Dirk Scharn: Darstellung und Screening von kombinatorischen [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken an planaren Oberflächen DISSERTATION |
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Darstellung und Screening
von kombinatorischen
[1,3,5]-Triazin-Bibliotheken
an planaren Oberflächen
DISSERTATION
zur Erlangung des akademischen Grades
d o c t o r r e r u m n a t u r a l i u m
(Dr. rer. nat.)
im Fach Chemie
eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin
vorgelegt von
Dipl.-Chem. Dirk
Scharn
geboren am 20.07.1971 in Berlin
Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin,
Prof. Dr. J. Mlynek
Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I,
Prof. Dr. B. Ronacher
Gutachter:
1. Prof. J. Liebscher
2. Prof. J. Schneider-Mergener
3. Prof. A. Beck-Sickinger
Datum der mündlichen Prüfung: 6. Juni 2001
Zusammenfassung:
Durch parallele SPOT-Synthese wurden trisamino- und amino-oxo-substituierte [1,3,5]-Triazine auf Zellulose- und Polypropylenmembranen dargestellt. Neben der Entwicklung geeigneter Linkerstrategien und dem Einsatz von Aminen und Phenolaten als Bausteine konnte eine Mikrowellenbestrahlung für die Substitution an den membrangebundenen Monochlor-[1,3,5]-triazinen nutzbar gemacht werden. Der Einsatz von gasförmiger TFA zur Abspaltung der Syntheseprodukte von den planaren Oberflächen erlaubte den Erhalt der örtlichen Adressierbarkeit der Verbindungen für Analyse und Screening.
Zusätzlich wurde ein neues Konzept für die Synthese von makrocyclischen Peptidmimetika entwickelt. Diese Methode bedient sich der sequenziellen SNAr-Reaktion von ursprünglich orthogonal geschützten Aminogruppen eines Peptides und anderer linearer Oligomere an halogenierten Heteroaromaten wie 2,4,6-Trichloro-[1,3,5]-triazin, 2,4,6-Trichloropyrimidin, 4,6-Dichloro-5-nitropyrimidin und 2,6,8-Trichloro-7-methyl-7H-purin. Die Möglichkeiten dieses neuen Zugangs zu Makrocyclen wurde systematisch mittels SPOT-Synthese untersucht. So wurden Fragen wie zugängliche Ringgrössen, Kompatibilität mit Aminosäuren, Cyclisierungsrichtungen und Verwendung von unterschiedlichen linearen Oligomeren adressiert. Es stellte sich heraus, dass eine Reihe von Peptidmimetika mit unterschiedlichen Ringgrössen (11- bis 37-gliedrige Ringe) und verschiedenen chemischen Strukturen des Rückgrades erhalten werden können.
Die erhaltenden [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken wurden sowohl in einem Festphasen-Screening als auch in einem Assay in Lösung eingesetzt. Es gelang, de novo Bindungspartner für den monoklonalen Antikörper TAB-2 aus einer Bibliothek aus 8000-zellulosegebundenen [1,3,5]-Triazinen zu finden und neuartige cyclische Peptid-Triazinderivate als Agonisten für einen Somatostatinrezeptor zu entwickeln.
Eigene Schlagworte:
Kombinatorische Chemie,
Heterocyclen,
SPOT-Synthese,
Screening
Abstract:
Effective spatially addressed parallel assembly of trisamino- and amino-oxy-1,3,5-triazines was achieved by applying the SPOT-synthesis technique on cellulose and polypropylene membranes. In addition to developing a suitable linker strategy and employing amines and phenolate ions as building blocks, a highly effective microwave assisted nucleophilic substitution procedure at membrane-bound monochlorotriazines was developed. The 1,3,5-triazines obtained could be cleaved in parallel from the solid support by TFA-vapor to give compounds adsorbed on the membrane surface in a conserved spatially addressed format for analysis and screening.
A novel concept for the synthesis of macrocyclic peptidomimetics which incorporate heteroaromatic units was developed. The method involves sequential SNAr reactions of former orthogonally protected amino groups of peptides and other linear oligomers on halo-genated heterocycles such as 2,4,6-trichloro-[1,3,5]-triazine, 2,4,6-trichloropyrimidine, 4,6-dichloro-5-nitropyrimidine and 2,6,8-trichloro-7-methyl-7H-purine. The scope of this novel solid phase approach was systematically evaluated by means of the SPOT-synthesis metho-dology. Besides the question of the accessibility of different ring sizes and the compatibility with protecting groups of commonly used amino acids, cyclization direction and the applicability of the technique towards peptidomimetics was studied. It was found that the procedure is well suited to assemble a wide variety of cyclic peptidomimetics differing in both size (11 to 37-membered rings) and chemical nature of the assembled backbones.
