Christian Bögi:
Endokrin wirksame Stoffe (endocrine disruptors) und deren Wirkungen auf die Sexualdifferenzierung bei dem Amphib Xenopus laevis:Untersuchungen in vitro, in vivo und im Freiland |
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[Seite 1↓]Endokrin wirksame Stoffe (endocrine disruptors) und deren Wirkungen auf die Sexualdifferenzierung bei dem Amphib Xenopus laevis:
Untersuchungen in vitro, in vivo und im Freiland
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie
eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin
von
Diplom Biologe Christian
Bögi
geboren am 12. März 1971 in Karlsruhe
Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jürgen Mlynek
Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Michael Linscheid
Gutachter:
1. Prof. Dr. Werner Kloas
2. Prof. Dr. Andreas Elepfandt
3. Prof. Dr. Jörg Oehlmann
Tag der mündlichen Prüfung:
26. Februar 2003
Zusammenfassung
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Erweiterung des etablierten Stu-dienmodells Xenopus laevis zur Untersuchung der Wirkung von endocrine disruptors auf die Reproduktionsbiologie von Amphibien.
Um einen Einblick in die grundlegenden Mechanismen der sexuellen Differenzierung von Amphibien zu gewinnen, wurden die Konzentrationen bestimmt, mit denen androgene und estrogene Sexualsteroide während der larvalen Entwicklung in verschiedenen Stadien von Xenopus vorliegen. Parallel wurde das Auftreten der korrespondierenden Rezeptoren im Verlauf der Entwicklung untersucht, über welche die hormonelle Wirkung vermittelt wird. Auf der Basis der gewonnenen Erkenntnisse konnte eine neue Hypothese zur sexuellen Differenzierung von Amphibien entwickelt und vorgestellt werden. Sie stellt das Enzym 5α-Reduktase, das die Umwandlung von Testosteron in das potentere und nicht weiter aromatisierbare Androgen Dihydrotestosteron (DHT) bewerkstelligt, in den Mittelpunkt des Prozesses der Geschlechtsdifferenzierung. Abhängig von der genetisch bedingten Expression dieses Enzyms kommt es zu einem höheren oder niedrigeren Auftreten des DHT und damit zu Unterschieden im Verhältnis von DHT zu Estradiol (E2). Der Charakter dieses Verhältnisses scheint der entscheidende Auslöser für die Entwicklung eines weiblichen oder männlichen Phänotyps zu sein.
In einem zweiten, anwendungsorientierten Teil wurde untersucht, in wie weit die bislang auf Laboruntersuchungen beschränkte Arbeit mit X. laevis auf Feldstudien erweiterbar ist und ob sich auf diese Weise gewonnene Daten auf die Situation heimischer Amphibien übertragen lassen. Parallele Expositionen des Krallenfrosches einerseits und des Grasfrosches (Rana temporaria) andererseits gegenüber realen Medien unter Freilandbedingungen bestätigten die hervorragende Eignung des Studienmodells X.laevis zur Beurteilung endokriner Belastungssituationen. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass sich durch die Verwendung von Festphasenextrakten die endokrinen Wirkungen komplexer Matrizes unter standardisierten Laborbedingungen charakterisieren lassen. Rezeptorbindungsstudien sowie Untersuchungen zur Genexpression spezifischer Marker, histologische Betrachtungen von Gonadengewebe und die Bestimmung von Geschlechterverhältnissen ermöglichten Aussagen auf vielfältigen Nachweisebenen. Auf diese Weise konnte das Potenzial, mit dem Proben jeder Art, sowohl durch kurz- als auch durch langfristige Exposition, adverse Effekte auf das amphibische Hormonsystem hervorrufen können, umfassend und differenziert analysiert werden.
Eigene Schlagworte:
Amphibien,
Xenopus laevis,
endokrine Disruption,
Sexualdifferenzierung,
Umwelt
Abstract
The presented work aims to contribute to the various opportunities of studying the effects of endocrine disruption on sexual differentiation in amphibians provided by the well established model Xenopus laevis.
