Fetter, Ingmar: Der Einfluß von Botulinumneurotoxin A auf Wachstum und Differenzierung primär dissoziierter hippocampaler Zellkulturen |
Aus dem Institut für Anatomie
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin
Zur Erlangung des akademischen Grades
doctor medicinae (Dr. med.)
vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin
Dekan: Prof. Dr. med. M. Dietel
Gutachter:
Prof. Dr. med. M. Gratzl
PD Dr. med. M. Bergmann
PD Dr. med. G. Grosse
Datum der Promotion: 28. Juni 1999
Structure and dimension of the dendritic arbor are important determinants of information processing by the nerve cell, but mechanisms and molecules involved in dendritic growth are essentially unknown. I investigated early mechanisms of dendritic growth using mouse fetal hippocampal neurons in primary culture, which form processes during the first week in vitro. I detected a key component of regulated exocytosis, SNAP-25 (synaptosomal associated protein of 25 kDa)., in axons and axonal terminals as well as in dendrites identified by the occurrence of the dendritic markers transferrin receptor and MAP2. Selective inactivation of SNAP-25 by botulinum neurotoxin A (BoNTA) resulted in inhibition of axonal growth and of vesicle recycling in axonal terminals. In addition, dendritic growth of hippocampal pyramidal and granule neurons was significantly inhibited by BoNTA. These observations indicate that SNAP-25, but not synaptobrevin, is involved in constitutive axonal growth and dendrite formation by hippocampal neurons.
Keywords:
Dendrite, SNAP-25, botulinum neurotoxin A, mouse hippocampal neurons
Obwohl die Struktur und das Ausmaß dendritischer Verzweigungen eine wichtige Rolle bei der Informationsübertragung neuronaler Zellen spielen, ist bislang wenig über die Bausteine und Molekularmechanismen des Dendritenwachstums bekannt. Unter der Verwendung primär dissoziierter hippocampaler Zellkulturen embryonaler Mäuse untersuchte ich frühe Stadien des Zellfortsatzwachstums. Dabei konnte ich SNAP-25 (synaptosomal associated protein of 25 kDA), ein Schlüsselprotein der regulierten Exozytose, nicht nur in Axonen und terminalen Axonendigungen, sondern auch anhand von Doppelimmunmarkierungen mit den dendritischen Markern Transferrin-Rezeptor und MAP-2 in Dendriten lokalisieren. Die spezifische Inaktivierung von SNAP-25 durch Botulinumneurotoxin A (BoNT/A) führte zur Hemmung des Axonwachstums und des Vesikelrecyclings in terminalen Axonendigungen. Darüberhinaus wurde auch das Wachstum dendritischer Fortsätze von Körner- und Pyramidenzellen durch BoNT/A signifikant gehemmt. Daraus läßt sich schließen, daß SNAP-25, im Gegensatz zu Synaptobrevin, an konstitutiven Prozessen in den Axonen und Dendriten hippocampaler Neurone beteiligt ist.
Schlagwörter:
Dendrit, SNAP-25, Botulinumneurotoxin A, hippocampale Zellkulturen
Inhaltsverzeichnis | |
Titelseite | Der Einfluß von Botulinumneurotoxin A auf Wachstum und Differenzierung primär dissoziierter hippocampaler Zellkulturen |
Danksagung | |
1 | Einleitung |
1.1 | Die Synaptische Transmission |
1.2 | Der Zyklus synaptischer Vesikel |
1.3 | Präsynaptische Proteine und die SNARE-Hypothese |
1.4 | Das synaptische Vesikelprotein SNAP-25 |
1.5 | Botulinumneurotoxine |
1.6 | Die Entwicklungsstadien der hippocampalen Zellkultur |
2 | Ziele der Arbeit |
3 | Material und Methoden |
3.1 | Geräte |
3.2 | Chemikalien |
3.3 | Gebrauchslösungen |
3.4 | Versuchstiere |
3.5 | Die primär dissoziierte hippocampale Zellkultur |
3.6 | Proteinnachweis mittels Westernblotverfahren |
3.7 | Nachweis von Proteinen auf licht- und elektronenmikroskopischer Ebene |
3.7.1 | Die Avidin/Biotin-Methode |
3.7.2 | Der Fluoreszenznachweis von Proteinen in der Zellkultur |
3.7.3 | Die Pre-embedding-Methode für die elektronenmikroskopische Aufarbeitung |
3.8 | Photographische Dokumentation |
3.9 | Morphometrische Messungen |
4 | Ergebnisse |
