Matthias Boentert: Untersuchuchungen zum makro- und mikroglialen Differenzierungspotential muriner Knochenmarkzellenin vitro und in vivo |
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Aus der Klinik für Neurologie
Abteilung für Experimentelle Neurologie
der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin
DISSERTATION
Untersuchuchungen zum makro- und mikroglialen Differenzierungspotential
muriner Knochenmarkzellen
in vitro und in vivo
Zur Erlangung des akademischen Grades
doctor medicinae (Dr. med.)
vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin
von
Matthias
Boentert
aus Dorsten
Dekan: Prof. Dr. med. Joachim W. Dudenhausen
Dekan: Prof. Dr. med. Martin Paul
Gutachter:
1. Prof. Dr. med. Josef Priller
2. PD Dr. rer. nat. Frank Kirchhoff
3. Prof. Dr. rer. nat. Andreas Faissner
Datum der Promotion: 19. Juli 2004
Abstract
Die vorliegende Arbeit untersucht das Differenzierungsverhalten adulter muriner Knochenmarzellen im Zentralnervensystem in vivo und in vitro. Hierzu wurden letal bestrahlte Mäuse mit Knochenmark aus transgenen Mausmutanten transplantiert, die das grün fluoreszierende Protein (GFP) unter der Kontrolle des humanen GFAP-Promoters exprimieren. Ein Teil der Rezipienten wurde vier Wochen nach Transplantation einer transienten fokalen cerebralen Ischämie unterzogen, um den Einfluss postischämischer inflammatorischer Vorgänge auf das Differenzierungsverhalten eingewanderter Zellen zu untersuchen. Eine zelluläre Koexpression von GFP und GFAP als Zeichen der Differenzierung hämatogener Zellen zu GFAP-exprimierenden Astrozyten fand sich bei keinem der analysierten Tiere. Für die in vitro-Versuche wurden murine Knochenmarkzellen auf Mausastrozyten und auf organotypischen entorhinal-hippocampalen Hirnschnitten kokultiviert. Die hierzu verwendeten Knochenmarkzellen waren entweder retroviral mit GFP transfiziert oder stammten aus zwei verschiedenen transgenen Mausmutanten, von denen eine GFP nahezu ubiquitär unter dem b-Actin-Promoter, die andere GFP unter der Kontrolle des humanen GFAP-Promoters exprimiert. Während zahlreiche Knochenmarkzellen nach wenigen Tagen der Kokultur die morphologischen Charakteristika ruhender Mikroglia annahmen und Immunoreaktivität für den Makrophagen/Mikroglia-Marker Iba1 aufwiesen, fand sich keine einzige Zelle mit Koexpression von GFP und GFAP. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass adulte murine Knochenmarkzellen bzw. ihre Abkömmlinge im zirkulierenden Blut nicht in GFAP-exprimierende Astrozyten differenzieren.
Eigene Schlagworte:
Astroglia,
Mikroglia,
Knochenmarktransplantation,
Transdifferenzierung,
grün fluoreszierendes Protein
Abstract
It has been postulated that adult murine bone marrow cells have the potential to differentiate into cells of neuroectodermal origin. In order to examine whether bone marrow cells can adopt an astroglial fate, various in vivo and in vitroapproaches were chosen. Lethally irradiated recipient mice were transplanted with bone marrow derived from transgenic mice which express the green fluorescent protein (GFP) under the control of the human GFAP promoter. Four weeks after transplantation, several animals underwent transient focal cerebral ischemia. Although postischemic inflammatory processes may eventually have a permissive effect on cell differentiation, not a single cells coexpressing GFAP and GFP was found in the brains of all recipients examined. For in vitro studies, murine bone marrow cells were co-cultured on astrocytic monolayers or organotypic entorhinal-hippocampal brain slices. Bone marrow cells were either labelled by retroviral transfection with GFP or derived from two different transgenic mouse mutants expressing GFP under the control of the human GFAP-promoter or the murine b-Actinpromoter, respectively. After several days of co-culture bone marrow derived cells developed a ramified morphology and showed immunoreactivity for the monocytic/microglial marker Iba1. However, differentiation of bone marrow derived cells into GFAP-expressing astrocytes was not observed. Our results suggest that adult murine bone marrow cells cannot differentiate into GFAP-expressing astrocytes in vivo or in vitro.