In order to gain insight into the basic mechanisms underlying the sexual differentiation in amphibians, the concentrations of androgen and estrogen sexual steroids during several stages of the larval development of Xenopus were determined. In parallel, the ocurrence of the corresponding receptors, which mediate the effects of the respective hormones, was observed.
Based on the results of the studies described, a new hypothesis regarding sexual differentiation in amphibians is presented, which assignes the enzyme 5α-reductase as the central element of sexual development. This enzyme converts the androgen testosterone into dihydrotestosterone, which can not be aromatized into estradiol. Depending on the genetic sex of the indivual, genexpression of 5α-reductase may differ and therefore lead to a characteristic ratio of androgens and estrogens. We suggest, that this ratio might be the essential trigger for amphibians to develop into a male or a female.
A second part aimed to enlarge the Xenopus model to the use in field studies and to proof the transferability of such data to the situation of endemic amphibians. Exposure in parallel of Xenopus on one hand and the green frog Rana temporaria on the other to the effluent of a bavarian wastewater treatment plant revealed the exceeding suitability of the model to asess the endocrine charge of the environment. Furthermore, the use of solid phase extracts derived from natural samples allowed the characterization of the respective endocrine potential under standardized laboratory conditions. Rezeptor binding studies, detection of genexpression of specific biomarkers, histological examination of gonadal tissue and the determination of sex ratios provided the evaluation of effects on several levels of investigation. By this means the Xenopus model offers the opportunity to assess the ability of any kind of sample to cause endocrine impacts on amphibians after short time as well as after long time exposure in a broad and at the same time differentiated way.
Keywords:
Amphibians,
Xenopus laevis,
endocrine disruption,
sexual differentiation,
environment
Inhaltsverzeichnis
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1
Einleitung
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1.1 Endocrine Disruption
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1.2 Amphibien als Studienmodell
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1.3 Ziele der Arbeit
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2
Material & Methoden
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2.1 Tiere
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2.1.1
Zucht
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2.1.1.1 Fertilisation in vivo
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2.1.1.2 Fertilisation in vitro
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2.1.1.3 Hälterung von Kaulquappen und juvenilen Tieren
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2.1.2 Versuchsaufbau
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2.1.2.1 Exposition während der Larvalentwicklung
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2.1.2.2 Exposition während und nach der Larvalentwicklung
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2.1.2.3 Kurzzeitexposition juveniler Tiere
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2.1.2.4
Biomonitoring Starnberg
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2.2
Geschlechtsbestimmung
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2.3 Radioimmunoassay (RIA)
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2.4 Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction
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2.4.1 RNA-Isolierung
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2.4.2 Reverse Transkription (RT)
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2.4.3 Polymerase Chain Reaction (PCR)
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2.4.4 Gelelektrophorese
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2.4.5 Sequenzierung
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2.5
Radio Rezeptor Assay (RARA)
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2.6 Extraktion
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2.7
Statistik
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3
Ergebnisse
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3.1 Untersuchungen zur Larvalentwicklung von Xenopus laevis
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3.1.1 Steroidgehalt
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3.1.2 Expression der mRNA von Estrogen- bzw. Androgenrezeptor
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3.1.3
Sexualdifferenzierung in vivo
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3.2 Langzeitstudie
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3.2.1 Geschlechterverhältnisse
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3.2.2 Mortalität und begleitende Beobachtungen
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3.2.3 Histologie
