50

Kapitel 3. Ergebnisse

3.1 Validierung der in-silico Expressionsanalyse

3.1.1 Auswertung des elektronischen Northern

Grundlage dieser Arbeit war die in-silico Expressionsanalyse von Genen durch die Nutzung von EST-Bibliotheken, die aus verschiedenen Normal- und Tumorgeweben generiert wurden. Der daraus resultierende elektronische Northern zu jedem Gen gab Aufschluss über das Expressionsmuster in den Geweben und den korrespondierenden Tumoren, wobei die signifikante differenzielle Expression hinsichtlich Brust- und Ovarialgewebe Auswahlkriterium für die weitere Validierung potenziell tumorassoziierter Gene war. Der elektronische Northern zeigt am Beispiel des Gens YAP65 (’’Yes-Associated Protein’’, 65kDa) die Verteilung der über AUTEX identifizierten ESTs aus den cDNA-Datenbanken von 23 Organen und Zelltypen bzw. ihren korrespondierenden Tumoren (Tab.10).

Tab. 10: Elektronischer Northern von YAP65

Gewebetyp	Normalgewebe		Tumorgewebe		Verhältnis T/N	P- Wert á	Signifikanzin %
	Treffer	Bibliotheks-Größe	Treffer	Bibliotheks-Größe
Blase	2	25641	2	42550	0.60	0.635	36.5
Blut-Leukozyten	0	130844	0	941	-	-	-
Brust	26	120725	6	67582	0.41	0.0437	95.6
B-Zell-Lymphom	1	108530	0	7357	-	1	0.0
Dickdarm	3	31042	4	35626	2.38	0.259	74.1
Dünndarm	3	36432	2	9379	2.56	0.272	72.8
Endometrium	3	18977	2	6023	2.08	0.6	40.0
Gehirn	1	110439	4	38567	11.11	0.0178	98.2
Haut	2	27182	0	1180	-	1	0.0
Herz	9	98496	0	7271	-	1	-0.0
Hoden	2	29540	0	16891	-	0.537	46.3
Leber	1	21521	1	15763	1.37	1	-
Lunge	8	96193	4	43114	1.11	1	0.0
Magen-Speiseröhre	0	13799	0	12119	-	-	-
Myometrium	10	35843	0	14713	-	0.0409	95.9
Nebenniere	0	25886	0	20230	-	-	-
Niere	3	44566	1	40078	0.37	0.627	37.3
Ovar	4	33687	7	41736	1.41	0.764	23.6
Pankreas	0	65807	0	21808	-	-	-
Prostata	7	88661	4	76762	0.66	0.56	44.0
Skelettmuskel	1	58315	1	27063	2.17	0.533	46.7
Squamöse Zellen	4	33833	3	25706	0.99	1	0.0
T-Zell-Lymphom	1	60680	0	17313	-	1	-0.0

51

3.1.2 Bestätigung der in-silico Expressionsdaten

Zur Verifizierung des elektronischen Northern wurde das in-silico generierte Expressionsmuster mit den experimentellen Expressionsdaten aus den Northernblot- und cDNA-Array-Experimenten verglichen. Exemplarisch wurde dieser Vergleich für zwei durch diesen Ansatz identifizierte Kandidatengene, YAP65 und ein putatives Calpain, dargestellt. Der elektronische Northern beinhaltet neben dem Expressionsverhältnis von Normal- und Tumorgewebe Informationen über die Gewebespezifität des untersuchten Gens. Im experimentellen Teil der Arbeit wurde das Expressionsmuster von YAP65 und dem putativen Calpain in 16 verschiedenen Normalgeweben mit Hilfe des Northernblots bestimmt. Zur besseren Darstellung des Vergleichs der Expressionsdaten des in-silico Ansatzes und des Northernblots wurde der elektronische Northern auf 13 äquivalente Normalgewebe reduziert, wobei die Anzahl der ESTs von YAP65 und dem putativen Calpain in den einzelnen Geweben auf eine konstante Bibliotheksgröße (Treffer/ 100.000 ESTs) umgerechnet wurde (Abb.9). Die drei Gewebe Milz, Thymus und Plazenta des Northernblots waren im elektronischen Northern nicht vertreten und konnten für diese Validierung nicht herangezogen werden. Die
13 Gewebe sind hinsichtlich der Expressionsstärke von YAP65 im elektronischen Northern absteigend aufgelistet. Beide Expressionsexperimente zeigen ein nahezu

52

Abb.9: Vergleich der Expression von YAP65 und dem putativen Calpain in verschiedenen Normalgeweben zwischen elektronischem Northern (Tabelle) und MTN-Northernblot. Im elektronischen Northern beziehen sich die EST-Zahlen der Gene, die die Expressionstärke in den Geweben repräsentieren, auf eine definierte Bibliotheksgröße von 100.000 ESTs (Freq/100.000). Zur Quantifizierung der Gewebe des Northernblots ist die Hybridisierung mit ß-Aktin dargestellt.

Bei dem putativen Calpain zeigte der elektronischen Northern eine sehr gewebespezifische Expression besonders in Dickdarm (16/100.000ESTs) und sehr schwach in Dünndarm, Lunge und Prostata (Abb.9). Der MTN-Northernblot bestätigte die spezifische, sehr starke Expression im Dickdarm und zeigte darüber hinaus wie im elektronischen Northern eine schwache Expression in der Lunge. Die identifizierten ESTs des elektronischen Northern im Dünndarm und Prostata wurden nicht bestätigt. Die Verifizierung des elektronischen Northern war in großem Maße abhängig von der

53

Die Gene YAP65 und das putative Calpain wurden aufgrund der in-silico differenziellen Expression in Brust- bzw. Ovarialtumoren identifiziert. Zur Verifizierung der Expressionunterschiede zwischen den Normalgeweben und den korrespondierenden Tumoren erfolgte der Vergleich mit einem radioaktiv markierten cDNA-Array. Auf dem cDNA-Array waren zu verschiedenen Geweben sowohl Normalgewebe als auch Tumorgewebe von Patienten repräsentiert (Brusttumoren: Nr.1, 3, 5, 6, 7, 9: IDCs; Nr.2: ILC; Nr.4: medullär; Nr.8: mucinös; Ovartumore: Nr.1-3: Adenokarzinome; Nr.1: serös; Nr.3: papillär). In der Gegen-überstellung wurde der elektronische Northern und der cDNA-Array auf die Gewebe Brust und Ovar reduziert, für die in dieser Arbeit tumorassoziierte Gene untersucht wurden (Abb.10).

Abb.10: Vergleich der differenziellen Expression von YAP65 und dem putativen Calpain in Brust- und Ovarialtumoren zwischen den Methoden des elektronischen Northern und des radioaktiv markiertem cDNA-Arrays. Die Werte unter den cDNA-Arrays geben die densitometrisch ermittelten Expressionsverhältnisse (T/N) der Probenpaare wieder, die zuvor auf die ß-Aktin-Expression normiert wurden.

54

Im Falle des putativen Calpains zeigte der elektronische Northern eine signifikant verstärkte Expression in Brusttumorgewebe gegenüber dem Normalgewebe (T/N=5,0) und ähnliche Verhältnisse hinsichtlich des Ovargewebes. Es bestätigte sich auf dem cDNA-Array in sieben der neun Gewebepaare für Brust (Nr. 3-9; T/N>2) eine verstärkte Expression des Calpains in den Tumorproben, von denen drei Probenpaare (Nr.3, 5, 6; T/N>4) eine ähnlich hohe differenzielle Expression zeigten wie im elektronischen Northern. Dieses Ergebnis ließ darauf schließen, dass die Expression des putativen Calpains im Brusttumor gegenüber dem Normalgewebe hochreguliert ist. Die in-silico differenzielle Expression im Ovargewebe wurde mittels des cDNA-Arrays nicht bestätigt, wobei sich bei allen drei Gewebepaaren keine Expression des Calpains nachweisen ließ.

Der elektronische Northern stellte sich als schnelle und verifizierbare Methode dar, über die Analyse der differenziellen Expression potenzielle tumorassoziierte Gene zu identifizieren.

55

3.2 Kartierung von 330 in-silico Kandidatengenen für gynäkologische Tumore

Nach der genomweiten in-silico Expressionsanalyse für die gynäkologischen Tumore der Ursprungsgewebe Brust, Ovar, Endometrium und Myometrium ergaben sich insgesamt 457 putative Gene, die nach dem elektronischen Northern in mindestens einem der genannten gynäkologischen Tumore differenziell exprimiert waren. Die
457 in-silico differenziell exprimierten Gene repräsentieren ein nicht-redundantes Set von 330 Kandidatengenen, die mittels der elektronischen PCR und des Radiation Hybrid Mappings chromosomal kartiert wurden (Dahl et al., 1999; Abstract). Die chromosomale Verteilung dieser Kandidatengene wurde anschließend mit bereits beschriebenen aberranten Regionen für die gynäkologischen Tumore verglichen (Abb.11.1/.2). Dabei zeigten sich die potenziell tumorassoziierten Gene nicht zufällig über das menschliche Genom verteilt. Ein große Zahl von Kandidatengenen wurde in chromosomale Regionen kartiert, die in LOH- und Amplifikationsstudien für gynäkologische Tumore häufig als aberrant beschrieben wurden. Beispielsweise in den häufig deletierten Regionen 1p36-p31, 3p21-p14, 6q21-q27, 7q11-q31, 10q23-q26, 11p15, 11q12-q23, 13q21, 17q und 22q sowie in den häufig amplifizierten Regionen 1q32-q41, 8q, 11q, 17q und 20q wurden über 120 in-silico Kandidatengene lokalisiert, die neben bereits bekannten tumorassoziierten Genen neue potenzielle Zielgene für die Tumorentstehung oder Tumorprogression darstellen. In mehreren chromosomalen Regionen wie 1q21-q22, 1q32-q41, 6q21, 7q11, 8p12, 9q34, 10q26, 11p15, 11q12-q23, 19q13, 20q13, 21q22, 22q12-q13 sind signifikante Anhäufungen von Kandidatengenen zu beobachten, die zur weiteren Charakterisierung als besonders interessant erscheinen. Die Kartierung der in-silico Kandidatengene stellt zusammen mit dem Vergleich von beschriebenen chromosomalen Aberrationen die Grundlage für eine Vielzahl möglicher Projekte zur Evaluierung von tumorassoziierten Genen und Proteinen dar. Für diese Arbeit erfolgte eine Auswahl der Kandidatengene aus den chromosomalen Regionen 1q32-q41 und 11q12-q23. Beide Chromosomenabschnitte zeigen signifikante Anhäufungen von in-silico Kandidatengenen und stellen für Brust- und Ovarialkarzinome häufig als aberrant beschriebene Regionen dar, in denen noch unbekannte tumorassoziierte Gene vermutet werden. Die gesamte Kartierungsübersicht soll ausschließlich die Vorgehensweise in dieser Arbeit demonstrieren. Detaillierte Angaben zu den verschlüsselten Genen der anderen chromosomalen Bereiche sind in der Arbeit nicht enthalten.