Keywords:
astroglia,
microglia,
bone marrow transplantation,
transdifferentiation,
green fluorescent protein
Inhaltsverzeichnis
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1 Zusammenfassung
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2
Einleitung
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2.1 GFP als biologischer Zellmarker
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2.2 Astrozyten und das gliale fibrilläre saure Protein (GFAP)
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2.3 Mikroglia
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2.4 Differenzierungspotential von Stammzellen aus dem Knochenmark
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2.4.1 Differentielle Flexibilität von Stammzellen
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2.4.2 Knochenmark als Quelle potentiell transdifferenzierender Stammzellen
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2.5 Zelluläre Reaktionen nach fokaler cerebraler Ischämie
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2.6
Cerebrale Ischämie und Zelldifferenzierung
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3
Herleitung der Aufgabenstellung
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4
Material und Methoden
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4.1 Materialien
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4.2
Versuche in vivo
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4.2.1 Die GFAP/GFP-transgene Donormaus
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4.2.2 Auswahl und Bestrahlung der Rezipienten
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4.2.3
Gewinnung von Knochenmark aus GFP/GFAP-transgenen Donortieren
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4.2.4 Transplantation und Haltung der Tiere
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4.2.5 Dokumentation des Rekonstitutionserfolges
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4.2.6 Transiente fokale cerebrale Ischämie
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4.2.7 Histologie und Immunhistochemie
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4.3
Versuche in vitro
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4.3.1 Transfektion von Knochenmark mit EGFP
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4.3.2 Knochenmarkentnahme
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4.3.3
Retroviraler Gentransfer in murine Knochenmarkstammzellen
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4.3.4
Dokumentation des Transfektionserfolges
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4.3.5 Knochenmarkentnahme aus β-Actin/GFP- und GFAP/GFP-transgenen Mäusen
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4.3.6 Präparation und Kultur muriner Astrozyten
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4.3.7
Präparation und Kultur muriner entorhinal-hippocampaler Hirnschnitte (OEHSC)
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4.3.8 Auftrennung von Knochenmarkzellen mittels MACS
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4.3.9
Kokultur von Knochenmarkzellen auf Astrozyten-Monolayers
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4.3.10
Kokultur von Knochenmark auf Organotypischen entorhinal-hippocampalen Hirnschnitten
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4.3.11 Kontrollen, Immunhistochemie und Fluoreszenzmikroskopie
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5
Ergebnisse
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5.1
Ergebnisse der in vivo - Versuche
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5.1.1 Etablierung von GFAP/GFP-Knochenmarkchimären
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5.1.2 Nativscreening
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5.1.3
Tiere nach fokaler cerebraler Ischämie
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5.2
Ergebnisse der in vitro-Versuche
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5.2.1 Charakterisierung der verwendeten Knochenmarkzellen aus Donormäusen
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5.2.2
Differenzierung von Knochenmarkzellen in Kultur auf Astrozyten
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5.2.3 Differenzierung von Knochenmarkzellen in Kultur auf OEHSC
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6
Diskussion
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Literaturverzeichnis
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Anhang
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Tabellarischer Lebenslauf
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Eidesstattliche Erklärung
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Danksagung
Tabellen
Bilder
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Abbildung 1: Charakterisierung der Virus-Producer-Zellinie für die retrovirale Transfektion von Knochenmark mit EGFP. a:Schematische Darstellung des retroviralen MGirL22Y-Vectors. Das abgebildete Fragment ist 3,6 kb lang und enthält die cDNA für EGFP sowie das humane Enzym Dihydrofolatreductase (L22Y). IRES = internal ribosomal entry site (Enzephalomyokarditis-Virus), LTR = long terminal repeats. Der Grundbaustein des Vektors ist ein Plasmid aus dem murinen Stammzell-Virus (MSCV). b: Die virusproduzierenden Fibroblasten weisen ein homogenes und helles GFP-Signal auf (x100). c – f: Die graphische und numerische Darstellung der FACS-Analyse zeigt, dass eine Mehrheit der Fibroblasten EGFP mit hoher Intensität exprimiert. Eine Subpopulation der Virus-Producer-Zellen (Gate 1 in c) wurde mit Hilfe von Propidiumjodid (PI) auf ihre Viabilität geprüft; die vitalen Zellen (Gate 2 in d) wurden selektioniert und hinsichtlich ihrer GFP-Expression untersucht (e, f).
