Höltje, Markus: Regulation der Aktivität der vesikulären Monoamintransporter VMAT1 und VMAT2 in neuroendokrinen Zellen und Neuronen |
13
5-Hydroxy-[3H] Tryptamintrifluoracetat Serotonin, spez. Aktivität 3260Bq / mmol |
Amersham (Dreieich) |
I-[7,8-3H] Noradrenalin spez. Aktivität 444 Bq / mmol |
Amersham (Dreieich) |
[2,5-3H] Histamindihydrochlorid spez. Aktivität 1550 Bq / mmol |
Amersham (Dreieich) |
Agarose |
Merck (Darmstadt) |
Acrylamid Stammlösung (30%) |
Roth (Karlsruhe) |
Ammoniumpersulfat |
Sigma (München) |
Araldit |
Serva (Heidelberg) |
|
Weller, Institut Ray-Roecky-Weller (Baden-Baden) |
ATP Adenosin-5´-Triphosphat |
Sigma (München) |
B27 Supplement |
Gibco Life Technologies (Eggenstein) |
BCA Natrium Bicinchoninsäure-4,4-di- carboxy-2,2-Bichinolin |
Sigma (St.Louis,. USA) |
Bisacrylamid Stammlösung (30%) |
Roth (Karlsruhe) |
BSA Rinderserum Albumin |
Sigma (St.Louis, USA) |
Diaminobenzidin (DAB) |
Sigma (München) |
DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Medium |
Biochrom (Berlin) |
14
DMEM / HAM`s F12 |
Biochrom (Berlin) |
DMSO Dimethyl-Sulfoxid |
Roth (Karlsruhe) |
ECLTM Enhanced Chemiluminescence |
Amersham (Buckinghamshire, England) |
EDTA Ethylendiamintetraacetat |
Roth (Karlsruhe) |
Fluoxetin Hydrochlorid |
Biotrend (Köln) |
Formvar |
Serva (Heidelberg) |
Glutamin |
Biochrom (Berlin) |
Glutaraldehyd |
Fluka (Neu-Ulm) |
GMppNp 5´-Guanylylimidodiphosphat |
Sigma (München) |
G-Protein Untereinheiten G |
Bernd Nürnberg, Institut für Pharmakologie der FU Berlin |
GTP Guanosin 5´-O-( 3-thiotriphosphat ) |
Sigma (München) |
Heparin |
Ratiopharm (Ulm) |
HEPES N-2-Hydroxyethylpiperazin-N`-2-Ethansulfonsäure |
Sigma (München) |
Histamin Hydrochlorid |
Sigma (München) |
Hybond C Nitrozellulose Membran |
Amersham (Buckinghamshire, England) |
Kaliumglutamat |
Sigma (München) |
Kälberserum, fötales |
Biochrom (Berlin) |
Ketavet |
Curamed Pharma GmbH (Karlsruhe) |
Kollagen |
Sigma (München) |
15
Lipofectin |
Gibco Life Technologies (Eggenstein) |
LMW Low Molecular Weight Marker |
Pharmacia Biotech (Uppsala,Schweden) |
Magermilchpulver |
Glücksklee (München) |
Mowiol |
Hoechst (Frankfurt/aM) |
Natriumdodecylsulfat (SDS) |
Boehringer Mannheim |
Neurobasal Medium (NBM) |
Gibco Life Technologies (Eggenstein) |
Optimem |
Biochrom (Berlin) |
OptiPhase ´HighSafe 3 Szintillationscocktail ` |
Wallac (Turku, Finnland) |
Osmiumtetroxid |
Merck (Darmstadt) |
Penicilin / Streptomycin |
Biochrom (Berlin) |
Pertussis Toxin |
Calbiochem / Novabiochem (Bad Soden / Taunus) |
Pipes Piperazin-N,N´-bis[2-ethansulfonsäure] |
Sigma (München) |
Pferdeserum |
Biochrom (Berlin) |
Poly-L-Lysin |
Sigma (München) |
Ponceau S |
Sigma (St.Louis, USA) |
Protease Inhibitoren: Aprotinin, Leupeptin, Pepstatin PMSF(Phenylmethylsulfonylfluorid) |
Boehringer Mannheim |
Reserpin |
Sigma (München) |
Rompun |
Bayer (Leverkusen) |
Serotonin Hydrochlorid |
Sigma (München) |
16
Streptolysin-O, Mutante 101 |
U.Weller, Institut Ray-Roecky-Weller (Baden-Baden) |
TEMED |
Sigma (München) |
Tetanus Neurotoxin |
U.Weller, Institut Ray-Roecky-Weller (Baden-Baden) |
Tetanus Neurotoxin, leichte Kette |
U.Weller, Institut Ray-Roecky-Weller (Baden-Baden) |
Triton X-100 |
Roth (Karlsruhe) |
Tetrabenazin |
Jean Pierre Henry, Institut de Biologie Physico-Chimique (Paris) |
Wasserstoffperoxid |
Merck (Darmstadt) |
Antikörper-Lösung für Immunorepklika-Analysen
1,5% w/v |
Rinderserum Albumin in TS Puffer |
Block-Lösung für Immunoreplika-Analysen
5% w/v |
Magermilchpulver |
0,1% v/v |
Tween 20 in TS Puffer |
Chlornaphtolentwicklung
2 ml |
