| Fetter, Ingmar: Der Einfluß von Botulinumneurotoxin A auf Wachstum und Differenzierung primär dissoziierter hippocampaler Zellkulturen |
Unter Anwendung morphologischer Kriterien und der immunzytochemischen Identifizierung von Neuronen und deren Kompartimenten wurde zunächst die neuronale Entwicklung in der hippo-campalen Zellkultur charakterisiert.
Der Hippocampus gehört als Teil des Archicortex zu den bestuntersuchten Regionen des Gehirns. Durch seine begrenzte Zahl von Neuronentypen und deren bekannte Vernetzung eignet er sich besonders als Modellsystem für die Zellkultivierung.
Bei der mechanischen Dissoziierung der Hippocampi zu Einzelzellen kommt es zum Abreißen aller vorhandenen Zellfortsätze, so daß bei der Aussaat in die Kulturschalen eine Suspension unter-schiedlich großer, fortsatzloser, abgerundeter Zellen vorhanden ist. Neben Glia- und Bindegewebs-zellen kommen hauptsächlich die zwei neuronalen Zelltypen, Pyramidenneurone und Körnerzel-len, vor.
Bereits nach einem Tag in der Kultur (1Tag in vitro = 1 day in vitro = 1 DIV) kann man die Zellen unterscheiden. So ist für die Pyramidenneurone ein pyramidenartig geformtes, im Durchmesser zunächst ca. 7-12 µm großes Perikaryon charakteristisch. Die Körnerzellen erscheinen mit anfangs durchschnittlich 5-8 µm im Durchmesser deutlich kleiner. Ihr Zellkörper weist eine eher runde Form auf. Die Zellen beginnen sofort nach Aussaat mit der Ausbildung mehrerer kleiner Fortsätze. Zum Teil ist dabei schon nach einem Tag in der Kultur die Differenzierung eines dieser Fortsätze in das Axon zu erkennen, das länger als die dendritischen Fortsätze ist. Nach zwei Tagen sind alle Zellen deutlich polarisiert, es lassen sich Dendriten und Axone voneinander unterscheiden. Letztere sind länger und wachsen zu diesem Zeitpunkt bis zu fünfmal schneller als die Dendriten ( Dotti1988 ). Auffällig sind am distalen Axonende Auftreibungen, die Wachstumskolben.
Abbildung 3: Pyramidenzelle nach 1 DIV
Nach 24 h in der Kultur sind die neu ausgebildeten Fortsätze deutlich zu erkennen. Dabei ist das Axon (Ax) deutlich länger als die dend-ritischen (D) Fortsätze. PN = Pyramidenneuron, anti-MAP-2-Markie-rung, DAB-Entwicklung und Phasenkontrast
Maßstab = 10 µm
Abbildung 4: Körnerzelle nach 2 DIV
Die 2 Tage alte Körnerzelle (GC) ist deutlich polarisiert - das Axon (Ax) ist von den kurzen Dendriten (D) zu unterscheiden. Am Axon ist die aufgetriebene Wachstumszone (aGC) zu erkennen. anti-MAP-2-Markierung,DAB-Entwicklung und Phasenkontrast
Maßstab = 15 µm
Nach drei Tagen (3 DIV) in der Kultur lassen sich Anhäufungen synaptischer Vesikel erkennen. Diese sind durch Antikörper gegen synaptische Vesikelproteine markiert worden. In der Abbildung 5 wurde das synaptische Vesikelprotein Synaptophysin detektiert Man erkennt die Anhäufungen der synaptischen Vesikel als punktuelle Immunreaktionen. Die intensive Immunreaktion im Zelleib weist auf die Synthese der synaptischen Vesikelproteine hin. Das Erreichen intrazellulärer Antige-ne wird den Antikörpern dabei durch die Permeabilisierung der Zellmembranen mit Triton X-100 ermöglicht. Das schnelle Axonwachstum setzt sich fort, während die Entwicklung der Dendriten deutlich langsamer voranschreitet.
Bei sechs Tagen alten Kulturen ( Abbildung 6 ) sind zahlreiche Nervenzellfortsätze zu erkennen. Am konfokalen Laserscanning-Mikroskop (CLSM) kann man Kolokalisationen von MAP-2 und Synap-tophysin als gelbe Punkte darstellen.
An der abgebildeten Zelle erfolgte eine Doppelimmun-
fluoreszenzdetektion mit anti-Synaptophysin (grün) und anti-MAP-2 (rot). Die Pfeile zeigen axo-dendri-tische Synapsen (gelb). Der Zelleib ist durch die Protein-synthese stark angefärbt. Die punktuellen Synapto-physin - Detektionen (Pfeil-spitzen) zeigen den axona-len Transport des synapti-schen Vesikelproteins. PN = Pyramidenzelle, D = Dendrit
Maßstab = 15 µm
Im Zelleib werden beide Proteine im rauhen ER synthetisiert und über den Golgi-Apparat sortiert. Die Dendriten werden durch die MAP-2 - Färbung identifiziert. Die punktförmigen Immunfluores-zenzen für Synaptophysin zeigen den axonalen Transport dieses Proteins. An der dendritischen Plasmamembran sind einige Synapsen zu erkennen.