56

Abb.11.1: Teil 1 der Übersicht über die chromosomale Verteilung von 330 Kandidatengenen für gynäkologische Tumore im Vergleich mit beschriebenen Aberrationen.

57

Abb.11.2: Teil 2 der Übersicht über die chromosomale Verteilung von 330 Kandidatengenen für gynäkologische Tumore im Vergleich mit beschriebenen Aberrationen. Die Literaturhinweise sind im Anhang nach den Chromosomen geordnet (G.3,Tab.27) wiedergegeben. Die Legende gibt Auskunft über Expressionscharakter der Gene für die entsprechenden Gewebe.

58

3.3 Beschreibung der Kandidatengene in 11q12-q23

3.3.1 Validierung aller in-silico Kandidatengene in 11q12-q23

Aus dem genomweiten Ansatz der in-silico Expressionsanalyse für gynäkologische Tumore wurden nach der chromosomalen Kartierung neun Gene in der Region 11q12-q23 identifiziert. Die Annotation der assemblierten Sequenzen nach der AUTEX-Analyse gegen die Nuklein- und Proteindatenbank ergab für alle neun Gene Identitäten zu entsprechenden Datenbankeinträgen (Tab.11).

Tab. 11: Beschreibung der in-silico differenziellen Gene aus der chromosomalen Region 11q12-q23.
*Der Name ELBT wurde für ein während dieser Arbeit noch unbekanntes Gen vergeben (aktueller Datenbankeintrag Stand Oktober 2001: DGAT2).

Gene in 11q12-q23	Gene Abkürzung	Genbank Eintrag	Funktion	Referenz
GS1999full (LOC84649)	ELBT *	gi14211870	unbekannt
Frizzled homolog 4	FZD4	gi6912383	Aktivierung des wnt-Signalweges	Kirikoshi et al., 1999; Sagara et al., 2001
CD20-like precursor (LOC64166)	MS4A6A	gi11641258	unbekannt	Liang et al.,2001
Yes-associated protein 1, 65kDa	YAP65	gi5174750	Transkriptions-Co-Aktivator mit WW1-und SH3-Domäne; bindet p53-Bindungsproteine	Sudol et al., 1995; Yagi et al., 1999; Espanel et al., 2001
Death associated protein 4	DAP4	gi9886758	Homologie zu P52rIPK; Regulation der doppelsträngigen RNA-aktivierten Protein Kinase	Gale et al., 1998
CGI-85 protein	CGI-85	gi7705794	unbekannt	Lai et al., 2000
Chloride channel, nucleotide-sensitive, 1°	CLNS1A	gi4502890	Regulation des Zellvolumens	Nagl et al., 1995; Buyse et al., 1996
FBR-MuSV associated ubiquitously expressed gene	FAU	gi31302	Fusionsprotein FAU besteht aus ribosomalen Protein S30 und Ubiquitin-ähnlichem Protein	Kas et al., 1992; Michiels et al., 1993
SYT interacting protein SIP	SIP	gi3746786	Interaktion mit SYT als transkriptioneller Co-Aktivator	Brett et al., 1997

Für die Gene FZD4, YAP65, DAP4, CLNS1A, FAU und SIP wurden in der Literatur potenzielle Funktionen der Proteine beschrieben. Zu den Genen MS4A6A und CGI-85 waren ausschließlich die Sequenzen annotiert ohne Aussagen über mögliche Funktionen der Proteine. MS4A6A zeigte schwache Homologien zu dem Glykoprotein CD20, während das humane Gen CGI-85 über die komparative Genomanalyse zu C.elegans identifiziert wurde. Das in dieser Arbeit als ELBT (’’Expressed in Liver, Breast and Testis’’) benannte Gen zeigte Sequenzidentitäten zu einem Genbankeintrag (’’GS1999full’’) mit Abweichungen am 5’-Ende des Gens. Die Kartierung der Gene erfolgte über Radiation Hybrid Mapping und der elektronischen PCR (Tab.12). Die

59

Tab. 12: Allgemeine Angaben zu den Genen in 11q12-q23 und Ergebnisse der chromosomalen Kartierung über Radiation Hybrid Mapping (RHdb) mit Angabe der Wahrscheinlichkeit (LOD_Score), des statistisch ermittelten Abstandes (cRs) und der zytogenetischen Bande nach der genomischen Datenbank (GDB) bzw. der aktuellen genomischen Sequenzdatenbank (UCSC).

Gene in 11q12-q23	Assembly in bp	Transkript in bp	Protein in aa	Chromosomale Kartierung
				RHdb / ePCR	LOD_Score	Abstand in cRs	GDB (08/1998)	UCSC (06/2001)
ELBT *	2408	2,4	388	SHGC-32865	1000	0	11q14.1	11q13.5
FZD4	1388	7,4	537	SHGC-20692	11.3	14	11q14.2-q14.3	11q14.2
MS4A6A	1679	1,5 (SV)	225	SHGC-35409	17.5	5.6	11q12.1-q13.1	11q12.3
YAP65	5132	5,2	454	D11S1339	1000	0	11q21.1-q22.3	11q22.1
DAP4	3275	4,2	761	SHGC-31396	10.4	6	11q13.5-q14.1	11q13.5
CGI-85	1574	2,8 (SV)	384	SHGC-14407	8.6	21	11q13.2-q13.5	11q13.4
CLNS1A	1427	1,5	237	SHGC-20692	11.3	14	11q14.2	11q14.1
FAU	598	0,5	133	RH76564	-	-	11q13.2	11q13.2
SIP	2913	2,8	669	SHGC-11846	-	-	11q13.3	11q13.3

Abb.12: Cytogenetische Lokalisation der Kandidatengene in 11q12-q23. Die in-silico differenziell exprimierten Genen (rechte Spalte) wurden entsprechend der annotierten Genomdatenbank (UCSC) chromosomal kartiert. Dazu sind schon beschriebene tumorassoziierte Gene wie MEN1, CCND1, FGF4, FGF3, EMS1 (11q13 Amplikon) und ATM angegeben.

60

Tab. 13: Ergebnisse des elektronischen Northern der Gene in 11q12-q23 bezüglich der differenziellen Expression in Brust- und Ovargewebe.

Gene in 11q12-q23	Gewebetyp	Normalgewebe		Tumorgewebe		Verhältnis T/N	P-Wert á	Signifikanz in %
		Treffer	Bibliotheks-Größe	Treffer	Bibliotheks-Größe
ELBT	Brust	24	120725	3	67582	0.22	0.00772	99.2
	Ovar	0	33687	0	41736	-	-	-
FZD4	Brust	14	120725	1	67582	0.13	0.0155	98.5
	Ovar	0	33687	1	41736	-	1	-0.0
MS4A6A	Brust	14	120725	1	67582	0.13	0.0155	98.5
	Ovar	0	33687	6	41736	-	0.0366	96.3
YAP65	Brust	26	120725	6	67582	0.41	0.0437	95.6
	Ovar	4	33687	7	41736	1.41	0.764	23.6
DAP4	Brust	10	120725	0	67582	-	0.017	98.3
	Ovar	0	33687	21	41736	-	0.00055	99.9
CGI-85	Brust	2	120725	1	67582	0.89	1	0.0
	Ovar	0	33687	6	41736	-	0.0366	96.3
CLNS1A	Brust	18	120725	22	67582	2.17	0.0197	98.0
	Ovar	2	33687	15	41736	5.88	0.00612	99.4
Fau	Brust	4	120725	11	67582	5.00	0.0048	99.5
	Ovar	2	33687	11	41736	4.35	0.0476	95.2
SIP	Brust	3	120725	6	67582	3.57	0.0786	92.1
	Ovar	1	33687	8	41736	6.67	0.0488	95.1

Die Gene ELBT, FZD4, MS4A6A, YAP65, DAP4 waren in Brusttumoren signifikant geringer exprimiert gegenüber den Bibliotheken des Brust-Normalgewebes. Die Gene CLNS1A, FAU und SIP zeigten sich sowohl in Brusttumoren als auch in Ovarialtumoren signifikant überexprimiert gegenüber den Normalgeweben. Für das Gen CGI-85 ergab sich im elektronischen Northern in Ovarialtumor-Bibliotheken eine Überexpression. Damit wurden in der Region 11q12-q23 Kandidatengene für die Entstehung und Progression dieser Tumore identifiziert. Zur weiteren Charakterisierung und der Verifizerung der differenziellen Expression wurden die Gene über Northernblot- und cDNA-Array-Analysen untersucht. Für acht von neun Genen wurde die generierten cDNA-Sonde im MTN-Northernblot auf ihre Spezifität getestet. Für das Gen CLNS1A

61

Abb.13: Übersicht über das Expressionsmuster der Gene aus 11q12-q23 im MTN-Northernblot (linke Bilderspalte) mit 16 verschiedenen Gewebetypen und im cDNA-Array (beide rechte Bildspalten) mit korrspondierenden Normal (N)- und Tumorproben (T) von Brust- und Ovargewebe. Unter den cDNA-Arrays sind die densitometrisch ermittelten Expressionsverhältnisse (T/N) in Bezug zur ß-Aktin-Expression angegeben (n.d.-nicht definiert). Für das Gen CLNS1A ist nur die Hybridisierung des cDNA-Arrays dargestellt, da die cDNA-Sonde bereits validiert vorlag.