4.1 | Die neuronale Entwicklung in der primär dissoziierten hippocampalenZellkultur |
4.2 | Zelluläre Verteilung von SNAP-25 im lichtmikroskopischen Bild |
4.3 | Ultrastrukturelle Verteilung von SNAP-25 |
4.4 | Der Einfluß von Botulinumneurotoxin A auf neuronale Zellkulturen |
4.4.1 | Nachweis von SNAP-25 in BoNT/A-behandelten neuronalen Zellkulturen |
4.4.2 | Qualitative Unterschiede zwischen BoNT/A-behandelten und Kontrollzellkulturen |
4.4.3 | Quantitative Unterschiede zwischen BoNT/A-behandelten und Kontrollkulturen |
4.4.4 | Der Einfluß von BoNT/A auf die regulierte Exozytose |
4.4.5 | Die Zelldichte unter BoNT/A-Einfluß |
4.5 | Die Wirkung von Botulinumneurotoxin C auf neuronale Zellkulturen |
5 | Diskussion |
5.1 | Die neuronale Entwicklung in der primär dissoziierten hippocampalenZellkultur der embryonalen Maus |
5.2 | Die entwicklungsabhängige Proteinsynthese und Lokalisation von SNAP-25 in der primär dissoziierten hippocampalen Zellkultur |
5.3 | Der Einfluß von BoNT/A auf das Fortsatzwachstum kultivierter hippocampaler Neurone |
6 | Zusammenfassung |
7 | Schlußfolgerungen |
Abkürzungsverzeichnis | Abkürzungsverzeichnis |
Bibliographie | Literaturverzeichnis |
Lebenslauf | |
Selbständigkeitserklärung |
Tabellenverzeichnis | |
Tabelle 1: | Arbeitskonzentrationen der Primärantikörper beim Westernblotverfahren |
Tabelle 2: | Konzentrationen der zytochemisch verwandten Primärantikörper |
Tabelle 3: | Konzentrationen der verwandten Sekundärantikörper |
Tabelle 4: | Einfluß von Botulinumneurotoxin A auf das Wachstum von Axonen und Dendriten |
Tabelle 5: | Blockierung der Transmitterexozytose durch Botulinumneurotoxin A |
Tabelle 6: | Botulinumneurotoxin A beeinflußt die Zelldichte in hippocampalen Zellkulturen |
Abbildungsverzeichnis | |
Abbildung 1: | Die minimalen Bindungsregionen der SNARE-Proteine (nach Fasshauer1998 ) |
Abbildung 2: | Der synaptische Fusionskomplex (nach Sutton1998 ) |
Abbildung 3: | Pyramidenzelle nach 1 DIV |
Abbildung 4: | Körnerzelle nach 2 DIV |
Abbildung 5: | Die hippocampale Zellkultur nach 3 DIV |
Abbildung 6: | Sechs Tage altes Pyramidenneuron |
Abbildung 7: | Ultrastruktur der neuronalen Somata nach 6 DIV |
Abbildung 8: | Ultrastruktur eines Neurons nach 6 DIV |
Abbildung 9: | Ultrastruktur eines Neurons nach 6 DIV |
Abbildung 10: | Ultrastruktur von Axonen nach 6 DIV |
Abbildung 11: | Ultrastruktur des Axons einer Körnerzelle nach 6 DIV |
Abbildung 12: | Hippocampusneurone nach 11 Tagen Kultivierung |
Abbildung 13: | Ultrastruktur einer Synapse nach 11 DIV |
Abbildung 14: | 20 Tage alte Körnerzelle |
Abbildung 15: | Hippocampale Moosfaserboutons nach 32 DIV |
Abbildung 16: | Myelinscheide nach 32 DIV |
Abbildung 17: | Vorkommen von SNAP-25 nach 23 DIV |
Abbildung 18: | Verteilung von SNAP-25 nach 6 DIV |
Abbildung 19: | SNAP-25 nach 6 DIV |
Abbildung 20: | Transferrinrezeptor nach 6 DIV |
Abbildung 21: | SNAP-25 nach 11 DIV |
Abbildung 22: | Synaptophysin nach 11 DIV |
Abbildung 23: | Kolokalisation von SNAP-25 und Synaptophysin nach 12 DIV |
Abbildung 24: | SNAP-25 nach 23 DIV |
Abbildung 25: | Synaptophysin nach 23 DIV |
Abbildung 26: | Ultrastruktur eines axo- dendritischen Kontaktes nach 13 DIV |
Abbildung 27: | Photomontage eines Axons |
Abbildung 28: | Ultrastruktur eines Perikaryonausschnittes |
Abbildung 29: | Ultrastruktur eines axo-dendritischen Kontaktes |
Abbildung 30: | Ultrastruktur eines Dendriten |
Abbildung 31: | Der Einfluß von Bo/NT A auf sein Substrat SNAP-25 |
Abbildung 32: | BoNT/A-vergiftetes Neuron nach 2 DIV |
Abbildung 33: | Unbehandeltes Neuron nach 2 DIV |
Abbildung 34 | |
Abbildung 35 | |
Abbildung 36: | SNAP-25 in der BoNT/A- vergifteten Zellkultur |
Abbildung 37: | Synaptophysin in der BoNT/A- vergifteten Zellkultur |
Abbildung 38: | BoNT/A hemmt die synaptische Exozytose |
Abbildung 39: | BoNT/C spaltet Syntaxin und SNAP-25 |
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