The obtained [1,3,5]-triazine libraries were subjected to heterogeneous and homogeneous screening assays. De novo binding partners for the monoclonal antibody Tab2 were detected from a 8000-membered library of cellulose-bound 1,3,5-trazines. In addition novel cyclic peptide-triazine derivatives were identified as agonists for a somatostatin receptor.
Keywords:
combinatorial chemistry,
heterocycles,
SPOT-synthesis,
screening
Inhaltsverzeichnis
-
1
Einleitung und Aufgabenstellung
-
1.1
Einleitung
-
1.2 Aufgabenstellung
-
2
Entwicklung einer SPOT-Synthesestrategie für [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken durch intermolekulare SNAr
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2.1
Planare Oberflächen in der SPOT-Synthese
-
2.1.1
Zellulosemembranen; etablierte Träger für Oligomersynthesen
-
2.1.2
Polypropylenmembranen; neue Träger in der SPOT-Synthese
-
2.2 Linkersysteme für die SPOT-Synthese
-
2.2.1
Basisch spaltbare Linkersysteme
-
2.2.2 Sauer spaltbare Linkersysteme
-
2.2.3
Photolytisch spaltbare Linkersysteme
-
2.3
Immobilisierung von 2,4,6-Trichlor-[1,3,5]-triazin an aminoderivatisierten planaren Oberflächen
-
2.4
Nucleophile Substitution an membrangebundenen 4,6-Dichlor-[1,3,5]-triazinen
-
2.4.1
Verwendung von N-Nucleophilen unter SPOT-Synthese-Bedingungen
-
2.4.2
Verwendung von O-Nucleophilen unter SPOT-Synthese-Bedingungen
-
2.5
Nucleophile Substitution an membrangebundenen 6-Monochlor-[1,3,5]-triazinen
-
2.5.1
Verwendung von Aminen unter SPOT-Synthese-Bedingungen
-
2.5.2 Verwendung von Phenolaten unter SPOT-Synthese-Bedingungen
-
2.6
Synthese von [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken unter optimierten Bedingungen
-
2.7
Zusammenfassung; Möglichkeiten und Grenzen der intermolekularen SNAr am 2,4,6-Trichlor-[1,3,5]-triazin unter SPOT-Synthese-Bedingungen
-
3
[1,3,5]-Triazin-Bibliotheken durch intramolekulare SNAr; Eine neue Cyclisierungsmethode für Peptide und Peptidmimetika
-
3.1
Einfluss der Ringgrösse auf die Effizienz der Cyclisierung
-
3.1.1 Variation der Cyclengrösse bei konstanter Sequenzlänge
-
3.1.2 Variation der Cyclengrösse bei variabler Sequenzlänge
-
3.1.3
Minimierung der erreichbaren Ringgrösse durch Verwendung von Aminosäuren mit verkürzter Aminoseitenkette
-
3.2
Kompatibilität der Cyclisierungsmethode mit proteinogenen Aminosäuren
-
3.3
Variation der Cyclisierungsrichtung
-
3.4 Nucleophile Substitution an cyclischen 6-Monochlor-[1,3,5]-triazinderivaten
-
3.5 Weitere lineare Oligomere mit orthogonal geschützten Aminogruppen
-
3.5.1
Peptomere als lineare Sequenzen für die Cyclisierung
-
3.5.2 Peptoide als lineare Sequenzen für die Cyclisierung
-
3.6 Intramolekulare SNAr–Reaktionen an weiteren halogenierten Heteroaromaten
-
3.6.1
2,4,6-Trichlorpyrimidin
-
3.6.2
4,6-Dichlor-5-nitropyrimidin
-
3.6.3 2,6,8-Trichloro-7-methyl-7H-purin
-
3.7
Zusammenfassung: Möglichkeiten und Grenzen der intramolekularen SNAr an halogenierten Heteroaromaten unter SPOT-Bedingungen
-
4
Einsatz von [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken in biologischen Assay-Systemen
-
4.1 Bindungsassays an Festphasen-gebundenen [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken mit einem monoklonalen Antikörper
-
4.2 Lösliche [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken in einem Agardiffusions-Assay
-
5
Zusammenfassung und Ausblick
-
6
