Fetter, Ingmar: Der Einfluß von Botulinumneurotoxin A auf Wachstum und Differenzierung primär dissoziierter hippocampaler Zellkulturen |
Puffer
Stammlösungen für die Zellkultur
Lösungen und Medien für die Zellkultur
Lösungen für Proteinaufarbeitung, Elektrophorese und Westernblotting
Lösungen zur Fixierung von kultivierten Zellen
Lösungen zur immunzytochemischen Analyse von Kulturen
Lösungen für die Elektronenmikroskopie
Lösung für den Meerrettich-Peroxidase-Nachweis
Die Primärkulturen wurden mit Zellen von 17 Tage alten Mäuseembryonen angelegt. Dazu wurden männliche C3H/He-Mäuseböcke (Fa. Harlan Winkelmann, Borchen, Deutschland) 12 Stunden lang mit weiblichen C57B1/6J-Mäusen gepaart. Die Betreuung der Tiere erfolgte im zentralen Tierver-suchsstall der Charité bzw. im Tierversuchsstall des Anatomischen Institutes der Charité. Die Tier-zucht und alle weiteren Arbeiten mit den Mäusen wurden entsprechend den geltenden Tierschutz-bestimmungen durchgeführt.
Sämtliche Arbeitschritte der Präparation, Kultivierung und Behandlung der Zellen wurden unter sterilen Arbeitsbedingungen an einer Sterilwerkbank durchgeführt. Benötigte Medien und Medien-zusätze wurden unter Verwendung von Einmalsterilfiltern mit 0,2 µm sterilfiltriert. Die Kulturen wurden nicht mit antibiotischen Substanzen behandelt.
Chirurgische Instrumentarien und Glaswaren wurden bei trockener Hitze von 180°C 30 min lang sterilisiert. Kunststoffgegenstände wurden bei feuchter Hitze von 121°C und einem Dampfdruck von 200 kPa 15 min lang autoklaviert.
Für das Anheftungs- und Überlebensverhalten der zu kultivierenden Zellen spielt die Oberfläche des Kulturgefäßes eine entscheidende Rolle. Zur Verbesserung der Oberflächeneigenschaften dient vor allem die Anreicherung elektrischer Ladungen. Dazu wurde der Boden der Kulturschalen mit Poly-D-Lysin oder Poly-L-Lysin beschichtet. Dies erfolgte durch Gabe von sterilen 2 %igen Poly-D-Lysin- und Poly-L-Lysin-Lösun-gen in die Kulturschälchen für 24 h bei RT. Nach anschlies-sendem dreimaligen Spülen mit Aqua bidest. wurden die Kulturschälchen in der Sterilwerkbank bei RT getrocknet. In Vorversuchen ergab sich kein Anhalt für unterschiedliches Anheftungs- und Differenzierungsverhalten der hippocampalen Zellen auf Poly-D-Lysin/ bzw. Poly-L-Lysin-Beschich-tung, so daß für alle Experimente einheitlich Poly-D-Lysin-beschichtete Kulturgefäße verwandt wur-den. Die schwangeren Muttertiere wurden mit Chloroform narkotisiert, durch zervikale Dislokation getötet und der Uterus entnommen. Die weitere Präparation erfolgte in einer sterilen Petrischale auf Eis in einer Sterilwerkbank. Die Embryonen wurden aus dem Uterus entfernt und sofort deka-pitiert. Die Köpfe wurden umgehend in modifizierter Hanks´scher Lösung (pH 7,2) auf Eis gestellt.
Unter Zuhilfenahme einer Stereolupe wurde die Schädelhaut entfernt, die Kalotte eröffnet und das Gehirn entnommen. Danach wurden die Meningen mit einer feinen Pinzette vom Gehirn abge-trennt. Anschließend wurde der Hippocampus mit dem Gyrus dentatus entnommen. Die gesamte Präparation erfolgte in PBS auf Eis. Die Hippocampi wurden zunächst in modifizierter Hanks´scher Salzlösung auf Eis gesammelt.
Nach mechanischer Zerkleinerung wurden die Zellen neun Minuten (1.500U/min) zentrifugiert, der Überstand dekantiert und das Zellpellet mit Kulturmedium resuspendiert. Die Dichte betrug 20.000 Zellen/cm2 bzw. 5.000 Zellen/cm2 für die Versuche, die zur Längenmessung herangezogen wur-den.
Die Zellen wurden anschließend bei 37°C und 10 % CO2 in einem Brutschrank inkubiert. Nach 48 h in Kultur (2 DIV = 2 days in vitro) wurde das Medium komplett durch frisches Medium ohne Serum-zusatz ersetzt. Während der weiteren Kultivierung erfogte das Füttern der Zellen wöchentlich,wobei jeweils die Hälfte des Mediums durch frisches Medium ohne Serumzusatz ersetzt wurde.