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Abbildung 2:Übersicht über die in vivo Experimente
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Abbildung 3: Übersicht über die in vitro Experimente
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Abbildung 4:Expression von GFP im Gehirn der GFAP/GFP-transgenen Donormaus. Bei 25-facher Vergrößerung sind im fluoreszierenden Auflicht zahlreiche GFP-exprimierende Zellen auf der Cortexoberfläche des frisch entnommenen Gehirns zu erkennen (a). Die starke Grünfluoreszenz der Kleinhirnrinde (b, Aufsicht und c, Sagittalschnitt, jeweils x25) kommt durch die für das Modell charakteristische intensive Expression von GFP in der Bergmann-Glia zustande.
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Abbildung 5:Charakterisierung der GFAP/GFP-transgenen Donormaus für die Knochenmarktransplantation. In einem nativen Gefrierschnitt (20 µm) des Striatums finden sich zahlreiche Zellen mit intensiver Grünfluoreszenz (a, x200). Die Zellen besitzen ein dichtes Geflecht feiner Zytoplasmafortsätze, in denen das GFP-Signal etwas schwächer ausgeprägt ist als im Zelleib (a, b). Die konfokalen Teilabbildungen b - d (x400) zeigen jeweils die gleiche Zelle: GFP-Fluoreszenz (b), GFAP-Färbung (c), Überlagerung beider Signale (d).
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Abbildung 6:Charakterisierung der GFAP/GFP-transgenen Donormaus für die Knochenmarktransplantation. Die Aufnahmen wurden mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie angefertigt und zeigen GFP-positive Astrozyten im Cortex eines drei Monate alten transgenen Tieres (a). Nach immunhisto-chemischer Anfärbung von GFAP (b) und Überlagerung (c) erweisen sich mehrere Zellen als doppelt markiert (Pfeilspitzen in c). Die Stärke des GFAP-Signals in Astrozyten ist bei in vivo-Färbungen physiologischerweise inhomogen; einige GFP-positive Zellen zeigen eine geringere Immunoreaktivität für GFAP (Pfeile in c). Eine GFAP-positive Zelle exprimiert kein GFP (Stern in c) Die Bilddaten wurden aus einem Gewebesegment von 230 mm x 130 mm x 13 mm Größe errechnet.
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Abbildung 7:Nachweis des transgenen Konstrukts in Leukozyten aus dem peripheren Blut mittels PCR. Die PCR-Produkte aus einer Transplantationsserie wurden auf einem Agarose-Gel separiert und anschließend mit Ethidiumbromid visualisiert. Die verwendeten Primer detektierten das GFP-Gen.Lanes 0 und 15: DNA molecular weight marker (1kb)Lanes 1 und 2: GFAP/GFP-transgene DonormäuseLanes 3, 4, 6 und 9 – 12: Knochenmarkchimären. Das Transgen ist vorhanden.Lanes 5, 7 und 8: Knochenmarkchimären. Das Transgen ist nicht vorhanden.Lane 13: Negativkontrolle der spezifischen Genamplifikation (nicht transplantierte Maus).Lane 14: Negativkontrolle der PCR (ohne DNA).
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Abbildung 8:Mikrogliazellen im Hirnparenchym einer GFP-Knochenmarkchimäre (C57bl6). Vier Wochen nachTransplantation von GFP-transfiziertem Knochenmark (nicht transgen!) erscheinen ramifizierte Donorzellabkömmlinge im Bulbus olfactorius und im weiteren Verlauf auch in anderen Hirnregionen. In diesem Bulbuspräparat sind die GFP-positiven Zellen stark ramifiziert (a) und exprimieren den Makrophagen-Marker Iba-1 (b, c Überlagerung). Die weiße Färbung der zentralen Cytoplasmabereiche kommt durch Überstrahlungsartefakte zustande. Vergr. x250.