Experimentelle Bedingungen und Durchführung
-
6.1 Allgemeines
-
6.2 Synthesen an polymeren Harzkugeln
-
6.2.1 Allgemeine Arbeitsvorschriften
-
6.2.2 Spezielle Synthesen
-
6.3 Synthesen an planaren Oberflächen
-
6.3.1
Allgemeine Arbeitsvorschriften
-
6.3.2 Membranfunktionalisierung
-
6.3.2.1 Aminofunktionalisierte Zellulosemembran
-
6.3.2.2 Aminofunktionalisierte PP-Membran
-
6.3.2.2.1 Ausgehend von carbonsäurefunktionalisierten PP-Membranen
28
-
6.3.2.2.2
Ausgehend von methylesterfunktionalisierten PP-Membranen 29
-
6.3.3
Spezielle Synthesen von [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken an Zellulosemembranen
-
6.3.3.1 Halbautomatische Synthese einer Peptomer-[1,3,5]-Triazin-Bibliothek 91
-
6.3.3.2 Cyclisierungen durch intramolekulare Substitution am Dichlor-[1,3,5]-triazin an der Zellulosemembran
-
6.3.3.3 [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken für das Festphasen-Screening
-
6.3.3.4 [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken für das Agardiffusions-Assay
-
6.3.4 Spezielle Synthesen von [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken an PP-Membranen
-
6.4 Durchführung der biologischen Assays
-
6.4.1 Bindungsstudien mit mAk TAB-2 an Triazin-Bibliotheken
-
6.4.2 Kompetitiver ELISA am mAk TAB-2
-
6.4.3 Agardiffusions-Assay mit rSSTR2-enthaltenden Reporterhefen
-
Verwendete Abkürzungen
-
Literaturverzeichnis
-
Selbständigkeitserklärung
-
Danksagung
-
Lebenslauf
Tabellen
-
Tabelle 1: Aminoderivatisierung der säurederivatisierten PP-Membran 28
nach verschiedenen Aktivierungsbedingungen zu 30 und Reaktion mit 26.
-
Tabelle 2: Aminolysebedingungen der methylesterfunktionalisierten PP-Membranen 29 mit dem Diamin 26 und resultierende Aminoderivatisierung.
-
Tabelle 3: Untersuchungen zur Einsatzmöglichkeit verschiedener Diamine für die Darstellung eines Carbamatlinkers 41.
-
Tabelle 4: Variation von Zeit, Konzentration und Base bei der Immobilisierung von Cyanurchlorid an einer Rink-Linker-modifizierten Zellulosemembran 38a.
-
Tabelle 5: Variation von Zeit, Konzentration und Base bei der Immobilisierung von Cyanurchlorid 5 an einer Rink-Linker-modifizierten PP-Membran 38b.
-
Tabelle 6: Variation von Zeit, Konzentration und Base bei der Immobilisierung von Cyanurchlorid am Carbamatlinker 41 auf einer PP-Membran.
-
Tabelle 7: Untersuchungen zur Immobilisierung von Cyanurchlorid
5 an einer Leu-RinkLinker- derivatisierten Zellulosemembran 38a-
1
.
-
Tabelle 8: Erste Untersuchung zur Monochlorsubstitution an 54 mit unterschiedlichen Aminen. Bestimmt wurde das Produkt zu Edukt Verhältnis aus der Peakfläche der HPLC-Spur bei 220 nm nach Abspaltung.
-
Tabelle 9: Umsatz und Reinheit nach Monochlorsubstitution an 54 durch Alkylamine unter SPOT-Synthese-Bedingungen.
-
Tabelle 10: Umsatz und Reinheit nach Monochlorsubstitution an 54 durch Aminoalkohole unter SPOT-Synthese-Bedingungen.
-
Tabelle 11: Umsatz und Reinheit nach Monochlorsubstitution an 54 durch Alkyldiamine unter SPOT-Synthese-Bedingungen.
-
Tabelle 12: Umsatz und Reinheit nach Monochlorsubstitution an 54 durch mehrfach funktionalisierte Alkylamine unter SPOT-Synthese-Bedingungen.
-
Tabelle 13: Umsatz und Reinheit nach Monochlorsubstitution an 54 durch Arylamine unter SPOT-Synthese-Bedingungen.
-
Tabelle 14: Umsatz und Reinheit nach Monochlorsubstitution an 54 durch Anilinderivate unter SPOT-Synthese-Bedingungen.