3 mg / ml |
10 ml |
TS |
10 µl |
Wasserstoffperoxid (30%) |
Elektrophorese Puffer (10 X)
30 g |
Tris |
144 g |
Glycin |
10 g |
SDS |
|
auf 1 Liter mit dH2O auffüllen |
17
Kaliumglutamat Puffer I (KG1)
150 mM |
Kaliumglutamat |
20 mM |
Pipes |
4 mM |
EGTA |
1 mM |
Mg2+ (freies), durch Zusatz von 111,4 µl 1 M Magnesiumacetat /100 ml Puffer |
|
mit KOH auf pH 7,0 eingestellt |
Kaliumglutamat Puffer III (KG3)
150 mM |
Kaliumglutamat |
20 mM |
Pipes |
4 mM |
EGTA |
2 mM |
ATP |
1 mM |
Mg2+ (freies), durch Zusatz von 111,4 µl 1 M Magnesiumacetat /100 ml Puffer |
|
mit KOH auf pH 7,0 eingestellt |
Kaliumglutamat Puffer IV (KG4)
150 mM |
Kaliumglutamat |
20 mM |
Pipes |
4 mM |
EGTA |
2 mM |
ATP |
1 mM |
Mg2+ (freies), durch Zusatz von 111,4 µl 1 M Magnesiumacetat /100 ml Puffer |
15 µM |
Ca2+ (freies), durch Zusatz von 78,28 µl 1 M CaCl2 / 20 ml Puffer |
|
mit KOH auf pH 7,0 eingestellt |
Krebs-Hepes Puffer (KR)
140 mM |
NaCl |
4,7 mM |
KCl |
2,5 mM |
CaCl2 |
15 mM |
Hepes |
18
1,2 mM |
MgSO4 |
6,5 mM |
Glucose |
|
auf pH 7,4 eingestellt |
Phosphatpuffer (PBS)
140 mM |
NaCl |
2,7 mM |
KCl |
10 mM |
Na2HPO4 |
1,8mM |
KH2PO4 |
Ponceau-S Lösung
0,5% w/v |
Ponceau S |
3% v/v |
Trichloressigsäure |
Probenpuffer (Laemmli)
12,48 ml |
Sammelgel-Puffer ( 4 X ) |
5 ml |
1,5 M DTT |
15 g |
Sacharose |
1,5 ml |
0,1 M EDTA ( Na-Salz ) pH 7.0 |
|
auffüllen auf 1 Liter mit dH2O |
Sammelgel-Puffer (4 X)
60,5 g |
Tris pH 6,8 |
4 g |
SDS |
|
auffüllen auf 1 Liter mit dH2O |
Trenngel-Puffer (4 X)
181,7 g |
Tris pH 8,8 |
4 g |
SDS |
|
auffüllen auf 1 Liter mit dH2O |
19
20 mM |
Tris |
150 mM |
NaCl |
Tyrode-Hepes Puffer
1 34 mM |
NaCl |
0,34 mM |
Na2HPO4 |
2,9 mM |
KCl |
12 mM |
NaHCO3 |
20 mM |
Hepes |
5 mM |
Glucose |
1 mM |
MgCl2 |
|
auf pH 7,3 eingestellt |
Immunoreplika Puffer (Semi Dry)
48 mM |
Tris |
385 mM |
Glycin |
3,7 g/ml |
SDS 10 % |
800 ml |
dH2O |
200 ml |
Methanol |
Kulturmedium für BON Zellen
45 ml |
DMEM |
45 ml |
DMEM / HAM`S F12 |
10 ml |
fötales Kälberserum |
1 ml |
Glutamin |
1 ml |
Penicillin / Streptomycin |
20
85 ml |
DMEM |
10 ml |
Pferdeserum |
5 ml |
fötales Kälberserum |
1 ml |
Glutamin |
1 ml |
Penicillin / Streptomycin |
Dissoziationsmedium für Rapheneurone
50 ml |
fötales Kälberserum |
5 ml |
Hepes 1 M |
5 ml |
Glutamin |
50 IE |
Insulin |
4 g |
Glucose |
|
auffüllen auf 500 ml mit DMEM |
Startermedium für Rapheneurone
5 ml |
Glutamat 2,5 mM |
|
auffüllen auf 500 ml mit Kulturmedium |
Kulturmedium für Rapheneurone
10 ml |
B27 |
1,25 ml |
Glutamin |
5 ml |
Penicillin / Streptomycin |
|
auffüllen auf 500 ml mit NBM |
Antikörper |
Bezugsquelle und Publikation |
VMAT1 polyklonal, Kaninchen |
R.Jahn, Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie, Göttingen |
VMAT2 polyklonal, Kaninchen |
R.Jahn, Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie, Göttingen |
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Synaptobrevin II (Klon 69.1) monoklonal, Maus |
Synaptic Systems, Göttingen Edelmann et al. (1995) |
Synaptophysin (Klon 7.2) monoklonal, Maus |
Synaptic Systems, Göttingen Jahn et al. (1985 ) |
Chromogranin A / B polyklonal, Kaninchen |
Quartett, Berlin |
Chromogranin B polyklonal, Kaninchen |
R.Fischer-Colbrie, Universität Innsbruck Kroesen et al. (1996) |
Cytochrom b561 monoklonal, Maus |
B.Wiedenmann, Universitätsklinikum Charité, Berlin Ahnert-Hilger et al. (1993) |
Dopamin- polyklonal, Kaninchen |
B.Wiedenmann, Universitätsklinikum Charité, Berlin Ahnert-Hilger et al. (1993) |
Serotonin polyklonal, Kaninchen und Huhn |
R.W.Veh, Institut für Anatomie der Charité, Berlin |