Die Zellen wurden durch Probenladepuffer vom Boden des Kulturschälchens abgelöst. und dann ca. 1 min mittels Ultraschall homogenisiert. Anschließend wurde das Homogenat für 5 min bei 100°C im Wasserbad gekocht. Aus dem proteinhaltigen Überstand wurde eine Probe zur Bestim-mung der Proteinkonzentration entnommen. Der verbleibende Überstand wurde mit Bromphenol-blau versetzt und 5 min bei 100°C im Wasserbad gekocht. Die Bestimmung der Proteinkonzentra-tion erfolgte photometrisch, wobei als Standard BSA diente.
Die endgültige Proteinkonzentration wurde durch Zugabe von Probenladepuffer auf 20 µg/µl einge-stellt. Jeweils 10 µl dieser Proben wurden pro Geltasche aufgetragen und durch SDS-Polyacryl-amid-Gelelektrophorese in der Midget-Kammer aufgetrennt. Dazu wurden Gele von 7,5 % - 10 % verwandt. Anschließend wurden die aufgetrennten Proteine mittels des Westernblot-Verfahrens auf eine Nitrozellulose-Membran übertragen. Die Detektierung der Proteine erfolgte durch die in Tabelle 1 aufgeführten Primärantikörper, die durch HRP- (Meerrettichperoxidase) gekoppelte Sekundäranti-körper und DAB-Entwicklung visualisiert wurden.
Tabelle 1: Arbeitskonzentrationen der Primärantikörper beim Westernblotverfahren
Antikörper |
Eigenschaft |
Verdünnung |
anti-Synaptophysin |
polyklonal, Kaninchen |
1:2000 |
anti-Synaptobrevin |
monoklonal, clone 69.1, Maus |
1:3000 |
PKC |
monoklonal, Maus |
1:1000 |
anti-Syntaxin |
monoklonal, clone HPC-1, Maus |
1:2000 |
anti-SNAP-25 |
monoklonal, Maus |
1:3000 |
PKC = Proteinkinase C
Die verschiedenen immunzytochemischen Nachweismethoden basieren alle auf dem folgenden Grundprinzip. Das gesuchte Antigen wird durch einen spezifischen Primärantikörper erkannt. Dieser wird entweder direkt mit einem Fluoreszenzfarbstoff-markierten Zweitantikörper nachge-wiesen, oder durch ein an einen Sekundärantikörper gebundenes Avidin-Biotin-System, über das ein weiterer Fluoreszenzfarbstoff bzw. ein chromogenes Enzym anheften kann.
Zunächst wurde mit einer Pasteur-Pipette vorsichtig das Medium aus den Kulturschalen abgesaugt und die Zellen in 0,5 ml 4 %iger Paraformaldehydlösung für 30 min bei RT fixiert. Anschließend wurde das Fixans durch dreimaliges Spülen à 5 min mit PBS entfernt. Zur Blockierung der endoge-nen Peroxidase wurden die Kulturen bei RT in einer Lösung aus 10 %igem Methanol und 0,1 %igem H2O2 in PBS inkubiert. Anschließend erfolgte wieder ein Waschgang mit PBS. Um ein bes-seres Eindringen der Antikörper in intrazelluläre Kompartimente zu ermöglichen, wurden die Zell-membranen der kultivierten Neurone für 5 min in 0,5 % Triton X-100 in PBS bei RT permeabilisiert. Danach wurden die Kulturen in einer 2 %igen Normalserum-Lösung der Spezies, in der der Sekun-därantikörper hergestellt wurde, inkubiert. Das verhindert ein Zustandekommen falsch-positiver Ergebnisse durch unspezifische Antikörperbindungen. Dann erfolgte ohne vorhergehenden Wasch-gang die Inkubation mit dem Primärantikörper (über Nacht, bei 4°C; zu Konzentrationen siehe Tabelle 2 ). Nach Waschen mit PBS erfolgte die Inkubation mit dem Sekundärantikörper ( 1 h, bei 4°C; zu Konzentrationen siehe Tabelle 3 ). Nach abermaligem Waschen schloß sich die Inkubation mit dem Avidin-Biotin-Komplex (ABC) oder einem HRP-gekoppelten Antikörper an.