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Abbildung 9: Um nachzuweisen, dass hämatogene Zellen nach Repopulation des blutbildenden Systems durch GFAP/GFP-transgene Donorzellen ins Hirnparenchym einwandern, wurden letztere vor der Transplantation mit EGFP transfiziert. Die Abbildungen wurden von Hirnschnittpäparaten zweier Knochenmarkchimären 6 Wochen nach Transplantation und 3 bzw. 5 Tage nach MCAO angefertigt (a – f: Maus Nr. 1, g – i: Maus Nr. 2). Sowohl im infarktfernen ipsilateralen Cortex (a – c, x250) als auch in der striatalen Periinfarktzone (d – f, x400, und g – i, x400) finden sich ramifizierte Zellen im Parenchym, die EGFP und den mikroglialen Marker Iba-1 koexprimieren.
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Abbildung 10:Transiente fokale cerebrale Ischämie. Die MCAO wurde 12 Wochen nach Transplantation mit GFAP/GFP-transgenem Knochenmark durchgeführt und dauerte 60 min. Die Überlebenszeit betrug 2 Tage. Das Infarktareal umfaßt weite Teile des dorsalen Striatums und den angrenzenden Cortex (a, HE, nicht vergrößert). Fluoreszenzmikroskopisch sieht man, daß das GFAP-Signal im Infarktbereich nahezu vollständig verschwunden ist, während sich perifokal ein Wall aus Astrozyten mit starker GFAP-Antigenität ausgebildet hat (b). Im gleichen Bereich findet sich keine Expression von GFP (c). Vergrößerung x200.
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Abbildung 11:Transiente fokale cerebrale Ischämie. Die Teilabbildungen zeigen Gewebeschnitte aus dem Hirn einer GFAP/GFP-transgenen Knochenmarkchimäre. 12 Wochen nach Rekonstitution wurde das Tier einer MCAO von 60 min Dauer unterzogen. Die Überlebenszeit betrug 5 Tage. (a) läßt die Grenze des vorwiegend striatal lokalisierten Infarktes erkennen (Pfeile, HE, x100), b zeigt einen Ausschnitt aus dem betroffenen Striatum (HE, x200, x = Seitenventrikel). (c) Im Infarktgebiet sind nur Inseln des astrozytären GFAP-Signals erhalten. Im Bereich des Corpus callosum sieht man zahlreiche Astrozyten mit intensivem GFAP-Signal als Ausdruck der perifokalenreaktiven Astrogliose (x100). Im blauen Fluoreszenzlicht ist keine GFP-Expression im selben Schnitt sichtbar (d, x100).
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Abbildung 12: Charakterisierung der β-Actin/GFP-transgenen Donormaus. Das Diagramm zeigt das Ergebnis der durchflusszytometrischen Analyse von Blutleukozyten eines transgenen Tieres (a). Bei den grün aufleuchtenden Partikeln im Blutausstrich in Teilabbildung b handelt es sich um Thrombozyten; die Erythrozyten der β-Actin/GFP-transgenen Tiere weisen kein GFP-Signal auf.
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Abbildung 13:Charakterisierung der ß-Actin/GFP-transgenen Donormaus für die Kokultur von Knochenmark auf Astrozyten bzw. organotypischen Hirnschnitten. Im gesamten Gehirn finden sich GFP-positive Zellen unterschiedlicher Morphologie. (a) Palisadenförmig angeordnete (Purkinje-) Zellen in der Kleinhirnrinde, (b) Ramifizierte Zellen im Neocortex (Pfeile), (c) Meningeale (1), ramifizierte (2) und endotheliale Zellen (3) in der Nähe des Seitenventrikels, (d) kortikale Zellen mit neuronaler Morphologie. Die Aufnahmen stammen aus zwei verschiedenenTieren.Vergrößerung x1000 (a, b), x400 (c, d).Abbildung 16
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Abbildung 14:FACS-Analyse der GFP- und Sca-1-Expression GFP-transfizierter Knochenmarkzellen nach Entnahme aus der Kokultur mit Virus-Producer-Zellen, d. h. vor Durchführung der Zellseparation mittels MACS. Aus dem vierten Diagramm und der nebenstehenden Tabelle ist ersichtlich, dass bereits 69,05% der Zellen Sca-1-positiv sind (Summe aus beiden oberen Quadranten).