G polyklonal, Kaninchen |
G.Schultz, Institut für Pharmakologie der FU Berlin Spicher et al. (1992) |
G polyklonal, Kaninchen |
G.Schultz, Institut für Pharmakologie der FU Berlin Spicher et al. (1992) |
G Polyklonal, Kaninchen
Monoklonal, Maus (Klon 94.1)
|
G.Schultz, Institut für Pharmakologie der FU Berlin Laugwitz et al. (1996) R.Jahn, Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie, Göttingen |
Antikörper |
Bezugsquelle |
Pferd anti-Maus IgG Peroxidase-gekoppelt |
Vector Laboratories, Burlingham (USA) |
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Ziege anti-Kaninchen IgG Peroxidase-gekoppelt |
Vector Laboratories, Burlingham (USA) |
Esel anti-Maus IgG Texas Red-gekoppelt |
Jackson Laboratories, West Grove (USA) |
Ziege anti-Kaninchen IgG Texas Red-gekoppelt |
Jackson Laboratories, West Grove (USA) |
Ziege anti Kaninchen IgG Oregon Green-gekoppelt |
Molecular Probes, Eugene (USA) |
Ziege anti-Huhn IgG Alexa Green-gekoppelt |
Molecular Probes, Eugene (USA) |
PC 12 Zellen wurden in Kollagen-beschichteten Kulturschalen (Durchmesser 100 mm) bei 37 °C und 10 % CO2 Gehalt in der Atmosphäre kultiviert. Zunächst wurde in einem Ansatz für 10 Schalen ein Gemisch aus 32 ml 30 %igem Ethanol und 1 ml Kollagen mit Hilfe eines Falcon 7107 Einmalfilter-Systems sterilfiltriert. Danach wurden jeweils 3 ml in eine Schale pipettiert und kurz geschwenkt. Die Flüssigkeit wurde dann über mehrere Stunden unter der eingeschalteten Steril-Arbeitsbank eingetrocknet. Die so vorbehandelten Schalen wurden im Brutschrank bei 37°C aufbewahrt. PC12 Zellen wurden mit einer Dichte von 2-2,5 x 106 je 100 mm Schale in Kulturmedium ausplattiert und einmal in der Woche zum Ausdünnen umgesetzt. Zum Umsetzen wurde das Medium abgesaugt und die Schale mit 5 ml PBS gespült. Darauf wurden die Zellen für 1 min mit 1 ml Trypsin-Lösung (1:10) überspült und anschließend für 2 min im Brutschrank stehen gelassen. Die Zellen wurden dann mit 2 ml PBS von der Schale gespült und für 2 min bei 1000 xg abzentrifugiert. Die sedimentierten Zellen wurden in 1 ml Medium aufgenommen, gut resuspendiert und
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in einer Dichte von 1-2 x 106 je Schale mit je 8,5 ml Kulturmedium ausplattiert.BON Zellen wurden in unbehandelten Schalen (100 mm Durchmesser) bei 37°C und 5 % CO2 Gehalt in der Atmosphäre kultiviert. Die Zellen wurden mit einer Dichte von 2,2-2,5 x 106 je Schale in Kulturmedium für BON Zellen ausplattiert und einmal in der Woche zum Ausdünnen (wie für PC12 Zellen beschrieben) umgesetzt.
Die Gehirne von embryonalen Wistar Ratten wurden am Embryonaltag (E)13 oder 14 präpariert. Das Alter der Embryonen wurde dabei über morphologische Kriterien der Extremitätenanlagen und des Kopfes nach Butler et al. (1987) bestimmt. Die Gehirne wurden in Dissoziationsmedium aufgenommen und die Meningen wurden vorsichtig vom Mittelhirn und Hirnstamm entfernt. Die dorsale Sutur des Neuralrohres wurde eröffnet und ein Gewebestreifen von 0,25-0,5 mm Breite wurde entlang der Mittellinie des Mes- und Rhombenzephalons freipräpariert. Von diesem Streifen konnten drei verschiedene Regionen präpariert werden. Die am weitesten rostral gelegene Region wurde als R1 bezeichnet und erstreckte sich vom Isthmus des Rhombenzephalons 1,5 mm nach rostral. Die zweite Region, R2, wurde weiter caudal zwischen dem Isthmus und der Austrittsstelle der Hirnnerven aus der Pons präpariert. Die dritte Region, R3, wurde definiert als die Region, die sich 1,5 mm von der Austrittsstelle der Hirnnerven nach caudal erstreckte.