62

63

3.3.2 Charakterisierung des potenziellen Tumorsuppressorgens ELBT

Von den neun untersuchten Genen aus der Region 11q12-q23 wurde ELBT aufgrund der bestätigten in-silico Expressionsdaten für die weitere Validierung eines potenziellen Tumorsuppressorgens ausgewählt. Es erfolgten Expressionsexperimente wie cDNA-Array-Hybridisierung und Taqmananalysen, die die verringerte Expression von ELBT in Brusttumoren belegen sollten. Mittels der Mutationsanalyse sollten mögliche Mutationen des Gens in Brusttumoren detektiert werden, die ein Ausfall des Proteins als Tumorsuppressor begründen könnten. Neben den quantitativen Expressionsstudien wurden RNA in-situ Hybridisierungen an Gewebeschnitten durchgeführt, um weitere Aussagen über die Lokalisation des Transkriptes im Brustgewebe und anderen Gewebetypen zu erhalten.

3.3.2.1 ELBT zeigte sich in Brusttumoren signifikant geringer exprimiert

ELBT wurde durch die in-silico analysierte differenzielle Expression in Brusttumoren identifiziert (Tab.14). Der elektronische Northern von ELBT zeigte ein weitgehend spezifisches Vorkommen von ESTs vor allem im Normalgewebe der Brust, Haut und Herz, sowie in geringerer Zahl in Blut-Leukozyten, Hoden und Niere.

Tab. 14: Elektronischer Northern von ELBT

Gewebetyp	Normalgewebe		Tumorgewebe		Verhältnis T/N	P-Wert á	Signifikanz in %
	Treffer	Bibliotheks-Größe	Treffer	Bibliotheks-Größe
Blase	0	25641	1	42550	-	1	-0.0
Blut-Leukozyten	5	130844	0	941	-	1	0.0
Brust	24	120725	3	67582	0.22	0.00772	99.2
B-Zell-Lymphom	0	108530	0	7357	-	-	-
Dickdarm	0	31042	0	35626	-	-	-
Dünndarm	0	36432	0	9379	-	-	-
Endometrium	0	18977	0	6023	-	-	-
Gehirn	1	110439	0	38567	-	1	0.0
Haut	4	27182	0	1180	-	1	0.0
Herz	9	98496	0	7271	-	1	-0.0
Hoden	2	29540	0	16891	-	0.537	46.3
Leber	0	21521	0	15763	-	-	-
Lunge	1	96193	0	43114	-	1	-0.0
Magen-Speiseröhre	0	13799	2	12119	-	0.219	78.1
Myometrium	0	35843	0	14713	-	-	-
Nebenniere	0	25886	0	20230	-	-	-
Niere	2	44566	0	40078	-	0.501	49.9
Ovar	0	33687	0	41736	-	-	-
Pankreas	0	65807	0	21808	-	-	-
Prostata	0	88661	1	76762	-	0.464	53.6
Skelettmuskel	1	58315	1	27063	2.17	0.533	46.7
Squamöse Zellen	2	33833	0	25706	-	0.509	49.1
T-Zell-Lymphom	0	60680	0	17313	-	-	-

64

Nach diesem ersten Hinweis der differenziellen Expression in Brusttumoren wurde zur statistisch signifikanteren Verifizierung der in-silico Ergebnisse als weiterer cDNA-basierter Blot der ’’Cancer Profiling Array’’ (CPA) mit der ELBT-Sonde hybridisiert. Der CPA repräsentiert, neben einer Vielzahl anderer Gewebe, cDNA-Proben von den Tumoren und den korrespondierenden Normalgeweben von insgesamt 50 Brusttumorpatientinnen (Abb.14). Zusammen mit drei Patientinnen, von denen neben dem Normal- und Tumorgewebe auch metastatisches Gewebe vorhanden war, wurden 53 Probenpaare zur Auswertung gebildet. Von 52 Probenpaaren konnten die Expressionsintensitäten nach Visualisierung mittels PhosphoImager über ImageQuant quantitativ ausgewertet werden. Die Berechnung der relativen Expressionverhältnisse von ELBT zwischen Normalgewebe und Tumorgewebe der Probanden erfolgte unter Berücksichtigung der Normierung der Proben nach der ß-Aktin-Hybridisierung (Abb.15). Die Expressionsverhältnisse zeigten eine signifikant geringere Expression von ELBT in den Tumorproben gegenüber den Normalgeweben der Brust (Tab.15). Neben einigen selteneren Karzinom-Typen waren 33 invasiv duktale Karzinome (IDC) und neun invasiv lobuläre Karzinome (ILC) unterschiedlicher Progression (Grading) vertreten. Eine mindestens vierfach geringere Expression von ELBT gegenüber dem Normalgewebe ergab sich bei 48% der IDCs und 56% der ILCs (T/N<0,25). Mindestens zehnfach geringer exprimiert waren noch 24% der IDCs und 33% der ILCs (T/N<0,1). Im Gegensatz dazu wurde bei nur 8% aller Tumore eine mindestens zweifach verstärkte Expression gegenüber dem Normalgewebe festgestellt. Bei 27% aller Tumore ergaben sich keine signifikanten Expressionsunterschiede (0,5<T/N<2). Unter den duktalen Karzinomen konnten Gruppen unterschiedlichen Gradings unterschieden werden. Eine signifikante Korrelation der differenziellen Expression von ELBT zur Tumorprogression konnte bei den IDCs nicht nachgewiesen werden (Abb.16).

65

Abb.14: Expression von ELBT auf dem ’’Cancer Profiling Array’’

Abb.15: Expression von ß-Aktin auf dem ’’Cancer Profiling Array’’

66

Tab. 15: Quantitative Auswertung der Expression von ELBT in den 53 Brustgewebe-Probenpaaren des Cancer Profiling Array (CPA) über ImageQuant. Die Koordinaten X,Y geben die Lage des untersuchten Probenpaars auf dem CPA (Abb.14) wieder. Der relative Expressionslevel (T/N) bezieht sich auf die differenzielle Expression (k.A.-keine Angaben; n.a.-nicht auswertbar).

Nr.

Y

X

Histologie

Grad

Lymph- knoten

T/N

Nr.

Y

X

Histologie

Grad

Lymph- knoten

T/N

1

Q

1/2

IDC

1

k.A.

0,22

28

L

½

IDC

k.A.

negativ

3,29

2

R

1/2

IDC

1

k.A.

0,22

29

O

½

IDC

k.A.

negativ

0,46

3

S

1/2

IDC

1

k.A.

2,05

30

V

½

IDC

k.A.

k.A.

0,36

4

T

1/2

IDC

1

k.A.

0,08

31

Z

½

IDC

k.A.

k.A.

0,07

5

U

1/2

IDC

1

k.A.

3,20

32

AA

½

IDC

k.A.

k.A.

0,05

6

D

3/4

IDC

1

k.A.

0,40

33

O

¾

IDC

k.A.

positiv

0,04

7

F

3/4

IDC

1

k.A.

1,11

34

A

½

DCIS

k.A.

negativ

0,88

8

N

3/4

IDC

2B

k.A.

0,74

35

Y

½

ILC

k.A.

k.A.

0,57

9

K/L

3/4

IDC

2B

positiv

0,12

36

DD

½

ILC

k.A.

k.A.

0,02

10

A

3/4

IDC

3A

k.A.

0,63

37

EE

½

ILC

k.A.

k.A.

0,19

11

B

3/4

IDC

3A

k.A.

0,53

38

FF

½

ILC

k.A.

k.A.

0,30

12

M

3/4

IDC

3A

k.A.

0,23

39

B

½

LC

k.A.

positiv

0,65

13

G/H

3/4

IDC

3A

positiv

0,14

40

M

½

LC

k.A.

positiv

0,05

14

I/J

3/4

IDC

3A

positiv

0,01

41

F

½

LC

k.A.

negativ

0,29

15

C

1/2

IDC

k.A.

positiv

0,54

42

K

½

LC

k.A.

negativ

0,04

16

D

1/2

IDC

k.A.

positiv

0,61

43

E

¾

LC

2A

k.A.

0,15

17

E

1/2

IDC

k.A.

positiv

0,03

44

BB

½

lob-duct. Ca

k.A.

k.A.

0,07

18

H

1/2

IDC

k.A.

positiv

1,80

45

Q

¾

medulläres Ca

k.A.

negativ

1,51

19

I

1/2

IDC

k.A.

positiv

0,21

46

T

¾

muzinöses AdCa

k.A.

k.A.

0,13

20

J

1/2

IDC

k.A.

positiv

5,34

47

C

¾

tubuläres AdCa

1

k.A.

0,14

21

N

1/2

IDC

k.A.

positiv

0,01

48

W

½

tubuläres Ca

2

k.A.

1,68

22

P

1/2

IDC

k.A.

positiv

0,18

49

X

½

Fibrosarkoma

k.A.

k.A.

0,21

23

P

3/4

IDC

k.A.

positiv

0,23

50

K

¾

Metastasen

-

-

0,41

24

R

3/4

IDC

k.A.

positiv

0,39

51

G

¾

Metastasen

-

-

0,11

25

S

3/4

IDC

k.A.

positiv

0,01

52

I

¾

Metastasen

-

-

0,05

26

U

3/4

IDC

k.A.

positiv

1,30

27

G

1/2

IDC

k.A.

negativ

1,12

53

CC

½

ILC

k.A.

k.A.

n.a.

Abb.16: Darstellung der relativen Expression (T/N) von ELBT im Säulendiagramm für 52 Probenpaare mit Unterteilung der Brusttumore in histologische Typen. Die Tabelle gibt die statistische Auswertung der signifikant geringeren Expression in IDCs und ILCs wieder.

