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Von 41 operierten Tieren wurden 35 Tiere in den Hauptversuch aufgenommen. 2 Tiere mußten wegen eines intraoperativ ausgebrochenen femoralen Tunnels ausgeschlossen werden, 3 Tiere verstarben aufgrund von der Operation unabhängigen Ursachen (Aspirationspneumonie, Perikarditis, Ileus) nach 3 Tagen, 5 Wochen und 24 Wochen. Bei einem weiteren Tier der 52 Wochen Gruppe versagte das Transplantat und stellte sich nur noch als dünner fibröser Strang, der am hinteren Kreuzband haftete, dar.
Alle Tiere konnten unmittelbar nach dem Eingriff ihren operierten Hinterlauf nach Maßgabe der Beschwerden belasten. Die Vollbelastung wurde spätestens 4 Wochen nach Kreuzbandersatz wieder beobachtet. Sämtliche Arthrotomiewunden und Transplantatentnahmestellen verheilten reiz- und komplikationslos.
Nach 6, 9, 12, 26, 52 und 104 Wochen wurden je 6 Tiere getötet. Die Kniegelenke der Hinterläufe wurden beidseits entnommen und, nach entsprechender Präparation und Einbettung der femoralen und tibialen Knochenenden, biomechanisch getestet. Es wurde die anterior-posteriore Translation im Schubladentest und Ausrißfestigkeit des vorderen Kreuzbandes ermittelt.
Von 36 Tieren konnten nach biomechanischer Testung pro Gruppe von je 5 Tieren das VKB-Transplantat entnommen und zur histologischen Analyse und Auswertung aufgearbeitet werden. Als Kontrollgruppe dienten 9 native vordere Kreuzbänder der Gegenseite und 6 Flexorsehnen als Transplantat zum Zeitpunkt Null.
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Natives vorderes Kreuzband und Flexorsehne:
Makroskopisch zeigte sich das native vordere Kreuzband von einer gut vaskularisierten synovialen Hülle umgeben, während die Flexorsehne zum Zeitpunkt Null von einer dünnen Schicht Peritendineum bedeckt war.
Frühe Remodellingphase (6 und 9 Wochen Standzeit):
Nach 6 Wochen zeigte das Kniegelenk noch geringe Entzündungszeichen, wie seröser Gelenkerguß und Gefäßinjektionen der Synovialis. Das Transplantat war bereits teilweise von einer reichlich vaskularisierten und hypertrophen Synovialschicht umhüllt.
Abbildung 12: Makroskopische Kniegelenksaufnahme 6 Wochen nach VKB-Ersatzes mit Darstellung des Transplantates, umgeben von einem stark vaskularisierten Synovialschlauch. | ||
Intermediäre Remodellingphase (12 und 24 Wochen Standzeit):
Die makroskopische Untersuchung des Kniegelenks zeigte zu diesen Zeitpunkten keinerlei Entzündungszeichen. Das Transplantat war nach 12 Wochen noch von einer diskret verdickten synovialen Hüllschicht bedeckt und vaskularisiert. Nach 24 Wochen zeigte sich das Transplantat von einer straffen synovialen Hülle umgeben und makroskopisch nicht mehr von der Gegenseite zu unterscheiden.
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Abbildung 13: A.: 12 Wochen postoperativ zeigt sich das Transplantat noch diskret hypertroph vaskularisiert. B.: Nach 24 Wochen läßt sich das Transplantat (im Bild rechts dargestellt) nicht mehr vom nativen VKB (im Bild links dargestellt) unterscheiden ( aus Weiler et al 2002 (121) ). | ||
Späte Remodellingphase (52 und 104 Wochen Standzeit):
In der späten Remodelingphase konnte weiterhin kein Unterschied des makroskopischen Erscheinungsbildes der Gelenke zu den nicht operierten Kontrollgelenken der Gegenseite festgestellt werden. Es gab keine Anzeichen einer inflammatorischen Veränderung und das Transplantat zeigte sich von einer straffen synovialen Hülle bedeckt.
