Aus der Medizinischen Klinik und Poliklinik
mit Schwerpunkt Kardiologie, Angiologie, Pneumologie
der Medizinischen Fakultät Charité, Campus Mitte
der Humboldt-Universität zu Berlin

DISSERTATION

Etablierung der Rasterkraftmikroskopie an kardiovaskulär relevanten Zellen, Proteinen und Materialien-Ein methodischer Ansatz-

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von


Herrn Christoph Richter
aus Jena

Gutachter:
1. Prof. Dr. med. K. Stangl
2. Prof. Dr. med. H. Klein
3. PD Dr. M. Pohl

Datum der Promotion: 20.Oktober 2003

Meinen Eltern

Inhaltsverzeichnis

• 1 Einleitung
  • 1.1 Meilensteine der Entwicklung der optischen Theorie und Lichtmikroskopie
  • 1.2 Mikroskopischer Fortschritt im 20. Jahrhundert
  • 1.3 Entwicklung der „Atomic Force Microscopy“ – Geburtsstunde einer mikroskopischen Ära?
  • 1.4 Rasterkraftmikroskopie in der kardiovaskulären Grundlagenforschung – Ein Überblick
• 2 Zielsetzung der Arbeit
• 3 Materialien und Methoden
  • 3.1 Grundlagen der Rasterkraftmikroskopie
    • 3.1.1 Prinzipieller Aufbau des AFM
      • 3.1.1.1 PSI Autoprobe CP 82
    • 3.1.2 Das lokale Experiment – Grundlage der verschiedenen Rastersondenmikroskope 83
    • 3.1.3 Kräfte in der AFM
    • 3.1.4 Die Scannereinheit 84
      • 3.1.4.1 Design und Funktionsweise
        • Der piezoelektrische Effekt
        • Herstellung piezokeramischer Präzisionsscanner
      • 3.1.4.2 Eigenresonanz, maximale Scanfrequenz- und geschwindigkeit
      • 3.1.4.3 Nichtlineare Effekte
        • Intrinsische Nonlinearität
        • Hysterese
        • Alterungsprozesse (“Aging”)
        • Elektrisches “Creeping”
        • Thermische Drift
        • Kreuzkopplung
        • Kombinierter Einfluss aller Nonlinearitätseffekte
        • Korrekturmöglichkeiten
      • 3.1.4.4 Kalibrierung
        • Kalibrierstandards
    • 3.1.5 AFM-Cantilever und Tips
      • 3.1.5.1 Cantilever 87
      • 3.1.5.2 AFM-Spitzen (Tips) ^{modifiziert nach 87}
        • Pyramidale AFM-Tips
        • Konoidale AFM-Tips
        • Kontrollstandard zur Evaluierung der Tipgeometrie
    • 3.1.6 AFM-Messumgebungen
      • 3.1.6.1 Design der einfachen, offenen Flüssigkeitszelle
      • 3.1.6.2 Kommerzielle, geschlossene, perfundierbare Flüssigkeitszelle
      • 3.1.6.3 Temperiereinrichtung
      • 3.1.6.4 Zubehör zur Optimierung der Messbedingungen
    • 3.1.7 Messsignaldetektion
      • 3.1.7.1 Positionssensitive Photodioden (PSPD)
    • 3.1.8 Messsignalverarbeitung
    • 3.1.9 Betriebsmodus
      • 3.1.9.1 Kraft-Abstands-Kurven und ableitbare Funktionen^{(modifiziert nach} 89 ^, 90 ⁾
  • 3.2 Probenpräparation
    • 3.2.1 Kardiovaskuläre Zellen aus immortalen Zellkulturen
      • 3.2.1.1 Bovine aortale Endothelzellen (BAEC)
      • 3.2.1.2 Myozyten H9C2
    • 3.2.2 Aortale Endothelzellen im Gewebsverband
    • 3.2.3 Primär isolierte Zellen
      • 3.2.3.1 Adulte Kardiomyozyten und kardiale FLC (fibrocyte like cells)
      • 3.2.3.2 Isolation neonataler Ratten Myozyten (NBR-Myozyten)
    • 3.2.4 Thrombozyten
    • 3.2.5 20S-Proteasom
    • 3.2.6 Koronarinterventionelle Stents
      • 3.2.6.1 Reinigung der Stenoberfläche
      • 3.2.6.2 Dilatation der Stents
      • 3.2.6.3 Zellpräparation auf Stentoberflächen
      • 3.2.6.4 AFM- Abbildung der Stentoberflächen
      • 3.2.6.5 Bildverarbeitung
      • 3.2.6.6 Rauhigkeitsanalyse der Stentoberflächen
        • Berechnete Rauhigkeits-parameter
• 4 Ergebnisse
  • 4.1 Immortale, bovine aortale Endothelzellen (BAEC)
    • 4.1.1 Avitale Zellen
      • 4.1.1.1 Exsiccierte Zellen, Abbildung unter Raumbedingungen
      • 4.1.1.2 Exsiccierte Zellen, Abbildung unter zellphysiologischen Bedingungen bei 37°C
    • 4.1.2 Vitale Zellen
      • 4.1.2.1 biophysikalische Elastizitätsmessungen
  • 4.2 Aortale Endothelzellen im Gewebsverband
  • 4.3 Fibrozytenähnliche Zellen (FLC)
  • 4.4 Kardiomyozyten / Kardiomyoblasten
    • 4.4.1 Primärisolierte adulte, humane Kardiomyozyten
    • 4.4.2 Zellkulturkardiomyozyten der H9C2-Zellinie
    • 4.4.3 Primärisolierte Kardiomyozyten neonataler Ratten
  • 4.5 Thrombozyten
  • 4.6 Abbildung komplexer, oligomerer Proteine – Das 20S-Proteasom
  • 4.7 Koronarinterventionelle Stents
• 5 Diskussion
• 6 Ausblick
• 7 Zusammenfassung
• Liste häufig verwendeter Akronyme
• Literatur
• Danksagung
• Erklärung an Eides Statt

