Mencke, Thomas: Thema: “DNA-Polymorphismus des endothelialen leukozytären Adhäsionsmoleküls-1 bei Patienten (unter 50 Jahren) mit interventionsbedürftigen Koronararterienstenosen”

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Kapitel 2. Material und Methoden

2.1. Charakterisierung des Patientenkollektivs

2.1.1. Einschlußkriterien

  1. Männliche oder weibliche Patienten der europiden Rasse, die mindestens eine angiografisch nachgewiesene, interventionsbedürftige Koronararterienstenose hatten und zum Zeitpunkt des Studienbeginns 50 Jahre oder jünger (le50 Jahre) waren. Interventionsbedürftige Koronararterienstenosen wurden definiert als ge50% Stenosen der Koronararterien, die einer therapeutischen Intervention (PTCA, DCA, ACVB, IMA-Bypass) bedurften.
  2. Zustimmung des Patienten nach lege artis durchgeführter Aufklärung

2.1.2. Anzahl, Alter und Geschlecht der Patienten

Es wurden 92 Patienten untersucht, die alle dem europiden Rassenkreis angehören und die sich nach Alter und Geschlecht folgendermaßen ordnen lassen:

Tabelle 14 Anzahl, Alter und Geschlecht der Patienten (<50 Jahre=Patienten mit 50 Jahren oder jünger, <50/>40 Jahre=Patienten mit 50 Jahren oder jünger und älter als 40 Jahre, <40 Jahre=Patienten mit 40 Jahren oder jünger)

Patienten in Jahren

Anzahl der Patienten

n

Männlich/ weiblich

n

Median in Jahren

Min./Max. in Jahren

< 50

92

82/10

44

27/50

< 50/> 40

51

45/6

47

43/50

< 40

41

37/4

40

27/40

2.1.3. Die Diagnosesicherung mit der Koronarangiografie

Die Herzkatheteruntersuchung ist die derzeit genaueste Untersuchungsmethode und Goldstandart bei der Diagnostik der koronaren Herzkrankheit (Fuster et al. 1992a siehe , Fuster et al. 1996 siehe , Gross et al. 1996 siehe ). Die angiografische Darstellung eines veränderten Gefäßlumens ist der beste Beweis einer Arteriosklerose (Isselbacher et al. 1995 siehe ). Ausdehnung und Schweregrad einer koronaren Herzkrankheit lassen sich objektivieren (Classen et al. 1994 siehe ). Außerdem kann nur die genaue Kenntnis der Koronaranatomie (Lokalisation und Ausmaß der Stenosen) über die Notwendigkeit und Art von Revaskularisationsmaßnahmen (katheterinterventionell oder chirurgisch) entscheiden (Classen et al 1994 siehe ).


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Alle Patienten sind während des augenblicklichen (n=86) oder während früherer Krankenhausaufenthalte (n=2) in der Charité (n=88) oder in anderen Krankenhäusern (n=4) koronarangiografisch untersucht worden. Das Zeitintervall der Koronarangiografien von augenblicklichen zu früheren Krankenhausaufenthalten variierte von Monaten zu Jahren. Diese Patienten wurden eingeschlossen, wenn sie seitdem katheterinterventionell (PTCA, DCA) und/oder chirurgisch (ACVB, IMA-Bypass) revaskularisiert worden waren.

Angiografisches Kriterium einer Arteriosklerose war das Vorkommen von mindestens einer Stenose von 50% oder mehr bzw. eine hochgradige Stenose von mindestens einer Koronararterie, die interventionspflichtig war. Gould et al. untersuchten 1974, ob eine Korrelation zwischen dem Grad der Stenose und der Reduzierung des Blutflußes existiert. Ab einer Stenose ge50% zeigte sich eine Verringerung der Koronarreserve (Steigerung der Ruhedurchblutung in den Koronararterien um den Faktor 5; Fuster et al. 1996 siehe , Stobbe et al. 1996 siehe , Zink et al. 1990 siehe ).

Die Einteilung der koronaren Herzkrankheit erfolgte in Abhängigkeit vom Ausmaß und der Lokalisation der Stenosen (ge50% Stenose) in der linken Herzkranzarterie (LCA) mit ihren Hauptästen Ramus interventricularis anterior (RIVA) und Ramus circumflexus (RCX) sowie der rechten Herzkranzarterie (RCA) in 1-, 2- oder 3-Gefäß-Erkrankung (Classen et al. 1994 siehe , Fuster et al. 1996 siehe ).

Die statistische Auswertung erfolgte anhand der Unterteilung in Eingefäßerkrankung und Mehrgefäßerkrankung (2- und 3-Gefäßerkrankung). Alle koronarangiografischen Befunde sind durch Herrn Prof. S. Felix (Leitender Oberarzt der I. Medizinischen Klinik) und Herrn Prof. F. Kleber begutachtet worden. Die Tabellen 15 und 16 geben einen Überblick über die Art der Gefäßerkrankung.