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3.3
Biomonitoring Starnberg
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3.3.1 Exposition vor Ort
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3.3.2 Vergleichsstudien mit Extrakten unter Laborbedingungen
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3.3.2.1 Geschlechterverhältnisse
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3.3.2.2
Biomarkerexpression
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3.3.2.3 Bindungspotenzial an den Estrogenrezeptor
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4
Diskussion
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4.1 Grundlagen der Geschlechtsdifferenzierung von Xenopus laevis
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4.2 Effekte langfristiger Behandlung mit EDs
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4.3 Biomonitoring Starnberg
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4.3.1 Exposition vor Ort
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4.3.2 Untersuchung von Extrakten in Bioassays
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4.4 Ausblick
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Danksagung
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Literatur
Tabellen
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Tab. 2.1:Volumina der Einzelbestandteile eines PCR-Ansatzes für ein Reaktionsgefäß bei Amplifikation verschiedener Biomarker (EF = Elongations-faktor 1α, RBP = retinol binding protein, VG = Vitellogenin, ER = Estrogen Rezeptor, AR = Androgen Rezeptor)
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Tab. 2.2:Ablauf einer PCR hinsichtlich Temperaturfolge und Dauer der Einzelschritte zur Amplifikation verschiedener Biomarker (EF = Elon-gationsfaktor 1α, RBP = retinol binding protein, VG = Vitellogenin, ER = Estrogen Rezeptor, AR = Androgen Rezeptor)
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Tab. 3.1:Konzentrationen an Nonylphenol (NP), Oktylphenol (OP), 17β-Estradiol (E2), Estron (ES) und Ethinylestradiol (EE2) in Würm und Kläranlagenauslauf während der Vor-Ort-Exposition von X. laevis und R. temporaria in Starnberg [ng/L]. * kennzeichnet die sensitive Phase der Sexualdifferenzierung für die Tiere, ** kennzeichnet den Entnahmezeitpunkt der Proben für RT-PCR und RARA (Quelle: LfW, Bayern)
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Tab. 3.2:Bindungspotenzial von Festphasenextrakten natürlicher Medien an den Estrogenrezeptor, deren Wirkung auf die Sexualdifferenzierung von X. laevis und R. temporaria in Freilandexperimenten untersucht wurde.
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Tab. 3.3:Bindungspotenzial von Festphasenextrakten natürlicher Medien an den Estrogenrezeptor, die innerhalb der vergleichenden Laborstudien zu den Freilanduntersuchungen verwendet wurden.
Bilder
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Abb. 1.1:Schematische Darstellung der Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden-Achse bei weiblichen (A) und männlichen (B) Amphibien. Neben den feedback-Mechanismen zur Regulation der Sexualsteroide und der biologischen Funktionen von Estradiol bzw. Androgenen in der Leber sind die potenziellen Angriffspunkte von endocrine disruptors (I-VI) dargestellt.AR: Androgen Rezeptor, ARE: Androgen responsives Element, ZNS: Zentralnervensystem, E2: 17β-Estradiol, ED: endocrine disruptor, ER: Estrogen Rezeptor, ERE: Estrogen responsives Element, FSH: Follikel stimulierendes Hormon, GnRH: Gonadotropin releasing Hormon, GR: Granulosazelle, IZ: interstielle Zelle, LH: luteinisierendes Hormon, mRNA: messengerRNA, RBP: Retinol binding protein, SBP: Sexualsteroid bindendes Protein, SZ: Sertoli Zelle, T: Testosteron, TH: Theca Zelle, VG: Vitellogenin (nach Kloas 2002, verändert)
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Abb. 3.1:Gehalte an 17β-Estradiol während der Larvalentwicklung von Xenopus laevis in Eiern und Ganzkörperhomogenaten (Mittelwerte ± SD, n = 6) in pg/g Gewebe. Signifikante Unterschiede zwischen den Geschlechtern sind durch Sterne gekennzeichnet (*p < 0,05). Zum Vergleich: 17β-Estradiol-Gehalt im Serum adulter Tiere: ♀ 3,7 ± 0,9; ♂ 0,2 ± 0,0 [ng/mL]
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Abb. 3.2:Gehalte an Androgenen (Testosteron und Dihydrotestosteron) während der Larvalentwicklung von Xenopus laevis in Eiern und Ganzkörperhomogenaten (Mittelwerte ± SD, n = 6) in pg/g Gewebe. Signifikante Unterschiede zwischen den Geschlechtern sind durch Sterne gekennzeichnet (*p < 0,05). Zum Vergleich: Androgen-Gehalt im Serum adulter Tiere: ♀ 6,2 ± 2,3; ♂ 19,8 ± 3,1 [ng/mL]
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Abb. 3.3:Verlauf der Expression von Estrogenrezeptor-mRNA während der Larvalentwicklung von Xenopus laevis in Eiern und Ganzkörperhomogenaten (Mittelwerte ± SD, n=6) in Prozent des größten, detektierten Mittelwertes. Signifikante Unterschiede zwischen den Geschlechtern sind durch Sterne gekennzeichnet (*p < 0,05).