Nach 6 DIV sind im elektronenmikroskopischen Bild große Zellkerne und ein organellenreiches Zytoplasma zu erkennen. Der Golgi-Apparat ist bereits gut differenziert und in enger Nachbarschaft mit zahlreichen, großen Mitochondrien und rauhem ER. In Anschwellungen der z.T. schon parallel gebündelten Axone sind Anhäufungen synaptischer Vesikel und in den Endigungen von Körner-zellaxonen typischerweise Large Dense Core Vesicles (LDCV) nachweisbar (Abb. 7-11).
Abbildung 7: Ultrastruktur der neuronalen Somata nach 6 DIV
Im Zellkern (N) ist das Chromatin fein dispers verteilt. Die Kernmem-bran besteht aus zwei Lamellen (Pfeil). PN = Pyramidenneuron, M = Mitochondrien
Maßstab = 1 µm
Abbildung 8: Ultrastruktur eines Neurons nach 6 DIV
In Kernnähe sind viele Ribosomen (Rib) und ribosomenbesetztes Endoplasmatisches Retikulum (rER) zu erkennen. Das quer ange-schnittene Axon (Ax) ist mit synaptischen Vesikeln angefüllt.
Maßstab = 0,25 µm
Abbildung 9: Ultrastruktur eines Neurons nach 6 DIV
Der Golgi-Apparat ist bereits gut differenziert und steht in enger räumlicher Beziehung mit Mitochondrien (M). KM = Kernmembran;
N = Nucleus
Maßstab = 0,5 µm
Abbildung 10: Ultrastruktur von Axonen nach 6 DIV
Die vier Axone (Ax) sind bereits gebündelt. Sie enthalten Wachs-tumsvesikel (Pfeilspitzen) und parallel angeordnete Mikrotubuli (MT). Maßstab = 0,6 µm
Abbildung 11: Ultrastruktur des Axons einer Körnerzelle nach 6 DIV
Die Axonvarikosität der sechs Tage alten Körnerzelle ist mit Large Dense Core Vesicles (LDCV) und synaptischen Vesikeln (SV) angefüllt. D = Dendrit, Ax = Axon
Maßstab = 1 µm
Nach 11 DIV ist das morphologische Bild der Zellkulturen gegenüber 6 - 8 DIV verändert. Man findet ein dichteres Fasernetzwerk mit vielen Synapsen vor. Die Perikarya zeigen kaum noch Immunreaktion gegen synaptische Vesikelproteine ( Abbildung 12 ). Die punktförmige Verteilung der Vesikelproteine zeigt die zunehmende Anreicherung in Präsynapsen, was die ultrastrukturelle Darstellung in Abbildung 13 erkennen läßt.
Abbildung 12: Hippocampusneurone nach 11 Tagen Kultivierung
Wie die punktförmigen Immunreaktionen (Pfeilspitzen) entlang der Fortsätze und Zellkörper zeigen, hat sich eine Vielzahl synaptischer Kontakte entwickelt. Dichte Aufreihungen ergeben dabei ein perlschnurartiges Bild. PN = Pyramidenzelle, Ax = Axon, D = Dendrit, anti-Synaptophysin-Markie-rung,DAB-Entwicklung
Maßstab = 30 µm
Nach 20 DIV haben die Zellen noch längere Fortsätze und mehr Synapsen gebildet. Die Abbildung 14 zeigt eine Doppelimmundetektion von Synaptophysin und MAP-2. Gelbe punkt-förmige Markierungen an den Dendriten und am Perikaryon zeigen Synaptophysin in Synapsen.
Abbildung 14: 20 Tage alte Körnerzelle
Synaptophysin ist in synaptischen Strukturen angereichert. Die Pfeile zeigen axo-dendritische und axo-somatische Synapsen. Die MAP-2 - Detektion (rot) ermöglicht die Dendritenidentifizierung. GC = Körnerzelle, D = Dendrit, CLSM
Maßstab = 20 µm
Nach 20 DIV und in älteren Kulturen sind im elektronenmikroskopischen Bild Moosfaserboutons zu erkennen ( Abbildung 15 ), die als unmyelinisierte Axone hippocampaler Körnerzellen an den Spines proximaler Dendriten von Pyramidenneuronen enden. Außer synaptischen Kontakten bilden sich auch Puncta adhaerentia zwischen Dendritenschaft und Moosfaserbouton. Die Moosfaserboutons haben einen Durchmesser von 3-5 µm und sind mit großen Mitochondrien, LDCV und synapti-schen Vesikeln ( Abbildung 15 ) angereichert. Sie entsprechen im morphologischen Bild den in vivo beobachteten Moosfaserboutons. Die Anreicherung von Meerrettichperoxidase (HRP) in vesiku-lären Strukturen der Boutons zeigt die endozytotische Aktivität. In Abbildung 16 ist im Gegensatz zu den unmyelinisierten Körnerzellaxonen die Myelinisierung anderer Axone zu erkennen.