67

3.3.2.2 Bestätigung der ELBT-Expression in mikrodissezierten Brustgeweben

Die differenzielle Expression von ELBT bezieht sich im elektronischen Northern und in den cDNA-Arrays auf nicht-mikrodisseziertes Gewebe. Um die differenzielle Expression hinsichtlich des Mammaepithels und daraus entstehenden Tumoren zu verifizieren, wurden quantitative Expressionsstudien an mikrodissezierten Brusttumoren und histologisch unauffälligen Mammaepithelien durchgeführt. Nach der Mikrodissektion erfolgte eine ELBT-spezifische Taqman-Analyse mit anschließender Bestimmung der Expressionsstärke (Tab.16). Für die Analyse wurden cDNA-Proben von 18 Brusttumoren eingesetzt, wovon 13 invasiv duktale und fünf invasiv lobuläre Karzinome waren. Von den mikrodissezierten Normalgeweben konnten drei unterschiedliche cDNA-Proben ausgewertet werden. Alle Proben wurden zuvor über die GAPDH-Expression normiert. Nach der Auswertung der ELBT-Expression, repräsentiert durch die ermittelten CT-Werte, ergaben sich durch den Vergleich mit der Referenzprobe (Nr. B19) relative Expressionsverhältnisse (Level) zwischen den verschiedenen mikrodissezierten Geweben. Die drei Normalepithel-Proben zeigten bis zu zweifache Expressionsunterschiede. Die mikrodissezierten Tumore waren in überwiegender Zahl signifikant geringer exprimiert als die Normalepithelien (Abb.17). Von den duktalen Karzinomen zeigten 77% eine mindestens vierfach (T/N<0,25), 46% eine mindestens zehnfach (T/N<0,1) geringere Expression gegenüber der Referenzprobe. Von den lobulären Karzinomen waren alle fünf Proben (100%) mindestens vierfach, zwei Proben (40%) mindestens zehnfach herunterreguliert. Die Expressionsanalyse der mikrodissezierten Brusttumoren und Normalepithelien bestätigte die differenzielle Expression von ELBT in einem größeren Anteil der untersuchten Probanden als in den bisherigen Expressionsexperimenten. Ein Grund dafür könnte das methodische Vorgehen der Isolierung distinkter Zellpopulationen durch die Mikrodissektion sein, wodurch ein sensitiverer Vergleich zwischen Normal- und Tumorgewebe gewährleistet ist. Die höhergradigen duktalen Karzinome (Nr. B9-B12: IDC, G3) waren gegenüber den geringergradigen Tumoren größtenteils schwächer differenziell exprimiert, wobei diese Korrelation zur Tumorprogression bei den zahlreicheren Probenpaaren des cDNA-Arrays nicht ersichtlich war.

68

Tab. 16: Quantifizierung der Expression von ELBT in den mikrodissezierten Brustgeweben nach der Taqman-PCR. Alle Proben wurden über die GAPDH-Expression normiert und der Expressionslevel aller mikrodissezierten Proben in Bezug zur Referenzproben B19 (Mammaepithel-Probe) gesetzt.

Nr.	Histologie	Gen	CT (Mw)	Stabw	Gen	CT (Mw)	Stabw	?CT	Stabw?CT	??CT	Level	- Fehler	+ Fehler
B1	IDC, Grad 2	GAPDH	24,7	0,10	ELBT	37,1	0,19	12,4	0,22	6,9	0,008	0,00	0,0
B2	IDC, Grad 2	GAPDH	25,8	0,44	ELBT	34,2	0,29	8,4	0,53	2,9	0,136	0,04	0,1
B3	IDC, Grad 2	GAPDH	28,2	0,18	ELBT	39,9	0,2	11,7	0,27	6,2	0,014	0,00	0,0
B4	IDC, Grad 2	GAPDH	27,2	0,13	ELBT	36,1	0,14	8,9	0,19	3,4	0,096	0,01	0,0
B5	IDC, Grad 2	GAPDH	25,9	0,22	ELBT	33,5	0,00	7,6	0,22	2,1	0,238	0,03	0,0
B6	IDC, Grad 2	GAPDH	24,9	0,03	ELBT	35,8	0,31	10,9	0,31	5,4	0,024	0,00	0,0
B7	IDC, Grad 2	GAPDH	26,9	0,12	ELBT	36,8	0,33	9,9	0,35	4,3	0,049	0,01	0,0
B8	IDC, Grad 3	GAPDH	26,9	0,28	ELBT	37,5	0,13	10,6	0,31	5,1	0,029	0,01	0,0
B9	IDC, Grad 3	GAPDH	26,5	0,14	ELBT	32,8	0,48	6,3	0,50	0,8	0,594	0,17	0,2
B10	IDC, Grad 3	GAPDH	27,7	0,18	ELBT	35,5	0,28	7,9	0,34	2,3	0,200	0,04	0,1
B11	IDC, Grad 3	GAPDH	28,8	0,19	ELBT	36,4	0,45	7,5	0,49	2,0	0,251	0,07	0,1
B12	IDC, Grad 3	GAPDH	31,3	0,06	ELBT	37,7	0,66	6,5	0,66	0,9	0,524	0,19	0,3
B13	IDC, Grad 3	GAPDH	25,1	0,20	ELBT	36,3	0,34	11,2	0,39	5,7	0,020	0,00	0,0
B14	ILC, Grad 2	GAPDH	28,4	0,32	ELBT	38,7	0,03	10,3	0,32	4,8	0,036	0,01	0,0
B15	ILC, Grad 2	GAPDH	27,3	0,45	ELBT	37,1	0,08	9,8	0,46	4,3	0,052	0,01	0,0
B16	ILC, Grad 2	GAPDH	31,7	0,10	ELBT	39,3	0,87	7,6	0,88	2,1	0,231	0,10	0,2
B17	ILC, Grad 3	GAPDH	24,1	0,29	ELBT	32,9	0,31	8,8	0,43	3,3	0,103	0,03	0,0
B18	ILC, Grad 3	GAPDH	28,5	0,10	ELBT	37,1	0,04	8,6	0,11	3,1	0,116	0,01	0,0
B19	Mammaepithel	GAPDH	28,8	0,55	ELBT	34,3	1,03	5,5	1,17	0,0	1,000	0,55	1,2
B20	Mammaepithel	GAPDH	31,4	0,30	ELBT	37,9	0,32	6,5	0,44	1,0	0,505	0,13	0,2
B21	Mammaepithel	GAPDH	31,5	0,05	ELBT	36,9	0,54	5,4	0,55	-0,2	1,124	0,35	0,5

Abb.17: Darstellung der relativen Expression von 21 mikrodissezierten Brusttumoren und Normalepithelien im Säulendiagramm mit Unterteilung der histologischen Typen. Die statistische Auswertung der signifikant geringeren Expression in Tumoren bezieht sich auf die Referenzprobe B19.

69

3.3.2.3 Die Mutationsanalyse des Gens ELBT ergab keine genomischen Veränderungen in Brusttumoren

Die Ergebnisse aus den Expressionsexperimenten, in denen das Gen ELBT als herunterreguliert in Brusttumoren identifiziert wurde, wiesen darauf hin, dass es sich um ein potenzielles Tumorsuppressorgen handeln könnte. Eine Möglichkeit der Validierung von Tumorsuppressorgenen ist die Suche nach Mutationen in der transkribierten Sequenz. Mutationen würden zwar nicht die verringerte Expression in den Tumoren erklären, jedoch einen Hinweis auf den Verlust der Proteinfunktion von ELBT in den Tumorzellen geben und damit die These der möglichen Tumorsuppressorfunktion unterstützen. In dieser Arbeit wurden 71 Brusttumore auf Mutationen untersucht. Der erste Schritt war die Optimierung der acht Primerpaare, mit denen die acht Exons von ELBT in den Tumorproben amplifiziert wurden (Abb.18).

Abb.18: Optimierung der PCR für 8 Primerpaare zur Amplifikation der Exons von ELBT in den Tumor-DNA-Proben. In den oberen Bildern sind die PCR-Amplifikate für Exon 1, 2 und 3-8 bei unterschiedlichen PCR-Bedingungen gezeigt. Im unteren Bild sind exemplarisch für Exon 4 die Amplifikate der 71 Tumorproben und der Plazentakontrolle (Nr.48) gezeigt. Als Längenstandard diente ein 100bp Marker.

70

Tab. 17: Übersicht über die Bearbeitung und Ergebnisse der 72 in der Mutationsanalyse untersuchten Proben (71 Tumorproben, 1 Plazenta-Kontrolle VP). Histologische Daten zu den Tumoren lagen in einem Teil der Tumorproben vor (IDC, ILC, DCIS) oder waren nicht weiter klassifiziert (BrCa). Es konnten einige Exons in den Tumorproben nicht amplifiziert werden (negativ), die meisten Amplifikate waren im SSCP-Gel unauffällig (-) oder wurden aufgrund auffälliger SSCP-Analysen anschließend sequenziert (Seq).