-
Tabelle 15: Umsatz und Reinheit nach Monochlorsubstitution an membrangebundenen Dichlor-[1,3,5]-triazinen durch verschiedene Cäsiumphenolate.
-
Tabelle 16: Untersuchungen zur Chlorsubstitution an Monochlor-[1,3,5]-triazinen durch Amine unter Mikrowellenbestrahlung.
-
Tabelle 17: Umsatz und Reinheit nach Chlorsubstitution unter Mikrowellenbestrahlung an membrangebundenen Monochlor-[1,3,5]-triazin 72 durch Alkylamine.
-
Tabelle 18: Umsatz und Reinheit nach Chlorsubstitution unter Mikrowellenbestrahlung an 72 durch mehrfach funktionalisierte Alkylamine.
-
Tabelle 19: Umsatz und Reinheit nach Chlorsubstitution unter Mikrowellenbestrahlung an membrangebundenen Monochlor-[1,3,5]-triazin 73 durch Arylamine.
-
Tabelle 20: Umsatz und Reinheit nach Chlorsubstitution unter Mikrowellenbestrahlung an membrangebundenen Monochlor-[1,3,5]-triazin 73 durch Anilinderivate.
-
Tabelle 21: Umsatz und Reinheit nach Chlorsubstitution unter Mikrowellenbestrahlung an membrangebundenen Monochlor-[1,3,5]-triazin 78 durch Cäsiumphenolaten.
-
Tabelle 22: Reinheiten der Trisamino-[1,3,5]-triazine 103 nach Darstellung unter SPOT-Synthese-Bedingung und Abspaltung vom Carbamatlinker 41-
1
.
-
Tabelle 23: Reinheiten der unterschiedlichen Makrocyclen nach einen Lysin-Scan in der Peptidsequenz und Umsetzung mit Cyanurchlorid an der Zellulose- und PP-Membran.
-
Tabelle 24: Reinheiten der unterschiedlichen Makrocyclen durch Verkürzung der Peptidsequenz 107 und Umsetzung mit 5 an der Zellulose- und PP-Membran.
-
Tabelle 25: Einfluss der Base und Zeit auf die Cyclisierungseffizienz von 107-
8
an Zellulosemembran.
-
Tabelle 26: Reinheiten der Cyclen bei Minimierung der Ringgrösse durch Einsatz von Lysinanaloga mit verkürzten Seitenketten.
-
Tabelle 27: „Seitenkette-zu-Seittenkette“ Cyclisierung durch intramolekulare Substitution eines Chloratoms am Dichlor-[1,3,5]-triazinrest mit der ε-Aminogruppe eines C-terminalen Lysins.
-
Tabelle 28: Untersuchungen zur Chlorsubstitution unter Mikrowellenbestrahlung an cyclischen Peptid-Triazinderivaten.
-
Tabelle 29: Variation der Ringgrösse durch Einsatz verschiedener Diamine im Peptoid-Baustein und Sequenzlänge.
-
Tabelle 30: Reinheiten der cyclischen Peptoid-Triaziderivate 135 der Abspaltung.
-
Tabelle 31: Bedingungen zur Immobilisierung von 136 an zellulosegebundenem 107-
8
und Verhältnis von Zielverbindung/Tripeptid nach der Abspaltung.
-
Tabelle 32: Bedingungen für die intramolekulare Substitution am Dichlorpyrimidinrest durch die ε-Aminogruppe der Tripeptid-Einheit.
-
Tabelle 33: Bedingungen zur Immobilisierung von 4,6-Dichlor-5-nitropyrimidin an den N-Terminus von zellulosegebundenem Ala-Phe-Lys.
-
Tabelle 34: Bedingungen für die intramolekulare Substitution am 6-Chlor-5-nitropyrimidinrest durch die ε-Aminogruppe des Lysins der Tripeptid-Einheit.
-
Tabelle 35: Bedingungen zur Immobilisierung von 2,6,8-Trichloro-7-methyl-7H-purin an den N-Terminus von zellulosegebundenem Ala-Phe-Lys.
-
Tabelle 36: Bedingungen für die intramolekulare Substitution am Dichlorpurinrest durch die ε-Aminogruppe der Tripeptid-Einheit.
-
Tabelle 37: Ausgewählte mAk-TAB-2 bindende Trisamino-[1,3,5]-triazine 149 in Festphasen-Screening und in ELISA-Experimenten.
-
Tabelle 38: Ausgewählte mAk-TAB-2 bindende Trisamino-[1,3,5]-triazine im Festphasen-Screening an Zellulose- und PP-Membran sowie im kompetitiven ELISA.