Abbildung 15: Hippocampale Moosfaserboutons nach 32 DIV
Moosfaserboutons (MF) lagern sich an einen apikalen Dendriten (D) einer Pyramidenzelle an, der durch seine Größe gut zu identifizieren ist. Die Moosfasern sind mit synaptischen Vesikeln (SV) und Mitochondrien (M) angefüllt. An den Kontaktzonen sind Puncta adhaerentia (Pfeil-spitzen) und synaptische Aktivzonen (Pfeil) ausgebildet. E = Endosom
Maßstab = 1 µm
Schon nach 2 DIV ist SNAP-25 in den neuronalen Zellen zu finden. Es ist zu diesem Zeitpunkt überwiegend im Soma der Zelle, aber auch in den Fortsätzen lokalisiert. Nach 3 DIV ( Abbildung 17 ) sind die Immunmarkierungen im Perikaryon bereits gut lokalisierbar. SNAP-25 wird dort vor allem im rauhen Endoplasmatischen Retikulum und im Golgi-Apparat, in dem synthetisierte Moleküle sortiert werden, detektiert. In allen Zellfortsätzen gelingt die Darstellung von SNAP-25. Daneben sind erste punktuelle Immunreaktionen zu erkennen, die auf Anhäufungen in präsynaptischen Strukturen hinweisen.
Abbildung 17: Vorkommen von SNAP-25 nach 23 DIV
Nach 3 DIV ist SNAP-25 im Perikaryon lokalisiert - es zeigt sich das typische Bild der perinukleären Kappe (Pfeile und Aus-schnitt). Daneben ist das Protein in Axonen und Dendriten immundetektiert (Pfeilspitzen). DAB-Entwicklung, PN = Pyrami-denzelle,GC = Körnerzelle, Ax = Axon, D = Dendrit
Maßstab = 20 µm
Nach 6 DIV ist SNAP-25 im Perikaryon und allen Fortsätzen nachweisbar. Die Abbildung 18 zeigt SNAP-25 als perinukleäre Kappe, was Proteinbiosynthese und Sortierung im Golgi-Apparat und rauhen Endoplasmatischen Retikulum entspricht. Auch Axone und Dendriten lassen Immun-markierungen für SNAP-25 erkennen. Punktuelle Immunreaktionen weisen auf Synapsen hin.
Abbildung 18: Verteilung von SNAP-25 nach 6 DIV
Punktuelle Immunreaktionen entlang der Zellfortsätze zeigen die An-reicherung in Synapsen. Das an Perlschnurketten erinnernde Bild erweist sich ultrastrukturell als Anhäufung vieler Synapsen. Im Soma ist die perinukleäre Kappe (Pfeilspitze) zu erkennen. PN = Pyra-midenzelle, A = Axon, D = Dendrit
Maßstab = 20 µm
Wurde bisher SNAP-25 vor allem in den Axonen neuronaler Zellen beschrieben ( Duc1995 ; Garcia1995 ), konnte in unseren Experimenten das Protein auch in Dendriten nachgewiesen werden ( Abbildung 17 und Abbildung 18 ). Die Doppelmarkierungen von SNAP-25 und typischen Dendritenmarkern, wie MAP-2 und Transferrinrezeptor ( Caceres1984 ; DeCamilli1984 ; Cameron1991 ), haben das bestätigt. Wie die Abb. 19 und 20 zeigen, ist eine Anreicherung von SNAP-25 in Zellfortsätzen zu sehen, die durch die Doppelmarkierung mit anti-Transferrinrezeptor-Immunglobulinen als Dendriten zu identifizieren sind. Das Axon bleibt bei der Immunmarkierung des Transferrinrezeptors ausgespart, während es sich mit SNAP-25 ( Abbildung 19 ) darstellen läßt.
Abbildung 19: SNAP-25 nach 6 DIV  |
Abbildung 20:Transferrinrezeptor nach 6 DIV  |
Doppelimmunfluoreszenz mit Antikörpern gegen SNAP-25 (
Abbildung 19
) und Transferrin-rezeptoren (
Abbildung 20
). Deutlich sichtbar ist die SNAP-25-Anreicherung in Fortsätzen, die in
Abbildung 20
als Dendriten (D) identifiziert werden können. Der Antikörper gegen den Transferrinrezeptor markiert nicht das Axon (Ax).
Maßstab = 20 µm
Die Doppelmarkierung von SNAP-25 und MAP-2 ergibt ein ähnliches Bild. Für SNAP-25 sind Immunreaktionen in Fortsätzen zu erkennen, die durch die Doppelmarkierung mit dem Antikörper gegen MAP-2 als Dendriten detektiert werden (nicht gezeigt).
