| [Seite 18↓] |
SKOV-3 (ATCC# HTB-77) |
Seröses Karzinom des Ovars |
Cell Lines Service, Heidelberg |
OVCAR-3 (ATCC# HTB-161) |
Seröses Karzinom des Ovars |
Cell Lines Service, Heidelberg |
OAW42 |
Seröses Karzinom des Ovars |
Cell Lines Service, Heidelberg |
CAOV-3 (ATCC# HTB-75) |
Seröses Karzinom des Ovars |
WAK Chemie Medical GmbH, Bad Soden |
A27/80 |
Seröses Karzinom des Ovars |
European Collection of Cell Cultures, Salisbury, England |
A27/80cis |
A27/80 Cisplatin-resistent |
PD Dr. H. Lage, Berlin |
ES-2 (ATCC# CRL-1978) |
Klarzellkarzinom des Ovars |
WAK Chemie Medical GmbH, Bad Soden |
MDAH 2774
|
Seröses Karzinom des Ovars |
WAK Chemie Medical GmbH, Bad Soden |
PA-1 (ATCC# CRL-1572) |
Teratokarzinom des Ovars |
Cell Lines Service, Heidelberg |
HOSE |
Oberflächenepithel des Ovars, durch HPV-Transfektion immortalisiert |
Dr. S.W. Tsao, Hong Kong, VR China67 |
I.M.A.G.E.-Consortium cDNA Clones68 lt. Tabelle 2, Vektor pT7T3D-Pac mod1 |
Resource Center of the German Human Genome Project Max Planck Institute for Molecular Genetics, Berlin IMAGE Consortium Homepage: http://image.llnl.gov |
|
Clone ID |
IMAGE ID |
enthaltene Phosphatase |
IMAGp998P205928Q2 |
2387203 |
DUSP1 |
IMAGp998D031197Q2 |
501842 |
DUSP6 |
Die Auswahl der Klone erfolgte unter Nutzung der Internetressourcen GenBank, UniGene und BLAST des National Center for Biotechnology Information der National Library of Medicine der National Institutes of Health, Bethesda, USA.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST
|
BCA Protein Assay Reagent |
Pierce, Rockford, USA |
|
Megaprime DNA Labelling System |
Amersham Pharmacia Biotec, Buckinghamshire, England |
|
Mini Prep Kit |
Qiagen, Hilden |
|
QIAEX II Gel Extraction Kit |
Qiagen, Hilden |
|
RNeasy Mini Kit |
Qiagen, Hilden |
|
RNeasy Midi Kit |
Qiagen, Hilden |
|
Super Sensitive Detection Kit |
BioGenex, San Ramon, USA |
α32P-dCTP 3000 Ci/mmol |
ICN Biochemicals, Eschwege |
| [Seite 22↓] |
human G3PDH cDNA control probe, cat# 9805-1 |
Clontech, Palo Alto, USA |
|
Primer lt. Tabelle 3 |
BioTez, Berlin |
Bezeichnung |
Sequenz |
Länge des |
GAPDH fwd |
5´-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3´ |
452 bp |
GAPDH rev |
5´-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3´ |
|
DUSP1 fwd |
5´-CCG CGC AAG TCT TCT TCC TC-3´ |
383 bp |
DUSP1 rev |
5´-GTC AAT GGC CTC GTT GAA CC-3´ |
|
DUSP4 fwd |
5´-GTT AAG CAG CGC CGC AGC AT-3´ |
409 bp (Var. 1) 410 bp (Var. 2) |
DUSP4 rev |
5´-TTC TGG CTG GCC TCG TCG TT-3´ |
|
DUSP5 fwd |
5´-AAG GAA GGC CAA GCC ATT AC-3´ |
514 bp |
DUSP5 rev |
5´-CTG AGA AGA GGT GGA ATG AG-3´ |
|
DUSP6 fwd |
5´-GAG GCC TTA TGC AGA AGC TC-3´ |
524 bp |
DUSP6 rev |
5´-CTA TGC GCT TGG AAG TCC TC-3´ |
|
DUSP9 fwd |
5´-AGC CGC GAG CTG TAC GAG TC-3´ |
449 bp |
DUSP9 rev |
5´-GCC TCG GAT TCC GCA TCA GA-3´ |
|
DUSP10 fwd |
5´-GCT GAA GAG GAG CGC CAG AT-3´ |
415 bp |
DUSP10 rev |
5´-GAG GTT CCG ATG GCA GTG GT-3´ |
Die Auswahl der Primersequenzen erfolgte mit Hilfe der Software Primer Designer V3.0
(Scientific & Educational Software).