Primärkulturen von Rapheneuronen wurden nach einem modifizierten Protokoll von Brewer (1995) für Serum-freie Kulturen angelegt. Definierte Bereiche aus der Raphe (s.o.) wurden präpariert, 2X mit PBS gewaschen und für 15 min bei 37°C in einem Trypsin / EDTA Gemisch (0,05 % / 0,02 % w/v in PBS) inkubiert. Darauf wurden die Zellen 1X mit PBS und 1X mit Dissoziationsmedium gewaschen, bevor sie mechanisch mit Hilfe einer Feuer-polierten Pasteur-Pipette vereinzelt wurden. Die Zellen wurden dann für 2 min bei 210 xg und 21°C abzentrifugiert, in Startermedium redissoziiert und nach der Zählung in einer Neubauer-Kammer mit einer Dichte von 85000 Zellen / cm2 auf 48-Loch Platten ausplattiert. Die Platten waren vorher mit poly-L-Lysin (0,5 % in PBS) für 1 h bei Raumtemperatur behandelt worden. Die Primärkulturen wurden bei 36,5°C und 5 % CO2 Gehalt bis zu 5 Wochen kultiviert.
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Ab Tag 4 der Kultur wurde die Hälfte des Mediums 2X in der Woche durch frisches Kulturmedium ersetzt.Zur Permeabilisierung der Zellen wurden die bakteriellen Zytolysine -Toxin und Streptolysin-O (SLO), Mutante 101, verwendet. Für alle Experimente, die nicht der Vorstellung der Permeabilisierungstechnik (siehe 3.1) dienten, wurde ausschließlich SLO verwendet.
Die zytolytische Aktivität beider Toxine wurde nach Lind et al. (1987) und Ahnert-Hilger et al. (1989) an Kaninchen-Erythrozyten bestimmt. Hierfür wurde eine Erythrozyten Suspension (2,5 % in PBS) mit verschiedenen Verdünnungen der Toxine versetzt. Nach Inkubation für 40 min bei 37°C wurde der hämolytische Effekt photometrisch bei 412 nm bestimmt. Der Kehrwert der Verdünnung des Toxins, bei der 50 % der Erythrozyten hämolysiert wurden, ergab die Anzahl der hämolytischen Einheiten (HE) / ml der unverdünnten Toxinpräparation.
Das Medium wurde entfernt und die semikonfluent gewachsenen Zellen wurden zunächst 2 X mit PBS, dann 1 X mit KG1 Puffer gewaschen. Darauf wurden sie mit 1 ml KG1 Puffer je Kulturschale suspendiert und bei 2000 xg für 2 min bei 4°C abzentrifugiert. Anschließend wurden die sedimentierten Zellen in 100 µl KG1 Puffer je Kulturschale aufgenommen und resuspendiert. Zur Permeabilisierung mit -Toxin wurde die Zellsuspension mit dem gleichen Volumen an Toxin in einer Aktivität von 50-100 HE / ml (in KG1 Puffer) für 20 min bei 36°C inkubiert. Um ungebundenes Toxin zu entfernen, wurde die Zellen bei 2000 xg für 2 min bei 4 °C abzentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und die Zellen wurden für Experimente zur Monoamin Aufnahme oder Sekretion in KG3 Puffer mit den jeweiligen Zusätzen aufgenommen.
Zur Permeabilisierung mit SLO wurde die Zellsuspension (s.o.) mit dem gleichen Volumen an Toxin-Verdünnung in einer Aktivität von 50-100 HE / ml ( in KG1 Puffer, der als Reduktionsmittel 1 mM DTT enthielt ) für 10 min auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden bei 2000 xg für 2 min bei 4 °C abzentrifugiert und in 100 µl KG1 Puffer / Ansatz resuspendiert. Zur Porenbildung durch das an das Cholesterol in der
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Plasmamembran gebundene SLO wurden die Zellen für 10 min bei 36°C inkubiert. Die Zellen wurden anschließend mit 500 µl eiskaltem KG1 Puffer gewaschen und für 2 min bei 2000 xg abzentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und die Zellen wurden für Experimente zur Monoamin Aufnahme oder Sekretion in KG3 bzw. KG4 Puffer mit den jeweiligen Zusätzen aufgenommen.Rapheneurone in Primärkultur wurden 1X mit PBS und 1X mit KG1 Puffer gewaschen, bevor sie mit 100 HE / ml SLO in KG1 Puffer (versetzt mit 0,1 % BSA) für 5 min auf Eis inkubiert wurden. Anschließend wurde die SLO-Lösung abgesaugt und die Zellen wurden für Experimente zur Monoamin Aufnahme in KG3 Puffer mit den jeweiligen Zusätzen inkubiert.
Die sedimentierten Trombozyten wurden in 50 µl Tyrode-Hepes Puffer je Tier suspendiert und mit dem gleichen Volumen an 20-30 HE / ml SLO (ebenfalls in Tyrode-Hepes Puffer) für 5 min auf Eis inkubiert. Die Thrombozyten wurden darauf bei 1000 xg für 5 min bei Raumtemperatur abzentrifugiert. Nach dem Absaugen der SLO-Lösung wurden die Thrombozyten für Experimente zur Serotonin Aufnahme in KG3 Puffer mit den jeweiligen Zusätzen inkubiert .