Bei 11 Tage alten Kulturen ist in den Perikarya kaum noch SNAP-25-Immunreaktivität zu sehen, bedeutend mehr ist in Fasern detektiert worden. Wie in den Doppelfluoreszenzen von SNAP-25 und Synaptophysin ( Abbildung 21 und Abbildung 22 ) zu sehen, überwiegen entsprechend der zunehmenden Synapsenbildung punktuelle Immunreaktionen. Die Fortsätze in dem dichten Netzwerk sind nicht mehr einer Zelle zuzuordnen. Die Zelleiber sind nur schwach immunreaktiv, d.h. die SNAP-25-Synthese ist stark zurückgegangen. Die Perikarya werden durch punktuelle Immunreaktionen entlang ihrer Oberfläche markiert. Diese entsprechen axo-somatischen Synap-sen. Im Gegensatz zu Synaptophysin ist SNAP-25 in den Fortsätzen auch außerhalb von Synap-sen detektiert.
Abbildung 21: SNAP-25 nach 11 DIV  |
Abbildung 22: Synaptophysin nach 11 DIV  |
In diesem Stadium überwiegt die durch punktuelle Immunreaktionen gekennzeichnete Loka-lisation des Proteins SNAP-25 an Synapsen entlang der Fortsätze und Somaoberfläche (Pfeile). Synaptophysin markiert als synaptisches Vesikelprotein Synapsen. Diese können dabei zu regelrechten Strängen konfluieren. SNAP-25 ist auch außerhalb von Synapsen in allen Fortsätzen detektiert (Pfeilspitzen). Die Perikarya sind kaum noch immunreaktiv. PN = Pyramidenneuron
Maßstab = 20 µm
Die Abbildung 23 wurde mit der CLSM-Technik erstellt. Punktuelle Kolokalisationen (gelb) mit dem synaptischen Vesikelprotein Synaptophysin entlang der Plasmamembran von Soma und Zell-fortsätzen zeigen die Anreicherung von SNAP-25 in axo-somatischen und axo-dendritischen Synapsen. Daneben sind Markierungen nur für SNAP-25 (rot) an der gesamten Plasmamembran zu erkennen.
Abbildung 23: Kolokalisation von SNAP-25 und Synaptophysin nach 12 DIV
Gelbe punktförmige Immunreaktionen an der Oberfläche von Soma und Fortsätzen (Pfeile) zeigen die Kolokalisation von SNAP-25 und dem synaptischen Vesikelprotein Synaptophysin in synaptischen Strukturen. SNAP-25 ist außerdem an der gesamten Plasmamembran detektiert (rot, Pfeilspitzen). PN = Pyramidenneuron, GC = Körnerzelle, CLSM
Maßstab = 20 µm
In der Abbildung 24 und der Abbildung 25 ist die Doppelmarkierung eines Neurons mit SNAP-25 und Synaptophysin nach 23 DIV dargestellt. SNAP-25 und Synaptophysin sind entlang der Plasmmembran von Soma und Zellfortsätzen als punktuelle Immunreaktionen detektiert. Das perikarielle Zytoplasma ist nur schwach angefärbt, weil die Neusynthese von SNAP-25 und Synaptophysin im Vergleich zu den ersten Tagen in vitro stark reduziert ist.
Abbildung 24: SNAP-25 nach 23 DIV  |
Abbildung 25: Synaptophysin nach 23 DIV  |
Die Doppelimmunfluoreszenzmarkierung zeigt eine Kolokalisation von SNAP-25 und Synap-tophysin an Synapsen entlang der Zellmembranoberfläche. Konfluierende Synapsenstränge (Pfeile) entlang der perikariellen Zellmembran und der Fortsätze haben sich gebildet. Das Zellplasma zeigt nur geringe Immunreaktivität. PN = Pyramidenzelle
Maßstab = 25 µm
Die ultrastrukturelle Analyse ermöglicht die genaue Lokalisierung von SNAP-25 in spezifischen subzellulären Strukturen der hippocampalen Neurone. In Abbildung 26 ist ein axo-dendritischer Kontakt mit vier Aktivzonen dargestellt. SNAP-25 ist an synaptischen Vesikeln zu erkennen.
Die Abbildung 27 ist eine Photomontage mehrerer Axonabschnitte. Obwohl das gesamte SNAP-25 - Molekül an der Innenseite der Plasmamembran liegt, stellt sich der Antigen-Antikörper-Komplex nach Saponinbehandlung scheinbar an der äußeren Oberfläche dar. Dies erklärt sich aus der starken und nicht immer regelmäßig zirkulären Anheftung des Silbers an die 1 nm großen Gold-partikel des Sekundärantikörpers.