DMEM, serumhaltig: |
500 |
ml |
DMEM |
DMEM, serumfrei: |
500 |
ml |
DMEM |
10 |
ml |
L-Glutamin |
10 |
ml |
L-Glutamin |
||
50 |
ml |
FCS |
LB-Medium: |
10 |
g |
Bacto Trypton |
LB-Medium mit |
1000 |
ml |
LB-Medium |
5 |
g |
Bacto Hefe Extrakt |
Agar: |
15 |
g |
Bacto Agar |
|
10 |
g |
Natriumchlorid | |||||
pH 7,0 einstellen | |||||||
ad 1000 |
ml |
H2O |
|
10 x PBS: |
82,3 |
g |
Di-Natriumhydrogenphosphat |
23,5 |
g |
Natrium-di-hydrogenphosphat |
|
40,0 |
g |
Natriumchlorid |
|
ad 1000 |
ml |
H2O |
|
pH 7,2 einstellen |
Tris-HCl 0,5M: |
30,25 |
g |
Tris-Base |
Tris-HCl 1,5M: |
90,75 |
g |
Tris-Base |
ad 500 |
ml |
H2O |
ad 500 |
ml |
H2O |
||
pH 6,8 einstellen |
pH 8,8 einstellen |
Tris-HCl 1,0M: |
60,50 |
g |
Tris-Base |
TE: |
1,0 |
ml |
1M TrisHCl |
ad 500 |
ml |
H2O |
0,2 |
ml |
0,5M EDTA |
||
pH 8,0 einstellen |
ad 100 |
ml |
H2O |
50 x TAE: |
242,0 |
g |
Tris-Base |
25 x MOPS: |
20,5 |
g |
Natriumacetat |
57,1 |
ml |
Essigsäure |
7,3 |
g |
EDTA |
||
100,0 |
ml |
EDTA 0,5M |
209,3 |
g |
MOPS |
||
ad 1000 |
ml |
H2O |
ad 1000 |
ml |
H2O |
||
pH 7,5 – 7,8 einstellen autoklavieren |
pH 7,0 einstellen |
20 x SSC: |
220,0 |
g |
Tri-Natriumcitrat-dihydrat |
DNA-Auftragspuffer: |
4,0 |
g |
Sucrose |
337,5 |
g |
Natriumchlorid |
2,5 |
mg |
Bromphenolblau |
||
ad 2500 |
ml |
H2O |
10 |
ml |
TE |
RNA-Auftragspuffer: |
300,0 |
µl |
deionisiertes Formamid |
|
22,5 |
µl |
25 x MOPS |
||
105,0 |
µl |
Formaldehyd |
||
3,0 |
µl |
Ethidiumbromid |
||
1 |
Krümel |
Bromphenolblau |
||
40,0 |
µl |
Glycerin |
Waschpuffer 1: |
1,0 |
g |
SDS |
Waschpuffer 2: |
1,0 |
g |
SDS |
(Northern Blot) |
100,0 |
ml |
20 x SSC |
(Northern Blot) |
5,0 |
ml |
20 x SSC |
ad 1000 |
ml |
H2O |
ad 1000 |
ml |
H2O |
Protein-Lysispuffer: |
1,2 |
ml |
0,5M Tris-HCl |
Western-Blot-Elektrophoresepuffer |
30,3 |
g |
Tris-Base |
|
2,0 |
ml |
10% SDS |
144,0 |
g |
Glycin |
|||
1,0 |
ml |
Glycerol |
2,8 |
g |
SDS |
|||
0,5 |
ml |
DTT |
ad 1000 |
ml |
H2O |
|||
5,3 |
ml |
H2O |
pH 8,3-8,4 einstellen |
WB-Sammelgel |
3,20 |
ml |
H2O |
WB-Trenngel |
3,2 |
ml |
H20 |
(4%) |
0,50 |
ml |
Acrylamid |
(12%) |
3,0 |
ml |
Acrylamid |
1,25 |
ml |
0,5M Tris-HCl |
2,5 |
ml |
1,5M Tris-HCl |
||
50 |
µl |
10% SDS |
100 |
µl |
10% SDS |
||
50 |
µl |
10% APS |
50 |
µl |
10% APS |
||
10 |
µl |
TEMED |
5 |
µl |
TEMED |
|
Immunhistologie – |
3,78 |
g |
Zitronensäure |
24,21 |
g |
Tri-Natriumcitrat-Dihydrat |
|
ad 1000 |
ml |
H2O |
|
pH 6,0 einstellen |
Chromatographiepapier 3MM CHR |
Whatman, Maidstone, England |
|
Deckgläser |
Menzel-Gläser, Braunschweig |
|
Filter |
Schleicher & Schuell, Dassel |
|
Hyperfilm ECL |
Amersham Pharmacia Biotec, Buckinghamshire, England |
|
Microtest Zellkulturplatten 96 well |
Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, USA |
|
Objektträger SuperFrostPlus |
Menzel-Gläser, Braunschweig |
|
Parafilm |
American National Can, Menasha, USA |
|
Petrischalen für Bakterien |
Falcon-Becton Dickinson, Le pont de Claix, Frankreich |
|
Petrischalen für Zellkultur |