Nr.	Tumor	Ex 1	Ex 2	Ex 3	Ex 4	Ex 5	Ex 6	Ex 7	Ex 8	Nr.	Tumor	Ex 1	Ex 2	Ex 3	Ex 4	Ex 5	Ex 6	Ex 7	Ex 8
1	BrCa	negativ	-	-	-	-	-	-	-	37	BrCa	-	-	-	-	-	-	-	-
2	BrCa	Seq	-	-	-	-	-	Seq	-	38	BrCa	-	-	-	Seq	-	-	-	-
3	BrCa	-	-	-	Seq	-	-	-	-	39	BrCa	-	-	-	-	-	-	-	-
4	BrCa	-	-	-	-	-	-	-	Seq	40	BrCa	-	Seq	-	-	negativ	-	-	-
5	BrCa	-	-	-	-	-	-	-	-	41	BrCa	-	Seq	-	-	Seq	-	-	-
6	BrCa	-	-	-	-	-	-	-	-	42	BrCa	-	Seq	-	-	Seq	-	-	-
7	BrCa	-	-	-	-	-	-	-	Seq	43	BrCa	-	-	-	-	-	-	-	-
8	BrCa	-	-	-	-	-	-	-	Seq	44	BrCa	-	-	Seq	-	-	Seq	-	-
9	BrCa	-	-	-	-	-	-	-	-	45	BrCa	-	-	-	-	-	-	-	-
10	BrCa	-	-	-	-	-	-	-	-	46	BrCa	-	-	-	-	-	Seq	-	-
11	BrCa	-	-	-	-	-	-	-	-	47	BrCa	negativ	-	-	-	-	-	negativ	-
12	BrCa	-	-	-	-	-	-	Seq	-	48	Plazenta	VP	VP	VP	VP	VP	VP	VP	VP
13	BrCa	-	-	Seq	-	-	-	-	-	49	ILC	-	-	-	-	-	-	-	-
14	BrCa	-	-	-	-	Seq	-	-	-	50	ILC	negativ	-	-	-	negativ	-	-	-
15	BrCa	-	-	-	-	Seq	-	-	Seq	51	IDC	negativ	-	-	-	negativ	-	negativ	-
16	BrCa	-	-	Seq	-	-	-	-	Seq	52	IDC	-	-	-	-	negativ	-	-	-
17	BrCa	-	-	-	-	-	-	Seq	-	53	IDC	negativ	-	-	-	negativ	-	negativ	-
18	BrCa	-	-	-	-	-	-	-	-	54	IDC	negativ	-	-	-	negativ	-	-	-
19	BrCa	-	-	-	-	-	-	-	Seq	55	IDC	negativ	-	Seq	-	negativ	-	-	-
20	BrCa	-	-	-	-	-	-	-	-	56	IDC	-	-	-	-	negativ	-	-	-
21	BrCa	-	-	-	-	-	-	-	-	57	IDC	-	Seq	-	-	-	-	-	-
22	BrCa	-	-	-	-	-	-	-	Seq	58	IDC	-	-	-	-	Seq	-	-	-
23	BrCa	-	-	-	-	Seq	-	-	Seq	59	IDC	-	Seq	-	-	Seq	-	-	-
24	BrCa	-	-	-	-	-	-	-	-	60	IDC	negativ	-	-	-	-	negativ	-	-
25	BrCa	-	-	-	-	-	-	-	-	61	ILC	negativ	-	-	-	-	negativ	-	-
26	BrCa	-	-	-	Seq	-	Seq	-	Seq	62	BrCa	negativ	-	Seq	-	negativ	negativ	-	-
27	BrCa	negativ	negativ	negativ	-	negativ	-	negativ	-	63	BrCa	negativ	-	-	-	-	-	-	Seq
28	BrCa	-	-	-	-	-	-	-	-	64	BrCa	-	-	-	-	negativ	negativ	-	Seq
29	BrCa	negativ	negativ	-	-	negativ	-	-	-	65	BrCa	negativ	-	-	-	-	-	-	-
30	BrCa	negativ	negativ	-	Seq	Seq	-	Seq	-	66	IDC	-	-	-	-	-	-	-	Seq
31	BrCa	-	-	-	-	-	Seq	-	Seq	67	DCIS	-	-	-	-	-	-	-	Seq
32	BrCa	-	-	-	Seq	Seq	Seq	-	-	68	BrCa	-	Seq	-	Seq	-	-	-	-
33	BrCa	-	-	-	-	-	-	-	-	69	BrCa	negativ	-	-	-	-	-	-	-
34	BrCa	-	-	-	-	-	-	-	-	70	IDC	negativ	Seq	-	Seq	-	Seq	-	Seq
35	BrCa	-	-	-	Seq	-	-	-	-	71	DCIS	-	Seq	-	Seq	-	Seq	-	Seq
36	BrCa	-	-	-	-	-	Seq	-	-	72	IDC	-	-	-	-	negativ	-	-	-

71

3.3.2.4 Expression von ELBT in Leber, Brust, Hoden und Blutleukozyten

Der elektronische Northern gab die größte EST-Frequenz des Gens ELBT in den Bibliotheken für Brust-Normalgewebe wieder. Darüber hinaus zeigten die in-silico Daten die Expression von ELBT in den Geweben Haut, Herz, Hoden und Blutleukozyten an (C.3.2.1,Tab.14). Dieses Expressionsmuster wurde durch die Northernblot- und Taqman-Analyse verifiziert und erweitert. Der MTN-Northernblot mit 16 verschiedenen Geweben ergab nach Hybridisierung mit der radioaktiv markierten ELBT-Sonde (Klon H25327) eine spezifische Bande mit der erwarteten Fragmentgröße von etwa 2,4kb (C.3.1, Abb.13). Die stärkste Expression von ELBT zeigte sich in Leber, eine moderate Expression in Blutleukozyten und Hoden sowie eine sehr schwache Expression in Herz und anderen Geweben. Die Expression von Herz im elektronischen Northern konnte im Northernblot nicht bestätigt werden, während die starke Expression von Leber im Northernblot nicht im elektronischen Northern auftrat. Die moderate Expression von ELBT im Hoden und in den Blutleukozyten korrelierten in beiden Expressionsexperimenten.

Um die Expression von ELBT in einem größeren Gewebespektrum zu untersuchen, wurden Taqman-Analysen mit cDNA-Proben von 22 verschiedenen Geweben, sechs Brusttumor-Zelllinien und drei Ovartumor-Zelllinien durchgeführt (Tab.18). Die quantitative Auswertung der Taqman-PCR erfolgte nach Normierung der cDNA-Proben über die GAPDH-Expression. Die Expressionslevel von ELBT in den Geweben und Zelllinien bezogen sich auf das Brustgewebe als Referenzwert. Das Ergebnis korrelierte sehr gut mit den Expressionsdaten des Northernblots. Die stärkste Expression von ELBT wurde in Leber nachgewiesen, gefolgt von den Geweben Brust und Hoden (Abb.19). Die übrigen Gewebe zeigten in Bezug auf Brustgewebe eine sehr schwache Expression, in den Tumorzelllinien war ELBT nicht mehr nachweisbar. Eine Normierung

72

Tab. 18: Auswertung der Taqman-PCR von 22 Geweben und 9 Tumorzelllinien. Die CT-Werte ergaben sich aus dem Mittelwert (Mw) des dreifachen PCR-Ansatzes mit Angaben der Standardabweichung (Stabw). Alle Proben wurden über die GAPDH-Expression normiert (CT). Die relativen Expressionsverhältnisse (Level) der Proben beziehen sich auf Brust als Referenzprobe (Level=1).

Name	Gen	CT (Mw)	Stabw	Gen	CT (Mw)	Stabw	?CT	Stabw ?CT	??CT	Level	- Fehler	+ Fehler
Gehirn	GAPDH	21,1	0,23	ELBT	27,8	0,18	6,7	0,29	6,4	0,01	0,00	0,00
Speicheldrüse	GAPDH	21,8	0,14	ELBT	27,8	0,16	6,1	0,21	5,8	0,02	0,00	0,00
Schilddrüse	GAPDH	21,6	0,01	ELBT	27,1	0,08	5,6	0,09	5,3	0,03	0,00	0,00
Magen	GAPDH	23,8	0,3	ELBT	28,8	0,24	5,0	0,38	4,7	0,04	0,01	0,01
Thymus	GAPDH	21,2	0,02	ELBT	27,1	0,19	5,9	0,19	5,6	0,02	0,00	0,00
Uterus	GAPDH	22,0	0,24	ELBT	31,2	0,13	9,2	0,27	8,9	0,00	0,00	0,00
Prostata	GAPDH	22,3	0,19	ELBT	29,0	0,3	6,7	0,36	6,4	0,01	0,00	0,00
Skelettmuskel	GAPDH	19,3	0,25	ELBT	30,4	0,09	11,1	0,27	10,8	0,00	0,00	0,00
Dünndarm	GAPDH	22,6	0,21	ELBT	28,9	0,15	6,3	0,26	6,1	0,01	0,00	0,00
Herz	GAPDH	21,5	0,49	ELBT	27,4	0,21	5,9	0,53	5,6	0,02	0,01	0,01
Plazenta	GAPDH	23,2	0,04	ELBT	30,7	0,21	7,4	0,21	7,1	0,01	0,00	0,00
Hoden	GAPDH	23,2	0,17	ELBT	24,9	0,05	1,6	0,18	1,3	0,40	0,05	0,05
Milz	GAPDH	23,4	0,1	ELBT	28,5	0,24	5,2	0,26	4,9	0,03	0,01	0,01
Hypophyse	GAPDH	22,9	0,24	ELBT	30,9	0,28	8,1	0,37	7,8	0,00	0,00	0,00
Pankreas	GAPDH	25,8	0,19	ELBT	31,0	0,27	5,2	0,33	5,0	0,03	0,01	0,01
Leber	GAPDH	23,7	0,24	ELBT	22,4	0,28	-1,2	0,37	-1,5	2,89	0,65	0,84
Brust	GAPDH	22,5	0,14	ELBT	22,8	0,15	0,3	0,21	0,0	1,00	0,13	0,15
Lunge	GAPDH	23,2	0,15	ELBT	28,2	0,1	5,0	0,18	4,8	0,04	0,00	0,00
Lymphknoten	GAPDH	24,2	0,3	ELBT	28,9	0,33	4,8	0,45	4,5	0,04	0,01	0,02
Dickdarm	GAPDH	23,3	0,11	ELBT	29,4	0,15	6,1	0,19	5,9	0,02	0,00	0,00
Niere	GAPDH	23,2	0,05	ELBT	29,9	0,26	6,7	0,26	6,4	0,01	0,00	0,00
Cervix	GAPDH	26,5	0,15	ELBT	32,1	0,25	5,6	0,30	5,3	0,03	0,00	0,01
MCF7	GAPDH	21,2	0,02	ELBT	28,7	0,19	7,6	0,19	7,3	0,01	0,00	0,00
T47D	GAPDH	23,1	0,07	ELBT	30,9	0,19	7,8	0,20	7,5	0,01	0,00	0,00
MDA231	GAPDH	21,2	0,11	ELBT	29,6	0,14	8,4	0,18	8,1	0,00	0,00	0,00
BT474	GAPDH	21,4	0,1	ELBT	31,4	0,28	10,0	0,30	9,7	0,00	0,00	0,00
MDA453	GAPDH	20,7	0,12	ELBT	29,2	0,43	8,5	0,45	8,2	0,00	0,00	0,00
SKBR3	GAPDH	20,6	0,26	ELBT	30,2	0,12	9,6	0,29	9,3	0,00	0,00	0,00
EB-2	GAPDH	19,7	0,16	ELBT	29,0	0,32	9,2	0,36	9,0	0,00	0,00	0,00
PA-1	GAPDH	21,3	0,07	ELBT	33,2	0,18	11,9	0,19	11,6	0,00	0,00	0,00
BG-1	GAPDH	21,0	0,16	ELBT	30,0	0,08	9,0	0,18	8,7	0,00	0,00	0,00

Abb.19: Darstellung der Expression von ELBT in verschiedenen Geweben im Säulendiagramm. Der relative Expressionslevel bezieht sich auf den CT-Wert der Brust-Probe. Es zeigt sich eine spezifische Expression in Leber, Brust und Hoden.