-
Tabelle 39: Peptidsequenzen für den ersten Transformationsschritt von S14.
-
Tabelle 40: Peptidsequenzen für den zweiten Transformationsschritt von S14.
-
Tabelle 41: Peptidsequenzen für den dritten Transformationsschritt von S14.
-
Tabelle 42: Peptidsequenzen für den vierten Transformationsschritt von S14.
Bilder
-
Schema 1: Synthetischer Zugang zu Trisamino-[1,3,5]-triazinen.
-
Schema 2: Temperaturabhängige
Chlorsubstitution am Cyanurchlorid
5
durch Amine nach Thurston et al.
[7]
-
Abb. 1: Beispiele für pharmakologisch relevante [1,3,5]-Triazine.
-
Abb. 2: In Lösung synthetisierte kombinatorische [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken.
[22, 23]
-
Abb. 3: Am Polystyrolharz nach der „split-and-mix“-Methode synthetisierte [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken
13
.
[29, 30]
-
Abb. 4: Verschiedene Techniken zur parallelen Synthese an fester Phase; a) Synthesereaktoren, b) PIN-Methode, c) Arrays auf planaren Oberflächen.
-
Schema 3: Definition der SPOTs und Anfärben der Aminogruppen (i). Nach schrittweiser ortsadressierter Synthese der Peptide (ii) können direkt Bindungsstudien mit markierten Proteinen (iii) oder Abspaltung der SPOTs für Analytik bzw. Tests in Lösung (iv) folgen.
-
Schema 4: Darstellung von Peptiden
15
PNAs,
16
und Peptoiden
17
mittels SPOT-Synthese.
-
Schema 5: Geplante Vorgehensweise zur Erzeugung von diversen [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken an planaren Oberflächen; ein Linker wird auf einer planaren Oberfläche verankert (
A
), Reaktion der Aminofunktion des Linkers mit geeigneten Reagenzien zur Diversitätssteigerung (
B
) mit anschliessender Immobilisierung von Cyanurchlorid (
C
) und schrittweisem Austausch der verbleibenden Chloratome (
D
) sowie Abspaltung vom polymeren Träger (
E
).
-
Schema 6: Aminoderivatisierung der Zellulosemembran
18
durch Veresterung mit
19
nach Frank.
[34]
-
Schema 7: Abspaltung von Peptiden von der Zellulose durch Diketopiperazin-Bildung.
-
Schema 8: Optimierte esterfreie Aminoderivatisierung von Zellulosemembranen.
[52]
-
Schema 9: Aufbringen eines funktionalisierten Pfropfpolymers an den Fasern der PP-Membran durch photoinitiierte Copolymerisation.
-
Abb. 5:
Mögliche Realisierungen einer gravimetrisch bestimmten Beladung von sechs Acrylsäuremolekülen pro Flächeneinheit. Im Fall a) würde eine geringere Homogenität pro Flächeneinheit erreicht als bei der gleichmässigeren Reaktion im Fall b).
-
Schema 10: Umsetzung der carbonsäure- zu einer aminoderivatisierten PP-Membran
31
.
-
Schema 11: Umsetzung einer methylester- zu einer aminoderivatisierten PP-Membran
32
.
-
Schema 12: Spaltung der Esterbindung durch verschiedene Amine.
[104]
-
Schema 13: Acylierung von aminoderivatisierten planaren Oberflächen mit aktiviertem Rink-Linker. Nach Acetylierung der nicht umgesetzten Aminofunktionen mit Acetanhydrid und Entschützen der N-Termini können die SPOTs mit Bromphenolblau angefärbt werden (
38
). Nach beendeter Synthese werden die Produkte mittels TFA-Dampf von dem Träger gespalten, wobei die roten Rink-Radikale die Position der adhäsiv gebundenen Verbindungen anzeigen (
39
).
-
Abb. 6: HPLC-Spur nach TFA-Dampf-Abspaltung und Ablösen mit Wasser:Acetonitril von
40
an der Zellulosemembran (a) und anschliessender Nachspaltung der selben Membran mit flüssiger TFA (b) zur Überprüfung der Vollständigkeit.
-
Schema 14: Darstellung des Carbamatlinkers
41-1
an PP-Membranen.
-
Schema 15: Immobilisierung des photolabilen Linkers
50
und
Spaltungsmechanismus unter Bestrahlung bei 365 nm in Anlehnung an Pillai et al.