Falcon-Becton Dickinson, Le pont de Claix, Frankreich |
|
Protein-Transfermembran Protran BA83 0,2 µm |
Schleicher & Schüll, Dassel |
|
RNA-Transfermembran Hybond N+ |
Amersham Pharmacia Biotec, Buckinghamshire, England |
|
Röntgenfilme Biomax MS |
Eastman Kodak, Rochester, USA |
|
Serologische Pipetten |
Falcon-Becton Dickinson, Le pont de Claix, Frankreich |
|
Zellkulturflaschen 75 cm2 |
Falcon-Becton Dickinson, Le pont de Claix, Frankreich |
|
Zellschaber |
Costar, Corning, USA |
|
Die Ovarialkarzinomzellinien SKOV-3, OVCAR-3, OAW42 und CAOV-3 wurden in 75 cm2-Zellkulturflaschen in Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium (DMEM) mit 10% FCS kultiviert. Für die Oberflächenepithelzellinie HOSE wurde MCDB 105 Medium und Medium 199 zu gleichen Teilen mit 15%igem FCS-Zusatz verwendet. Die Inkubation im Zellkulturschrank erfolgte in wassergesättigter Atmosphäre bei 37°C und einem 5%igen Volumenanteil CO2.
Alle Zellkulturarbeiten erfolgten unter einer sterilen Werkbank unter Verwendung steriler Materialien und Lösungen. Die Trypsin-Lösung wurde zusätzlich bei der Zugabe filtriert.
Der Austausch des Kulturmediums erfolgte alle 3-4 Tage. Bei ca. 80%iger Konfluenz wurden die Zellen wie folgt passagiert: Zunächst wurde das verbrauchte Medium abgesaugt und die Zellen mit 2 ml Trypsin gespült. Nach erneuter Absaugung wurde 1 ml frisches Trypsin über den gesamten Flaschenboden verteilt. Im Anschluß erfolgte die Inkubation bei 37°C, bis sich unter mikroskopischer Kontrolle alle Zellen vom Untergrund gelöst und vereinzelt hatten. Die Trypsinwirkung wurde durch Zugabe von 9 ml Medium gestoppt. Von der resultierenden Zellsuspension wurden abhängig von Zellinie 0,25 ml bis 5 ml in der Kulturflasche belassen und diese mit Medium auf 10 ml aufgefüllt.
| [Seite 26↓] |
Die aus der Passagierung zur Verfügung stehende Zellsuspension wurde je nach Bedarf mit Medium verdünnt und gleichmäßig in Petrischalen ausgesät. Nach der Ergänzung von Medium auf ein Volumen von jeweils 4 ml folgte die Inkubation im Brutschrank für 2-3 Tage. Nach dem Erreichen von mind. 70%iger Konfluenz wurde das Medium durch 4 ml serumfreies Medium ausgetauscht.
Am folgenden Tag erfolgte die Stimulation mit Zytokinen, TPA oder Cisplatin. Hierbei wurde für jeden Zeitpunkt eine bis auf die Stimulantienzugabe gleich behandelte Kontrolle, sowie pro Versuchsreihe eine zum Zeitpunkt 0 geerntete Kontrolle mitgeführt.
Sofern bei Versuchen Inhibitoren verwendet wurden, erfolgte deren Zugabe 30 min vor der Zytokinstimulation; den Kontrollen wurden gleiche Volumina des Inhibitor-Lösungsmittels DMSO zugesetzt.
Nach Ablauf der jeweiligen Inkubationszeit erfolgte die Zell-Lyse durch Zugabe von 100 µl des Protein-Lysis-Puffers pro Petrischale. Einer 5-minütigen Inkubationszeit auf Eis folgte die mechanische Ablösung mit Hilfe eines Zellschabers und die Überführung in Eppendorfgefäße. Durch mehrmaliges Aufziehen in eine Insulinspritze (0,45 mm-Kanüle) wurde die Homogenisierung abgeschlossen. Die Lagerung erfolgte bei –20°C.
