Wolfgang Daniel Schmitt: Expression und Regulation der MAPK-Phosphatasen im Ovarialkarzinom |
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Aus dem Institut für Pathologie
der Medizinischen Fakultät der Charité
Universitätsmedizin Berlin
Dissertation
Expression und Regulation der
MAPK-Phosphatasen im Ovarialkarzinom
Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)
vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité
Universitätsmedizin Berlin
von
Wolfgang Daniel
Schmitt
aus Saarbrücken
Dekan: Prof. Dr. Martin Paul
Gutachter:
1. Prof. Dr. Steffen Hauptmann
2. Prof. Dr. Sigurd Lax
3. PD Dr. Angela Reles
Datum der Promotion:14.03.2005
Zusammenfassung:
Phosphorylierung und Dephosphorylierung gehören zu den zentralen Regulationsmechanismen jeder Zelle. Während einer der bekanntesten Signalwege, der Mitogen-aktivierte Protein-Kinase(MAPK)-Signalweg bereits intensiv untersucht wurde, ist über die MAPK-Phosphatasen als wesentliche Inaktivatoren dieser Signalwegfamilie bisher nur wenig bekannt. Die MAPK-Signalwege sind in Tumoren häufig aktiv. Dies ließe sich durch aktivierende Mutationen der Kinasen oder ihrer übergeordneten Rezeptoren erklären. Ein anderer Ansatz geht von der stromalen Entzündungsreaktion aus, die viele solide Tumoren begleitet. Zytokine, die durch die Entzündungszellen gebildet werden, sind physiologische Aktivatoren der MAPK und eine fehlende Gegenregulation durch inaktivierende Phosphatasen würde ebenso zu hoher Aktivität der MAPK führen.
In der vorliegenden Arbeit wurde ein solches Entzündungsgeschehen in Ovarialkarzinomzellinien simuliert und die Reaktion der Phosphatasen MKP-1 und MKP-3 auf proinflammatorische Zytokine untersucht. MKP-1 und MKP-3 reagierten mit erheblichen Unterschieden auf die Zugabe proinflammatorischer Zytokine, das Reaktionsmuster reichte von starker Aktivierung (MKP-1 in SKOV-3 und OVCAR-3) bis hin zu verringerter Aktivität der Phosphatasen (MKP-1 in OAW42 und CAOV-3).
Zur Ergänzung der Zellkulturstudien wurde die Expression der Phosphatase MKP-1 in primären Ovarialkarzinomen, Zystadenomen sowie gesunden Ovarien immunhistochemisch untersucht. Der Proteinnachweis in insgesamt 101 Gewebeproben ergab eine signifikant geringere Expression der Phosphatase MKP-1 in Karzinomen im Vergleich zu normalem Ovarialepithel oder Zystadenomen. Innerhalb der Gruppe der Karzinome zeigte die MKP-1-Expression dennoch eine hohe Varianz, hierbei waren Malignome mit deutlicher MKP-1-Expression mit einer wesentlich schlechteren Prognose der Erkrankung verbunden. Die Phosphatase war in der multivariaten Analyse des rezidivfreien Überlebens ein unabhängiger Prognoseparameter (RR=4,03; 95%CI=1,72-9,48; p=0,001). Ein kürzeres rezidivfreies Überleben ist häufig mit der frühen Entwicklung von Chemoresistenzen verbunden. Ein möglicher Zusammenhang zwischen der Phosphatase MKP-1 und Chemoresistenz wurde in Zellkulturversuchen unter Verwendung von Cisplatin, einem wesentlichen Bestandteil der Standardchemotherapie bei Ovarialkarzinomen, untersucht. Die Expression der MKP-1 konnte durch Zugabe von Cisplatin deutlich induziert werden. Bemerkenswerterweise zeigten resistente Zellinien dabei eine frühe Reaktion, sensible Zellen reagierten deutlich verzögert. Diese frühe Induktion der MKP-1 könnte die therapeutisch induzierte Apoptose blockieren. Weitere Erkenntnisse über die daran beteiligten Signalwege sowie pharmakologische Inhibitoren der Phosphatasen sind daher vielversprechende Ansätze zur Optimierung der Chemotherapie.