Die Monoamin Aufnahme in permeabilisierte PC12 und BON Zellen (s.o.) wurde durch die Zugabe von 100 µl KG3 Puffer / Ansatz, der entweder 90 nM [3H]Noradrenalin, 90 nM [3H]Serotonin oder 200 nM [3H]Histamin enthielt, gestartet. Der Ansatz enthielt zusätzlich 1 mM Ascorbinsäure als Antioxidanz. Die Inkubation
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wurde normalerweise für 20 min bei 36°C durchgeführt. Die zu untersuchenden Substanzen, wie GTP-Analoga oder G-Protein Untereinheiten wurden diesem Inkubationsansatz zugefügt. Gestoppt wurde die Monoamin Aufnahme durch die Zugabe von 1 ml eiskaltem KG1 Puffer und die anschliessende Zentrifugation bei 15000 xg. Die sedimentierten Zellen wurden in 100 µl Triton X-100 (0,4 %) aufgenommen und für 10 min bei 42°C unter heftigem Schütteln im Thermomixer lysiert. Von dem Lysat wurden 50 µl abgenommen, mit 4 ml Flüssigszintillator OptiPhase versetzt und für die Szintillationsmessung der aufgenommen Radioaktivität in einem Beckman LS 6500 Zählautomat verwendet. Die übrigen 50 µl wurden zur Bestimmung des Proteingehalts mit der BCA Methode verwendet. Die aufgenommenen Mengen an [3H]Monoamin sind in pmol / mg Protein angegeben. Berechnet wurde die aufgenommene Menge der Monoamine über die Anzahl der Zerfälle (DPM) / min und die spezifische Aktivität des jeweiligen eingesetzten Tritium-markierten Monoamins.Permeabilisierte Neurone wurden auf den Kulturplatten mit je 100 µl KG3 Puffer je Ansatz, der 1 mM Ascorbinsäure, 90 nM [3H]Serotonin oder [3H]Noradrenalin sowie die zu untersuchenden Substanzen enthielt, für 10 min bei 36°C inkubiert. Die Monoamin Aufnahme wurde durch die Zugabe von 500 µl eiskaltem KG1 gestoppt. Die Inkubations-Lösung wurde abgesaugt und die Neurone wurden noch einmal mit 500 µl eiskaltem KG1 Puffer gewaschen. Die anschließende Lyse der Zellen erfolgte durch die Inkubation für 10 min bei 42°C mit 100 µl Triton X -100 (0,4 %). Die
Bestimmung der aufgenommenen Menge an [3H]Monoamin sowie des Proteingehalts erfolgte wie für PC12 und BON Zellen beschrieben.
Die Experimente zur Serotoninaufnahme wurden nach Permeabilisierung ebenso wie in BON und PC12 Zellen durchgeführt
Die Inkubation neuroendokriner Zellen und Neurone mit Pertussis Toxin (100 ng / ml) oder Tetanus Neurotoxin (10 nM) erfolgte für 48 Stunden in Kulturmedium. In einigen Experimenten wurden die Zellen nach der Permeabilisierung für 20 min bei 36°C in KG1 Puffer inkubiert, der die leichte Kette von Tetanus Neurotoxin (1 µM bzw. 200 nM) enthielt.
PC12 Zellen wurden in serumfreiem DMEM, versetzt mit 20 nM [3H]Noradrenalin und 1 mM Ascorbinsäure für 2 h im Brutschrank vorbeladen. Danach wurde das Medium abgesaugt und die Zellen noch einmal für 1-2 h in DMEM im Brutschrank belassen. Anschließend wurde das DMEM abgesaugt und die Zellen 3X mit Krebs-Hepes Puffer, sowie 1X mit KG1 Puffer gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden mit
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500 µl KG1 Puffer / Schale abgeschwemmt und zur Permeabilisierung mitPrimärkulturen der Rapheneurone wurden zu unterschiedlichen Kulturzeitpunkten in DMEM, versetzt mit 20 nM [3H]Serotonin und 1 mM Ascorbinsäure für 4 h im Brutschrank vorbeladen. Die Inkubations-Lösung wurde abgesaugt und die Zellen 3X mit Krebs-Hepes Puffer gewaschen. Darauf erfolgte eine Zwischeninkubation für 10 min bei 36°C mit Krebs-Hepes Puffer, der 0,1 % BSA enthielt. Der Puffer wurde abgesaugt und durch frischen Krebs-Hepes Puffer ersetzt, der für die Stimulation der Sekretion einen auf 50 mM erhöhten K+-Gehalt besaß. Die Stimulation erfolgte mit 100 µl des Puffers für 5 min bei 36°C. Die Bestimmung des [3H]Serotoningehalts im Überstand sowie in den Zellen erfolgte wie zuvor beschrieben.