Die Bestimmung der Protein-Konzentrationen erfolgte mit dem BCA Protein Determination Kit nach Pierce. Hierbei wird Cu2+ durch die Proteine reduziert, die reduzierten Cu+-Ionen bilden mit Bicinchoninsäure einen farbigen Komplex, dessen Farbintensität als Maß des Reaktionsumfangs in einem ELISA-Reader bei einer Wellenlänge von 562 nm quantifiziert wurde. Die Durchführung erfolgte nach den Anweisungen des Herstellers, die Inkubationszeit betrug 1 h. Mit Hilfe einer unter gleichen Bedingungen mitgeführten Protein-Standardreihe konnten die Protein-Konzentrationen berechnet werden.
| [Seite 27↓] |
Die Elektrophorese wurde als SDS-PAGE unter Verwendung eines 4%igen Sammel- und 12%igen Trenngels durchgeführt. Die Angleichung des Proteingehalts der einzelnen Proben geschah zuvor durch Zugabe von Lysispuffer. Weiterhin erfolgte eine 5-minütige Lyse bei 95°C. Die Auftrennung der Proben und eines Längenmarkers verlief über 30 min bei 30 V und anschließend über 90 min bei 100 V.
Der Transfer der Proteine auf eine Nitrozellulose-Membran erfolgte als Semi-Dry-System bei 100mA über 90 min. Durch die Inkubation in Blocking-Puffer über Nacht wurden unspezifische Bindungsstellen blockiert.
Die Primärantikörper gegen MAPK, Phospho-MAPK und ß-Actin wurden 1:1000 mit Blocking-Puffer verdünnt, die Inkubationszeit betrug 1,5 h. Nach mehrfachem Waschen mit Waschpuffer erfolgte die Zugabe des AP-gekoppelten, 1:5000 verdünnten Sekundärantikörpers für einen Zeitraum von 45 min. Die Zugabe des aktivierten Chemolumineszens-Systems CDP-Star nach erneutem Waschen und 4-minütiger Pufferung in Assay-Puffer ermöglichte die Belichtung von ECL-Hyperfilmen über unterschiedliche Zeiträume. Zur Auswertung wurden die entwickelten Filme densitometrisch quantifiziert.
Die RNA-Isolation erfolgte mit Hilfe des RNeasy Mini Kits. Hierzu wurde dem zum Kit gehörenden Lysispuffer RLT anweisungsgemäß 1% ß-Mercaptoethanol als RNase-Inhibitor zugesetzt. Nach dem Absaugen des Mediums wurde in jede Petrischale 600 µl Lysispuffer gegeben und durch 2-minütiges Schwenken gleichmäßig verteilt. Anschließend folgte eine 5 Minuten dauernde Inkubation auf Eis. Das Lysat wurde schließlich mit einem Zellschaber vollständig abgelöst und in Eppendorfgefäße pipettiert. Dort erfolgte durch mehrmaliges Pipettieren eine weitere Verflüssigung der gelartigen Substanz. Die Lagerung der Proben erfolgte bei –80°C.
Zur Ausfällung der DNA wurden zu jeder Probe 600 µl 70%iges Ethanol gegeben und die ausfallenden Fragmente durch Pipettieren zerkleinert. Das entstehende Gemisch wurde in zwei Schritten auf eine RNeasy-Säule geladen, diese jeweils 1 min bei 11.500 U/min zentrifugiert und das Filtrat verworfen. Die [Seite 28↓]spezifische Pufferzusammensetzung führte hierbei zur selektiven Bindung der RNA an die Säulenmembran. Es folgte die Zugabe von 700 µl RW1-Puffer, eine 2-3 minütige Inkubationszeit und eine erneute Zentrifugation bei 11.500 U/min für 1 Minute. In diesem Schritt wurden weitere nicht erwünschte Lysefragmente ausgewaschen. Durch die Zugabe von 500 µl RPE-Puffer, der zuvor mit Ethanol gemäß Anweisung vervollständigt wurde, und erneuter 1-minütiger Zentrifugation bei 11.500 U/min mußten nun die in den zuvor eingesetzten Lösungen enthaltenen Salze aus der Säule gelöst werden. Eine weitere Zugabe von 500 µl RPE-Puffer mit anschließender Zentrifugation bei 13.000 U/min für 2 Minuten schloß die Reinigung ab.
Die nun in der Säule verbliebene RNA wurde durch die zweimalige Zugabe von 30µl H2O, im ersten Schritt gefolgt von einer 10-minütigen Inkubationszeit, und jeweiliger Zentrifugation bei 11.500 U/min für 1 Minute in ein Eppendorfgefäß eluiert und bei –80°C gelagert.
Die Isolierung aus Tumormaterial erfolgte analog mit Hilfe des RNeasy Midi Kits nach den Empfehlungen des Herstellers.