Tabelle 15 Die Anzahl der Patienten n mit einer 1-, 2- und 3-Gefäßerkrankung

  Anzahl der Patienten n
Patienten in Jahren 1-Gefäß-erkrankung 2-Gefäß-erkrankung 3-Gefäß-erkrankung
< 50 44 32 14
< 50/ > 40 20 23 8
< 40 24 9 6


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Tabelle 16 Der prozentuale Anteil der Patienten mit einer 1-, 2- und 3-Gefäßerkrankung

  Anteil der Patienten in %
Patienten in Jahren 1-Gefäßerkrankung 2-Gefäßerkrankung 3-Gefäßerkrankung
< 50 48,9 35,6 15,5
< 50/ > 40 39,2 45,1 15,7
< 40 61,5 23,1 15,4

2.1.4. Interventionen

Ein Einschlußkriterium des Patientenkollektivs betraf die Interventionspflichtigkeit der Koronararterienstenosen, also der koronaren Herzkrankheit. Interventionspflichtige Maßnahmen umfaßten katheterinterventionelle Behandlungen, wie die perkutane transluminale koronare Angioplastie (PTCA) und die direktionale koronare Atherektomie (DCA), sowie kardiochirurgische Maßnahmen, wie die aortokoronare Venenbypass(ACVB)-Operation und die Arteria-mammaria-interna-Bypass(IMA-Bypass)-Operation. 7 Patienten (7,9%) sind sowohl katheterinterventionell als auch chirurgisch behandelt worden. Kriterien der interventionspflichtigen Koronararterienstenosen der Patienten umfaßten das Stellen der Indikation für eine Revaskularisationsmaßnahme infolge der durchgeführten Koronarangiografie sowie bereits erfolgte Revaskularisationsmaßnahmen an der Charité oder an anderen Krankenhäusern. Diese bereits erfolgten Interventionen lagen Monate bis Jahre zurück. 53 Patienten (57,6%) waren zum Zeitpunkt der Studie bereits interventionell therapiert worden. Die Tabelle 17 zeigt, welche Interventionen bei den Patienten durchgeführt wurden bzw. welche Indikation zur Therapie gestellt wurde.

Tabelle 17 Übersicht über die Interventionen (Anmerkung: Bei 4 Patienten besteht z.Z. keine interventionelle Möglichkeit)

  Katheterinter- ventionen (PTCA, DCA) Bypass-Op Katheterinter- ventionen +Bypass-Op PTCA- oder Bypass-Op-Indikation
Interventionen n=88 51 27 7 3
Anteil der Interventionen in % 57,9 30,8 7,9 3,4


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2.2. Studienaufbau

Die Studie begann im September 1992 und war im Dezember 1995 abgeschlossen. Nach erfolgter Aufklärung der Patienten und Zustimmung zur Aufnahme in die Studie wurde die Befragung der Patienten anhand standardisierter Erhebungsbögen durchgeführt.

Die Erhebungsbögen beinhalteten Fragen zur Eigenanamnese und Familien-anamnese kardiovaskulärer Erkrankungen sowie erfolgten Interventionen und Fragen zu möglichen Risikofaktoren, wie Zigarettenrauchen, Hyperlipidämie, Diabetes mellitus und Hypertonie. Außerdem wurde die Medikamentenanamnese im Hinblick auf Antidiabetika, Antihypertensiva und lipidsenkende Pharmaka erhoben.

Weiterhin erfolgte die Blutdruckmessung, die Bestimmung von anthropometrischen Daten (Größe, Gewicht) und eine einmalige venöse Blutentnahme zur Bestimmung von Cholesterin, HDL-Cholesterin, Triglyzeriden und Blutzucker sowie zur DNA-Polymorphismusanalyse. Das Blut für die DNA-Polymorphismusanalyse wurde sofort im Kühlschrank bei -70°C tiefgefroren.

Alle ermittelten Daten wurden in den Erhebungsbögen vermerkt und am Ende der Studie analysiert.

2.2.1. Patientenrekrutierung

Die Rekrutierung der Patienten erfolgte über die kardiologischen Stationen 15 und 16 und die kardiologische Intensivstation IIa der I. Medizinischen Klinik der Charité, wo sich die Patienten stationär wegen der Diagnostik bzw. der Therapie einer koronaren Herzkrankheit aufhielten. Außerdem konnten ungefähr ein Drittel der Patienten durch Einbestellung in die kardiologische Ambulanz der I. Medizinischen Klinik der Charité in die Studie aufgenommen werden. Anhand der Analyse von Koronarangiografiebefunden von Patienten, die im Herzkatheterbereich der I. Medizinischen Klinik der Charité untersucht worden waren, ist diese letzte Gruppe entstanden.

2.2.2. Aufklärungsgespräch

Der Patient wurde über den Ablauf und das Ziel der Studie aufgeklärt. Nur bei Zustimmung zur DNA-Polymorphismusanalyse der Blutprobe, erfolgte die Aufnahme in die Studie (siehe Einschlußkriterien).