Abstract:
Protein phosphorylation and dephosphorylation is a central regulatory system of cells. The mitogen-activated-protein-kinase(MAPK)-pathway as a typical example is one of the most investigated signalling pathways in cancers. In contrast, much less is known about MAPK-phosphatases, their physiological inactivators. MAPK pathways are frequently up-regulated in cancers. This might be explained by activating mutations of kinases or of up-stream receptors. Another view is based on the inflammatory stroma infiltrate that accompanies most solid carcinomas. Cytokines produced by inflammatory cells are physiological activators of MAPK pathways and missing balance of inactivating phosphatases would also result in up-regulated MAPK pathways. In this study, such an inflammatory situation was simulated in cell culture models and expression patterns of MAPK-phosphatases MKP-1 and MKP-3 were investigated after addition of proinflammatory cytokines. The expression of MKP-1 and MKP-3 after cytokine addition differed widely between the ovarian cancer cell lines investigated, ranging from strong induction in SKOV-3 and OVCAR-3 to down-regulation of phosphatases in OAW42 and CAOV-3.
In addition to cell culture experiments, expression of MKP-1 was examined immunohistochemically in primary ovarian cancers, adenomas and normal ovaries (total of 101 samples). There was a lower expression of phosphatase MKP-1 in ovarian cancers compared to surface epithelium of normal ovaries and cystadenomas. However, MKP-1 expression in the group of carcinomas showed a high variation, including also a number of negative cases. Among all investigated cancer samples, those with a higher expression of MKP-1 were associated with poorer prognosis. Multivariate survival analysis revealed this phosphatase as an independant prognostic factor for progression-free survival (RR=4,03; 95%CI=1,72-9,48; p=0,001). Short progression-free survival is usually associated with early development of chemoresistance. Consequently, poor prognosis might result from different efficiencies of initial adjuvant chemotherapeutical treatments. Based on this presumption, the effects of cisplatin, a typically used drug against ovarian cancer, were investigated in cell culture. The phosphatase MKP-1 was highly inducable by cisplatin, remarkably as early reaction in cisplatin-resistant cell lines and with distinct delay in sensitive cells. This early induction of MKP-1 in resistant cells might block drug-induced apoptosis. Further studies about influencing pathways and pharmacological inhibitors of phosphatase MKP-1 might be promising efforts to optimize chemotherapy.
Schlagworte:
Eigene Schlagworte:
MAPK-Signalweg,
Phosphatasen,
MKP-1,
Ovarialkarzinom,
Chemotherapie
Keywords:
MAPK-Pathway,
phosphatases,
MKP-1,
ovarian cancer,
chemotherapy
Inhaltsverzeichnis
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1
Einleitung
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1.1 Bedeutung und Hintergründe des Ovarialkarzinoms
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1.2 Tumor und Entzündung
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1.2.1 Entzündungsmediatoren fördern das Tumorwachstum
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1.2.2 Therapeutische Beeinflussung des Entzündungsgeschehens
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1.3
Der MAPK-Signalweg
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1.3.1 ERK-MAP-Kinase
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1.3.2 p38-MAP-Kinase
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1.3.3 JNK / SAPK-MAP-Kinase
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1.3.4
Funktionelle Bedeutung des MAPK-Netzwerkes
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1.4
Die Familie der MAPK-Phosphatasen
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1.4.1
MKP-1 / CL100
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1.4.2 MKP-3 / Pyst-1
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1.4.3 Weitere Phosphatasen
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1.4.4 Aktivität und Spezifität gegenüber MAP-Kinasen
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1.4.5
Funktionelle Bedeutung der Phosphatasen
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1.5
Fragestellung
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2
Material und Methoden
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3
Ergebnisse
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3.1 Basale MAPK-Phosphatasen-Expression (PCR)
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3.2 Regulation der Phosphatasen MKP-1 und MKP-3
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3.2.1 Auswahl der Aktivatoren und Zellinien
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3.2.1.1 Induktion der MKP-1 durch IL-1β und TNFα
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3.2.1.2 MKP-1-Induktion in Abhängigkeit von der Zellinie
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3.2.2
Zytokin-induzierte mRNA-Expression (MKP-1)
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3.2.3
p38-Aktivität im Zeitverlauf (Western-Blot)
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3.2.4 Untersuchungen der MKP-1 auf Proteinebene
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3.2.5
Zytokin-induzierte mRNA-Expression (MKP-3)
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3.3