Um die Spezifität und mögliche Kreuzreaktivität der verwendeten polyklonalen Antikörper gegen VMAT1 und VMAT2 zu testen, wurden COS Zellen mit der DNA des jeweiligen Transporters transient transfiziert. COS Zellen wurden in 35 mm Kulturschalen auf Glasplättchen bis zu 40 % Konfluenz kultiviert. Für die Transfektion einer Schale wurden 1-2 µg DNA (Transporter DNA im Plasmidvektor pcDNA3) in 100 µl serumfreiem Medium (Optimem) aufgenommen, 30 min bei Raumtemperatur
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inkubiert, und dann mit 5 µl Lipofectin (ebenfalls in 100 µl Optimem) vermischt. Zur Ausbildung des DNA-Liposomen Komplexes wurde das Gemisch für weitere 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Das Kulturmedium wurde abgenommen und die Zellen wurden 1X mit 2 ml Optimem gewaschen. Zur Transfektion wurden die Zellen mit dem DNA-Lipofectin Gemisch und 0,8 ml Optimem für 8 h im Brutschrank inkubiert. Darauf wurde das DNA-Lipofectin Gemisch durch Wachstumsmedium (DMEM) ersetzt, und die Zellen für 48h zur Proteinsynthese im Brutschrank belassen. Die erfolgreiche Synthese der Transporterproteine wurde immunzytochemisch überprüft.Protein Proben wurde elektrophoretisch in einem denaturierenden Natrium-Dodecylsulfat Polyacrylamid Gel-System (SDS-Page) nach der Methode von Laemmli (1970) aufgetrennt. Verwendet wurden 10 %ige Gele der Dicke von 0,75
mm. Die Protein-Proben wurden vor dem Aufbringen auf das Gel für 5 min bei 95°C zur Denaturierung erhitzt. Standard Marker-Proteine (LMW) von 14,4 bis 94 kDa wurden bei jedem Lauf des Gels mit aufgetragen.
Zusammensetzung der Gele:
Trenngel 10 % |
|
Sammelgel 3,75 % |
|
Trenngel Puffer |
1,5 ml |
Sammelgel Puffer |
500 µl |
Acrylamid Stammlösung |
2 ml |
Acrylamid Stammlösung |
250 µl |
Bisacryamid Stammlösung |
0,8 ml |
Bisacrylamid Stammlösung |
100 µl |
H2O |
1,7 ml |
H2O |
1,15 ml |
TEMED |
8 µl |
TEMED |
2,6 µl |
10 % Ammoniumpersulfat |
75 µl |
10 % Ammoniumpersulfat |
20 µl |
Die Elektrophorese wurde bei 20 mA / Gel für 80 min durchgeführt.
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Die aufgetrennten Proteine wurden elektrophoretisch vom Gel auf Hybond C Nitrozellulose Membranen transferiert und so immobilisiert. Die Stromstärke betrug 300 mA / Gel im ´semi-dry` Verfahren in einer Bio-Rad Trans Blot® SD Kammer unter Verwendung von ´semi-dry` Puffer. Nach dem Blot Verfahren wurden die Membranen in Ponceau-S Lösung gebracht, um die Banden der Marker-Proteine sichtbar zu machen und die Integrität der übrigen Proteine zu testen. Überschüssiges Ponceau-S wurde mit H2O abgewaschen. Die Membranen wurden getrocknet und, falls benötigt, mit dem Skalpell in horizontale oder vertikale Streifen geschnitten, wobei die Banden der Marker-Proteine als Anhaltspunkte für das apparente Molekulargewicht der Proteine dienten. Die Membranstreifen wurden mit einem Bleistift markiert und für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit Block-Lösung inkubiert. Die Inkubation mit dem primären Antikörper erfolgte bei 4°C über Nacht in Antikörper-Lösung. Danach wurden die Membranstreifen 4X für 15 min in Block-Lösung gewaschen. Die Inkubation mit dem an Meerrettich-Peroxidase gekoppelten sekundären Antikörper erfogte bei Raumtemperatur für 1 h in Antikörper-Lösung. Anschließend wurden die Membranstreifen 3 X für 10 min in TS Puffer gewaschen. Alle Inkubations- und Wasch-Schritte wurden auf einem Schüttler durchgeführt. Zur Detektion der Meerrettich-Peroxidase Aktivität wurden die Membranstreifen für 1 min mit ECL-Lösung benetzt und zur Belichtung auf ECL-Film aufgelegt. Die Membranstreifen konnten anschließend noch zur Nachfärbung mitBON und COS Zellen sowie Rapheneurone in Primärkultur wurden auf Glasplättchen in 35 mm Kulturschalen kultiviert und 2X für 5 min mit PBS gewaschen. Anschließend wurden sie für 15 min in eiskaltem Formalin (4 % in PBS) fixiert. Die fixierten Zellen wurden dann 2X für 10 min mit PBS gewaschen. Zum Absättigen unspezifischer Bindungsstellen wurden die Zellen für 1 h mit PBS, das 2 % BSA, 5 % NGS und 0,1 % Triton X-100 enthielt, bei Raumtemperatur inkubiert. Die Inkubation mit dem primären Antikörper erfolgte in der Absättigungs-Lösung für 1,5 h bei 37°C in einer feuchten Kammer. Im Anschluß daran wurden die Zellen 2X für 10 min mit PBS gewaschen. Als sekundäre Antikörper dienten Oregon Green-fluoreszenzmarkiertes anti-Huhn bzw. anti-Kaninchen IgG, sowie Texas Red-