2.2.3. Bestimmung der Risikofaktoren

Als Risikofaktoren definiert man Variablen, die in einer prospektiven Untersuchung in statistischer Beziehung zu einer später auftretenden Krankheit stehen, ohne aber deren Ursache sein zu müssen (Hecht et al. 1988 siehe ). Diese bestimmte Anzahl von Bedingungen sind bei Personen, die eine Arteriosklerose entwikkeln, häufiger als in der Gesamtpopulation (Isselbacher et al. 1995 siehe ). Folgende


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Risikofaktoren wurden untersucht: männliches Geschlecht, Eigenanamnese einer peripheren arteriellen Verschlußkrankheit oder einer koronaren Herzkrankheit, Familienanamnese einer koronaren Herzkrankheit (bei Eltern oder Geschwistern), Zigarettenrauchen, Hyperlipidämie, niedriges HDL-Cholesterin (<0,9 mmol/l bzw. <35 mg/dl), Diabetes mellitus, Adipositas und arterielle Hypertonie (Assmann 1990 siehe , Classen et al. 1994 siehe , Gross et al. 1996 siehe , Stobbe et al. 1996 siehe , Study group 1987 siehe , Study group 1988 siehe ). Hypercholesterinämie, Hypertonie und Zigarettenrauchen sind die drei Hauptrisikofaktoren für die Entstehung einer koronaren Herzkrankheit (Assmann 1990 siehe , Isselbacher et al. 1995 siehe ).

2.2.3.1. Männliches Geschlecht

Die Patientengruppe (n=92) setzte sich aus 82 männlichen und 10 weiblichen Patienten zusammen (siehe unter Charakterisierung des Patientenkollektivs).

5 bis 10 % der männlichen Bevölkerung in der Bundesrepublik Deutschland leiden an einer koronaren Herzerkrankung, wobei das Geschlechterverhältnis Männer : Frauen bei 4:1 liegt (Classen et al. 1994 siehe ). Im höheren Lebensalter wird das Verhältnis annähernd gleich (Fuster et al. 1996 siehe ). Eine Behandlung von Männern nach Myokardinfarkt mit Östrogen verstärkte die koronare Herzkrankheit (KHK), bei postmenopausalen Frauen scheint sich die Inzidenz der KHK zu vermindern (Fuster et al. 1996 siehe ). Das männliche Geschlecht ist als irreversibler Risikofaktor der Atherosklerose zu betrachten (Classen et al. 1994 siehe , Isselbacher et al. 1995 siehe ).

2.2.3.2. Eigenanamnese einer peripheren arteriellen Verschlußkrankheit oder einer koronaren Herzkrankheit

Innerhalb der Patientengruppe gab es 4 Patienten (4,5%), die neben der koronaren Herzkrankheit eine periphere arterielle Verschlußkrankheit hatten.

Ein vorausgegangener Herzinfarkt wurde anhand dokumentierter medizinischer Anlagen oder durch die anamnestischen Angaben des Patienten bestimmt.

2.2.3.3. Familienanamnese einer koronaren Herzkrankheit (bei Eltern oder Geschwistern)

Die Familienanamnese einer koronaren Herzkrankheit, besonders die einer frühzeitig auftretenden Erkrankung, ist ein starker unabhängiger Risikofaktor (Fuster et al. 1996 siehe ). Nach Harrison ist die Familienanamnese einer vorzeitigen koronaren Herzkrankheit (<55 Jahren bei Eltern oder Geschwistern) einer der bedeutendsten Faktoren bei der Einschätzung des Risikos, indem sie die Ergreifung präventiver Maßnahmen ermöglicht (Isselbacher et al. 1995 siehe ).

Zwei Gruppen von Patienten wurden gebildet: die Gruppe mit der positiven Familienanamnese war charakterisiert durch das Vorhandensein eines Herzinfarktes bei Eltern oder Geschwistern und die Gruppe mit der negativen Familien-anamnese, charakterisiert durch das Fehlen eines Myokardinfarktes in der Fa-


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milienanamnese. Die Angaben hierzu wurden mit Hilfe des Erhebungsbogens erfragt und da die Angaben hinsichtlich des Alters in der Mehrzahl der Fälle nicht präzise angegeben werden konnten, wurden alle Familienereignisse unabhängig vom Zeitpunkt des Auftretens in die erste Gruppe aufgenommen.

2.2.3.4. Zigarettenrauchen

Zwei Gruppen von Patienten wurden gebildet: Raucher, die gegenwärtig rauchen oder in den letzten 10 Jahren geraucht haben und Nichtraucher, die nie geraucht haben oder vor 10 Jahren letztmalig geraucht haben. Die Raucher wurden weiter differenziert: Raucher, die weniger als 20 Zigaretten/d rauchen und Raucher, die 20 oder mehr Zigaretten/d rauchen. Dies erfolgte wegen der engen Beziehung von gerauchter Zigarettenmenge zum kardiovaskulären Risiko und Sterberate (Isselbacher et al. 1995 siehe , Stobbe et al. 1996 siehe ), es besteht eine Dosis-Wirkungs-Beziehung (Isselbacher et al. 1995 siehe ).

Rauchen ist eine der Hauptursachen für die Entstehung der koronaren Herzkrankheit (Isselbacher et al. 1995 siehe , Study group 1987 siehe ). Da die Angaben in der Literatur hinsichtlich des Absinkens des Risikos für eine koronare Herzerkrankung uneinheitlich sind (nach 1 Jahr; Isselbacher et al. 1995 siehe , nach 2-3 Jahren; Gross et al. 1996 siehe , nach 5 Jahren; Stobbe et al. 1996 siehe , einige Jahre; Hornbostel et al. 1992 siehe , nie; Classen et al. 1994 siehe , Risikoniveau von Nichtrauchern nach Abstinenz), wählten wir den Zeitraum von 10 Jahren als Abstinenzzeit, um einen Patienten in der Gruppe der Nichtraucher zu führen.