Suppression der Phosphatasen durch verschiedene Inhibitoren
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3.3.1 Inhibitoren des MAPK-Signalweges
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3.3.1.1 Hemmung der MKP-1 in SKOV-3
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3.3.1.2 Hemmung der MKP-3 in SKOV-3
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3.3.2
Inhibitoren der atypischen PKC
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3.3.3 Inhibitoren des PI3K-Signalweges
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3.4
Expression im Ovarialkarzinom und prognostische Bedeutung
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3.4.1
Expressionsunterschiededer MKP-1 auf mRNA-Ebene in Tumormaterial
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3.4.2
Immunhistologische Untersuchungen
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3.4.3
MKP-1 ist in invasiven Karzinomen geringer exprimiert
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3.4.4
Univariate Überlebensanalyse
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3.4.4.1 Keine Korrelation der MKP-1 mit bekannten Prognosefaktoren
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3.4.4.2 MKP-1 hat keinen Einfluß auf das Gesamtüberleben
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3.4.4.3 Kürzeres rezidivfreies Überleben bei MKP-1-positiven Tumoren
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3.4.5
Multivariate Überlebensanalyse
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3.5
Phosphatasen-Induktion durch Cisplatin
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3.5.1 Induktion der MKP-1 durch Cisplatin in OVCAR-3
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3.5.2
Induktion der MKP-3 durch Cisplatin in OVCAR-3
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3.5.3
Verhalten der MKP-1 in einer Cisplatin-resistenten Zellinie
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4
Diskussion
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4.1 MAPK-Phosphatasen sind in verschiedenen Zellinien nachweisbar
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4.2 Beeinflussung der Phosphatasenexpression durch Zytokine
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4.2.1 Induktion der Phosphatase MKP-1
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4.2.2 komplexe Reaktion der Phosphatase MKP-3
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4.3
aktivierende Signalwege
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4.3.1 Einfluß der MAPK-Kaskade
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4.3.2
Einfluß der Protein Kinase C
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4.3.3 Bistabilität des MAPK-Signalweges
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4.4
MKP-1-Expression in primären humanen Ovarialkarzinomen
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4.4.1 Erhebliche Expressionsunterschiede auf mRNA-Ebene
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4.4.2 MKP-1 ist in invasiven Karzinomen geringer exprimiert
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4.5 Korrelation der MKP-1-Expression mit der Prognose
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4.5.1 Vergleich der MKP-1 mit klinisch-pathologischen Prognosefaktoren
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4.5.2 MKP-1 korreliert mit kürzerem rezidivfreiem Überleben
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4.5.3
MKP-1 ist unabhängiger Prognoseparameter
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4.6 Bedeutung der MKP-1 im Rahmen der Chemotherapie
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4.6.1 Die Bedeutung des MAPK-Signalweges bei der Apoptose
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4.6.1.1 JNK und p38 sind mit Apoptose assoziiert
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4.6.1.2
ERK wirkt anti-apoptotisch
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4.6.2 Die kritische Rolle der MKP-1 „zwischen Leben und Tod“
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4.6.3 Verhalten des MAPK-Signalweges unter Chemotherapeutika
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4.7 Ausblick
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Abkürzungsverzeichnis
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Literaturverzeichnis
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Publikationen
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Danksagung
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Selbständigkeitserklärung
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Lebenslauf
Tabellen
Bilder
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Abbildung 1: MAPK-Signalwege im Überblick12,15,16. Vereinfachte Darstellung. MEKK1 darstellungsbedingt doppelt aufgeführt. Transkriptionsfaktoren: MAPKAPK 5 = PRAK, p90RSK = MAPKAPK 1A
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Abbildung 2: funktionelle Signalmodule durch Gerüstmolekül JIP-112,16
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Abbildung 3: MAPK-Phosphatasen-Spezifität
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Abbildung 4: PCR-Screening. Gleichmäßige Expression von MKP-1 und MKP-3, MKP-5 lediglich in A27/80 reduziert. MKP-2 in PA-1, MDAH2774, ES-2 und CAOV-3 deutlich, in SKOV-3, A27/80 und OAW42 schwach und in OVCAR-3 nicht exprimiert. MKP-4 und B23 nicht oder nur schwach exprimiert.