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fluoreszenzmarkiertes anti-Kaninchen IgG. Die Inkubation mit dem sekundären Antikörper erfolgte in PBS, versetzt mit 2 % BSA, für 1,5 h bei Raumtemperatur in der abgedunkelten feuchten Kammer. Ungebundene Antikörper wurden 2X für 10 min mit PBS abgewaschen und die Zellen in jeweils 10 µl Mowiol auf Objektträgern eingebettet. Ausgewertet wurden die Färbungen mit einem Leica DMLB Epifluoreszenz-Mikroskop. Die Bilder wurden mit einer SPOT Kamera der Firma INTAS, Göttingen, digital aufgenommen.Bereiche aus dem präfrontalen Cortex adulter Ratten wurden präpariert, in eiskaltem PBS aufgenommen, und in kleine Würfel von ca. 8 mm3 geschnitten. Diese wurden zuerst für 2 h auf Eis und dann für 2 h bei Raumtemperatur in PBS, versetzt mit 4 % Formalin, 0,05 % Glutaraldehyd sowie 0,2 % Pikrinsäure, fixiert. Anschließend wurde das fixierte Gewebe für 2 h in PBS gewaschen und in 3 % Agarose (in PBS) zur Anfertigung von 50 µM dicken Vibratomschnitten eingebettet. Um die Aktivität der endogenen Peroxidase zu blockieren, wurden die Schnitte für 30 min in 0,5 % H2O2 inkubiert. Die Schnitte wurden mit PBS gewaschen und für 30 min in Block-Lösung inkubiert. Die Inkubation mit einem polyklonalen anti-Serotonin Antikörper aus dem Huhn wurde für 24 h bei 4°C in Antikörper-Lösung durchgeführt. Die Detektion der Immunreaktivität erfolgte mit einem Kit von Vectastain, wobei Diaminobenzidin (DAB) als Chromogen verwendet wurde. Nach mehrmaligem Waschen mit PBS wurden die Schnitte für 30 min mit 1 % OsO4 (in PBS) inkubiert, in aufsteigender Alkoholreihe dehydratisiert und in Araldit flach-eingebettet. Ultradünnschnitte von 70 nm wurden auf Formvar-behandelten (in 0,3 % Dichlorethan) Nickel-Objekthaltern 2 X für 7 min in 1 % Perjodat angeätzt, 2 X mit doppelt destilliertem H2O gewaschen und nach der ´post-embedding`Methode (Wenzel et al., 1997) weiterbehandelt. Verwendet wurden hierfür polyklonale Antikörper gegen VMAT2, Go2 und Synaptophysin sowie an 5 nM Goldpartikel gekoppeltes anti-Kaninchen IgG als sekundärer Antikörper.
Zur subzellulären Fraktionierung wurden 4-5 60 mm Kulturschalen semikonfluent gewachsener BON Zellen oder Rapheneurone 2X mit eiskaltem PBS gewaschen.
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Die Zellen wurden mit 1 ml PBS pro Kulturschale abgeschwemmt und bei 2000 xg abzentrifugiert. Sämtliche folgenden Schritte wurden bei 4°C durchgeführt: Die Zellen wurden in 400 µl Homogenisierungs-Puffer aufgenommen, dem zuvor Leupeptin (2 µg / ml), Aprotinin (1 µg / ml) sowie PMSF (1 mM) als Protease-Inhibitoren zugesetzt worden waren. Die Zellsuspension wurde durch die 20-fache Passage durch eine 27G Kanüle homogenisiert. Das Homogenat wurde für 15 min bei 4000 xg zentrifugiert und der resultierende postnukleäre Überstand (PNÜ) wurde abgenommen. Während der Zentrifugation wurden mit einem Hoefer SG 15 Gradienten-Mischer mindestens 2 kontinuierliche Saccharose-Gradienten in den Konzentrationen von 0,35-2 M mit einem Volumen von 1,8 ml hergestellt. Der PNÜ von etwa 350 µl wurde vorsichtig auf den Gradienten aufgetragen und für 3 h in einem Beckman TLS 55 Rotor bei 86.000 xg zentrifugiert. Der zweite Gradient wurde dabei als Gegengewicht verwendet. Die Fraktionen von jeweils 60 µl wurden mit einer Kanüle über eine Schlauchpumpe vom Boden des Gradienten her abgesaugt und aufgefangen. Anschließend wurden die aufgefangenen Fraktionen noch einmal mit 1 ml 4 mM Hepes Puffer, pH 7,3, verdünnt und für 30 min bei 65.000 xg in einem Beckman TLA 100.4 Rotor abzentrifugiert. Die sedimentierten Membranen wurden dann in 50 µl 1X Laemmli Puffer aufgenommen und der Gelelektrophorese mit anschließender Immunoreplika-Analyse unterzogen.Die Bestimmung von Protein-Konzentrationen erfolgte mit der Bicinchoninsäure (BCA) Methode nach Smith et al. (1985). Über Verdünnungsreihen wurde eine Standardkurve von 50 bis 400 µg / ml BSA hergestellt. Das BSA wurde üblicher-weise in 0,4 % Triton-X100 angesetzt.