2.2.3.5. Hyperlipidämie

Im Rahmen der Studie wurden folgende Parameter bei allen Patienten im Serum bestimmt: Cholesterin, Triglyzeride und HDL-Cholesterin. Die Hyperlipid-ämie beinhaltet die Hypercholesterinämie und die Hypertriglyzeridämie (Zink et al. 1990 siehe ).

Die Hypercholesterinämie ist ein unabhängiger Risikofaktor (Study group 1987 siehe ) und geht eindeutig mit einer erhöhten Inzidenz an frühzeitiger koronarer Herzkrankheit einher (Isselbacher et al. 1995 siehe , Kannel et al. 1971 siehe ). Obwohl es laut Framingham-Studie keine kritischen Werte gibt, oberhalb derer eine steile Zunahme der Morbidität einsetzt (Hornbostel et al. 1992 siehe ), entstanden Empfehlungen zur Bewertung und Therapie von erhöhten Cholesterinwerten (Assmann 1990 siehe , Isselbacher et al. 1995 siehe , Study group 1987 siehe , Study group 1988 siehe ).

Die Hypertriglyzeridämie kann bei einigen spezifischen Erkrankungen mit einer frühzeitigen Atherosklerose verbunden sein (Isselbacher et al. 1995 siehe ). In einigen, aber nicht in allen Bevölkerungsstudien, korrelieren erhöhte Triglyzeridwerte allein mit einer koronaren Herzkrankheit (Isselbacher et al. 1995 siehe ). Triglyzeride scheinen ein unabhängiger kardiovaskulärer Risikofaktor bei den Frauen und Männern zu sein, die niedrige HDL-Cholesterin Werte (<1,04 mmol/l bzw. <40 mg/dl bzw. <0,9 mmol/l bzw. <35 mg/dl) haben (Assmann et al. 1992 siehe , Castelli 1986 siehe , Study group 1987 siehe ).


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Der High-density Lipoprotein(HDL)-Spiegel korreliert invers mit der Entwicklung einer frühzeitigen koronaren Herzkrankheit (Assmann et al. 1992 siehe , Classen et al. 1994 siehe , Isselbacher et al. 1995 siehe ). In der Framingham-Studie war ein niedriges HDL-Cholesterin ein wichtigerer Lipidrisikofaktor als erhöhte Werte für Gesamtcholesterin oder LDL (Isselbacher et al. 1995 siehe , Kannel et al. 1979 siehe , Kronmal et al. 1993 siehe ). Nach den Empfehlungen der Europäischen Atherosklerose-Gesellschaft (EAS) basiert die Diagnose und Behandlung einer Fettstoffwechselstörung auf der Messung von Cholesterin, Triglyzeriden und HDL-Cholesterin im Serum und der Erfassung möglicher weiterer Risikofaktoren (Assmann 1990 siehe , Study group 1987 siehe , Study group 1988 siehe ).

Die empfohlenen Referenzwerte waren die Grundlage für die Bildung der folgenden Gruppen.

2.2.3.5.1. Hypercholesterinämie

Zwei Gruppen von Patienten wurden gebildet: Patienten mit einer gesicherten dokumentierten Hypercholesterinämie, die mit lipidsenkenden Pharmaka therapiert wurden bzw. mit erhöhten Cholesterinwerten, festgestellt durch die erfolgte Blutentnahme und Patienten ohne eine Hypercholesterinämie bzw. mit normalen Cholesterinwerten. Der Normalwert im Serum bzw. Plasma war definiert <5,2 mmol/l bzw. <200 mg/dl (Assmann 1990 siehe , Study group 1987 siehe , Study group 1988 siehe , Thomas 1995 siehe ). Die erste Gruppe teilte sich weiter auf in eine Gruppe von Patienten mit Cholesterinwerten von 5,2 mmol/ bis 7,8 mmol/l bzw. 200 mg/dl bis 300 mg/dl und in eine Gruppe von Patienten mit Cholesterinwerten von ge7,8 mmol/l bzw. ge300 mg/dl.

Der Zusammenhang zwischen Hypercholesterinämie, Herzinfarkt und Arterio-sklerose ist eindeutig belegt (Seiffert 1995 siehe ). Es besteht ein proportionaler Zusammenhang zwischen der Höhe des Cholesterinwertes im Serum und dem Risiko der koronaren Herzkrankheit (Kannel et al. 1971 siehe ). In der Framingham-Studie konnte im Bereich von 4,8 mmol/l bis 8,7 mmol/l bzw. 185 mg/dl bis 335 mg/dl ein stetiger Anstieg des Risikos beobachtet werden (Kannel et al. 1971 siehe ). In der Multiple Risk Factor Intervention Trial Screening Programme(MRFIT)-Studie ergab sich ein Anstieg in der Mortalität an der koronaren Herzkrankheit von der niedrigsten zur höchsten Perzentile. Die Mortalität war bei Serumcholesterinwerten von <4,7 mmol/l bzw. <182 mg/dl am niedrigsten. Ähnliche Ergebnisse zeigten andere Studien (Study group 1987 siehe ). Die NIH Consensus Development Conference “Lowering Blood Cholesterol to Prevent Heart Disease” empfahl die Senkung der Serumcholesterins auf 4,7 mmol/l bzw. 180 mg/dl für Erwachsene, die jünger als 30 Jahre sind und auf 5,2 mmol/l bzw. 200 mg/dl für Erwachsene, die 30 Jahre oder älter sind (Study group 1987 siehe ). Die Einteilung der Patientengruppen in der Studie orientierte sich an den Empfehlungen der Europäischen Atherosklerose-Gesellschaft (EAS) von 1987 (Study group 1987 siehe ) und 1988 (Study group 1988 siehe ).