Abbildung 28 zeigt den Ausschnitt eines Perikaryons. Nur intakte Zellmembranbestandteile sind mit SNAP-25 - Antikörpern detektiert. Dazwischen sind Perforationen der Plasmamembran zu erken-nen, wie sie nach Permeabilisierung durch Saponin typisch sind. Sie ermöglichen den Antikörpern den Zugang zum Intrazellularraum.
In Abbildung 29 ist ein axo-dendritischer Kontakt dargestellt. Immunmarkierungen für SNAP-25 sind an synaptischen Vesikeln, an der axonalen Plasmamembran und an vesikulären Strukturen in der Postsynapse zu erkennen.
Abbildung 30 zeigt einen Dendritenausschnitt. Immunmarkierungen für SNAP-25 sind entlang der Plasmamembran und intrazellulär an vesikulären Strukturen zu erkennen.
In dieser Abbildung (15 DIV) sind neben gut differenzierten Mitochondrien (M) SNAP-25-Immunmarkierungen an der Plasmamembran (Pfeile) und intrazellulär in Vesikeln (Pfeil-spitzen) zu erkennen. D = Dendrit, Pre-em-bedding-Methode, Gold/Silber
Maßstab = 1µm
Auf den vorgestellten Abbildungen erkennt man, daß SNAP-25 nicht nur an synaptischen Vesikeln, sondern auch außerhalb synaptischer Kontakte an der Plasmamembran sowie an vesikulären Strukturen von Soma und Fortsätzen vorkommt. Aufgrund dieser Tatsache stellte sich uns die Frage, ob es an weiteren Prozessen außer der regulierten Exozytose in den Synapsen beteiligt ist. Dazu wurden Experimente mit Botulinumneurotoxin A durchgeführt, dessen proteolytisches Sub-strat SNAP-25 ist. Es wurde insbesondere der Frage nachgegangen, ob SNAP-25 auch bei der konstitutiven Exozytose, die für das Zellwachstum wesentlich ist, eine Rolle spielt.
SNAP-25 ist das Proteolysesubstrat von Botulinumneurotxin A. Als Teil des Fusionskomplexes, der aus Syntaxin, SNAP-25 und Synaptobrevin besteht, ist es essentiell für die synaptische Vesikel-exozytose. Die Spaltung aller SNAP-25-Moleküle durch BoNT/A kann die synaptische Transmis-sion nicht vollständig ausschalten, sie wird aber um ein Vielfaches reduziert ( Ahnert-Hilger1995 ; Stecher1989 ). Um eventuelle allgemeinzytotoxische Schädigungen durch BoNT/A zu verhindern, von denen die substratspezifischen Effekte des Toxins nicht abzugrenzen sind, wurde auf der Grundlage von Ergebnissen einer Vorversuchsreihe BoNT/A in einer Konzentration von 0,1 nM verwendet.
Die proteolytische Spaltung von SNAP-25 zeigt sich im Westernblot ( Abbildung 31 ). In den drei gezeigten Bahnen wurden drei verschiedene Proteinproben sechs Tage alter hippocampaler Zellkulturen aufgetragen. Die erste stammt von einer unbehandelten Zellkultur. Die zweite Probe enthält die Zellen einer BoNT/A-vergifteten Zellkultur. In der dritten Bahn sind Proteine einer Zellkultur aufgetragen, die mit BoNT/A, das vor Gabe in die Zellkultur mit BoNT-Antiserum inkubiert wurde, behandelt ist. In der zweiten Bahn ist nicht gespaltenes SNAP-25 bei 25 kDa als schwache Bande zu sehen. Daneben zeigt sich in der zweiten Bahn eine starke Bande bei 24 kDa. Durch BoNT/A werden neun Aminosäuren vom COOH-Terminus des SNAP-25 abgespalten ( Blasi1993a ; Binz1994 ). Der gegen das N-terminale Ende gerichtete Antikörper erkennt auch das 24 kDa schwere Spaltprodukt. Weitere Proteine, Synaptophysin und Synaptobrevin, wurden als Kontrolle für die sonst unveränderte Zusammensetzung synaptischer Vesikelproteine in den Kulturen detektiert.
Abbildung 31: Der Einfluß von Bo/NT A auf sein Substrat SNAP-25
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Sechs Tage alte Kulturen wurden für 24 h (5+1 DIV) mit BoNT/A (Bahn 2) oder BoNT/A+ Anti-serum (Bahn 3) behandelt. Die daraus gewonnenen Homogenate wurden ebenso wie die einer unbehandelte Kontrollkultur (Bahn1) mit Anti-körpern gegen SNAP-25, Synapto-brevin und Synaptophysin detek-tiert. SNAP-25 ist als 25 kDa-, sein Spaltprodukt als 24 kDa-Bande zu erkennen (Pfeilspitze). Synaptophy-sin ist bei 38 kDa und Synapto-brevin bei 18 kDa markiert. |
Im phasenkontrastmikroskopischen Bild zwei Tage alter Kulturen, die zwei Stunden nach der Aussaat mit BoNT/A vergiftet worden sind ( Abbildung 32 ), zeigen sich keine morphologischen Verän-derungen an den Zellen gegenüber unbehandelten Kontrollkulturen ( Abbildung 33 ). Der axonale Fortsatz ist in beiden Fällen deutlich schneller als die dendritischen Fortsätze gewachsen. Es ergaben sich nach 2 DIV und gleicher Behandlung mit BoNT/A bei Körnerzellen und Pyrami-denneuronen keine Unterschiede.