73

3.3.2.5 Die RNA in-situ Hybridisierung zeigte die Expression von ELBT in Brustepithelzellen und in der Haut

Die quantitativen Expressionsexperimente ergaben Aufschluss über die differenzielle Expression von ELBT zwischen dem normalem Epithel und den daraus entstehenden Tumoren des Brustgewebes. Mittels der RNA in-situ Hybridisierung wurde die Expession von ELBT in Gewebeschnitten visualisiert. Durch diese qualitative Expressionsstudie sollte die Transkriptionsaktivität des ELBT-Gens distinkten Zellpopulationen zugeordnet werden und die Expressionsverhältnisse der bisherigen Experimente bestätigen. Der Nachweis der ELBT-Expression erfolgte auf Paraffinschnitten von Normalgeweben und Tumoren der Brust, desweiteren auf Gewebe-Arrays mit Paraffinschnitten von unterschiedlichen Organen und Tumoren. Die ELBT-spezifischen Sonden wurden durch Linearisierung des Klons H25327 und in-vitro Transkription von 1µg linearisierter DNA präpariert (Abb.20).

Abb.20: Fragmente der Antisense (A)- und Sense (S)-Sondenpräparation von ELBT (Klon H25327) nach der Linearisierung und der in-vitro Transkription (IVT).

Die DIG-markierten Antisense- und Sense-RNA-Sonden waren etwa 1kb lang und wurden für die Hybridisierung der Gewebeschnitte in einer Konzentration von 2,5ng/µl eingesetzt. Die Visualisierung der an die zelluläre RNA gebundenen Sonde erfolgte nach der Inkubation mit dem Farbstoff BM-Purple durch ein blau-violettes Präzipitat. Präparate, die mit der Antisense-RNA-Sonde von ELBT hybridisiert wurden, zeigten im Falle der Expression des Gens nach drei bis vier Tagen Färbung bei 4°C einen Farbniederschlag. Die Gewebeschnitte, die zur Kontrolle mit der Sense-RNA-Sonde von ELBT hybridisiert wurden, waren negativ. Die rosa Gegenfärbung des gesamten

74

75

Abb.21: Expression von ELBT im Drüsenepithel der Brust. Die beiden Ausschnitte in der oberen Reihe zeigen die Expressionssignale nach der Antisense-Sonden-Hybridisierung visualisiert durch den blauen Niederschlag von BM Purple. Die mittleren äquivalenten Auschnitte aus dem Präparat, hybridisiert mit der Sense-Sonde, stellen die Negativkontrolle des Experimentes dar. In der unteren Reihe sind die Gewebeareale zur histologischen Beurteilung nach Hämalaun-Eosin-Färbung dargestellt. In der linken Spalte ist ein Lobulus in der 200fachen mikroskopischen Vergrößerung gezeigt, in der rechten Spalte ein Ausschnitt der Epithelzellen (Pfeile) in 400facher Vergrößerung.

76

Abb.22: Expression von ELBT in verschiedenen Tumoren. Im Brusttumor (IDC) konnte keine Expression von IDC nachgewiesen werden (linke Bildreihe). Eine schwache Expression konnte in Zellen des Leberkarzinoms detektiert werden (rechte Bildreihe).

77

Abb.23: Expression von ELBT in Hautanteilen des Brustgewebe-Präparates. Es zeigt sich in der oberen Reihe ein sehr spezifisches Signal in den Hautschichten Stratum granulosum und Stratum lucidum an der Grenze zur Stratum corneum (Pfeile).

78

Abb.24: Expression von ELBT in den sekretorischen Zellen von Schweißdrüsen (Pfeile) in der Haut. In der linken Bilderspalte ist die Schweißdrüse tiefer im Gewebe angeschnitten, in der rechten Bilderspalte ist die positive Schweißdrüse direkt unter der Epidermis lokalisiert.

79

3.3.2.6 Transkriptanalyse und genomische Struktur von ELBT

Das durch den in-silico Ansatz identifizierte Gen ELBT ergab nach der Assemblierung der ESTs durch AUTEX eine cDNA-Länge von 2408 Basenpaaren. Die Transkriptlänge konnte in den Northernblot-Experimenten bestätigt werden, Spleissvarianten wurden nicht identifiziert. Der größte offene Leserahmen betrug 1164bp und ergab ein mögliches translatiertes Protein von 388 Aminosäuren. Zur Verifizierung der Sequenz wurden verschiedene Klone aus dem Assembly sequenziert, die zudem als Sonde für die Expressionsexperimente dienten. Das 5’-Ende des Gens zeigte innerhalb der assemblierten ESTs Sequenzvariationen, die nicht von öffentlichen Klonen abgedeckt waren. Daher wurde eine RACE-PCR mit einem ELBT-spezifischen 3’-Primer durchgeführt, das amplifizierte PCR-Fragment von ca. 550bp kloniert und sequenziert (Abb.25). Mit der gesicherten Sequenzinformation wurde nahezu das gesamte Transkript (P1: 1,4kb; P2: 2,3kb) einschließlich des kodierenden Bereiches amplifiziert, kloniert und sequenziert.

Abb.25: Ergebnis der RACE-PCR zur Verifizierung des 5’-Endes (R1) und der Amplifikation von ELBT-Fragmenten (P1, P2) zur Klonierung der kodierenden Sequenz.

Um die genomische Struktur des Gens zu ermitteln, wurde die cDNA-Sequenz gegen die humane genomische Sequenzdatenbank abgeglichen. Dabei wurden zwei sich überlappende BAC-Sequenzen (AP000649; AC021221) identifiziert, die zusammen assembliert die gesamte genomische Sequenz von ELBT abdeckten (Abb.26). Die BACs kartierten gemäß der annotierten Sequenzdatenbank in die chromosomale

80

Abb.26: Chromosomale Lokalisation und genomische Struktur von ELBT. Oben ist die physikalische Lokalisation des Gens in 11q13.5 angegeben (A.). Das Gen ELBT wird von den BACs AP000649 und AC021221 der genomischen Sequenzdatenbank UCSC abgedeckt (B.). Innerhalb der Region liegt ELBT zwischen den Genen FLJ22644 und UVRAG (C.). Das Gen besteht aus 8 Exons (Kästen) mit einer Transkriptlänge von insgesamt 2408bp und umspannt etwa 30kb (D.).

Der aktuellste Datenbankabgleich (Oktober 2001) ergab Sequenzübereinstimmungen zum Unigene-Cluster Hs.334305 mit den Einträgen ’’GS1999full’’ (gi14211870) und ’’Diacylglycerol acyltransferase 2’’ (DGAT2, gi15099952). DGAT2 codiert ein Protein von 387aa und ist mit einer geringen Abweichung von 4bp des offenen Leserahmens identisch zu ELBT (translatierte Sequenz siehe Anhang G.4).

81

3.3.2.7 Das Protein ELBT ist eine putative Acyltransferase

Die Zusammenstellung einer potenziellen ELBT-Proteinfamilie beruhte auf den Protein-Datenbank-Vergleich (nr, NCBI) des humanen ELBT mit 388 Aminosäuren (Stand 1.Juli 2001). Es konnten insgesamt 18 putative Proteine der ELBT-Familie mit einem vorgegebenen Erwartungswert (E>4e^-5) zugeordnet werden (Abb.27.1/.2). Die Ähnlichkeit zwischen der humanen und der Maus-Sequenz (gi12832432) betrug auf der Proteinebene 95%. Die weiteren putativen Proteine unbekannter Funktion wurden bei unterschiedlichen Organismen gefunden, wie beispielweise Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, Arabidopsis thaliana, Saccharomyces cerevisiae oder Mycobacterium tuberculosis, was auf eine hohe Konservierung dieser Proteinfamilie hindeutete. Innerhalb der Proteinsequenz bilden die Aminosäuren 73-95 eine Transmembran-Domäne (TMHMM, Version 2.0).

Der erste Hinweis auf eine Acyltransferase-Funktion von ELBT erbrachte nach der Datenbanksuche (E=4e^-4) die Identifizierung eines hypothetischen Proteins Mycobakterium tuberculosis (gi7476966). Dieses Protein wurde als Acyltransferase im Pfam64 Modell identifiziert (E=2,1e^-27). Um dieses Ergebnis zu bestätigen wurde mit der ELBT-Proteinsequenz eine iterative PSIBLAST-Suche gegen die Proteindatenbank (nr) durchgeführt und alle Proteine über dem vorgegebenen Erwartungswert (E>1e^-5) eingesammelt. Nach vier PSIBLAST-Runden wurden neben den Mitgliedern der potenziellen ELBT-Proteinfamilie eine gut annotierte 1-Acyl-SN-Glycerol-3-Phosphat Acyltransferase (1-AGPAT) von Borrelia Burgdorferi (gi3914378) mit signifikantem Erwartungswert (E=1e^-4) identifiziert. Die reziproke PSIBLAST-Suche mit 1-AGPAT führte neben der Identifizierung von 230 putativen 1-AGPAT-ähnlichen Acyltransferasen wiederum zum oben genannten Protein (gi7476966) von M. tuberculosis, das als mögliche Verbindung zur ELBT-Familie gesehen wurde. Um dies zu bestätigen, wurde ein erneuter PSIBLAST (E>4e^-5) mit diesem Protein als Matrize durchgeführt. Neben einigen Mitgliedern der ELBT-Familie (beispielsweise gi7304166 von Drosophila melanogaster und gi6324819 von Saccharomyces cerevisiae) wurden auch Mitglieder der 1-AGPAT-Proteinfamilie (beispielsweise gi7477100 von Mycobacterium tuberculosis, gi7479681 von Streptomyces coelicolor) identifiziert und damit eine Verbindung zwischen den beiden Proteinfamilien gezeigt.