Die Bestimmung der RNA-Konzentration beruht auf dem UV-Absorptionsmaximum von RNA bei einer Wellenlänge von 260 nm. Von jeder Probe wurden zur Doppelbestimmung zwei 1:50 Verdünnungen hergestellt, deren OD bei 260 nm im UV-Spektrometer bestimmt wurde. Aus dem Mittelwert ergibt sich unter Einbezug des Verdünnungsfaktors und eines weiteren, für einzelsträngige Nukleinsäuren geltenden Faktors von 40 µg/µl die Probenkonzentration.
Mittels Reverser Transkription wird die isolierte RNA in cDNA umgeschrieben, die als Basis für die folgende PCR dient. Hierzu wurde je Ansatz das 1 µg RNA enthaltende Volumen in einem 0,5 ml Eppendorfgefäß vorgelegt und auf 5 µl mit H2O ergänzt. Als Negativkontrolle diente ein weiterer, lediglich aus 5 µl Wasser bestehender Ansatz. Hinzu kamen jeweils 15 µl des Master-Mixes, der in einem getrennten Gefäß für alle Proben gemeinsam vorbereitet wurde und wie folgt zusammengesetzt war:
|
7 |
µl |
H2O |
2 |
µl |
10 x PCR-Puffer |
2 |
µl |
dNTP |
2 |
µl |
Hexamere |
1 |
µl |
RNasin (40 U) |
1 |
µl |
MMLV (200 U) |
Die Ansätze durchliefen im Thermocycler folgendes Programm:
10 |
min |
22°C |
(Anlagerung der Hexamere) |
45 |
min |
42°C |
(Transkription durch MMLV) |
5 |
min |
95°C |
(Denaturierung der Doppelstränge) |
Durch die PCR wird die vorgelegte cDNA durch vielfach wiederholte Denaturierung und Gegenstrangsynthese vervielfältigt. Die Spezifität wird durch ein für das jeweilige Produkt ausgewähltes Primerpaar erreicht, wovon sich jeweils ein Primer an den zu ihm komplementären Template-Strang anlagert und durch die Polymerase verlängert wird.
Als Template wurden je Probe 10 µl aus der Reversen Transkription vorgelegt, die um 90 µl Master-Mix, in einem getrennten Gefäß für alle Proben vorbereitet, ergänzt wurden. Der Master-Mix hatte folgende Zusammensetzung:
69,5 |
µl |
H2O |
10,0 |
µl |
10 x PCR-Puffer |
8,0 |
µl |
dNTP |
1,0 |
µl |
forward Primer (2 µM) |
1,0 |
µl |
reverse Primer (2 µM) |
0,5 |
µl |
AmpliTaq-Polymerase (2,5 U) |
Die Ansätze durchliefen im Thermocycler folgendes Programm:
a) |
1 |
min |
94°C |
(initiale Denaturierung) | |
b) |
1 |
min |
94°C |
(Denaturierung) |
|
c) |
1 |
min |
55°C |
(Annealing der Primer) |
|
d) |
1 |
min |
72°C |
(Elongation durch Polymerase) |
|
e) |
10 |
min |
72°C |
(finale Elongation) | |
f) |
∞ |
4°C |
Die Schritte b) – d) durchliefen 50 (Phosphatasen) bzw. 22 Zyklen (GAPDH).
| [Seite 30↓] |
Die elektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte erfolgte in 2%igem Agarose-Gel, das mit 1 x TAE-Elektrophoresepuffer unter Zusatz von 0,1‰ Ethidiumbromid gegossen wurde. Nach der Ergänzung von 10 Vol% DNA-Ladepuffer wurden von jeder Probe 10 µl, sowie zur Bestimmung der Fragmentlängen eine 100bp-Standard-Leiter aufgetragen. Die Elektrophorese erfolgte 30 min bei 100 V in 1 x TAE-Elektrophoresepuffer; die Banden wurden anschließend bei 254 nm auf einem UV-Transilluminator sichtbar gemacht und dokumentiert.
Zur Isolierung der DNA wurde das QIAEX II Gel Extraction Kit gemäß Anweisung des Herstellers verwendet.
Die Bestimmung der DNA-Konzentration erfolgte analog zur RNA-Konzentrationsbestimmung (Kapitel 2.2.4.2, S. 21), jedoch unter Verwendung des für DNA geltenden Faktors von 50 µg/µl.
Die Sequenzierung führte Herr Dr. Martin Meixner am Institut für Genetik der Humboldt-Universität Berlin durch.