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Abb. 3.4:Verlauf der Expression von Androgenrezeptor-mRNA während der Larvalentwicklung von Xenopus laevis in Eiern und Ganzkörperhomogenaten (Mittelwerte ± SD, n=6) in Prozent des größten, detektierten Mittelwertes.
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Abb. 3.5:
Gonaden juveniler, männlicher (A) und weiblicher (B) Xenopus laevis. Vergrößerung 20-fach, Maßstab entspricht 500µm.
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Abb. 3.6:Beeinflussung der sexuellen Differenzierung von Xenopus laevis durch Behandlung mit Estrogenen (E), Antiestrogenen (AE), Androgenen (An) und Antiandrogenen (AAn) während der larvalen Entwicklung. E2=17β-Estradiol, EE2=Ethinylestradiol, TAM=Tamoxifen, T=Testosteron, MT= Methyltestosteron, DHT=Dihydrotestosteron, DDE=p,p’-DDE, CYP=Cyproteronacetat. Signifikante Unterschiede sind durch Sterne gekennzeichnet (*: p<0,05, ***: p<0,001, Mann-Whitney U-Test)
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Abb. 3.7:Beeinflussung der sexuellen Differenzierung von Xenopus laevis im Rahmen der Langzeitstudie (Expositionsbeginn während der Larvalphase) durch Behandlung mit 17β-Estradiol (E2), Tamoxifen (TAM), Testosteron (T) und Methyltestosteron (MT) und p,p’-DDE (DDE) während der larvalen Entwicklung. Signifikante Unterschiede sind durch Sterne gekennzeichnet (*: p < 0,05, ***: p < 0,001, Mann-Whitney U-Test)
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Abb. 3.8:(A) Juveniles Tier, dessen Körper durch die Behandlung mit 17β-Estradiol (10-7 M), die erst nach Abschluss der Metamorphose begann, stark aufgedunsen ist (B). Durch die Behandlung mit Methyltestosteron (10-8 M) hervorgerufene Dunkelfärbung der Vorderextremitäten von juvenilen Tieren
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Abb. 3.9:Histologische Abbildungen von Ovarien etwa 20 Monate alter Xenopus: (A) unbehandelte Kontrolle, frühe Oocytenstadien, 100x (B) unbehandelte Kontrolle, reifere Oocyten, 100x, (C) Dauerexposition mit E2 10-7 M, 100x (D) Exposition nach Abschluss der Metamorphose mit MT 10-8 M, 100x (E) Exposition nach Abschluss der Metamorphose mit TAM 10-7 M, 100x (F) Dauerexposition mit TAM 10-7 M, 100x, Maßstäbe entsprechen 20 µm.