[115]
-
Abb. 7: Abspaltungskinetik des Photolinkers an einer Zellulosemembran
27
(Beladung von 380 nmol/cm
2
). Die abgespaltene Menge an 2,4,6-Triamino-[1,3,5]-triazin in Abhängigkeit von der Photolysezeit bei 365 nm wurde HPLC-chromatographisch bei 220 nm durch Vergleich mit Werten einer Eichkurve (vgl. Kapitel 2.3) bestimmt.
-
Schema 16: Immobilisierung von Cyanurchlorid an einer aminoderivatisierten Oberfläche.
-
Abb. 8: Integral der UV-Absorption bei 220 nm in Abhängigkeit von der Injektionsmenge an
53
.
-
Schema 17: Umsetzung membrangebundener Dichlor-[1,3,5]-triazine
54
mit unterschiedlichen Aminen und anschliessende Abspaltung für eine Analytik.
-
Schema 18: Bestimmung der Umsetzung von Aminen mit Dichlor-[1,3,5]-triazin
54
am Beispiel des n-Butylamins
58
.
-
Schema 19: Umsetzung von membrangebundenem Dichlor-[1,3,5]-triazin
54
mit Mischungen (1:5 bis 5:1) aus n-Propanol
61
und n-Butylamin
58
.
-
Abb. 9: HPLC-MS-Spuren des abgespaltenen Rohprodukts
60-
1
:
63
bei einem Mischungs-verhältnis von 1 : 5 (n-Butylamin : n-Propanol). Abgebildet ist die UV-Spur (a), der Massenfilter für
60-1 (M+H
+
) (b) und
63
(M+H
+
) (c).
-
Schema 20: Bestimmung der Umsetzung von Arylaminen mit Dichlor-[1,3,5]-triazin
54
am Beispiel des 2-Chlorbenzylamins
64
nach Abspaltung von der planaren Oberfläche.
-
Abb. 10: Umsatzverteilung der getesteten Amine an der Zellulose- und PP-Membran.
-
Schema 21: Untersuchungen zur SPOT-Synthese von diamino-oxy-substituiertem Triazin
69
an einer PP-Membran am Beispiel von Alkoholen mit Arylrest.
-
Abb. 11: Umsatz verschiedener O-Nucleophile
mit Dichlor-[1,3,5]-triazin
54
an der PP-Membran.
-
Abb. 12: Modellsysteme zur Untersuchung der Substituierbarkeit des Chloratomes von Monochlor-[1,3,5]-triazinen an Zellulose- und PP-Membran in der SPOT-Synthese.
-
Schema 22: Untersuchungen der Cäsiumphenolate zur Chlorsubstitution am Monochlor-[1,3,5]-triazin unter Mikrowellenbestrahlung.
-
Schema 23: Halbautomatische SPOT-Synthese der [1,3,5]-Triazin-Bibliothek
mit
einer C-terminalen Peptomereinheit.
-
Abb. 13: Die eingesetzten Amine in der Peptoidsynthese (R
1
) und zur Monochlorsubstitution am Dichlor-[1,3,5]-triazin bei Raumtemperatur (R
2 / R
3
).
-
Schema 24:
Hydrolyse des C-Terminus der Peptomereinheit von
91-(
1-18-1
)
vor der HPLC-MS Analytik.
-
Schema 25: Hydrolyse von
93
zu
94
vor der HPLC-MS Analytik.
-
Abb. 14: Hydrolyse von
93
zu
94
in wässrigem Acetonitril mit 0,1 % TFA nach 30 (a), 120 (b) und 360 (c) min.
-
Schema 26: Einsatz verschiedener Amine zur Darstellung von fünf Trisamino-[1,3,5]-triazinen am Glycin-Esterlinker.
-
Schema 27: Darstellung von
Trisamino-[1,3,5]-triazinen unter Einsatz des Carbamatlinkers
41
-1
an der PP-Membran.
-
Schema 28: Cyclisierung von linearen Oligomeren durch schrittweise nucleophile Substitution an Cyanurchlorid
5
.
-
Schema 29: Variation der Cyclengrösse in
106
unter Verwendung eines Lysin-Scans durch die Peptidsequenz
104
und Umsetzung mit Cyanurchlorid
5
.
-
Schema 30: Variation der Cyclengrösse durch schrittweise Verkürzung der Peptidsequenz und Umsetzung mit Cyanurchlorid
5
.
-
Schema 31: Minimierung der Ringgrösse durch Einbau von Aminosäuren mit verkürzter Aminoseitenkette in die Peptidsequenz
110
.