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Abbildung 5: MKP-1-Northern Blot. Stimulation mit TPA, IL-1β und TNFα für 10 min, 30 min und 6 h. Deutliche Induktion 30 min nach IL-1β– oder TNFα–Zugabe in SKOV-3(A) und OVCAR-3(B). In OVCAR-3 Nachweis der MKP-1 noch 6 h nach IL-1β–Zugabe. SKOV-3 zeigt zusätzlich eine MKP-1-Expression 6 h nach TPA.
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Abbildung 6: MKP-1-Northern-Blot. SKOV-3 und OVCAR-3 zeigen keine basale Expression bei deutlicher Induzierbarkeit durch IL-1β und TNFα. OAW42 und CAOV-3 exprimieren MKP-1 bereits ohne Zytokin-Zugabe, nach Zugabe zeigt sich nur eine mäßige Steigerung.
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Abbildung 7: MKP-1-Northern-Blot. Zeitreihen in HOSE nach Zugabe von IL-1β(A) bzw. TNFα(B), jeweils Darstellung eines repräsentativen Blots und densitometrischer Quantifizierung. Mittelwert aus 2(A) bzw. 3(B) unabhängigen Versuchen mit Standardabweichung. *: Signifikanz zur Kontrolle. Nach IL-1β deutlicher Anstieg nach 30 min und bereits nach kurzer Zeit Rückgang zum basalen Level. Ähnliches Verhalten nach TNFα mit hoher Signifikanz nach 30 min (p=0,0001).
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Abbildung 8: MKP-1-Northern-Blot. Zeitreihen in SKOV-3 nach Zugabe von IL-1β(A) bzw. TNFα(B), jeweils Darstellung eines repräsentativen Blots und densitometrischer Quantifizierung. Mittelwert aus 3 unabhängigen Versuchen mit Standardabweichung. *: Signifikanz zur Kontrolle. Durch IL-1β signifikanter Anstieg nach 30 min (p=0,023) und 1 h (p=0,008), nach 3 h Rückgang auf Basalwert. Durch TNFα-Zugabe Anstieg nach 30 min (p=0,038) und 1 h (p=0,025). Nach 3 h Rückgang unter die Signifikanz-Grenze.
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Abbildung 9: MKP-1-Northern-Blot. Zeitreihen in OVCAR-3 nach Zugabe von IL-1β(A) bzw. TNFα(B), jeweils Darstellung eines repräsentativen Blots und densitometrischer Quantifizierung. Mittelwert aus 3 unabhängigen Versuchen mit Standardabweichung. *: Signifikanz zur Kontrolle. Durch IL-1β signifikanter Anstieg nach 30 min (p=0,0001), Höchstwert nach 1 h (p=0,019) und langsamer Abfall bis 24 h (3 h: p=0,009, 6 h: p=0,0004, 24 h:p=0,049). Durch TNFα-Zugabe kurzfristiger Anstieg nach 30 min, der jedoch keine Signifikanz erreicht (p=0,057).
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Abbildung 10: MKP-1-Northern-Blot. Zeitreihen in OAW42 nach Zugabe von IL-1β(A) bzw. TNFα(B), jeweils Darstellung eines repräsentativen Blots und densitometrischer Quantifizierung. Mittelwert aus 3 unabhängigen Versuchen mit Standardabweichung. *: Signifikanz zur Kontrolle. Keine Reaktion unter IL-1β. Nach TNFα zunächst signifikanter Anstieg nach 30 min (p=0,012), nach 1 h und 3 h signifikanter Abfall (1 h: p=0,036, 3 h: p=0,002).