Abbildung 32: BoNT/A-vergiftetes Neuron  |
Abbildung 33: Unbehandeltes Neuron  |
Die Morphologie der mit 0,1nM BoNT/A behandelten Zelle zeigt keine Unterschiede gegen-über einer unbehandelten Nervenzelle. Bei beiden differenziert sich das Axon (Ax). Die Den-driten (D in Abb. 32 und Pfeilspitzen in Abb. 33) bleiben im Längenwachstum deutlich zurück. PN = Pyramidenzelle, MAP-2-Markierung, DAB-Färbung und Phasenkontrast
Maßstab = 10 µm
Bei 6 Tage alten Kulturen, die nach 1 DIV mit 0,1 nM BoNT/A behandelt wurden, ist wie bei gleich-altrigen, unbehandelten Kontrollkulturen zu erkennen, daß sich ein Fasernetzwerk mit Synapsen gebildet hat ( Abbildung 34 und Abbildung 35 ). Die Morphologie der Fortsätze und Perikarya zeigt keine Unterschiede.
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In diesen Abb. ist nach 6 DIV eine BoNT/A-vergiftete (
Abbildung 34
) einer unbehandelten Nervenzelle (
Abbildung 35
) gegenübergestellt. Es lassen sich zunächst keine morphologischen Unterschiede feststellen. Die Axone beider Zellen sind deutlich länger als die Dendriten und stark verzweigt. PN = Pyramidenzelle, Ax = Axon, D = Dendrit, MAP-2 - Markierung, DAB-Färbung und Phasenkontrast
Maßstab = 25 µm
Auch mit der Immunfluoreszenzmarkierung von SNAP-25 in sechs Tage alten Neuronen, die mit 0,1 nM BoNT/A behandelt wurden, lassen sich keine Unterschiede gegenüber der unbehandelten Kultur erkennen. Die Neusynthese des Proteins in den Zellkörpern ist nicht unterbrochen. Doppel-markierungen mit Synaptophysin zeigen die Anreicherung von SNAP-25 und Synaptophysin in Synapsen. Das ist nicht ganz unerwartet, da, wie bereits erwähnt, der größere Teil der SNAP-25 - Moleküle bei 0,1 nM BoNT/A gespalten wird, aber die am N-Terminal gelegenen Epitope für die Antikörper erhalten bleiben. Außerdem fallen linienförmige Immunmarkierungen von SNAP-25 entlang von Axonen und Dendriten auf ( Abbildung 36 ), die sich nicht mit Synapsen bzw. der Synaptophysin-Markierung decken.
Abbildung 36: SNAP-25 in der BoNT/A-  |
Abbildung 37: Synaptophysin in der BoNT/A-  |
Das fluoreszenzmikroskopische Bild sechs Tage alter Hippocampuskulturen, die mit 0,1 nM BoNT/A behandelt wurden, zeigt keine Veränderungen in der SNAP-25-Verteilung in den Neuronen. Punktuelle Immunreaktionen (Pfeile) weisen auf synaptische Kontakte hin. Der Golgi-Apparat und das synthetisierende rauhe ER sind als perinukleäre Kappe zu erkennen. Eine eher linienförmige Markierung ist in dendritischen und axonalen Fortsätzen (Pfeilspitzen) zu sehen.
Maßstab = 20 µm
Um den Einfluß von BoNT/A auf die konstitutive Exozytose zu erfassen, ist das Wachstum von Dendriten und Axonen kultivierter Hippocampusneurone untersucht worden. Den Kulturen ist nach 1 DIV 0,1 nM BoNT/A zugesetzt worden. Die Dendriten der Körnerzellen und Pyramidenneurone wurden mit MAP-2 - Antikörpern immunmarkiert und die Axone durch Phasenkontrast dargestellt. Axone und Dendriten wurden an einem halbautomatischen Photomeßplatz vermessen. Die Meß-daten sind mit dem U-Test nach Mann und Whitney, der für verteilungsunabhängige Parameter verwendet wird, statistisch verarbeitet worden. Die Ergebnisse sind als Mittelwerte (mean) und Standardfehler des Mittelwertes (sem = standard error of the mean) in Tabelle 4 dargestellt. Das Signifikanzniveau wurde bei p < 0,01 festgelegt. Zum Vergleich sind unbehandelte Kontrollkulturen und mit BoNT/A-Antiserum behandelte Kulturen vermessen worden. Signifikante Werte sind fett-gedruckt.