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Abbildung 15:FACS-Analyse von GFP-transfizierten Knochenmarkzellen nach MACS (gleiche Probe wie in Abbildung 14).Teilabbildung a zeigt die Ergebnisse der Analyse für die vorwiegend Sca-1-negative Fraktion des Eluats: Der Anteil der Sca-1-negativen Zellen beträgt hier 60,93% (Summe aus beiden unteren Quadranten des dritten Diagramms). R1: Gate nach Zellgröße, R2: Gate nach Viabilität (Propidiumjodid-Färbung).Teilabbildung b zeigt die Ergebnisse der Analyse für die vorwiegend Sca-1-positive Fraktion des Eluats: Der Anteil der Sca-1-positiven Zellen beträgt hier 85,2% (Summe aus beiden oberen Quadranten des dritten Diagramms). R1: Gate nach Zellgröße, R2: Gate nach Viabilität (Propidiumjodid-Färbung).
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Abbildung 16:Kokultur von GFP-transfizierten und mit BrdU markierten Knochenmarkzellen auf Astrozyten, Tag 6. Die Abbildung zeigt drei GFP-exprimierende Zellen (a), von denen zwei ein nukleäres BrdU-Signal aufweisen (b, c). Mehrere BrdU-positive Knochenmarkzellen exprimieren kein GFP. Vergrößerung x 250.
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Abbildung 17:Kultur von transfizierten, Sca-1-negativen Knochenmarkzellen auf Mausastrozyten. Tag 3 der Kokultur. Die überwiegende Mehrheit der bei Aussaat sphärischen Knochenmarkzellen hat sich entrundet. Einige Zellen haben bipolare, z. T. bereits sehr lange Zytoplasmafortsätze ausgebildet und zeigen eine spindelartige Form (Pfeilspitzen in a und d). In Zusammenschau mit ihrer Immunoreaktivität für Iba-1 (b, e) handelt es sich am ehesten um reifere monozytäre Zellen, die auch auf azellulären Substraten eine solche Morphologie annehmen. Andere Zellen, ebenfalls positiv für Iba-1 und GFP, besitzen plumpere Zelleiber und Fortsätze (Pfeile in c) oder weisen mehr als zwei Pseudopodien auf (Stern in d - f). Vergrößerung x100 (a - c), x400 (d - f).
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Abbildung 18:Kultur von transfizierten, Sca-1-negativen Knochenmarkzellen auf Mausastrozyten. Tag 6 der Kokultur. Zahlreiche GFP-positive Zellen weisen primäre und sekundäre Ramifikationen auf (Pfeile in a, x200). Jede dieser Zellen ist immunoreaktiv für Iba-1 (b) und zeigt eine klare Kolokalisation beider Fluoreszenzsignale (c). Eine ramifizierte Zelle (Pfeilspitze in c) exprimiert zwar Iba-1, nicht aber GFP. Sie leitet sich entweder von kontaminierenden Mikrogliazellen aus der primären Astrozytenkultur oder von nicht transfizierten Knochenmarkzellen her.
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Abbildung 19:Kultur von transfizierten, Sca-1-negativen Knochenmarkzellen auf Mausastrozyten(x400), Tag 6. Die abgebildete Zelle besitzt einen entrundeten Zelleib und mehrere Fortsätze, die sich noch nicht weiter aufgezweigt haben. (a) Durchlicht, (b) EGFP, (c) Iba-1, (d) Überlagerung.
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Abbildung 20: Kultur transfizierter, Sca-1-positiver Knochenmarkzellen auf Astrozyten. Tag 12 der Kokultur. (a) GFP, (b) Iba-1, (c) Überlagerung. Die rechts unten zu erkennende Zelle weist langgestreckte Zytoplasmafortsätze mit kurzen sekundären Verzweigungen auf. Vergr. x400.