Die Grundlage der Bakterienkultur waren die mit den Plasmiden transfizierten E. coli-Bakterien. Neben den Zielsequenzen enthalten die Plasmide ein Ampicillin-Resistenz-Gen, wodurch die Bakterien selektierbar waren. Daher wurde für alle hier beschriebenen Schritte das LB-Medium mit 30 µg/ml Ampicillin versetzt.
| [Seite 31↓] |
Die gelieferten E. coli-Pellets wurden mit jeweils 500 µl Medium überschichtet und 6 h bei 37°C im Schüttelinkubator inkubiert. Außerdem wurde pro Bakterien-Klon eine 10 cm-Petrischale mit 12 ml LB-Agar gegossen.
Nach der Inkubation wurden anfangs jeweils 200µl des Überstands auf einer Platte ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert. Das Ausstrichvolumen wurde aufgrund zu starken Wachstums bei einigen Klonen bis auf 30 µl reduziert.
Am Folgetag wurden je Klon 4 Einzelkolonien in etwa 4 ml Medium überführt und erneut über Nacht bei 37°C inkubiert. Hiervon wurden am nächsten Morgen jeweils 1,5 ml in ein Eppendorfgefäß überführt und 10 min bei 13.000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das Eppendorfgefäß durch Ausklopfen von verbliebener Flüssigkeit befreit und bei –20°C eingefroren.
Weitere 900 µl wurden jeweils mit 900 µl Glycerol versetzt und als Glycerolstock bei –80°C gelagert.
Die Isolierung der Plasmide aus den Bakterienpellets erfolgte mit Hilfe des Qiagen Mini Prep Kits. Hierzu wurden die Pellets in je 250 µl P1-Puffer resuspendiert und in ein neues Eppendorfgefäß überführt. Durch die Zugabe von 250 µl P2-Puffer wurde die alkalische Lyse zu einer klaren, gelartigen Substanz sowie der RNA-Verdau durch im Puffer enthaltene RNasen erreicht. Die Zugabe von 350 µl N3-Puffer führte zur Denaturierung der Proteine, außerdem wurden pH-Wert und Salzkonzentrationen auf das Optimum zur Bindung der DNA an die Mini Prep-Säulen eingestellt. Durch 10-minütige Zentrifugation bei 13.000 U/min erfolgte die Sedimentation der wolkig ausgefallenen Proteine zu einem weißen Pellet. Die Überstände wurden auf die Säulen überführt, die Pellets mit dem Eppendorfgefäß verworfen. Durch eine 1-minütige Zentrifugation konnte die an der Säulenmembran gebundene DNA von den weiteren Lösungsbestandteilen getrennt werden, letztere wurden mit dem Filtrat verworfen. Die noch vorhandenen Endonukleasen wurden durch Zugabe von 500 µl PB-Puffer und erneuter 1-minütiger Zentrifugation bei 13.000 U/min entfernt. Entsprechend erfolgte das Auswaschen der Salze durch 750 µl PE-Puffer.
Die nun in der Säule verbliebene DNA wurde durch 50µl des DNA stabilisierenden Puffers PE und Zentrifugation bei 13.000 U/min für 1 Minute in ein Eppendorfgefäß eluiert und bei –20°C gelagert.
| [Seite 32↓] |
Aus den zuvor isolierten Plasmiden wurden durch PCR die gewünschten Sondenabschnitte amplifiziert. Folgender PCR-Ansatz kam zur Anwendung:
2,0 |
µl |
Plasmid-Lösung, 1:100 mit H2O verdünnt |
12,5 |
µl |
H2O |
2,0 |
µl |
10 x PCR-Puffer |
1,0 |
µl |
dNTP |
1,0 |
µl |
forward Primer (2 µM) |
1,0 |
µl |
reverse Primer (2 µM) |
0,5 |
µl |
AmpliTaq DNA Polymerase (2,5 U) |
Die Kombination von Plasmid und Primern erfolgte gemäß der aus Tabelle 2 (S. 13) zu entnehmenden Zugehörigkeiten. Zu jedem Klon wurde eine H2O-Negativkontrolle mitgeführt.
Die Ansätze durchliefen im Thermocycler folgendes Programm:
a) |
60 |
s |
94°C |
(initiale Denaturierung) | |
b) |
60 |
s |
94°C |
(Denaturierung) |
|
c) |
90 |
s |
60°C |
(Annealing der Primer) |
|
d) |
90 |
s |
72°C |
(Elongation durch Polymerase) |
|
e) |
10 |
min |
72°C |
(finale Elongation) | |
f) |
∞ |
4°C |
Die Schritte b) – d) durchliefen 36 Cyclen.