Tabellen

• Tabelle 1
• Tabelle 2

Bilder

• Abbildung 1 aus ¹
• Abbildung 2 aus ⁸
• Abbildung 3 modifiziert nach ¹⁴
• Abbildung 4 modifiziert nach ⁸²
• Abbildung 5 aus ⁸⁵
• Abbildung 6: Lennard- Jones- Funktion interatomarer Wechselwirkungen
• Abbildung 7 aus ⁸⁵
• Abbildung 8 aus ⁸⁵
• Abbildung 9 modifiziert nach ⁸⁵
• Abbildung 10 modifiziert nach ⁸⁵
• Abbildung 11 modifiziert nach ⁸⁵
• Abbildung 12 modifiziert nach ⁸⁵
• Abbildung 13 modifiziert nach ⁸⁵
• Abbildung 14 aus ⁸⁵
• Abbildung 15 aus ⁸⁵
• Abbildung 16 modifiziert nach ⁸⁵
• Abbildung 17
• Abbildung 18
• Abbildung 19
• Abbildung 20
• Abbildung 21 aus ⁸⁷
• Abbildung 22 aus ⁸⁵
• Abbildung 23 modifiziert nach ⁸⁴
• Abbildung 24
• Abbildung 25 aus ⁸²
• Abbildung 26
• Abbildung 27
• Abbildung 28 aus ⁸²
• Abbildung 29
• Abbildung 30: idealer Messtip
• Abbildung 31: Messtip mit Doppelspitze (appositionelle Verunreinigung oder Herstellungsdefekt)
• Abbildung 32
• Abbildung 33 (PSI^©–Foto)
• Abbildung 34
• Abbildung 35 aus ⁸⁵
• Abbildung 36 modifiziert nach ⁸⁹
• Abbildung 37
• Abbildung 38
• Abbildung 39
• Abbildung 40
• Abbildung 41
• Abbildung 42
• Abbildung 43
• Abbildung 44
• Abbildung 45
• Abbildung 46
• Abbildung 47
• Abbildung 48
• Abbildung 49
• Abbildung 50: Endothel der Aorta thoracalis des Meerschweins
• Abbildung 51: Endotheliale Oberfläche der Aorta thoracalis des Kaninchens
• Abbildung 52: Endothel der Aorta thoracalis des Kaninchens
• Abbildung 53: Endotheloberfläche der Aorta thoracalis der Ratte
• Abbildung 54: FLC- Primärisolation aus Rattenmyokard
• Abbildung 55: FLC- Primärisolation aus Rattenmyokard
• Abbildung 56: Fibrozyten – Primärisolation aus Myokard des Meerschweins
• Abbildung 57: Vitaler Fibrozyt aus humanem linksventrikulären Myokard primärisoliert
• Abbildung 58: Fibroblast und Fibrozyt primärisoliert aus Myokard neonataler Ratten
• Abbildung 59 aus ¹⁰¹
• Abbildung 60
• Abbildung 61
• Abbildung 62
• Abbildung 63
• Abbildung 64
• Abbildung 65
• Abbildung 66
• Abbildung 67 aus ¹⁰³
• Abbildung 68 aus ¹⁰³
• Abbildung 69
• Abbildung 70
• Abbildung 71
• Abbildung 72 aus ¹⁰³
• Abbildung 73
• Abbildung 74
• Abbildung 75
• Abbildung 76
• Abbildung 77
• Abbildung 78
• Diagramm 1
• Abbildung 79: Palmaz-Schatz-Stent undilatiert (nativ)
• Abbildung 80: Palmaz-Schatz-Stent dilatiert
• Diagramm 3
• Abbildung 81