Die Axonlänge ist bei den mit BoNT/A-behandelten Neuronen um etwa ein Drittel geringer. Die Axone vergifteter Zellen sind durchschnittlich 275 µm lang, die Axone von Kontrollkulturen 465 µm. Die Dendritenlänge ist unter BoNT/A-Einfluß um fast die Hälfte reduziert. Die Dendriten vergifteter Neurone sind durchschnittlich 44 µm und die Dendriten unbehandelter Kontrollkulturen 73 µm lang. Das Wachstum der Fortsätze der unbehandelten und der mit Antiserum gegen BoNT/A behandel-ten Zellen ist identisch zueinander gewesen und entspricht der normalen Wachstumsgeschwindig-keit in hippocampalen Zellkulturen ( Dotti1988 ). Da nur SNAP-25 gespalten wurde, und alle ande-ren Bedingungen konstant blieben, muß angenommen werden, daß SNAP-25 bei der konstitutiven Exozytose ebenso wie bei der regulierten Exozytose eine Rolle spielt.
Tabelle 4: Einfluß von Botulinumneurotoxin A auf das Wachstum von Axonen und Dendriten
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Axonlänge
|
Dendritenlänge
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Dendriten/Neuron
|
Neurone
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Kontrolle
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465.5 +/- 50.1
|
73.2 +/-6.1
|
4.3 +/- 0.3
|
24
|
|
BoNT/A
|
275.2 +/- 34.3
|
44.6 +/- 3.1
|
4.0 +/- 0.3
|
18
|
|
BoNT/A+ Antiserum |
465.7 +/- 42.6
|
80.7+/- 5.5
|
3.9 +/- 0.2
|
35
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Randomisiert ausgewählte Neurone aus sechs Tage alten BoNT/A-, BoNT/A-Antiserum- und nicht behandelten Zellkulturen wurden mittels VIDEOPLAN-Meßsystem vermessen und statistisch erfaßt. Bei BoNT/A-behandelten Zellen ist das Längenwachstum von Axonen und Dendriten hochsignifikant verringert. Die Ergebnisse der Fortsatzlängenmessung sind als Mittelwert und Standardfehler des Mittelwertes in µm angegeben. Zur statistischen Auswertung wurde der U-Test für verteilungsunab-hängige Parameter nach Mann und Whitney verwandt. Hochsignifikanten Werten (fettgedruckt) wurde ein p < 0,01 zugrunde gelegt.
Um den Einfluß von BoNT/A auf die Transmitterexozytose untersuchen zu können, wurde Meerret-tichperoxidase (HRP) zu den Zellkulturen gegeben. Eine intakte synaptische Aktivität setzt die Rückführung und Neubeladung der synaptischen Vesikel-membranen nach der Transmitterexozyt-ose voraus. Den Zellen zugesetzte exogene Marker, die vesikulär endozytiert werden können, aber nicht zellmembranpermeabel sind, müssen daher im Zellinneren nach der Exozytose auftauchen. Das Enzym Meerrettichperoxidase (HRP) ist ein endozytotisch aufgenommener Marker. Zu BoNT/A- vergifteten und unbehandelten Kontrollkulturen wurde 20 Minuten eine HRP-Lösung (5 mg HRP/ml, bei 37 °C oder 4°C) zugesetzt. Nach Fixierung und Entwicklung mit Diaminobenzidin (DAB) sind HRP-angereicherte Vesikel im Elektronenmikroskop geschwärzt zu erkennen. Unmar-kierte Vesikel erscheinen optisch leer ( Abbildung 38 ). Anhand der elektronenmikroskopischen Bilder sind die markierten und unmarkierten synaptischen Vesikel in den präsynaptischen Terminalen ausgezählt worden. Das errechnete Verhältnis gilt als indirektes Maß für die Vesikelexozytose. Mit HRP angereicherte endosomale Strukturen konnten aufgrund der charakteristischen Größenunterschiede (synaptische Vesikel ca. 50 nm im Durchmesser, bei Endosomen ca. 250 nm Durchmesser) ausgeschlossen werden.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefaßt: Unter BoNT/A-Einfluß ist sowohl die absolute Anzahl HRP-enthaltender Vesikel als auch das Verhältnis von HRP-enthaltenden zu nicht HRP-enthaltenden Vesikeln als Maß exo-/endozytotischer Ereignisse gegenüber der Kontrolle signifikant verringert.