Im nativen vorderen Kreuzband wurde eine signifikant höhere Gesamtzellzahl (810,4 /mm2) im Vergleich zur Flexorsehne (245,8 /mm2 ,p = 0,004) gezählt. Die Fibroblasten des VKB zeigten in der Hämatoxylin-Eosin (H&E) Färbung im Gegensatz zur Flexorsehne mehr ovoide Zellkerne auf, deren Fibroblastenzellkerne streng spindelförmige imponierten.
In der Trichromfärbung nach Masson-Goldner stellte sich sowohl im VKB als auch in der Flexorsehne ein straffer paralleler Kollagenfaserverband dar, der von [Seite 43↓]bindegewebigen Septen durchzogen wird, die das intraligamentäre Kapillarnetz von den kollagenen Fasern trennt. Insgesamt erschien der Anteil der bindegewebigen Septen in der Flexorsehne geringer.
In der frühen Remodellingphase nach 6 Wochen zeigte sich in der konventionellen Lichtmikroskopie ein hyperzelluläres und hypervaskuläres Granulationsgewebe, welches fingerförmig von peripher nach zentral in das Transplantat einwuchs (Abbildung 14).
Abbildung 14: Transplantat, 6 Wochen nach VKB-Ersatz (Masson-Goldner Trichromfärbung (MG)): A: Hyperzellulärer Bindegewebsstrang (MG,400x) B: Fingerförmig einwachsender Bindegewebsstrang (MG, 100x) C: Gefäßdarstellung in einwachsendem Bindegewebsstrang (Immunhistochemie, F.VIII, 100x) ( je aus Weiler et al 2001 (122) ). | ||
Die synoviale Deckschicht war deutlich verdickt auf bis zu 5 - 8 Zellagen eines mehrschichtigen Epithels.
Abbildung 15: Stark verdickte synoviale Deckschicht mit 5 - 8 Zelllagen, Transplantat 6 Wochen postoperativ (MG 200x). | ||
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Intraligamentär dominierten plumpe Zellen mit meist runden bis ovoiden Zellkernen. Weiterhin zeigten sich noch verbliebene hypozelluläre nicht remodelierte Bereiche, die nur wenig vaskularisiert waren. Trotzdem wiesen die Transplantate aufgrund des hyperzellulären Granulationsgewebes nach 6 Wochen mit durchschnittlich 2508 Zellen /mm² eine signifikant höhere Gesamtzellzahl gegenüber allen anderen untersuchten Zeitpunkten auf (Graphik1).
Graphik 1: Gesamtzellzahl/ mm² im VKB, der Flexorsehne, sowie dem Transplantat zu verschiedenen Standzeiten. | ||
Nach 9 Wochen Standzeit konnten keine alten hypozellulären Bandanteile mehr nachgewiesen werden. Das histologische Erscheinungsbild wurde von unstrukturiertem und zellreichem Granulationsgewebe dominiert mit vorwiegend spheroiden Zellkernen. Die Gesamzellzahl war gegenüber 6 Wochen mit durchschnittlich 1876 Zellen/ mm² bereits rückläufig, jedoch weiterhin signifikant erhöht gegenüber dem nativen VKB (p = 0,008) und der Flexorsehne (p= 0,004).
In der 12 Wochen Gruppe waren weiterhin hyperzelluläre Transplantate zu beobachten. Das Granulationsgewebe wies jedoch bereits eine regional beginnende Ordnung der kollagenen Fasern auf. Die Gesamtzellzahl verringerte sich kontinuierlich weiter, war jedoch im Vergleich zu den Kontrollgruppen (entsprechend p = 0,008 und p = 0,004) immer noch signifikant erhöht. Gefäße waren zunehmend nur noch in bindegewebigen Septen zwischen den Kollagenfasern nachzuweisen. Durch diese Trennung konnten in [Seite 45↓]einigen Regionen bereits Myofibroblasten auf Grund ihrer interfaszikulären Lage klar von Gefäßzellen und Perizyten unterschieden werden. Sie wiesen zu diesem Zeitpunkt einen ovoid bis spindelförmigen Zellkern auf.