-
Schema 32: Synthese der 19 Tripeptide Ala-Xxx-Lys und Cyclisierung an der Zellulosemembran zur Untersuchung des Einflusses der Seitenketten auf die Cyclisierungseffizienz.
-
Abb. 15: Reinheiten der cyclisierten Tripeptide Ala-Xxx-Lys
119
in Abhängigkeit von den Aminosäureseitenketten bzw. Schutzgruppen.
-
Abb. 16: Reinheiten der cyclisierten Tripeptide Xxx-Phe-Lys in Abhängigkeit von den Aminosäureseitenketten bzw. Schutzgruppen.
-
Schema 33: „Seitenkette-zu-Seitenkette“-Cyclisierung durch intramolekulare Chlorsubstitution am Dichlor-[1,3,5]-triazin.
-
Schema 34: Einsatz von Mikrowellenbestrahlung zur Chlorsubstitution an cyclischen Peptid-Triazinderivaten.
-
Schema 35: Darstellung von Peptomer-Triazin-Cyclen mit verschiedenen Ringgrössen durch Variation der Aminoseitenkettenlängen.
-
Schema 36: Cyclisierung von Peptoiden durch intramolekulare Reaktion einer Amino-seitenkettengruppe mit einem am N-Terminus befindlichem Dichlor-[1,3,5]-triazinrest.
-
Schema 37: Regioisomere Dichlorpyrimidin-Peptide nach Reaktion von 2,4,6-Trichlorpyrimidin
136
mit Ala-Phe-Lys an der Zellulosemembran.
-
Abb. 17: HPLC-Spur der regioisomeren Dichlorpyrimidin-Peptide; im Verlauf der Analytik kam es zu partiellen Boc-Entschützung durch TFA im Lösungsmittel.
-
Schema 38: Intramolekulare Substitution am Dichlorpyrimidinrest von
137
durch die
ε
-Aminogruppe des Lysins der Tripeptid-Einheit an der Zellulosemembran.
-
Abb. 18: HPLC-Spur der drei möglichen regioisomeren cyclischen Monochlorpyrimidin-Peptide
140
direkt nach der Abspaltung von der Zellulose.
-
Schema 39: Immobilisierung von 4,6-Dichlor-5-nitropyrimidin
141
an zellulosegebundenen Ala-Phe-Lys.
-
Schema 40: Intramolekulare Substitution am 6-Chlor-5-nitropyrimidinrest durch die
ε
-Aminogruppe des Lysins der Tripeptid-Einheit an der Zellulosemembran.
-
Schema 41: Immobilisierung von 2,6,8-Trichloro-7-methyl-7H-purin
145
an den N-Terminus des zellulosegebundenen Tripeptides Ala-Phe-Lys unter Ausbildung dreier möglicher Regioisomere.
-
Abb. 19: HPLC-Chromatogramm der regioisomeren Dichlorpurin-Peptide; im Verlauf der Analytik kam es zu partiellen Boc-Entschützung durch TFA im Lösungsmittel. Die gekennzeichneten Peaks zeigten die erwartete Masse für das Dichlorpurin-Peptidderivat.
-
Schema 42: Intramolekulare Substitution am Dichlorpurinrest von
146
durch die
ε
-Aminogruppe des Lysins der Tripeptid-Einheit an der Zellulosemembran.
-
Abb. 20: HPLC-Spur der möglichen regioisomeren cyclischen Monochlorpurin-Peptide direkt nach der Abspaltung von der Zellulose.
-
Abb. 21: Nachweis von Peptid-mAk-TAB-2-Wechselwirkung an einer Zellulosemembran durch einen zweiten POD-markierten Antikörper (POD = Peroxidase, Substrat: Chemolumineszenz-Substrat auf Luminol-Basis).
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Abb. 22: Substitutionsanalyse des Hepta-Peptids VVSHFND: 140 (7 x 20) Peptide zzgl.
7 Kopien des Wildtyps (wt) wurden an einer Zellulosemembran (6 x 13 cm) synthetisiert und mit mAk TAB-2 inkubiert. Dunkle SPOTs zeigen Bindung des Antikörpers, und unter-scheiden sich in einer Aminosäure (hervorgehoben in den angegeben Sequenzen).
[35, 102]
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Abb. 23: Entwurf der [1,3,5]-Triazin-Bibliothek aus 8000 Einzelverbindungen.