Tabelle 2: Konzentrationen der zytochemisch verwandten Primärantikörper
Antikörper |
Eigenschaft |
Verdünnung |
anti-Synaptophysin |
polyklonal, Kaninchen monoklonal, clone SY38, Maus |
1:1000 1:20 |
anti-SNAP-25 |
monoklonal, Maus polyklonal, Kaninchen |
1:1000 1:200 |
anti-MAP-2 |
monoklonal, Maus |
1:200 |
anti-Transferrin |
polyklonal, Kaninchen |
1:500 |
Tabelle 3: Konzentrationen der verwandten Sekundärantikörper
Antikörper |
Eigenschaft / Herkunft |
Verdünnung |
biotinyl. anti-Maus |
Pferd |
1:200 |
biotinyl. anti-Kaninchen |
Ziege |
1:200 |
FITC |
chromogen, Ziege-anti-Kaninchen |
1:750 |
Zur enzymatischen Umsetzung des Chromogens wurden die Zellen in einer Lösung aus 0,05 % DAB (Diaminobenzidin), und 0,03 % H2O2 in Tris-HCl inkubiert, wobei sich die Entwicklungsdauer nach Stärke der Immunreaktion richtete und unter dem Mikroskop kontrolliert wurde.
Sämtliche Schritte dieser immunzytochemischen Nachweismethode erfolgten direkt in den Kultur-schalen. Die Antikörper wurden in einer Antikörper-Verdünner-Lösung angesetzt, der AB-Komplex entsprechend den Empfehlungen des Herstellers 1:100 in PBS verdünnt. Abschließend wurden die Kulturschalenböden mit einem Hohlbohrer ausgebohrt, und die fertigen Präparate mit Kaisers-Glycerin-Gelatine eingedeckt.
Analog dem Vorgehen bei der Avidin-Biotin-Methode erfolgte zunächst eine Fixierung der Zellkul-turen in 4 %igem Paraformaldehyd bei RT, ein Permeabilisieren der Zellmembranen für 5 min mit 0,3 % Triton X-100 bei RT, unterbrochen durch Waschen in PBS. Als nächstes erfolgte die Inkuba-tion der Zellen in 2 %igem Normalserum der Spezies des Sekundärantikörpers. Nach dem Absau-gen dieses Serums folgte die Inkubation mit dem Primärantikörper (über Nacht, bei 4°C). Mittels zweier verschiedener Sekundärantikörper, des Fluorescein-markierten Zweitantikörpers (FITC-anti-rabbit) und des Biotin-konjugierten Zweitantikörpers (biotinyl. anti-mouse), der durch Anlagerung TexasRot-angereicherter Avidinmoleküle sichtbar wurde, waren Doppelmarkierungen möglich. Nach dreimaligem Spülen mit PBS erfolgte die Inkubation mit dem biotinylierten Zweitantikörper und/oder dem FITC-Antikörper (1 h, bei 4°C). Ab diesem Zeitpunkt mußte in einer abgedunkelten Kammer gearbeitet werden, um ein frühzeitiges Verblassen der Fluoreszenzen zu vermeiden. Nach erneutem Spülen mit PBS erfogte die Visualisierung des Biotin-markierten Sekundär-antikörpers mit TexasRot-konjugiertem Avidin. Durch Anregung mit unterschiedlichen Wellen-längen (TexasRot: Emission bei 615 nm und Extinktion bei 595 nm; FITC: Emission bei 512 nm und Extinktion bei 492 nm) wurden die Vesikelproteine sichtbar. Die Kontrolle mit Sekundäranti-körpern (ohne Primärantikörper) zeigte eine schwache, diffuse Hintergrundfärbung.
Um eine Konservierung der Fluoreszenzen zu gewährleisten, wurden diese nach dem Ausbohren mittels Hohlbohrer in ImmunoMount (Fa. Shandon) eingedeckt und bei 4°C im Dunkeln aufbewahrt.
Zur Darstellung der Ultrastrukturen mittels Transmissionselektronenmikroskopie wurde eine Pre-embedding-Methode mit Gold/Silber-Verstärkung genutzt. Die Fixierung der Neurone in den Zell-kulturschalen erfolgte durch 1,5 %iges Glutaraldehyd in 0,1 M Cacodylatpuffer für 30 min. bei RT. Die endogene Peroxidase wurde durch 10 %iges Methanol und 10 µl H2O2 in 10 ml PBS blockiert (5 min), anschließend erfolgte eine Permeabilisierung in 0,5 mg Saponin/ml HBSS (10 min). Die Vorinkubation fand in 2 %igem Ziegenserum statt. Zwischen den einzelnen Schritten wurde jeweils dreimal in PBS gewaschen. Die Inkubation in der Lösung des Primärantikörpers erfolgte für 24 h bei 4°C. Vor Zugabe des Sekundärantikörpers wurde wiederum in PBS gewaschen und 30 min in einer 10 %igen PBS-A-Lösung vorinkubiert.