Nach 24 Wochen nahm die Gesamtzelldichte weiter auf 794,2 Zellen /mm² ab und erreichte damit erstmalig wieder die Zellzahl des nativen VKB (810,4 Zellen /mm2). Verglichen mit dem Transplantat zum Zeitpunkt Null (Flexorsehne), zeigte sich die Gesamtzellzahl signifikant erhöht (p = 0.004). Die nur noch vereinzelt auftretenden Gefäße waren durch bindegewebige Septen, von den kollagenen Fasern getrennt
Nach 52 (805,8/ mm2) und 104 Wochen (777,9/ mm2) zeigten die Transplantate eine Zelldichte vergleichbar mit dem nativen vorderen Kreuzband (810,4/ mm²). Die Zellen waren hauptsächlich ovoid bis fusiform und zeigten sich regelmäßig zwischen den Kollagenfasern verteilt. Im Vergleich zur nativen Flexorsehne zeigte sich eine signifikant höhere Gesamtzellzahl (je p = 0,004). Zwischen den 24, 52 und 104 Wochengruppen zeigte sich keine signifikante Änderung der Gesamtzellzahl.
Mit Hilfe der Polarisationsmikroskopie konnte eine Kollagenwellenlänge von 29,4 ± 6,1 µm im nativen vorderen Kreuzband gemessen werden. Diese war signifikant kürzer als im Flexorsehnentransplantat (127,4 ± 21 µm, p = 0,004).
Abbildung 16: A.: Natives vorderes Kreuzband unter polarisiertem Licht: Es imponiert eine hochfrequente, regelmäßige Kollagentertiärstruktur (polarisiertes Licht 200x). B.: Sehne des M. flexor digitorum superficialis unter polarisiertem Licht: Es läßt sich im Vergleich zum nativen VKB eine deutlich niederfrequente Kollagentertiärstruktur abbilden (polarisiertes Licht 200x). | ||
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In frühen Phase der Transplantateinheilung zeigte sich nach 6 Wochen eine Kollagenwellenlänge von 105,2 ± 52,7 µm ohne signifikanten Unterschied im Vergleich zum nativen VKB und dem Transplantat zum Zeitpunkt Null. Auffällig ist jedoch eine große Standartabweichung (SD = 52,7) ,welche die große Diversität der Wellenlängen in den verschiedenen Präparaten zu diesem Zeitpunkt abbildet.
Die Kollagenwellenlänge war nach 9 Wochen (34,3 ± 16 µm) signifikant niedriger als im Flexorsehnengewebe (p = 0,004). Im Vergleich zum nativen VKB zeigte sich kein signifikanter Unterschied.
Abbildung 17: A/ B.: Nach 6 Wochen zeigt sich eine große Diversität der Kollagentertiärstruktur innerhalb eines Transplantates. Das Bandgewebe zeigt sich hinsichtlich seiner Kollagenstruktur sehr inhomogen. Es lassen sich in dieser frühen Remodelingphase neben neugebildetem hochfrequentem Granulationsgewebe (A) immer noch Abschnitte von avaskulärem und niedrigfrequentem “altem“ Transplantatgewebe (B) nachweisen. C.: Nach 9 Wochen zeigt sich das Kollagen zunehmend homogen und es läßt sich nur noch vereinzelt altes niedrigfrequentes Kollagengewebe der Flexorsehen nachweisen. | ||
Nach 12 Wochen zeigte sich ein irregulärer und hochfrequenter Kollagenwellenabstand (25,5 ± 6,6 μm). Zu diesem Zeitpunkt war die Wellenlänge signifikant kürzer als im Flexorsehnengewebe (p = 0.004), während kein signifikanter Unterschied zum nativen VKB festzustellen war.
Nach 24 Wochen konnte weiterhin ein hochfrequenter Wellenabstand beobachtet werden (16.8 ± 3.3 μm). Die Kollagenwellenlänge war signifikant kürzer als in der Flexorsehne (p = 0,004), dem nativen vorderen Kreuzband (p = 0,008) und im Transplantat nach 9 und 12 Wochen (p = 0,016) (siehe Graphik 2).