82

Abb.27.1: 1. Abschnitt des Sequenzvergleichs der ELBT-Proteinfamilie.

83

Abb.27.2: 2. Abschnitt des Sequenzvergleichs der ELBT-Proteinfamilie.

84

Neuste Literaturhinweise über ELBT (Stand Oktober 2001):

ELBT wurde als Gen DGAT2 einer Acyl CoA:Diacylglycerol Acyltransferase (DGAT) beschrieben und einer neuen DGAT-Genfamilie zugeordnet (Cases et al., 2001). Identifiziert wurde DGAT2 über die Homologie zu DGAT aus dem Pilz Mortierella rammaniana (Lardizabal et al., 2001). DGAT2, das keine Homologien zu DGAT1 zeigt, wurde in Insektenzellen exprimiert und zeigte eine Stimulation der Triglycerin-Synthese. Dadurch wurde die vorangegangene Hypothese von ELBT als Acyltransferase und die zusammengefasste neue Proteinfamilie bestätigt. Die in der Publikation beschriebenen weiteren humanen und murinen Mitglieder wurden in dieser Arbeit nicht identifiziert. Die in der TMHMM-Analyse vorhergesagte Transmembrandomäne wurde auch in der oben genannten Referenz beschrieben.

85

3.4 Identifizierung von neuen Kandidatengenen in 11q12-q23 mittels der positionalen Strategie

Im genomweiten Ansatz der in-silico Expressionsanalyse mit den schon beschriebenen Genen aus der chromosomalen Region 11q wurden nach dem elektronischen Northern differenziell exprimierte Gene chromosomal kartiert. Im Gegensatz dazu sollten bei der positionalen Strategie möglichst viele Gene aus der Region 11q über AUTEX identifiziert und assembliert werden, um sie anschließend im elektronischen Northern zu analysieren. Für diese systematische in-silico Expressionsanalyse von Transkripten aus der chromosomalen Region 11q12-q23 wurden 968 STS-Markern zwischen dem proximalen Marker RH13699 in 11q12 und dem distalen Marker RH27416 in 11q23 über AUTEX verlängert und im elektronischen Northern ausgewertet. Die Sequenzen von 921 STS-Marker aus der ’’GenMap99’’-Datenbank konnten durch AUTEX mit Hilfe der EST-Datenbanken verlängert werden. Nach der Eliminierung von identischen Sequenzen resultierte ein nicht-redundantes Set von 563 assemblierten Sequenzen, die jeweils putative Gene aus dieser chromosomalen Region repräsentieren. Die in-silico Expressionsanalyse durch den elektronischen Northern ergab 30 differenziell exprimierte Gene in den Brustgewebe-Bibliotheken (Tumor- gegen Normalgewebe) unter Berücksichtigung der definierten Signifikanzschwelle (P-Wert<0,05). Von den 30 im Brustgewebe differenziell exprimierten Genen waren verglichen mit dem Brust-Normalgewebe 19 im Tumor überexprimiert und 11 im Tumor unterexprimiert (Tab.19). Die meisten der identifizierten Gene stellten bekannte Gene dar. Einige der im genomweiten Ansatz identifizierten Gene wie ELBT, Frizzled 4, CLNS1A oder YAP65 aus 11q12-q23 wurden auch in diesem positionalen Ansatz gefunden. Den in-silico differenziellen Genen gegenübergestellt wurden 21 LOH-Marker und 9 Amplifikations-Marker (Gene), die innerhalb dieser chromosomalen Region 11q12-q23 lokalisiert waren und für die in primären Brusttumoren entsprechende Aberrationen beschrieben worden sind (Tab.19). Zusammen mit den 30 in-silico differenziellen Gene wurden die LOH- und Amplifikations-Marker physikalisch neu kartiert, wobei die annotierte genomische Sequenzdatenbank der UCSC (Stand Juni 2001) verwendet wurde. Die angegebenen physikalischen Bereiche (Position in Mb) bezogen sich auf die Ausdehnung der BAC-Sequenzen, auf denen die Gene und STS-Marker lokalisiert wurden. Dadurch konnten neben der Abfolge auch die ungefähren Abstände der potenziell tumorassoziierten Gene und aberranten Loci wiedergegeben werden.

86

Tab. 19: Auflistung der in-silico Kandidatengene und beschriebenen aberranten STS-Marker für Brusttumore von proximal 11q12 nach distal 11q23 mit Angaben der zytogenetischen Bande und der physikalischen Position auf dem Chromosomenabschnitt in Megabasen (MB). Die Spalte Expression/ Aberration zeigt die charakteristischen Eigenschaften der differenziell exprimierten Gene und beschriebenen STS-Marker in den Brusttumoren (rotes Feld, auf: überexprimiert; grünes Feld, ab: unterexprimiert; rote Schrift, Amp: amplifiziert; grüne Schrift, LOH: Verlust der Hetreozygotie) mit Angaben der Ergebnisse des elektronischen Northern (P-Wert<0,05) und der Aberrationsstudien (verschlüsselte Referenz, siehe Anhang G.2).

Nr.	Gen / STS-Marker	Expression /Aberration	Kartierung		eNORTHERN in Brust			Aberrationen in primären Brusttumoren
			Bande	Position in Mb	Hits N	Hits T	Ratio T/N	Ratio	Fälle	Referenzen
1	Lipophilin B	auf	11q12.1	54,40 - 54,70	14	24	2,86	-	-	-
2	Mammaglobin 1	auf	11q12.1	54,40 - 54,70	51	98	3,13	-	-	-
3	Desmoyokin	ab	11q12.1	54,90 - 55,20	60	15	0,45	-	-	-
4	Transcobalamin 1	auf	11q12.3	60,70 - 60,90	1	6	11,11	-	-	-
5	CD 20 like precursor	ab	11q12.3	61,00 - 61,30	14	1	0,12	-	-	-
6	Lipophilin A	auf	11q13.1	63,00 - 63,30	0	4	n.d.	-	-	-
7	Nuclear RNA export factor 1	ab	11q13.1	64,10 - 64,50	18	3	0,30	-	-	-
8	Solute carrier family 3, member 2	auf	11q13.1	64,10 - 64,50	4	14	6,25	-	-	-
9	Retinoic acid receptor responder 3	auf	11q13.1	65,20 - 65,60	10	21	3,70	-	-	-
10	Cytochrome c oxidase subunit VIII	auf	11q13.1	65,70 - 66,00	2	7	6,25	-	-	-
11	FLJ22711	auf	11q13.1	66,30 - 66,80	1	6	11,11	-	-	-
12	Fau	auf	11q13.2	67,30 - 67,60	4	11	5,00	-	-	-
13	Heat shock protein 90	ab	11q13.3	67,70 - 68,00	232	102	0,72	-	-	-
14	Alpha gene sequence	ab	11q13.3	67,70 - 68,00	105	35	0,60	-	-	-
15	Protein kinase MLK-3	auf	11q13.3	67,90 - 68,10	1	6	11,11	-	-	-
16	Non-muscle type cofilin 1	auf	11q13.3	68,30 - 68,50	9	19	3,70	-	-	-
17	FLJ21749	auf	11q13.3	71,40 - 71,70	0	5	n.d.	-	-	-
18	FLJ20853	auf	11q13.3	71,40 - 71,70	1	5	9,09	-	-	-
19	Glutathione S-transferase pi 1	Amp	11q13.4	71,60 - 71,90	-	-	-	5%	13 / 239	1
20	Deleted in oral cancer-related 1	auf	11q13.4	71,60 - 71,90	3	9	5,26	-	-	-
21	Aldehyde dehydrogenase 8	auf	11q13.4	71,60 - 71,90	5	14	5,00	-	-	-
22	D11S97	Amp	11q13.4	73,40 - 73,60	-	-	-	17%	86 / 514	1, 2
23	Cyclin D1 (PRAD1)	Amp	11q13.4	73,90 - 74,20	-	-	-	15%	373 / 2451	1 - 8
24	CCND1 / FGF3	Amp	11q13.4	73,90 - 74,20	-	-	-	16%	317 / 1993	9 - 12
25	Fibroblast growth factor 4	Amp	11q13.4	73,90 - 74,20	-	-	-	14%	231 / 1632	1, 4, 8, 13 - 16
26	FGF4 / FGF3	Amp	11q13.4	73,90 - 75,60	-	-	-	17%	49 / 292	17
27	Fibroblast growth factor 3	Amp	11q13.4	75,40 - 75,60	-	-	-	14%	447 / 3311	1, 4 - 8, 13, 15, 16, 18 - 25
28	Fibroblast growth factor 3	LOH	11q13.4	75,40 - 75,60	-	-	-	22%	32 / 143	23, 26, 27
29	Amplaxin	Amp	11q13.4	74,80 - 75,10	-	-	-	11%	146 / 1350	1, 12
30	Protein phosphatase methylesterase-1	auf	11q13.4	78,90 - 79,20	1	5	9,09	-	-	-
31	ELBT	ab	11q13.5	80,50 - 80,80	24	3	0,22	-	-	-
32	Death associated protein 4	ab	11q13.5	81,10 - 81,40	10	0	n.d.	-	-	-
33	GARP	Amp	11q13.5	81,30 - 81,60	-	-	-	12%	66 / 544	1, 7
34	Chloride channel regulatory protein 1A	auf	11q14.1	82,50 - 82,80	18	22	2,17	-	-	-
35	D11S901	LOH	11q14.1	87,10 - 87,40	-	-	-	30%	16 / 54	28, 29
36	Unbekannt	auf	11q14.1	88,60 - 88,80	0	3	n.d.	-	-	-
37	Clathrin assembly protein	ab	11q14.2	91,70 - 92,00	25	4	0,29	-	-	-
38	Frizzled 4	ab	11q14.2	92,60 - 92,80	14	1	0,12	-	-	-
39	D11S4175	LOH	11q14.3	96,40 - 96,60	-	-	-	34%	24 / 70	30
40	D11S1342	LOH	11q14.3	96,60 - 96,80	-	-	-	40%	4 / 10	31
41	D11S873	LOH	11q14.3	98,60 - 98,90	-	-	-	46%	5 / 11	29
42	D11S29	LOH	11q14.3	98,70 - 100,00	-	-	-	38%	60 / 160	31, 32
43	Hypothetical protein HSPC148	auf	11q21	101,60 - 102,00	0	3	n.d.	-	-	-
44	D11S35	LOH	11q22.1	108,60 - 108,90	-	-	-	39%	64 / 165	26, 27, 28, 31
45	D11S940	LOH	11q22.1	109,30 - 109,50	-	-	-	31%	11 / 36	31
46	Yes-associated protein	ab	11q22.1	109,90 - 110,20	26	6	0,41	-	-	-
47	Matrix metalloproteinase 7	ab	11q22.2	110,30 - 110,60	18	3	0,30	-	-	-
48	D11S2000	LOH	11q22.3	113,80 - 114,00	-	-	-	43%	3 / 7	31
49	D11S1325	LOH	11q22.3	113,90 - 114,10	-	-	-	33%	30 / 91	33
50	D11S1778	LOH	11q22.3	116,40 - 116,70	-	-	-	37%	294 / 791	33, 34
51	D11S1294	LOH	11q22.3	116,50 - 116,70	-	-	-	43%	258 / 607	33, 34
52	D11S927	LOH	11q22.3	118,60 - 118,90	-	-	-	39%	185 / 472	27, 33, 34
53	D11S1391	LOH	11q23.1	119,10 - 119,30	-	-	-	37%	38 / 97	36, 37
54	D11S1347	LOH	11q23.1	120,80 - 121,20	-	-	-	37%	46 / 123	33
55	D11S897	LOH	11q23.1	121,60 - 121,80	-	-	-	36%	9 / 25	29, 31
56	D11S528	LOH	11q23.2	123,30 - 123,60	-	-	-	38%	16 / 42	26, 31
57	Apolipoprotein C-III	LOH	11q23.3	126,20 - 126,30	-	-	-	44%	231 / 529	28, 33, 38, 39
58	D11S976	LOH	11q23.3	127,50 - 127,70	-	-	-	24%	43 / 182	32
59	CD3D antigen	LOH	11q23.3	127,80 - 128,10	-	-	-	27%	15 / 56	29, 31
60	D11S925	LOH	11q23.3	131,10 - 131,30	-	-	-	31%	27 / 87	27