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Abb. 3.10:Histologische Abbildungen von Testes etwa 20 Monate alter Xenopus: (A) unbehandelte Kontrolle, 100x (B) unbehandelte Kontrolle, 400x (C) Dauerexposition mit MT 10-8 M, 100x (D) Dauerexposition mit MT 10-8 M, 400x (E) Exposition nach Abschluss der Metamorphose mit E2 10-8 M, 100x (F) Dauerexposition mit T 10-8 M, 400x, Maßstäbe entsprechen: A, C, E: 20 µm, B, D, F: 5 µm
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Abb. 3.11:Histologische Schnitte von Amphibiengonaden (fixiert nach Bouin, HE-gefärbt) zur Bestimmung der Geschlechterverhältnisse im Biomonitoring-Experiment Starnberg: A) Rana weiblich, 400x, B) Rana “Hermaphrodit”, 200x, C) Rana männlich, 400x, D) Xenopus weiblich, 200x, E) Xenopus “Hermaphrodit”, 200x, F) Xenopus männlich, 400x (Quelle: LfW, Bayern), Maßstäbe entsprechen: A, C, F: 5 µm, B, D, E: 10 µm
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Abb. 3.12:Einfluss der Exposition von X. laevis und R. temporaria gegenüber komplexen Matrizes (Würm, Mischungen Abwasser/Würm im Verhältnis 1:12 und 1:2) während der larvalen Entwicklung auf die sexuelle Differenzierung. Zum Vergleich ist der Anteil weiblicher X. laevis aus unbehandelten Kontrollansätzen im Labor angeführt. (Quelle der Daten für R. temporaria: LfW, Bayern)
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Abb. 3.13:Expression von Biomarker-mRNA in der Leber juveniler weiblicher (oben) und männlicher (unten) Xenopus nach Abschluss der larvalen Entwicklung im Biomonitoring-Experiment (Mittelwerte + SD, n = 18). Signifikante Unterschiede sind durch Sterne gekennzeichnet (**: p < 0,01, Mann-Whitney U-Test)
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Abb. 3.14:Kompetitive Verdrängungskurven von [3H]-E2 am Estrogenrezeptor durch E2 (A) und angereicherte lipophile Inhaltsstoffe (B) aus natürlichen Medien (Mittelwerte, n = 2). Die zugehörigen Darstellungen nach logit / log -Umformung (C und D) ermöglichen die Berechnung des Bindungspotentials von Würm und Kläranlagenauslauf in E2 -Äquivalenten (nähere Erläuterungen im Text)
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Abb. 3.15:Beeinflussung der sexuellen Differenzierung von Xenopus laevis durch Behandlung mit SPE-Extrakten von Kaulquappenmedium, Würm und den Abwasser/Würm-Mischungen 1:12 sowie 1:2 während der larvalen Entwicklung. Zum Vergleich wurden parallel zwei Ansätze mit 17β-Estradiol-Behandlung (E2, 10-7 und 10-8 M) als Positivkontrolle mitgeführt. Signifikante Unterschiede sind durch Sterne gekennzeichnet (**: p < 0,01, ***: p < 0,001, Mann-Whitney U-Test)
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Abb. 3.16:Induktion von Biomarker-mRNA in der Leber juveniler weiblicher (oben) und männlicher (unten) Xenopus durch Behandlung mit Festphasenextrakten von Hälterungsmedium, Würm und den Abwasser / Würm-Mischungen 1:12 sowie 1:2 während der larvalen Entwicklung. Zum Vergleich wurden parallel zwei Ansätze mit 17β-Estradiol-Behandlung (E2, 10-7 und 10-8 M) als Positivkontrolle mitgeführt (Mittelwerte + SD, n=4). Signifikante Unterschiede sind durch Sterne gekennzeichnet (*: p<0,05, Mann-Whitney U-Test)
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Abb. 4.1:Hypothetisches Schema der Geschlechtsdifferenzierung von Xenopus laevis, das der 5α-Reduktase eine zentrale Rolle in diesem Prozess zuordnet. Nähere Erläuterungen im Text (E2=17β-Estradiol, T=Testosteron, DHT=Dihydrotestosteron) (nach Bögi et al. 2002, verändert)
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DiML DTD Version 3.0 | Zertifizierter Dokumentenserver der Humboldt-Universität zu Berlin | HTML-Version erstellt am: 30.01.2004 |