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Abbildung 18: A.: Nach 12 Wochen zeigt sich im Vergleich zum nativen VKB kein signifikanter Unterschied des Kollagencrimps bei jedoch noch deutlicher Irregularität. B.: Nach 24 Wochen steigt die Frequenz der Kollagenwellen weiter an und ist signifikant kürzer als im nativen VKB, sowie nach 9 und 12 Wochen. | ||
In der späten Remodellingphase unterschieden sich die Kollagenwellenlängen nach 52 (18,8 ± 3,1 µm) und 104 Wochen (18 ± 2,9 µm) kaum und zeigten sich signifikant kürzer im Vergleich zum nativen vorderen Kreuzband (p = 0,016 und p = 0,008) und dem nativen Flexorsehnentransplantat (je p = 0.004).
Abbildung 19: A.: Nach 52 Wochen zeigt sich eine homogene hochfrequente Kollagenstruktur. B.: Nach 104 Wochen imponiert weiterhin eine hochfrequente Kollagenstruktur mit signifikant geringerem Wellenabstand im Vergleich zum nativen VKB. | ||
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Graphik 2: Graphische Darstellung der Kollagenwellenlänge (Crimp) | ||
In der immunhistologischen Färbung mit Faktor VIII ließ sich im nativen vorderen Kreuzband im Vergleich zur Flexorsehne in allen drei definierten Schichten eine signifikant höhere Anzahl an Gefäßanschnitten nachweisen (entsprechend p = 0,012, p = 0,005 und p = 0,026).
Abbildung 20: A.: Die immunhistologische Färbung des nativen vorderen Kreuzbandes zeigt F. VIII (von Willebrandt Faktor) positive Gefäßendothelzellen. Die Gefäße liegen in bindegewebigen Septen von den regelmäßig geformten Kollagenfasern getrennt (100x). B.: Darstellung der Gefäßquerschnitte in der Sehne des M. flexor digitorum superficialis zum Zeitpunkt Null. Die Immunhistologische Anfärbung von F. VIII zeigt nur vereinzelte Gefäßquerschnitte umhüllt von dünnen bindegewebigen Membranen zwischen den Kollagenfaszikeln (100x) (aus Unterhauser et al 2003 (115) ). | ||
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Immunhistologisch zeigte sich nach 6 Wochen eine hohe subsynoviale Gefäßdichte (285,35 Gefäßanschnitte/ mm²) mit signifikant mehr Gefäßanschnitten als im nativen VKB oder der Flexorsehne zum Zeitpunkt null (p= 0,001 und p= 0,004). Auch die intermediäre und die zentrale Region zeigten eine signifikant höhere Gefäßdichte im Vergleich zu den beiden Kontrollgruppen.
Abbildung 21: A.: Signifikant erhöhte Gefäßdichte der subsynovialen und intermediären Schichten nach 6 Wochen (Immunhistologie F.VIII 50x). B./ C.: Hypervaskularität der synovialen Deckzellschicht mit Gefäßen die in bindegewebigen Septen von Peripher nach Zentral einziehen (Immunhistologie F.VIII 200x) | ||
Nach 9 Wochen Standzeit zeigte sich in allen drei Zonen gegenüber den Kontrollgruppen weiterhin eine signifikant erhöhte Anzahl von Gefäßen. Die Zahl der subsynovialen Gefäßanschnitte nahm im Vergleich zur 6 Wochen Gruppe deutlich ab (230,5 Gefäßanschnitte /mm²), blieb im intermediären Bereich nahezu konstant (197,1 Gefäßanschnitte /mm²), während die zentrale Region eine weiter zunehmende Anzahl von Gefäßanschnitten aufwies (133,37 Gefäßanschnitte /mm²).
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Abbildung 22: A.: Synoviale und subsynoviale Hypervaskularität 9 Wochen nach VKB-Ersatz. (Immunhistologische Färbung F.VIII, 50x) B: Hypervaskularisierung des Transplantates nach 9 Wochen bis in die zentralen Anteile (Immunhistologische Färbung F.VIII, 200x) | ||
Nach 12 Wochen blieb die Anzahl der Gefäßanschnitte/ mm² im Vergleich zu nativem VKB und Flexorsehne zum Zeitpunkt null in allen drei Zonen weiterhin signifikant erhöht. Im Gegensatz zur 6 und 9 Wochen Gruppe verringerte sich die Gefäßdichte subsynovial auf 146,6 Gefäßanschnitte /mm², wohingegen sie intermediär weiter annähernd (210,02 Gefäßanschnitte /mm²) konstant blieb und zentral auf 165,58 Gefäßanschnitte/ mm² weiter zunahm.
