift Assay (NFkB)
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4.10. Statistik
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D. Ergebnisse
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1. Projekt 1 – IP-Zeitprotokoll
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1.1. Hepatozellulärer IR Schaden (Serumkonzentrationen AST, ALT, GLDH)
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1.2.
Zusammenfassung Projekt 1
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2. Projekt 2 – warme Leberischämie
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2.1. Hepatozellulärer IR Schaden (Serumkonzentrationen AST, ALT, GLDH, HE-Färbung)
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2.2. Apoptose (Cyctochrom C mRNA, Caspase 3 Protein, TUNEL Färbung)
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2.3. Inflammation (ICAM-1 mRNA, inflammatorisches Infiltrat, Myeloperoxidase)
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2.4. Nukleärer Transkriptionsfaktor NFkB
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2.5. Mikrozirkulation (sinusoidale Perfusion, Leukozyten/Endothelzell-Interaktion, NADH-Fluoreszenz, Gallefluß)
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2.6.
Zusammenfassung Projekt 2
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3. Projekt 3 – warme Leberischämie und partielle Hepatektomie (70%)
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3.1. Resektion und hepatozellulärer IR Schaden (Serumkonzentrationen AST, ALT, GLDH)
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3.2. Regeneration (Körpergewicht, Lebergewicht, prozentuales Lebervolumen)
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3.3.
Regeneration (Ki-67 Färbung, Mitose Index)
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3.4.
Zusammenfassung Projekt 3
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4. Projekt 4 – warme Leberischämie und partielle Hepatektomie (90%)
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4.1. Überleben
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4.2. Laserdopplerflowmetrie
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4.3. Mikrozirkulation (sinusoidale Perfusion, velocity, volumetric blood flow, Leukozyten/Endothelzell-Interaktion)
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4.4. Zusammenfassung Projekt 4
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E. Diskussion
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1. pharmakologische Präkonditionierung mit Methylprednisolon (Protektion vor Ischämie/Reperfusionsschädigung, Wirkmechanismus)
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2. Methylprednisolon im Resektionsmodell (Protektion vor Ischämie/Reperfusionsschädigung, Regenerationskinetik)
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3. Ischämische Präkonditionierung (IP-Zeitintervall, Protektion vor Ischämie/Reperfusionsschädigung, Wirkmechanismus)
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4. Ischämische Präkonditionierung im Resektionsmodell (Protektion vor Ischämie/Reperfusionsschädigung, Regenerationskinetik, Hyperperfusions-Syndrom)
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F. Zusammenfassung
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Literaturverzeichnis
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Danksagung
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EIDESSTATTLICHE VERSICHERUNG
Tabellen
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Tabelle 1: Projekt 1 / verschiedene IP-Zeitintervalle
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Tabelle 2: Histologisches Grading [Bilbao 1999]
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Tabelle 1: Hepatozelluläre Schädigung nach einem histomorphologischen Score nach Bilbao [Bilbao 1999]. Angegeben sind Mittelwert ± SEM. * p<0,05 für Kontrolle versus MP; + p<0,01 für Kontrolle versus IP und MP
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Tabelle 2: TUNEL positive Zellen [%]. Angegeben sind Mittelwert ± SEM. # p<0,05 für Kontrolle versus IP und MP; * p<0,05 für Kontrolle versus MP; + p<0,01 für Kontrolle versus IP und MP
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Tabelle 3: Leukozytäres Infiltrat [n/Gesichtsfeld]. Angegeben sind Mittelwert ± SEM. # p<0,05 für Kontrolle versus IP und MP
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Tabelle 4: Myeloperoxidase-Spiegel [mU/mg]. Angegeben sind Mittelwert ± SEM. # p<0,05 für Kontrolle versus IP und MP
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Tabelle 5: NADH Fluoreszenz [aU]. Angegeben sind Mittelwert ± SEM. # p<0,05 für Kontrolle versus IP; * p<0,05 für Kontrolle versus Basalwert.
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Tabelle 6: Körpergewicht, Gewicht der resezierten Leber und Verhältnis von Resektat zu Körpergewicht sowie die Serumkonzentrationen von AST, ALT und GLDH 6 h nach Reperfusion. Angegeben sind Mittelwert ± SEM. # p<0,05 für Kontrolle versus IP und MP
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Tabelle 7: Laborchemische Analysen von AST, ALT, Albumin und Bilirubin. Angegeben sind Mittelwert ± SEM. # p<0,05 für IP versus Kontrolle und MP. * p<0,05 für MP versus IP und Kontrolle
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Tabelle 8: Körpergewicht, Gewicht der resezierten Leber und Verhältnis von Resektat zu Körpergewicht. Angegeben sind Mittelwert ± SEM.