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Abbildung 11: MKP-1-Northern-Blot. Zeitreihen in CAOV-3 nach Zugabe von IL-1β(A) bzw. TNFα(B), jeweils Darstellung eines repräsentativen Blots und densitometrischer Quantifizierung. Mittelwert aus 2(A) bzw. 3(B) unabhängigen Versuchen mit Standardabweichung. *: Signifikanz zur Kontrolle. Keine Reaktion unter IL-1β. Nach TNFα zunächst signifikanter Anstieg nach 30 min (p=0,002) und 1 h (p=0,020). Zum Zeitpunkt 3 h signifikanter Abfall unter den Kontrollwert (p=0,0001), nach 24 h erneuter Anstieg.
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Abbildung 12: p38-Western Blot. Deutliche Phosphorylierung nach 10 min und 30 min.
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Abbildung 13: MKP-3-Northern Blot. MKP-3-Induktion durch IL-1β(A) bereits nach 30 min bis über 72 h hinaus, Maximum bei 1 h. Nach TNFα(B) Induktion nach 30 min und 1 h.
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Abbildung 14: MKP-1-Northern-Blot. Einfluß der Inhibitoren SB203580 und PD 98059 auf die MKP-1-Expression in SKOV-3 nach Zugabe von TNFα. Darstellung eines Blots und densitometrischer Quantifizierung: Mittelwert aus 2 unabhängigen Versuchen mit Standardabweichung. *: Signifikanz TNFα-stimuliert zur unstimulierten Kontrolle. Die DMSO-Kontrolle reagiert signifikant auf TNFα (p=0,046), bei SB-Vorbehandlung (10 µM) zeigt sich keine Reaktion (p=0,941). Unter PD-Einfluß ergibt sich wieder eine signifikante Reaktion (p=0,015), die Dimension der DMSO-Kontrolle wird jedoch nicht erreicht.
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Abbildung 15: MKP-3-Northern Blot. Einfluß von MAPK-Inhibitoren auf die MKP-3-Expression unter TNFα in SKOV-3. Nach 30 min unabhängig von Stimulation deutlicher MKP-3-Rückgang durch PD98059. Etwas schwächere Reaktion unter SB203580. Keine eindeutige Inhibition nach 24 h.
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Abbildung 16: MKP-1-Northern-Blot. Einfluß der Inhibitoren GF109203X und Ro-31-8220 auf die MKP-1-Expression in SKOV-3(A) und OVCAR-3(B) nach Zugabe von IL-1β. Einfluß von hohen Konzentrationen des Inhibitors GF109203X auf die MKP-1-Expression in OVCAR-3 nach Zugabe von IL-1β und TNFα (C). Jeweils Blot und densitometrische Quantifizierung. Deutliche Inhibierung durch Ro in beiden Zellinien, nur geringe Reaktion auf 2,5µM und 5 µM GF. Bei einer GF-Konzentration von 20 µM mäßige Reduktion der MKP-1-Induktion nach IL-1β.
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Abbildung 17: MKP-3-Northern Blot. Einfluß der Inhibitoren GF109203X und Ro-31-8220 auf die MKP-3-Expression in OVCAR-3 nach Zugabe von IL-1β. Deutliche Inhibierung durch Ro, nur geringe Reaktion auf GF.
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Abbildung 18: MKP-1-Northern-Blot. Expressionsunterschiede in Tumormaterial ohne Korrelation mit histologischer Differenzierung oder Grading.
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Abbildung 19: MKP-1 Immunhistologie. Exemplarische Abbildung positiver und negativer immunhistologischer Färbungen.
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Abbildung 20: Univariate Analysen
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Abbildung 21: Multivariate Analyse
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Abbildung 22: MKP-1-Induktion in OVCAR-3 durch Cisplatin (repräsentative Abbildung aus 2 unabhängigen Versuchen)
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Abbildung 23: MKP-3-Northern Blot. Induktion in OVCAR-3 durch Cisplatin (repräsentative Abbildung aus 2 unabhängigen Versuchen)
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Abbildung 24: MKP-1-Induktion in A27/80 durch Cisplatin
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Abbildung 25: molekulare Struktur von Cisplatin und Transplatin
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XDiML DTD Version 4.0 | Zertifizierter Dokumentenserver der Humboldt-Universität zu Berlin | HTML-Version erstellt am: 10.05.2005 |