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Abbildung 21: Kultur transfizierter, Sca-1-positiver Knochenmarkzellen auf Astrozyten. Tag 18 der Kokultur. (a) GFP, (b) Iba-1, (c) Überlagerung. Vergrößerung x200.
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Abbildung 22: Kultur transfizierter Sca-1-positiver Knochenmarkzellen auf Mausastrozyten. Tag 18 der Kokultur. Die in den Teilabbildungen unten dargestellte Zelle besitzt Primär- und Sekundärfortsätze (Pfeile in a ). Nach dieser längeren Kulturphase erscheinen die Fluoreszenzsignale von GFP und Iba-1perinukleär verstärkt und in den Zellfortsätzen deutlich abgeschwächt. Dieses Phänomen konnte in allen Experimenten beobachtet werden. (a) EGFP, (b) Iba-1, (c) Überlagerung. Vergrößerung x400.
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Abbildung 23:Kultur transfizierter, Sca-1-positiver Knochenmarkzellen auf Astrozyten. Tag 18 der Kokultur. (a) GFP, (b) Iba-1, (c) Überlagerung. Vergrößerung x100. Die abgebildeten Zellen zeigen eine irreguläre Morphologie mit langgestreckten, z. T. spindelförmigen Zytoplasmafortsätzen ohne weitere Ramifikation.
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Abbildung 24:Kultur Sca-1-positiver Knochenmarkzellen aus einer ß-Actin/GFP-transgenen Donormaus auf Astrozyten. Tag 12 der Kokultur. (a) GFP, (b) Iba-1, (c) Überlagerung. Vergrößerung x100. Nicht anders als in der Kokultur transfizierter Zellen haben zahlreiche Zellen eine ramifizierte Morphologie angenommen und koexprimieren GFP und Iba1. Das GFP-Signal der ß-Actin/GFP-transgenen Zellen ist nach 12 Tagen in vitro noch ebenso intensiv wie im Gehirn des Donortiers unmittelbar nach der Perfusion mit PFA (vgl. Abb. 15). Teilabbildung c zeigt in der Bildmitte 3 untereinander liegende Zellen (eine davon mit Primär- und Sekundärfortsätzen), die Iba-1-negativ sind.
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Abbildung 25:Kultur transfizierter, Sca-1-negativer Knochenmarkzellen auf Astrozyten. Tag 3 der Kokultur. (a) Durchlicht, (b) GFP, (c) GFAP, (d) Überlagerung. Deutlich ist der enorme Größenunterschied zwischen den GFP-positiven Zellen und den darunterliegende Astrozyten. Zu diesem frühen Zeitpunkt der Kokultur haben fast alle Knochenmarkzellen noch eine amöboide Form. Zelluläre Kolokalisation von GFP und GFAP ist nicht erkennbar. Vergrößerung x100.
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Abbildung 26: a – c: Kultur transfizierter, Sca-1-neg. Knochenmarkzellen auf Astrozyten, Tag 6 der Kokultur. d
– e: Kultur transfizierter, Sca-1-pos. Knochenmarkzellen auf Astrozyten, Tag 12 der Kokultur (x200). Der Größenunterschied zwischen Knochenmarkzellen einerseits (a) und GFAP-positiven Astrozyten andererseits (b) bleibt deutlich. Zelluläre Kolokalisationen beider Fluoreszenzsignale sind nicht erkennbar (c). Das mehr flächen-hafte GFAP-Signal bildet den Hintergrund einiger GFP-positiver Zellen, so dass diese nach Überlagerung z. T. gelb erscheinen (c). Um diesen Artefakt zu umgehen, wurden zusätzlich Einzelzellanalysen an zytozentrifugierten Kokulturen durchgeführt (s. Text). Vergrößerung x100.