Nach 24 Wochen zeigte sich im Vergleich zum nativen VKB nur noch die Zentralzone signifikant stärker vaskularisiert (p= 0,019). Im Gegensatz zur Flexorsehne war die mittlere Anzahl von Gefäßanschnitten in der Intermediär- und Zentralzone signifikant erhöht.
Abbildung 23: A.: Nach 12 Wochen zeigt sich eine deutlich reduzierte Vaskularität der subsynovialen Schicht, im Vergleich mit den 6 und 9 Wochen Präparaten. Es formieren sich erstmalig bindegewebige Septen, welche die Gefäße von den kollagenen Fasern trennen (Immunohistochemie Faktor VIII, 200x). B.: Nach 24 Wochen sind alle Gefäße vollständig von einer bindegewebigen Hülle umschlossen und gänzlich von den kollagenen Fasern getrennt. Bis auf die zentrale Schicht sind Gesamtzellzahl und Gefäßstatus des nativen vorderen Kreuzbandes erreicht (Immunohistochemie Faktor VIII, 200x) (aus Unterhauser et al 2003 (115) ). | ||
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Bezüglich der Gefäßdichte konnte keine signifikante Änderung zum nativen VKB noch zum Transplantat nach 24 Wochen festgestellt werden, jedoch zeigte sich eine weiter abnehmende Zahl von kapillären Gefäßanschnitten in der zentralen Zone, bis erstmals nach 52 Wochen die Gefäßdichte des nativen VKB erreicht wurde. Subsynovial und intermediär blieb die Gefäßdichte über die Zeit von 24 bis 104 Wochen konstant.
Im Vergleich mit der Flexorsehne zum Zeitpunkt Null zeigte sich subsynovial und intermediär keine signifikante Änderung der Gefäßdichte nach 52 und 104 Wochen. In der Zentralzone war erst nach 104 Wochen keine signifikante Änderung der Gefäßdichte mehr festzustellen.
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Abbildung 24: A.: Nach 52 Wochen hat das Transplantat den Gefäßstatus des vorderen Kreuzbandes erreicht (Immunhistochemie, F.VIII, 200x). B.: Nach 104 Wochen läßt sich keine weitere Veränderung der Vaskularität im Vergleich zum nativen VKB nachweisen (Immunhistochemie, F.VIII, 200x) (aus Unterhauser et al 2003 (115) ). | ||
Bei der Färbung mit α-smooth-muscle Aktin zeigte sich in den Kontrollgeweben zum Zeitpunkt Null eine Myofibroblastendichte von 156/ mm2 im nativen vorderen Kreuzband, beziehungsweise 76,2/ mm2 in der Flexorsehne (p = 0,009). Der Klassifikation von Murray und Spector folgend (80), wiesen die Myofibroblasten im nativen VKB einen ovoiden Zellkern auf, im Gegensatz zu den dünnen spindelförmigen Zellkernen der Myofibroblasten des Flexorsehnentransplantates. Bezogen auf die Gesamtzellzahl, lag der prozentuale Anteil der MFB im hyperzellulären VKB mit 19,2 % wesentlich niedriger als im hypozellulären Flexorsehnentransplantat (32,3%).
Abbildung 25: A.: Die immunhisto-chemische Färbung des intakten VKB zeigt ASMA-positive Myofibroblasten. Die Myofibroblasten sind ungleichmäßig verteilt und weisen eine ovoide Zellform auf (Immunhistologie, ASMA 200x, polarisiertes Licht). B.: Die Myofibroblasten der Flexorsehne weisen einen fusiformen Zellkern auf und sind gleichfalls unregelmäßig verteilt(Immunhistologie, ASMA 200x, teil-polarisiertes Licht) (Weiler et al 2002 (123) ) | ||
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Im einwachsenden reparativen Gewebe ließen sich eine hohe Anzahl α-smooth-muscle Aktin (ASMA) positive Zellen nachweisen. Jedoch war es zu diesem frühen Zeitpunkt nach 6 und 9 Wochen aufgrund des noch ungerichteten Granulationsgewebes noch nicht möglich, alle ASMA positiven Zellen klar den einzelnen Zelltypen zuzuordnen und Myofibroblasten klar von Perizyten und glatten Gefäßmuskelzellen zu trennen.