Die elektrophoretische Auftrennung der amplifizierten DNA erfolgte in 1%igem Agarose-Gel, das mit
1 x TAE-Elektrophoresepuffer unter Zusatz von 0,1‰ Ethidiumbromid gegossen wurde. Nach der Ergänzung von 15 Vol% DNA-Ladepuffer wurden die vollständigen Ansätze sowie eine 100bp-Standard-Leiter zur Bestimmung der Fragmentlängen aufgetragen. Die Elektrophorese erfolgte
30 min bei 100 V in 1 x TAE-Elektrophoresepuffer.
| [Seite 33↓] |
Auf einem UV-Transilluminator mit einer Wellenlänge von 254 nm wurden im Anschluß die Banden sichtbar gemacht, auf die korrekte Länge überprüft und etwa 1-2 mm vor jeder zu isolierenden Bande ein schmales, bandenbreites Rechteck des Gels ausgeschnitten. Dieses wurde mit zuvor erhitzter 0,4%igen Low-Melting-Agarose großzügig ausgefüllt, anschließend das gesamte Gel zu deren Aushärtung 30 min bei 4°C inkubiert. Schließlich folgte eine erneute Elektrophorese für wenige Minuten, bis die gewünschte Bande unter UV im Low-Melting-Gel zu finden war. Dieses, nun die gebrauchsfertige Northern-Blot-Sonde enthaltend, wurde in ein Eppendorfgefäß überführt und bei –20°C gelagert.
Die Isolierung der RNA wurde bereits im Kapitel 2.2.4.1, S. 20 beschrieben. Deren elektrophoretische Auftrennung erfolgte in Agarose-Gelen folgender Zusammensetzung:
2 |
g |
Agarose |
156 |
ml |
H2O |
36 |
ml |
Formaldehyd |
8 |
ml |
25 x MOPS |
Formaldehyd und MOPS wurden erst nach dem Aufkochen und Abkühlen des Gels auf ca. 60°C zugegeben.
Von jeder Probe wurden 20 µl RNA-Lösung aliquotiert und aufgrund des beschränkten Taschenvolumens der Gele ca. 45 min im Vakuum reduziert. Anschließend wurden die Proben mit 18 µl RNA-Auftragspuffer versehen.
Die Proben wurden schließlich zur Degeneration 5 min auf 65°C erhitzt und bis zur Auftragung, jedoch mind. 2 min, auf Eis gelagert.
Die Elektrophorese erfolgte initial 10 min bei 240 V und eine weitere Stunde bei 200 V. Als Elektrophoresepuffer wurde 1 x MOPS verwendet.
Nach einer orientierenden Kontrolle der Auftrennung bei 254 nm auf einem UV-Illuminator wurde das Gel 20 min in H2O sowie 2 x 20 min in 20 x SSC gewaschen.
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Zum Transfer der aufgetrennten RNA auf eine Nylonmembran wurde folgender Blot luftblasenfrei aufgebaut: Auf einer Glasplatte, die eine mit 20xSSC gefüllte Wanne überdeckte, bildete ein auf 8,5 x 19,5 cm zurechtgeschnittenes Whatmanpapier die Basis. Darauf stellte ein weiteres Whatmanpapier in gleicher Breite, aber in Längsrichtung beidseits in die Wanne reichend, die Verbindung zum 20xSSC-Vorrat her. Das gewendete Gel, dessen Transferfläche durch Parafilm eingegrenzt wurde, sowie die auf Gelgröße zurechtgeschnitte Transfermembran folgten. Den Abschluß bildeten drei auf 7,5 x 19,5 cm zurechtgeschnittene Whatmanpapiere und 15 aus je zwei Lagen gefaltete Zellstoffpakete. Die Membran wurde zuvor in H2O aktiviert, anschließend wie alle Whatmanpapiere in 20 x SSC getränkt.
Der Transferturm wurde durch eine weitere Glasplatte abgedeckt und unter einem Gewicht von ca. 1 kg mind. 36 h inkubiert.
Nach dem Abbau erfuhr die Membran einen 5-minütigen Spülschritt in 2xSSC, nach der folgenden Lufttrocknung wurde die RNA im UV-Crosslinker fixiert.
Die radioaktive Markierung der zuvor hergestellten Sonden beruht auf der Neusynthese eines komplementären DNA-Strangs, in den 32P-markierte Nukleotide eingebaut werden. Hierzu wurde das Megaprime DNA Labelling System verwendet. Für jede zu hybridisierende Membran wurden 10 µl Sonde vorgelegt, 5 µl der im Kit enthaltenen Random-Primer und 18 µl H2O ergänzt. Zur Denaturierung wurden die Ansätze 5 min auf 99°C erhitzt. Anschließend wurden 10 µl Labelling-Puffer, 5 µl 32P-dCTP und 2 µl Klenow-Enzym hinzugefügt. Die Synthese des markierten Strangs erfolgte in der folgenden 30-minütigen Inkubation bei 37°C, nach der die Enzymaktivität durch 5 µl 0,2M EDTA gestoppt wurde. Zur Denaturierung der beiden Sondenstränge wurden die Ansätze nochmals 5 min auf 99°C erhitzt und direkt auf Eis gelagert, um eine erneute Hybridisierung der gerade getrennten Stränge zu vermeiden.