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2.2.3.5.2. Hypertriglyzeridämie

Zwei Gruppen von Patienten wurden gebildet: Patienten mit einer Hypertriglyzeridämie und Patienten mit einer Normotriglyzeridämie. Der Normalwert im Serum war definiert <2,3 mmol/l bzw. <200 mg/dl (Assmann 1990 siehe , Study group 1987 siehe , Study group 1988 siehe , Thomas 1995 siehe ).

Viele Patienten mit einer koronaren Herzkrankheit haben erhöhte Triglyzeridwerte. Die Ergebnisse bezüglich der Triglyzeride als ein Risikofaktor sind widersprüchlich in Studien bzw. in der Literatur (Boettiger et al. 1982 siehe , Carlson et al. 1981 siehe , Isselbacher et al. 1995 siehe , Lusis et al. 1992 siehe ). Einige Studien, wie die Stockholm Prospective Study (SPS) zeigten einen Zusammenhang zwischen dem Triglyzeridspiegel und dem Risiko, eine koronare Herzkrankheit zu entwickeln (Boettiger et al. 1982 siehe , Carlson et al. 1981 siehe , Study group 1987 siehe ). Die Framingham Studie legte dar, daß Triglyzeride ein unabhängiger Risikofaktor bei denjenigen Männern und Frauen sind, die niedrige HDL-Cholesterin-Spiegel (<1,04 mmol/l bzw. <40mg/dl) haben (Castelli 1986 siehe ). Zu ähnlichen Ergebnissen kam die Prospective Cardiovascular Münster(PROCAM)-Studie, welche nur bei niedrigen HDL-Cholesterin Spiegeln (<0,9 mmol/l bzw. <35 mg/dl) eine Assoziation zwischen einer Hypertriglyzeridämie und dem Risiko für einen Myokardinfarkt oder Tod durch die koronare Herzkrankheit verdeutlichen konnten (Assmann et al. 1992 siehe ).

2.2.3.5.3. Kombinierte Hyperlipidämien

Kombinierte Hyperlipidämien sind definiert durch das gleichzeitige Vorhandensein von Hypercholesterinämie und Hypertriglyzeridämie (Zink 1990 siehe ).

Zwei Gruppen von Patienten wurden gebildet: Patienten, die sowohl die Kriterien der Hypercholesterinämiegruppe als auch der Hypertriglyzeridämiegruppe erfüllen und Patienten, die sowohl die Kriterien der Normocholesterinämiegruppe als auch der Normotriglyzeridämiegruppe erfüllen. Außerdem wurde eine Gruppe von Patienten gebildet, die die Kriterien der Hypercholesterinämie und der Hypertriglyzeridämie erfüllen und die ein niedriges HDL-Cholesterin (<0,9 mmol/l bzw. <35 mg/dl) haben.

Beide Fette, Cholesterin und Triglyzerid, sind im Stoffwechsel untrennbar miteinander verbunden. So kann eine chronisch gewordene Überlastung des Triglyzeridstoffwechsels eine entscheidende Rolle bei der Entstehung einer Hypercholesterinämie spielen (Seiffert 1995 siehe ).

2.2.3.6. Niedriges HDL-Cholesterin (<0,9 mmol/l bzw. <35 mg/dl)

Zwei Gruppen von Patienten wurden gebildet: Patienten mit einem HDL-Cholesterin <0,9 mmol/l bzw. <35 mg/dl und Patienten mit einem HDL-Cholesterin ge0,9 mmol/l bzw. ge35 mg/dl. Es betraf nur Patienten der Hypercholesterinämiegruppe.


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In der Framingham-Studie erwies sich das HDL-Cholesterin als der stärkste Lipidrisikofaktor für die Entwicklung einer koronaren Herzkrankheit (Kannel et al. 1979 siehe ). Andere Studien konnten diese inverse Beziehung bestätigen (Isselbacher et al. 1995 siehe , Study group 1987 siehe ). Die Europäische Atherosklerose Gesellschaft legte dar, daß ein HDL-Cholesterinwert von <0,9 mmol/l bzw. <35 mg/dl ein wichtiger Faktor bei der Bewertung einer möglichen Fettstoffwechselstörung ist (Study group 1987 siehe , Study group 1988 siehe ).

2.2.3.7. Diabetes mellitus

Zwei Gruppen von Patienten wurden gebildet: Patienten mit einem gesicherten dokumentierten Diabetes mellitus, die mit oralen Antidiabetika und/oder Insulin therapiert wurden bzw. mit erhöhten Blutglukosewerten, festgestellt durch die erfolgte Blutentnahme und Patienten ohne Diabetes mellitus bzw. mit normalen Blutglukosewerten.