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Tabelle 9: Leukozytenadhärenz und NADH Fluoreszenz nach 90%-iger Leberresektion mit 30 min warmer Ischämie. Angegeben sind Mittelwert ± SEM.
Bilder
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Abbildung 1: Pathophysiologie des hepatischen Ischämie/Reperfusionsschaden [Glanemann 2003]
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Abbildung 2: Struktur des Methylprednisolon
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Abbildung 3: Parenchymmasse vor bzw. nach 70%-iger und 90%-iger Leberresektion einer 200-300 g schweren Wistar-Ratte (Verlauf der V. cava inferior - Plastikschlauch)
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Abbildung 4: Serumkonzentrationen von AST (A), ALT (B) und GLDH (C) in U/l 24 h nach 45-minütiger warmer Leberischämie bei sham operierten Tieren, unbehandelten Ischämietieren und mit verschiedenen IP-Zeitintervallen vorbehandelten Tieren (Box-and-Whisker-Plots)
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Abbildung 5: Serumkonzentrationen von AST, ALT und GLDH nach 45-minütiger warmer Leberischämie (
Ischämie;
I/P-Behandlung;
MP-Behandlung)
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Abbildung 6: Hepatozelluläre IR Schädigung (HE-Färbung 400-fach)
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Abbildung 7: Darstellung der Proteinexpression von Cytochrom C im Zeitverlauf
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Abbildung 8: Darstellung der Proteinexpression von Caspase3/32 im Zeitverlauf
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Abbildung 9: Darstellung der mRNA- Expression von ICAM-1 im Zeitverlauf
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Abbildung 10: Darstellung der NFkB Kernproteinexpression
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Abbildung 11: Darstellung der NFkB Untereinheiten NFkB1 p50, NFkB2 p52, RelA p65, c-Rel, Rel-B mittels Supershift- und Competitionanalyse
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Abbildung 12: Darstellung der sinusoidalen Perfusion in der Rattenleber nach einer 45 minütigen warmer Ischämie. Angegeben sind Mittelwert ± SEM. # p<0,05; ## p<0,01
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Abbildung 13: Darstellung der sinusoidalen und postsinusoidalen Leukozytenadhärenz nach 45-minütiger warmer Leberischämie. Angegeben sind Mittelwert ± SEM
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Abbildung 14: Gallefluß nach 45-minütiger Leberischämie in IP-behandelten und unbehandelten Kontrolltieren. Angegeben sind Mittelwert ± SEM. # p<0,05 für Kontrolle versus IP
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Abbildung 15: Körpergewicht (A), Restparenchym (B) und Restleber pro Körpergewicht (C) nach Leberresektion. Angegeben sind Mittelwert ± SEM. # p<0,05 für Kontrolle versus MP. * p<0,05 für Kontrolle versus IP
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Abbildung 16: Ki-67 positive Hepatozyten (A) und Mitose Index (B) als Regenerationsparameter nachg 70%-iger Leberresektion. Angegeben sind Mittelwert ± SEM. # p<0,05 für IP versus Kontrolle und MP
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Abbildung 17: Repräsentative Immunhistochemische Färbungen mit Darstellung von Ki-67 positiven Hepatozyten an Tag 1 nach Resektion (600-fach)
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Abbildung 18: Repräsentative HE-Färbungen mit Darstellung von mitotischen Hepatozyten an Tag 1 nach Resektion (600-fach)
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Abbildung 19: Überleben nach 90%-iger Leberresektion. # p<0,05 für IP-Behandlung versus MP-Behandlung.
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Abbildung 20: Portale Leberperfusion nach 90%-iger Leberresektion. Angegeben sind Mittelwert ± SEM. # p<0,05 für IP-Behandlung versus Kontrolle. * p<0,05 für IP-Behandlung versus Kontrolle und MP-Behandlung
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Abbildung 21: Perfundierte Sinusoide nach 30-minütiger Ischämie ohne bzw. mit Resektion
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Abbildung 22: Velocity (A) und Volumetric blood flow (B) nach 90%-iger Leberresektion mit 30 min warmer Ischämie. Angegeben sind Mittelwert ± SEM. # p<0,05 für IP versus Kontrolle
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DiML DTD Version 4.0 | Zertifizierter Dokumentenserver der Humboldt-Universität zu Berlin | HTML-Version erstellt am: 19.10.2005 |