Der goldmarkierte Zweitantikörper (1 nm Gold) wurde 1:50 in einer Lösung aus BSA/C, Tween 20, Natriumazid und PBS verdünnt. Nach der Inkubation für 24 h bei 4°C wurde in 0,05 %igem PBS-Tween (20 min und 40 min) und PBS (60 min) gewaschen und anschließend mit 2 %igem Glutaral-dehyd für 15 min nachfixiert. Nach Spülungen mit PBS und 150 mM NaNO3 wurde für 30-60 min unter Sichtkontrolle der Silberverstärker (Inten SE M, Fa. Amersham) dazugegeben und der Abbruch mit 150 mM NaNO3 erzeugt.
Dann wurde im Kühlraum mit 5 mM Goldchlorid, Acetat-Waschpuffer, Natriumthio-sulfat-Puffer, HEPES-Waschpuffer und PBS gespült. Bei RT wurde mit 1 %igem OsO4 kontrastiert. Nach 25 min wurde je dreimal in 50 %igem und 70 %igem Alkohol gespült, dann mit 2 %igem Uranylacetat für 10 min bei 4°C nachkontrastiert. Die vollständige Entwässerung erfolgte in einer aufsteigenden Alkoholreihe, die Einbettung in vier Schritten mit steigender Epon 812-Konzentration. Für je 15 min wurden Mischungen aus 2 Volumenteilen (VT) HPMA + 1VT Epon, dann je 1 VT HPMA und Epon und 1 VT HPMA + 2 VT auf die Kulturen gegeben. Zuletzt wurde reines Epon auf die Zellkulturen gegeben.
Bei 60°C polymerisierte Epon aus, anschließend wurden die eingebetteten Zellen von ihrer Unter-lage abgesprengt. Nach Trimmen mit einer Rasierklinge wurden an einem Ultramikrotom Semi- und Ultra-Dünnschnitte angefertigt, die auf Zaponlack-befilmte Nickelgrids aufgezogen wurden. Anschließend erfolgte eine Nachkontrastierung für 3 min mit Natriumcitrat-Lösung, dann weitere 3 min mit Uranylacetat-Lösung.
Die kultivierten Zellen wurden lichtmikroskopisch mit dem inversen Mikroskop (Axioplan, Fa. Zeiss) ausgewertet. Der Dokumentation der Ergebnisse diente der integrierte Photoaufsatz (Ricoh). Dabei wurden Pan Ilford-Filme (schwarz/weiss Negativfilm, 50 ASA) verwandt. Fluoreszenzpräparate wurden an dem Mikroskop BX50 der Firma Olympus mit der Photosteuereinheit PM-20 und dem Apparat PM-C 35 DX photografiert. Die Anregung der Farbstoffe erfolgte mit einer Quecksilber-dampflampe und den Olympus-Filtern U-MNIBA (Anregung von 470-490 nm, dichroitische Teilung bei 505 nm, Sperrfilter von 515-550 nm) für FITC und U-MWIG (Anregung von 520-550 nm, dichroitische Teilung bei 565 nm, Sperrfilter von > 580 nm) für CY-3. Für die gleichzeitige Anre-gung beider Fluoreszenzfarbstoffe wurde das Mischfilter U-M51004 (Anregung von 480-495 nm sowie 550-570 nm, Sperrfilter von 515-535 nm und 590-620 nm) genutzt. Photographiert wurde auf Kodak Elite - Film (Diafilm, 1600 ASA). Bei der CLSM-Technik (confocal laser scanning micro-scopy) werden die mikroskopischen Bilder (Diaphot, Nikon; Anregung durch Argonlaser bei 514 nm, Emission für Fluorescein bei 540 nm und für TexasRot bei 600 nm) unter Verwendung eines Scanners (MRC-600, BioRad, Hemel Hempstead, UK) in eine Computerdatei umgewandelt. In dieser Datei können Kolokalisationen errechnet und in einem dritten Farbton dargestellt werden. Die ultrastrukturellen Aufnahmen wurden an einem Transelektronenmikroskop (EM 900) der Firma Zeiss gemacht.
Zur Ermittlung von Axon- und Dendritenlängen wurde das halbautomatische Bildanalysesystem Videoplan der Firma KONTRON-Elektronik (Eching, Deutsch-land) genutzt. An photografierten Zellkulturneuronen konnten so Dendritenanzahl, Anzahl der Dendriten- und Axonverzweigungen sowie die Längen der Fortsätze gemessen werden. Die erhaltenen Daten wurden in MS-Excel aufbereitet und anschließend statistisch ausgewertet. Für die Stichprobenvergleiche wurde der U-Test nach Mann und Whitney bei einem Signifikanzniveau von p < 0,01 verwandt.
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HTML - Version erstellt am: Mon Mar 17 17:30:37 2003 |