Die Standardwerte sowie die Proben wurden in Duplikaten in die Löcher einer 96-Loch Mikrotiter Platte (20 µl / Loch) pipettiert. Dazu wurden pro Loch 200 µl der BCA Reaktionslösung gegeben (eine Mischung aus Lösung A und B im Verhältnis 50:1, v / v). Die Mikrotiter Platte wurde dann für 30 min bei 60°C im Wasserbad inkubiert. Anschließend wurde die Platte für 10 min zum Abkühlen stehen gelassen, bevor die Absorption bei 550 nm in einem Elisa-Reader gemessen wurde. Die Protein-Konzentrationen der Proben wurden anhand der Standardkurve bestimmt.
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Synaptische Vesikel wurden von adulten Wistar Ratten beiden Geschlechts nach einem von Huttner et al. (1983) beschriebenem Protokoll präpariert. Alle Schritte wurden auf Eis oder bei 4°C durchgeführt.
Zumeist wurde ein Tier für eine Präparation von synaptischen Vesikeln benötigt.
Die Ratte wurde mit Ether betäubt und dann dekapitiert. Das Gehirn wurde so schnell wie möglich entnommen und in 15 ml eiskalter Saccharose-Lösung (320 mM) aufgenommen, der folgende Protease-Inhibitoren zugesetzt worden waren: Aprotinin (1 µg / ml), Leupeptin (2 µg / ml), Pepstatin (2 µg / ml) und PMSF (0,1 mM). In einem Dounce-Homogenisator (900 rpm, 10X) wurde das Gehirn homogenisiert. Das Homogenat wurde darauf für 10 min bei 800 xg in einem Beckman Ti 70 Rotor zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde für 15 min bei 9200 xg zentrifugiert. Die sedimentierten Membranen wurden in 10 ml der Saccharose-Lösung resuspendiert und erneut für 15 min bei 9200 xg zentrifugiert. Das resultierende synaptosomale Pellet wurde in 1-1,5 ml der Saccharose-Lösung suspendiert, durch die Zugabe von 9 Volumenanteilen destilliertem H2O lysiert, und im Dounce-Homogenisator (2000 rpm, 3X) homogenisiert. Das Lysat wurde durch die Zugabe von Hepes (Endkonzentration 10 mM) auf einem pH-Wert von 7,4 eingestellt. Die folgende Zentrifugation für 20 min bei 25000 xg führte zum 1. Pellet des Lysats (LP1), das sich hauptsächlich aus Fragmenten der Plasmamembran zusammensetzt, sowie zum Überstand des 1. Lysats (LS1). Der Überstand wurde dann aufgeteilt und in einem Beckman TLA 100.4 Rotor (Röhrchenvolumen 3,5 ml) für 30 min bei 350.000 xg zentrifugiert. Diese letzte Zentrifugation führte zum 2. Pellet des Lysats (LP2), das sich haupsächlich aus kleinen synaptischen Vesikeln zusammensetzt. Zur Resuspendierung des Pellets diente die 5-fache Passage durch eine 27 G Kanüle.
Die Mäuse wurden zunächst mit 50 µl Ketavet und 50 µl Rompun je 10 g Körpergewicht intraperitoneal narkotisiert. Danach wurde die Bauchhöhle eröffnet und die Vena cava freigelegt. Aus dieser wurde etwa 1 ml Blut mit einer Spritze abgenommen, in der 30 IU Heparin vorgelegt waren. Das abgenommene Blut wurde in ein Eppendorf-Röhrchen überführt, mit dem halben Volumen an Tyrode-Hepes
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Puffer vermischt, und bei 200 xg für 7,5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Das thrombozytenreiche Plasma wurde abgenommen und erneut bei 1000 xg für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die sedimentierten Thrombozyten wurden darauf in Tyrode-Hepes Puffer resuspendiert und zur Vorbereitung der Serotoninaufnahme mit SLO permeabilisiert.Zentrifugen
Beckman L-70 Ultrazentrifuge |
Beckman OptimaTM TL Ultrazentrifuge |
Rotoren: TLS 55, TLA 100.4 |
Rotoren: Ti 70, SW 40 |
Beckman J2-HS |
Eppendorf Zentrifuge 5402 |
Rotor: JA 14
Elektrophorese
Trans-Blot® SD Semi-Dry Transfer Cell (Bio-Rad)
Power Pac 200 Netzgerät (Bio-Rad)
Mini-Protean® II Elektrophorese-Kammer (Bio-Rad)
Photometer
Dynatech MR 500 Elisa Reader (Dynatech)
UV 1202 UV-VIS Spektrophotometer (Shimadzu)
Mikroskop
Leica DMLB Epifluoreszenz-Mikroskop mit Durchlichteinrichtung
Szintillationsmessungen
Beckman LS 6500, Liquid Szintillation Counter
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