Die Normalwerte im Serum bzw. Plasma sind 4,22-6,11 mmol/l bzw. 76-110 mg/dl (Boehringer Mannheim 1991 siehe ). Ein klinisch manifester Diabetes mellitus ist ein gesicherter unabhängiger Risikofaktor für die Entstehung einer Koronar-sklerose (Classen et al. 1994 siehe , Isselbacher et al. 1995 siehe , Study group 1987 siehe ). Ob eine pathologische Glukosetoleranz bereits als Risiko zu betrachten ist, ist augenblicklich noch unklar (Classen et al. 1994 siehe ). Außerdem scheint das Risiko für eine arteriosklerotische Erkrankung mit dem Ausmaß der Hyperglykämie unter Diabetikern in keinem besonderen Zusammenhang zu stehen (Isselbacher et al. 1995 siehe , Study group 1987 siehe ).

2.2.3.8. Adipositas

Zwei Gruppen von Patienten wurden gebildet: Patienten mit einem Körpermassenindex oberhalb der 85. Perzentile (bei Männern >27,8 kg/m², bei Frauen >27,3 kg/m²) und Patienten mit einem Körpermassenindex unterhalb der 85. Perzentile (bei Männern le27,8 kg/m², bei Frauen le27,3 kg/m²).

Der Körpermassenindex bzw. der Body-Mass-Index (BMI) ist folgendermaßen definiert: Körpergewicht (in kg) : Körpergröße (in m) im Quadrat. Die Framingham-Studie zeigte, daß ein 20%iges Übergewicht (dies entspricht dem BMI oberhalb der 85. Perzentile) mit deutlichen Gesundheitsrisiken und mit einem deutlichen Anstieg der Mortalität einhergeht (Hornbostel et al. 1992 siehe , Isselbacher et al. 1995 siehe ).

2.2.3.9. Hypertonie

Zwei Gruppen von Patienten wurden gebildet: Patienten mit einem gesicherten dokumentierten Hypertonus, die mit Antihypertensiva therapiert wurden bzw. mit hypertonen Blutdruckwerten (nach der Definition der WHO), festgestellt durch die erfolgte Messung und Patienten ohne einen Hypertonus bzw. mit normotonen sowie grenzwertig erhöhten Blutdruckwerten.


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Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) definiert als Hypertonie willkürlich einen systolischen Blutdruck von 160 mmHg oder darüber und/oder einen diastolischen Blutdruck von 95 mmHg oder darüber. Eine Normotonie ist durch systolische Blutdruckwerte von weniger als 140 mmHg und diastolische Blutdruckwerte von weniger als 90 mmHg charakterisiert. Ein systolischer Blutdruck zwischen 140 und 159 mmHg sowie ein diastolischer Blutdruck zwischen 90 und 94 mmHg kennzeichnen den Grenzbereich (Gross et al. 1996 siehe , Isselbacher et al. 1995 siehe , Stobbe et al. 1996 siehe ).

Ein hoher Blutdruck ist ein wichtiger Risikofaktor für die Atherosklerose (Isselbacher et al. 1995 siehe ). Da keine klare Differenzierung zwischen normalem und hohem Blutdruck existiert, haben sich willkürliche Werte durchgesetzt, um die Patienten zu definieren, bei denen ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung einer kardiovaskulären Komplikation besteht und/oder die deutlich von einer medikamentösen Therapie profitieren würden. Das kardiovaskuläre Risiko nimmt progressiv mit steigendem Blutdruck zu (Isselbacher et al. 1995 siehe ). In der Framingham-Studie war die Inzidenz einer koronaren Herzkrankheit bei Männern im mittleren Alter mit hypertonen Blutdruckwerten (>160/95 mmHg) 5 mal höher als bei normotensiven Männern (le140/90 mmHg; Isselbacher et al. 1995 siehe ).

Die Messung des Blutdruckes erfolgte unter standardisierten Bedingungen mit der indirekten Methode nach Riva Rocci (RR) auskultatorisch. Die Messung erfolgte am sitzenden Patienten am linken Arm, der in Herzhöhe gelagert wurde. Eine Blutdruckmessung erfolgte am Anfang des Gesprächs und eine weitere am Ende, wenn bei der ersten Messung erhöhte Blutdruckwerte festgestellt wurden. Der zweite Blutdruckwert wurde dann registriert (Assmann et al.1992 siehe , Classen et al. 1994 siehe , Isselbacher et al. 1995 siehe ).


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2.2.4. Blutentnahme zur Bestimmung von Cholesterin, HDL-Cholesterin, Triglyzeriden und Blutzucker und zur DNA-Polymorphismusanalyse

Die Blutentnahme umfaßte ein Serumröhrchen (10 ml) zur Bestimmung von Blutzucker, Gesamtcholesterin, HDL-Cholesterin und Triglyzeriden und ein EDTA-Blutröhrchen (10 ml) zur DNA-Polymorphismusanalyse. Der Blutzucker und die Lipide wurden im Chemielabor der Charité bestimmt. Die venöse Blutentnahme erfolgte morgens, um die geforderte Fastenzeit von 12-14 Stunden für die Triglyzeridbestimmung einzuhalten.