Abbildung 26: A.: Nach 6 Wochen zeigt sich eine deutliche Myofibroblastenexpression in einwachsendem Granulationsgewebe). Es zeigt sich deutlich eine Degradation der Kollagenfasern und ihrer Tertiärstruktur, dem Kollagen-Crimp. Das alte, nicht remodelierte Bandgewebe weist vereinzelte Myofibroblasten auf (Pfeile) (Immunhistologie, ASMA 100x, teil-polarisiertes Licht.) B.: Die weitere Vergrößerung des einwachsenden Granulationsgewebes zeigt neu formiertes Kollagengewebe in dem spindelförmige Myofibroblasten nachgewiesen werden können (Pfeile). (Immunhistologie, ASMA 100x, teil-polarisiertes Licht) (aus Weiler et al 2002 (123) ) | ||
Aufgrund der Trennung der Gefäße von den Kollagenfasern durch bindegewebige Septen konnte nach 24 Wochen eine klare morphologische Abgrenzung der Myofibroblasten (MFB) von Perizyten und glatten Gefäßmuskelzellen getroffen werden, und diese eindeutig identifiziert werden.
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Abbildung 27: A.: Bei immunhistologischer Färbung mit anti-α-smooth-muscle Aktin werden glatte Muskelzellen von Gefäßen dargestellt. B: In der unmittelbaren Umgebung von Gefäßen lassen sich Myofibroblasten nicht eindeutig von Perizyten unterscheiden (Immunhistochemie, F. VIII, 100x). C.: Nach 24 Wochen lassen sich Myofibroblasten aufgrund ihrer Morphologie von Perizyten und rein intraligamentärer Lage von glatten Gefäßmuskelzellen differenzieren (Immunhistochemie, F. VIII, 400x) | ||
Die Verteilung der MFB im Transplantat zeigte sich insgesamt sehr unregelmäßig. Die MFB waren teilweise longitudinal aligniert und konnten mit Hilfe der Polarisationsmikroskopie parallel zur Wellenformation der Kollagenfasern ausgerichtet lokalisiert werden
Abbildung 28: A.: ASMA exprimierende Myofibroblasten konnten im Kollagenfaserverband nachgewiesen werden (24 Wochen ASMA, 400x) B: Sie zeigten sich longitudinal entlang der kollagenen Fasern orientiert (gleiches Präparat wie A, 400x, polarisiertes Licht) | ||
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Nach 24 Wochen zeigte sich kein signifikant höherer Anteil an Myofibroblasten (252.8 /mm2) im Vergleich zum nativen VKB und der Flexorsehne.
In der immunhistochemischen Färbung mit anti-α-smooth-muscle Aktin konnten nach 104 Wochen signifikant mehr Myofibroblasten (330,2 MFB/ mm²) nachgewiesen werden, als im nativen VKB (156 MFB/ mm²) (p=0,008) und in der Flexorsehne (76,2 / mm²) (p=0,004), während sich nach 52 Wochen (288,6 MFB/ mm²) nur gegenüber der Flexorsehne eine signifikante Veränderung der MFB-Zahl zeigte (p=0,004).
Abbildung 29: A.: Nach 52 Wochen stieg der Anteil der ASMA exprimierenden Myofibroblasten weiter an. Sie wiesen eine ovoide Zellform auf und waren weiterhin unregelmäßig verteilt (Immunhistochemie ASMA, 200x). B.: Nach 104 Wochen stieg der Anteil an Myofibroblasten im Vergleich zum nativen VKB weiter an. Die Zellen zeigten erneut eine ovoide Form (Immunhistochemie ASMA, 200x). | ||
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DiML DTD Version 4.0 | Zertifizierter Dokumentenserver der Humboldt-Universität zu Berlin | HTML-Version erstellt am: 19.05.2005 |