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Abb. 24: Verteilung der Häufigkeit der a) H-Akzeptor-, b) H-Donor Gruppen, c) des Molgewichtes und d) einzelner logP-Wert in der [1,3,5]-Triazin-Bibliothek aus 8000 Einzelverbindungen ermittelt mit dem Programm ChemX.
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Schema 43: Syntheseschritte für die [1,3,5]-Triazin-Bibliothek aus 8000 Einzel-verbindungen.
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Abb. 25: Verteilung der Amine in der [1,3,5]-Triazin-Bibliothek. Jeder Block der Amine repräsentiert 400 Verbindungen bestehend aus einer Dipeptid- und einer Triazin-Hälfte (vgl.
Schema 23
).
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Abb. 26: Bindung des mAk TAB-2 an einzelnen SPOTs der Bibliothek aus 8000 [1,3,5]-Triazinderivaten
149
. Die Visualisierung erfolgte durch einen POD-markierten Nachweisantikörper, Umsatz mit einem
Chemolumineszenz-Substrat und digitale Detektion der Lumineszenz (LumiImager™).
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Abb. 27: Inhibition der Bindung des mAk TAB-2 an das festphasengebundene Peptidepitop VVSHFNDCPDSHTQFAF durch die Verbindungen
18-6-19
,
6-3-1
und das Peptid VVSHFND in ELISA-Experimenten. Die Negativkontrolle
7-14-6
zeigt keine Inhibition.
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Schema 44: Gestaltung der Folgebibliothek. 6 Dipeptidsequenzen (A-F) wurden in Zeilen synthetisiert, nach Immobilisierung von Cyanurchlorid wurden 10 Nucleophile (1-10) zur Monochlorsubstitution eingesetzt. Das verbleibende Chloratom jeder Verbindung wurde mit Piperidin umgesetzt.
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Abb. 28: Bindungsstudien an [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken
153
synthetisiert an Zellulose- (a und b) und PP-Membran (c und d). Die Kontrollinkubation (a und c) zeigt an der Zellulose geringe, an der PP-Membran keine Bindung des POD-markierten Antikörpers. Die Zahlen in der Abbildung codieren die jeweiligen Reste von
153
.
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Abb. 29: Primärstruktur von S14 und dem Derivat Sandostatin
®
. Im Gegensatz zu S14 enthält Sandostatin
®
D-Aminosäuren und trägt C-terminal einen Alkohol. Die Schlüsselpositionen für die Aktivität von S14 sind rot hervorgehoben.
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Abb. 30: Prinzip des Assays; a) Zugabe von S14 zur modifizierten Hefe löst eine Signalkaskade aus und LacZ wird gebildet, das im Nähragar mit X-Gal durch eine Blaufärbung nachgewiesen wird. Die Menge an zugegebenen S14 ist proportional zum Radius der Blaufärbung (b).
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Abb. 31: Durchführung des Agardiffusions-Assays mit ausgestanzten SPOTs und Auswertung nach drei Tagen.
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Abb. 32: Austausch der Disulfidbrücke im S14 gegen eine 2,4-Diamino-[1,3,5]- triazineinheit.
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Abb. 33: Ansatz zur Transformation von S14 und zusätzliche lineare Kontrollen
A
und
B
der cyclischen Verbindungen
C
für das Assay.
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Abb. 34: Ergebnis des ersten Screenings mit cyclischen Peptid-Triazinderivaten; eine Blaufärbung zeigt aktive Verbindungen auf den SPOTs an.
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Abb. 35: Screening der Substanzen nach der letzten Verkürzung der Peptidsequenz. Nur die cyclische „Ausgangssequenz“ zeigte, neben den Kontrollen, eine agonistische Aktivität.
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Abb. 36: HPLC-MS Analytik von
4-1C
(a) und
4-4C
(b); gezeigt sind die UV-Spur bei 220 nm (oben) und der entsprechende Massenbereich der Zielverbindung (unten).
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Abb. 37: Kleinster aktiver SSTR2-Agonist
4-1C
aus der Transformation von S14. Die im S14 bekannten Schlüsselpositionen sind gelb hervorgehoben.
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Schema 45: Aminoderivatisierung der PP-Membranen.
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Abb. 38: Modulares System bei der Synthese von diversen [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken.
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Schema 46: Variabilität in der neuen Cyclisierungsmethode; es können unterschiedliche Oligomere mit verschiedenen halogenierten Stickstoff-Aromaten umgesetzt werden.
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Abb. 39: Kleinster im Verlauf dieser Arbeit gefundener SSTR2-Agonist 4-1C.
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