Abbildung 38: BoNT/A hemmt die synaptische Exozytose
Sechs Tage alte Zellkulturen wurden mit 0,1 nM BoNT/A vergiftet. Nach 8 DIV wurden die Kulturen 20 min mit einer HRP-Lösung (5 mg/ml bei 37°C) inkubiert. Die Anzahl HRP-angereicherter Vesikel (Pfeilspitzen) wurde durch das Toxin (B) gegenüber Kontrollen (A) deutlich verringert. Endosomale Strukturen (Pfeile in A) wurden nicht ausgezählt. DAB-Entwicklung
Maßstab = 0,5 µm
Tabelle 5: Blockierung der Transmitterexozytose durch Botulinumneurotoxin A
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Anzahl der synaptischen vesikel (µm-2) |
ratio |
Anzahl der ana |
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markiert |
nicht markiert |
markiert/unmarkiert |
N |
|
Kontrolle |
4.3 +/- 0.7 |
25.4 +/- 3.2 |
0.240 +/- 0.042 |
34 |
|
BoNT/A |
1.3 +/- 0.3 |
28.4 +/- 3.2 |
0.059 +/- 0.015 |
44 |
Die hippocampalen Neurone sind mit und ohne BoNT/A-Behandlung nach 8 DIV für 20 min mit HRP (37°C) inkubiert worden. Nach DAB-Entwicklung konnten HRP-angereicherte Vesikel identifiziert werden. Anschließend sind markierte und nicht markierte Vesikel in einer BoNT/A-Gruppe und einer unbehandelten Kontrollgruppe ausgezählt worden. Die Ergebnisse sind als Mittelwert +/- Standardfehler des Mittelwertes (SEM) aufgeführt. Der Signifikanz ist ein p < 0.01 im U-Test nach Mann und Whitney zugrunde gelegt. Die Signifikanzen sind fettgedruckt.
Nach HRP-Inkubation bei 4°C wurden keine markierten Vesikel beobachtet.
Die Zelldichtemessung hat zwischen unbehandelter und BoNT/A-vergifteter Zellkultur einen signifikanten Unterschied ergeben. Sowohl nach 2 DIV als auch nach 6 DIV hat sich bei den toxinbehandelten Kulturen die Zelldichte über das durch Apoptose (programmierter Zelltod) verursachte Maß hinaus verringert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengestellt. Die signifikanten Werte sind fettgedruckt.
Tabelle 6: Botulinumneurotoxin A beeinflußt die Zelldichte in hippocampalen Zellkulturen
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Zelldichte nach 2 DIV Kontrolle BoNT/A |
Zelldichte nach 6 DIV Kontrolle BoNT/A |
Anzahl der Zellen |
213,5 +/-7,8 121+/-4,3 |
59,4 +/- 3,6 40,8 +/- 3,1 |
SNAP-25 ist neben Syntaxin auch Proteolysesubstrat von Botulinumneurotoxin C. Deshalb ist versucht worden, nach Zugabe dieses Toxins Unterschiede zwischen behandelten und unbe-handelten Zellkulturen zu erfassen.
Im Westernblot (
Abbildung 39
) ist die Spaltung von Syntaxin und SNAP-25 in hippocampalen Zell-kulturen bei unterschiedlichen Konzentrationen von BoNT/C zu sehen. Auf die Bahn 1 ist Pro-teinmaterial einer unbehandelter Kontrollkultur aufgetragen worden. Auf den Bahnen 2-4 sind Homogenate unterschiedlicher Konzentrationen von BoNT/C-vergifteten Zellkulturen (24 h Ein-wirkzeit) aufgetragen worden. Die Immunmarkierungen für Syntaxin sind bei 35 kDa und für SNAP-25 bei 25 kDa zu erkennen. Bei 1 nM BoNT/C ist Syntaxin vollständig gespalten und bei einer Toxinkonzentration von 10 pM teilweise proteolysiert (Bahn 3). SNAP-25 ist bei 1 nM BoNT/C gespalten, es ist nur noch die 24 kDa-Bande zu sehen. Bei 10 pM Toxinkonzentration ist die 25 kDa-Bande deutlich schwächer als in der Kontrolle. Nach Einwirkung von 1 pM BoNT/C (Bahn 4) zeigt sich mit diesem Verfahren kein Unterschied zur Kontrollkultur. Außerdem sind Proteinkinase C 
(PKC ) und Synaptobrevin als Kontrollproteine detektiert worden.
Abbildung 39: BoNT/C spaltet Syntaxin und SNAP-25
Auf Bahn1 sind Proteine einer unbehandelten Kontrollkultur und auf den Bah-nen 2-4 Homogenate von BoNT/C-vergifteten Zellkulturen aufge-tragen worden. Bei einer Konzentration von 1 nM BoNT/C (Bahn 2) sind Syntaxin und SNAP-25 gespalten. Proteinkinase C und Synaptobrevin sind unverändert in Kontroll- und Versuchskulturen vorhanden.
Die mit BoNT/C vergifteten Zellen wiesen schon nach 1 DIV zytotoxische Schädigungen auf. Die Perikarya waren abgerundet und die Zellfortsätze aufgetrieben. Deshalb konnten keine Fortsatz-längenmessungen durchgeführt werden.
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