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Abbildung 27: Kultur transfizierter, Sca-1-negativer Knochenmarkzellen auf OEHSC. Wegen der konvexen Schnittoberfläche haben sich die meisten EGFP-positiven Knochenmarkzellen in den Randbereichen angesammelt (a und b, Tag 3 der Kokultur, x50). Die Teilabbildungen c – e zeigen alle den gleichen Ausschnitt und dokumentieren die Proliferationsfähigkeit der EGFP-markierten Knochenmarkzellen auf dem Slice. (b) Tag 3 der Kokultur, (c) und (d) Tag 3 der Kokultur, (e) Tag 5 der Kokultur. Vergrößerung x200.
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Abbildung 28: Kultur transfizierter, Sca-1-negativer Knochenmarkzellen auf OEHSC. Tag 5 der Kokultur, vor der Fixierung. Das Gewebe wird im Durchlicht (a) von außen nach innen dunkler, während im blauen Licht (b) die Autofluoreszenz in derselben Richtung zunimmt (a und b zeigen denselben Ausshnitt). Beides wird durch die zum Rand hin abnehmende Dicke des Präparates verursacht. Die GFP-positiven Zellen in b und c wirken teilweise unscharf, was ihre Einwanderung in tiefere Gewebeschichten widerspiegelt (Pfeilspitzen in c). Die Zahl der Knochenmarkzellen hat im Vergleich zum ersten Tag der Kokultur stark zugenommen (b). Die Zellen weisen z. T. Zellfortsätze auf (c).Vergrößerung x200 (a, b), x400 (c).
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Abbildung 29:Kultur transfizierter, Sca-1-positiver Knochenmarkzellen auf OEHSC. Tag 8. Alle Aufnahmen stammen von vitalen Präparaten. Die Knochenmarkzellen haben massiv proliferiert und konzentrieren sich auf die Furche zwischen Hippocampus und entorhinalem Cortex (a, b, x50). Vertikal zum Schnittrand bilden sie eine Straße im kortikalen Gewebe (c, d, x100). Bei stärkerer Vergrößerung sind diverse, u. a. ramifizierte Zellmorphologien sichtbar (e, x 200und f, x400). Schärfenunterschiede zwischen den Zellen sind durch ihre Migration in die Tiefe des Gewebes bedingt.
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Abbildung 30: Kultur transfizierter, Sca-1-negativer Knochenmarkzellen auf OEHSC, Tag 3 der Kokultur. Der organotypische Hirnschnitt ist nach der Mikrogliafärbung mit Iba-1-positiven Zellen übersät (a). Teilabbildung b zeigt den gleichen Ausschnitt im blauen Fluoreszenzlicht; im linken oberen Teil ist ein Haufen GFP-exprimierender Zellen zu sehen. Vergrößerung x50.
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Abbildung 31:Kultur transfizierter, Sca-1-negativer Knochenmarkzellen auf OEHSC, Tag 3. Die Zelle in der Bildmitte besitzt einen Sekundärfortsatz (Pfeilspitze) und weist ein deutliches Iba-1-Signal auf (b), das mit GFP kolokalisiert (c). In b und c sind Zellen zu sehen, die zwar Iba-1, nicht aber GFP exprimieren (Pfeile). Am ehesten handelt es sich dabei um intrinsische Mikroglia aus der Hirnschnitt-Kultur. Vergrößerung x250.
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Abbildung 32:Kultur Sca-1-negativer Knochenmarkzellen auf OEHSC. Tag 5 der Kokultur. Auf beiden Teilabbildungen sind zahlreiche ramifizierte GFP-positive Zellen zu sehen. Pfeile in a: Präparatrand. Vergr. x100 (a), x200 (b).
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Abbildung 33:Kultur Sca-1-positiver Knochenmark-zellen auf OEHSC. Tag 5 der Kokultur. Man erkennt GFP-positive Knochenmarkzellen entlang der Cortex-Hippocampus-Grenze (a - c). Der überwiegende Teil dieser Zellen kolokalisiert mit Iba-1 (c) und besitzt eine bipolare Form mit schmalen Zytoplasmafortsätzen (Pfeile). Der hohe Ordnungsgrad der der applizierten Knochenmarkzellen deutet auf ihre Integration in die lokalen Strukturen hin und läßt vermuten, dass sie mit ihrer Umgebung in Wechselwirkung stehen. Die Einschübe ina - c zeigen eine Zelle mit unipolar ansetzenden Ramifikationen. Vergrößerung x100, x400.