Die Methodik: Cholesterin (Cholesterinoxidase-PAP-Methode), HDL-Cholesterin (Phosphorwolframsäure-Fällung und Colesterinoxidase-PAP-Methode), Triglyzeride (Glyzerinphosphat-oxidase-PAP-Methode) und Glukose (Hexo-kinasemethode) wurden mit einem BM/Hitachi 747/737 Analyseautomaten (Boehringer Mannheim, Bundesrepublik Deutschland) bestimmt (Boehringer Mannheim 1991 siehe , Thomas 1995 siehe ). Die Referenzwerte der Bestimmungsmethoden des Labors der Charité sind im Einklang mit den in den o.g. Studien empfohlenen Werten (Thomas 1995 siehe ).

Die empfohlene Aufschiebung der Triglyzeridbestimmung um 3 Monate nach schweren Erkrankungen wie Myokardinfarkt ließ sich organisatorisch im Rahmen dieser Studie nicht verwirklichen. Da Cholesterol in den ersten 24 Stunden eines Myokardinfarktes noch unbeeinflußt ist, konnte die Blutentnahme in den meisten Fällen rechtzeitig erfolgen (Study group 1988 siehe ).

Die intraindividuelle biologische Variabilität der Lipide ist ausgeprägt und durch mehrere Studien beschrieben worden (Marcovina et al. 1994 siehe , Study group 1988 siehe ). In einer Untersuchung von Marcovina et al. ergab sich eine intraindividuelle Variabilität von 6-7% für Cholesterin und HDL-Cholesterin und 28% für Triglyzeride (Marcovina et al. 1994 siehe ).


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2.3. DNA-Polymorphismusanalyse

Die DNA-Polymorphismusanalyse erfolgte im molekularbiologischen Labor der I. Medizinischen Klinik der Charité. Sie kann in 4 Abschnitte unterteilt werden: Die DNA-Präparation, nachfolgend die Polymerasekettenreaktion, danach die Einzelstrang-Konformationspolymorphismus-Analyse und schließlich die direkte DNA-Sequenzierung. Die EDTA(Ethylendiamintetraessigsäure)-Blutröhrchen (10 ml) wurden entweder gleich weiter bearbeitet oder bei -70°C tiefgefroren.

2.3.1. DNA-Präparation

Zwei Methoden wurden bei der DNA-Präparation angewendet. Zum einen erfolgte sie von Lymphozytenpellets durch SDS(Natrium-Dodecylsulfat)-Lyse, Chloroform/Octanol-Extraktion und Äthanolfällung (Davies et al. 1985 siehe ). Zum anderen diente dazu ein Extraktionskit von QIAGEN (QIAGEN GmbH, Hilden, Bundesrepublik Deutschland). Nach Abschluß der DNA-Präparation wurde spektrophotometrisch die Konzentration der DNA bestimmt. Eine nachfolgend durchgeführte Agarosegel-Elektrophorese mit nachfolgender Färbung durch Ethidiumbromid demonstrierte die Reinheit der untersuchten Proben (Qiagen 1995 siehe ).

2.3.2. Polymerasekettenreaktion (PCR)

Die Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction) ist ein teilweise automatisiertes enzymatisches In-vitro-Verfahren zur Vermehrung (Amplifizierung) von Nukleotidsequenzen (Friedman et al. 1996 siehe ). Die interessierenden Genbereiche, die Mutationen enthalten könnten, wurden amplifiziert (Watson et al. 1993 siehe ). Für die nachfolgende Einzelstrang-Konformationspolymorphismus-Analyse bildete die PCR die Voraussetzung.

250 ng Matrizen DNA wurden zusammengebracht mit einer 50 µl Reaktionslösung, bestehend aus 50 nM KCL, 10 mM TRIS HCL (pH 9,0 bei 25°C), 1,5 mM MgCl², 0,2 mM Desoxynukleotide, 15 pmol jeweils von beiden Primern, 0,1% Triton X-100 und 2,5 IU Taq-DNA-Polymerase (PROMEGA). In einem Techne PHC-3 Thermal Cycler wurde die Denaturierung der doppelsträngigen DNA bei 95°C für 5 min erreicht, gefolgt von insgesamt 30 Zyklen, charakterisiert durch die Denaturationsphase bei 95°C für 30 sek, die Annealingphase (Abkühlungs-phase) bei 58°C für 60 sek und die Extensionsphase (Polymerisationsphase) bei 72°C für 60 sek und abschließend eine letzte Extension bei 72°C für 5 min (Bauernfeind et al. 1995 siehe , Friedman et al. 1996 siehe , Jorde et al. 1995 siehe , Watson et al. 1993 siehe , Wenzel et al. 1994a siehe , Wenzel et al. 1994b siehe ).

2.3.3. Einzelstrang-Konformationspolymorphismus(SSCP)-Analyse

Die Einzelstrang-Konformationspolymorphismus(single-stranded conformation polymorphism)-Analyse ist charakterisiert durch den Unterschied in der elektrophoretischen Mobilität zwischen einem mutierten und einem normalen


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Fragment in neutralen Polyacrylamidgelen. Diese veränderte elektrophoretische Mobilität entsteht durch eine Konformationsänderung eines einzelsträngigen DNA-Fragmentes bedingt durch einzelne Basenaustausche (Gassen et al. 1996 siehe ).