Zunächst erfolgte die 30-minütige Vorhybridisierung der Membranen mit jeweils 10 ml Hybridisierungslösung bei 68°C, bevor die Sonden zur 1-stündigen Hybridisierung bei gleichbleibender Temperatur zugegeben wurden. Anschließend erfolgten zwei 20- bis 30-minütige Waschschritte mit Waschpuffer 1 bei Raumtemperatur sowie zwei ebenfalls 20- bis 30-minütige Waschschritte mit Waschpuffer 2 bei 50°C. Schließlich folgte die Exposition von BIOMAX MS-Röntgenfilmen durch die in Haushaltsfolie versiegelten Blots unter Verwendung einer Verstärkerfolie bei –80°C.
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Zur Auswertung wurden die entwickelten Filme densitometrisch quantifiziert. Die Verrechnung potentieller Fehler, etwa bedingt durch unterschiedliche Auftragsmengen oder ungleichmäßigen Transfer, erfolgte durch den Vergleich mit einer GAPDH-Re-Hybridisierung der jeweiligen Blots. Bei Vergleichen verschiedener Blots diente die basale Expression zum Zeitpunkt 0 als Orientierung, diese erhielt willkürlich den Wert 100%.
Die immunhistochemische Analyse erfolgte retrospektiv an Proben der Routinediagnostik, bei denen das Einverständnis zur Verwendung für wissenschaftliche Untersuchungen vorlag. Die Auswahl wurde auf primäre Ovarialkarzinome aus den Jahren zwischen 1991 und 2001 mit ausreichend archiviertem Tumormaterial begrenzt. Das Kollektiv umfaßte 66 invasive primäre Ovarialkarzinome sowie 13 Borderline-Tumore. Weiterhin wurden 11 benigne Zystadenome sowie 11 normale Ovarien untersucht.
Alle Fälle wurden von Prof. Dr. med. Steffen Hauptmann hinsichtlich der klinisch-pathologischen Diagnose, histologischem Typ, Staging und Grading reevaluiert.
Das Gesamtüberleben wurde definiert als Zeit zwischen Diagnose und Tod, entsprechende Daten wurden vom Landeseinwohneramt unter Einhaltung der Richtlinien des Datenschutzes erfragt. Das rezidivfreie Überleben wurde bestimmt als Zeit zwischen Diagnose und dem Auftreten von lokalen oder fernen Rezidiven, die klinisch oder pathologisch festgestellt wurden. Entsprechende Aufzeichnungen waren für 46 der 66 Patientinnen mit primärem Ovarialkarzinom verfügbar.
Die ca 5 µm dicken Schnitte wurden zunächst in Xylol entparaffiniert, anschließend folgte die Fixation in absteigender Alkoholreihe. Eine 5-minütige Erhitzung unter Überdruck in Zitratpuffer ging der Antikörper-Färbung voraus, die bei 4°C mit dem 1:1000 verdünnten, polyklonalen MKP-1-Antikörper über Nacht erfolgte. Die Inkubation mit dem biotinyliertem anti-rabbit-Zweitantikörper sowie dem multilink biotin-streptavidin-amplified detection system erfolgte über jeweils 20 Minuten bei Raumtemperatur, die Anfärbung schließlich durch das fast-red chromogen system. Als Positivkontrolle wurde Nerven- und Gangliongewebe gefärbt69. Die immunhistologische Färbung erfolgte größtenteils durch Frau Ines Koch.
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Die Färbungen wurden unabhängig voneinander durch zwei Pathologen (Prof. Dr. med. Steffen Hauptmann und Dr. med. Carsten Denkert) ausgewertet. Die Einteilung erfolgte in MKP-1-negative Fälle (keine oder schwache Färbung) und MKP-1-positive Fälle (moderate und starke Färbung).
Die Signifikanz wurde in SPSS V10.0 unter Nutzung des χ²- bzw. des Fisher-Tests berechnet. Die univariaten Überlebenskurven entstanden nach der Methode von Kaplan und Meier, die vergleichende Signifikanz-Berechnung erfolgte mit dem log-rank-Test. Die multivariate Analyse basierte auf dem „Cox proportional hazard regression model“.
Generell wurden p-Werte < 0,05 als signifikant betrachtet.
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