87

Abb.28: Vergleich der Lokalisation beschriebener aberranter Loci (grüne quergestreifte Balken = LOH-Region; rote quergestreifte Balken = amplifizierte Region) und der über den positionalen Ansatz identifizierten in-silico Kandidatengene (grüne Balken= im Tumor herunterreguliert; rote Balken= in Tumor hochreguliert). Die Kandidatengene bzw. Nummern entsprechen den Angaben der Tab.19. Die Gene MEN1, CCND1, FGF3, FGF4, EMS1 und ATM stellen schon beschriebene tumorassoziierte Gene dar.

Im proximalen Abschnitt 11q12.1-q13.3 wurden mehrheitlich Gene identifiziert, die sich im elektronischen Northern als überexprimiert in Brusttumoren zeigten. Mit Lipophilin A, Lipophilin B und Mammaglobin 1 (MGB1) gehören drei dieser Gene der Uteroglobin-Familie an, wobei für MGB1 eine Überexpression in Brusttumoren bereits beschrieben

88

89

3.5 Beschreibung der Kandidatengene in 1q32-q41

Aus dem genomweiten Ansatz wurden, neben der Region 11q12-q23, die differenziell exprimierten Gene aus der Region 1q32-q41 weiter untersucht. Aufgrund der schlechteren genomischen Charakterisierung der Region 1q und der geringen Vergleichsdaten aus LOH- und Amplifikationsstudien über die Tumore erfolgte die für die Region 11q durchgeführte positionale Strategie nicht für die Region 1q.

3.5.1 Validierung aller in-silico Kandidatengene in 1q32-q41

In der chromosomalen Region 1q32-q41 konnten fünf Gene identifiziert werden, die nach der in-silico Expressionsanalyse in Brust- oder Ovarialtumoren differenziell exprimiert waren. Vier Gene zeigten nach der Annotation durch die Nukleinsäure- und Protein-Datenbanken Identitäten zu bereits beschriebenen Genen (Tab.20).

Tab. 20: Beschreibung der in-silico differenziellen Gene aus der chromosomalen Region 1q32.q41. Die Angabe der Signifikanz (E-Wert) bezieht sich auf das Ergebnis des Vergleichs der assemblierten Sequenz mit der Nukleinsäure-Datenbank (BLASTN).

Gene in 1q32-q41	Gene Abkürzung	Genbank-eintrag	Funktion	Referenz
Protein phosphatase 2, regulatory subunit B (B56), alpha isoform	PPP2R5A	gi5453949	Interaktion mit APC; inhibitiert ß-catenin über wnt-Signalweg	McCright et al., 1996; Seeling et al., 1999
ETS-related transcription factor ERT / ELF3	ERT / ELF3	gi2338755	Transkriptionsfaktor der ETS-Familie; epithelspezifisch	Brembeck et al., 2000; Chang et al., 2000
Homologie zu: RAT mRNA for calpain	putatives Calpain	gi441199	Calpaine: Ca2+ -aktivierte Protease reguliert Ca2+-abhängige Signalwege des Zellzyklus	Sato et al., 2001
Decay accelerating factor DAF	DAF / CD55	gi181464	Hemmung des Komplement-systems; Interaktion mit CD97	Aust et al., 1997; Hamann et al., 1998
Hypothetical protein HSPC186	HSPC186	gi7106761	unbekannt

Eines der identifizierten Gene zeigte signifikante Ähnlichkeiten zu einem Calpain der Ratte (gi441199) und wurde in dieser Arbeit als putatives Calpain bezeichnet. Die allgemeinen Angaben über die Funktion bezieht sich dabei auf die Proteinfamilie der Calpaine, zu der das putative Calpain ein potenziell neues Mitglied darstellt. Für die Gene PPP2R5A, ELF3 und DAF lagen Literaturhinweise vor, die aufgrund ihrer Funktion für einen möglichen Einfluss in die Karzinogenese sprechen. Zum Gen HSPC186 gab es ausser dem Sequenzeintrag in der Datenbank keine weiteren Informationen zur möglichen Funktion des Proteins.

90

Tab. 21: Ergebnisse der chromosomalen Kartierung der Gene in 1q32-q41 über Radiation Hybrid Mapping (RHdb) oder ePCR mit Angabe der Wahrscheinlichkeit (LOD_Score), des statistisch ermittelten Abstandes (in cRs) und der Angabe der zytogenetischen Bande nach der genomischen Datenbank (GDB) bzw. der aktuellen genomischen Sequenzdatenbank (UCSC). Die Größe des Transkriptes ergab sich aus dem Northernblot (Abb.30).

Gene in 1q32-q41	Assembly in bp	Transkript in bp	Protein in aa	Chromosomale Kartierung
				RHdb / ePCR	LOD_Score	Abstand in cRs	GDB (08/1998)	UCSC (06/2001)
PPP2R5A	3121	3,1	486	WI-7329	11.5	5.4	1q32.2-q32.3	1q32.3
ERT / ELF3	2657	2,5	371	RH75923	-	-	1q32.2	1q32.1
putatives Calpain	1499	7,5	n.b.	SHGC-3992	11.5	5.4	1q41	n.b.
DAF / CD55	2367	2,2 (SV)	381	SHGC-11228	1000	0	1q32.2	1q32.2
HSPC186	1571	1,5	183	SHGC-76170	9.4	0	1q32.1	1q32.1

Abb.29: Cytogenetische Lokalisation der Kandidatengene in 1q32-q41. Die in-silico differenziell exprimierten Genen (rechte Spalte) wurden entsprechend der annotierten Genomdatenbank (UCSC) chromosomal kartiert. Die getrennt dargestellten Gene ELF3 und MDM4 wurden in verschiedenen Tumoren als häufig amplifiziert beschrieben (Tymms et al., 1997; Riemenschneider et al., 1999).

91

Tab. 22: Ergebnisse des elektronischen Northern der Gene in 1q32-q41 bezüglich der differenziellen Expression in Brust- und Ovargewebe.

Gene in 1q32-q41	Gewebetyp	Normalgewebe		Tumorgewebe		Verhältnis T/N	P-Wert á	Signifikanz in %
		Treffer	Bibliotheks-Größe	Treffer	Bibliotheks-Größe
PPP2R5A	Brust	7	120725	10	67582	2.56	0.0732	92.7
	Ovar	4	33687	0	41736	-	0.0394	96.1
ERT / ELF3	Brust	10	120725	23	67582	3.85	0.00023	100.0
	Ovar	3	33687	11	41736	2.94	0.107	89.3
Putatives Calpain	Brust	2	120725	6	67582	5.00	0.0598	94.0
	Ovar	0	33687	6	41736	-	0.0369	96.3
DAF / CD55	Brust	6	120725	9	67582	2.50	0.107	89.3
	Ovar	0	33687	5	41736	-	0.0697	93.0
HSPC186	Brust	10	120725	15	67582	2.50	0.0366	96.3
	Ovar	0	33687	2	41736	-	1	0.0