Es wurden 5% und 10% nichtdenaturierende Polyacrylamidgele, bestehend aus 10% Glyzerol, verwendet. Die doppelsträngigen Fragmente wurden denaturiert, um die Stränge voneinander zu trennen. Danach wurden sie auf dem Polyacrylamidgel einer Elektrophorese ausgesetzt. Die Elektrophorese fand bei 20 W für 3-4 h bei verschiedenen Geltemperaturen (12°C und 20°C) statt. Anschließend erfolgte die Silberfärbung der Gele, um die DNA sichtbar zu machen (Lenk et al. 1993 siehe , Strachan et al. 1996 siehe , Watson et al. 1993 siehe , Wenzel et al. 1996 siehe ).

Zur Bestätigung der SSCP-Ergebnisse wurden die PCR-Fragmente vom Gel gereinigt und mit radioaktiv markierten Primern (32 P) sequenziert. Die Aufreinigung der PCR-Produkte erfolgte nach zwei Verfahren, die mit speziellen Kits der QIAGEN GmbH durchgeführt wurden. Die Verfahren werden vom Hersteller der dazugehörigen Kits als QIAEX II Gel Extraction und QIAquick PCR Purification bezeichnet. Bei QIAEX II Gel Extraction handelt es sich um eine Agarosegel-Extraktion und bei QIAquick PCR Purification um eine direkte Extraktion (ohne Gelelektrophorese; Qiagen 1995 siehe ).

2.3.4. Direkte DNA-Sequenzierung

Die Einzelstrang-Konformationspolymorphismus-Analyse erlaubte keine Aussage zu Art und Position der Mutation. Somit mußte eine DNA-Sequenzierung angeschlossen werden (Friedman et al. 1996 siehe , Jorde et al. 1995 siehe , Strachan et al. 1996 siehe ).

Die DNA-Sequenzierung erfolgte mit dem fmol DNA Sequencing System (PROMEGA; Wenzel et al. 1996 siehe ). Zur Sequenzierung wurde die SANGER-Methode verwendet, die auch als Kettenabbruch- oder Didesoxynukleotid-Verfahren bezeichnet wird. Die einzelsträngige DNA dient dabei als Matrix für die enzymatische Synthese komplementärer Stränge, die schließlich gelelektrophoretisch analysiert werden.


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2.4. Statistische Auswertung

Die statistische Datenanalyse erfolgte mit dem Statistikprogrammpaket SPSS für PC, Version 4.1. Die absoluten und relativen Häufigkeiten der kategorialen Merkmale wurden bestimmt. Die Vergleiche bezüglich der Häufigkeit des Auftretens eines Merkmals wurden mit der x²-Kontingenztafelanalyse nach Pearson durchgeführt. Hierbei erfolgte die Testung auf Unabhängigkeit bzw. Homogenität. Bei niedrigen Beobachtungswerten und bei p-Werten im Grenzbereich (p=0,05-0,1) wurde zusätzlich zur Kontrolle der Fisher´s Exact Test (einseitig getestet) durchgeführt. Einheitlich wurde als Signifikanzniveau für die Irrtumswahrscheinlichkeit p=05 (entspricht der Irrtumswahrscheinlichkeit alpha=5%) festgelegt (Sachs 1992 siehe ).

Die Berechnung von Mittelwert, Standardabweichung und Median erfolgte mit dem Tabellenkalkulationsprogramm von Microsoft Excel Version 5,0. Dies betraf folgende Größen: Alter, Geschlecht, Zigarettenmenge, Cholesterin-, HDL-Cholesterin-, Triglyzerid- und Blutzuckerwerte und Body-Mass-Index (Sachs 1992 siehe ).

2.4.1. Kontingenztafelanalyse für die Häufigkeiten der Mutationen in Abhängigkeit vom Alter

Die Kontingenztafelanalyse für die Häufigkeit der Patienten mit dem DNA-Polymorphismus in Abhängigkeit vom Alter beinhaltete die Häufigkeiten der Merkmale in der Altersgruppe 50 Jahre oder jünger und älter als 40 Jahre (le50/>40 Jahre) sowie in der Altersgruppe 40 Jahre oder jünger (le40 Jahre). Jeder der drei Polymorphismen ist einzeln untersucht worden.

2.4.2. Kontingenztafelanalyse für die Häufigkeiten der Mutationen in Abhängigkeit von den Risikofaktoren

Die Kontingenztafelanalyse für die Häufigkeiten der Patienten mit den Polymorphismen in Abhängigkeit von den Risikofaktoren erfolgte jeweils für alle Patienten (le50 Jahre), für die Altersgruppe 50 Jahre oder jünger und älter als 40 Jahre (le50/>40 Jahre) sowie für die Altersgruppe 40 Jahre oder jünger (le40 Jahre). Dies betraf folgende Risikofaktoren: männliches Geschlecht, Eigen-anamnese einer koronaren Herzkrankheit (Myokardinfarkt), Familienanamnese, Zigarettenrauchen, Hypercholesterinämie, Hypertriglyzeridämie, kombinierte Hyperlipidämie, niedriges HDL-Cholesterin, Diabetes mellitus, Adipositas und Hypertonie. Außerdem wurde eine mögliche Abhängigkeit mit dem Ausmaß der Koronararteriensklerose durch Vergleich von Ein- und Mehr(2- und 3-)-Gefäß-erkrankungen ermittelt. Jeder der drei Polymorphismen ist einzeln untersucht worden.


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Wed Jun 3 18:03:36 1998