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Abbildung 34:Kultur Sca-1-neg. Knochenmarkzellen aus einem ß-Actin/GFP-transgenen Donortier auf OEHSC. Tag 5 der Kokultur. Die konstitutive GFP-Expression in den Knochenmarkzellen ist mit einem ebenso intensiven Fluoreszenzsignal verbunden wie bei GFP-transfiziertem Knochenmark (a). In einem Cluster von etwa 20 Zellen zeigen die meisten eine Kolokalisation von GFP und Iba-1 (c); einige weisen feine Ramifikationen auf (Pfeile in a - c). Der Rand des Hirnschnittes ist durch Sterne gekennzeichnet (b). Vergrößerung x200.
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Abbildung 35:Kultur von transfizierten, Sca-1-negativen Knochenmarkzellen auf OEHSC. Tag 8 der Kokultur. Es finden sich zahlreiche GFP-positive Zellen mit primären und sekundären Ramifikationen, die Immunoreaktivität für Iba-1 aufweisen (a – c, Vergrößerung x 200). Teilabbildung d zeigt die in a - c mit einem Pfeil markierte Iba-1-positive Zelle in 400-facher Vergrößerung; die haarfeinen Zellfortsätze sind gut zu erkennen.
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Abbildung 36:Kultur transfizierter, Sca-1-negativer Knochenmarkzellen auf OEHSC. Tag 8 der Kokultur. Die Bildreihen a – c inklusive der Einschübe zeigen ramifzierte Zellen mit Zytoplasmafortsätzen, in denen EGFP und Iba-1 weniger intensiv zur Darstellung kommen als im Zelleib und im Bereich des Zellkerns. Dennoch läßt sich die Kolokalisation beider Signale durch Übereinanderlagerung der Einzelbilder nachweisen. Vergrößerung x400.
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Abbildung 37:Kultur von transfizierten, Sca-1-positiven Knochenmarkzellen auf OEHSC. Tag 8 der Kokultur. Auch hier finden sich ramifizierte Zellen mit der Morphologie ruhender Mikroglia, die ein Doppelsignal aus GFP und Iba-1 (Texas Red) aufweisen (Pfeil). Vergrößerung x100.
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Abbildung 38: Kultur Sca-1-positiver Knochenmarkzellen aus einem β-Actin/GFP-transgenen Donortier auf OEHSC. Tag 8 der Kokultur. Die mit einem Stern markierte Zelle weist feine Ramifikationen auf, die durch das zytosolisch lokalisierte GFP erkennbar sind. GFP kolokalisiert mit dem Mikroglia-Marker Iba-1. Die Intensität des GFP, dessen Expression an die von b -Actin gekoppelt ist, hat im weiteren Verlauf der Kokultur nicht nachgelassen. Vergrößerung x200.
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Abbildung 39: Kultur von Knochenmark aus einem β-Actin/GFP-transgenen Donortier auf OEHSC. Tag 8 der Kokultur. Nahe dem Rand des Hirnschnittes (Pfeilspitzen in b) sieht man zwei Mikroglia-ähnliche Zellen, die GFP und Iba-1 koexprimieren (Pfeile in a - c). Vergrößerung x200.
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Abbildung 40: Kultur von Knochenmark aus einer β-Actin/GFP-transgenen Donormaus. Tag 8 der Kokultur. Die drei abgebildeten Zellen mit (peri)nukleär akzentuiertem GFP-Signal haben lange Zellausläufer ausgebildet und exprimieren das mikrogliale Antigen Iba-1. Vergrößerung x400.
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Abbildung 41: Kultur transfizierter,Sca-1-positiver Knochenmarkzellen auf OEHSC. Tag 5 der Kokultur. Wie auch in sämtlichen anderen Kokulturexperimenten auf organotypischen Hirnschnitten findet sich hier keine zelluläre Kolokalisation des EGFP-Signals mit GFAP. Die Knochenmarkzellen sind erheblich kleiner als die z. T. nur noch eingeschränkt anfärbbaren Astrozyten innerhalb des Hirnschnittes. Vergrößerung x100.
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