↓40 |
Alle im Rahmen dieser Doktorarbeit untersuchten Patienten sind innerhalb sogenannter „advanced access“- Studien behandelt worden. Hierbei handelt es sich um drei multizentrische Phase II-Studien, CSTI571-0113/-0114/-0115.
↓41 |
In die Studie für CSTI571-0113-Patienten konnten ausschliesslich chronische Phase-Patienten rekrutiert werden, die bereits eine Therapie mit IFNα erhalten hatten. In die Studien für akzelerierte Phase bzw. Blastenkrise wurden sowohl Patienten mit vorangegangenen Therapien als auch Patienten mit neu diagnostizierter CML in akzelerierter Phase oder Blastenkrise aufgenommen. Im Folgenden sind die Ein- und Ausschlusskriterien der einzelnen Studien zusammengefasst.
Alle Studien umfassten nur Patienten mit einem Alter von mindestens 18 Jahren und mit Ph-Chromosom-positiver CML. Patienten, die Ph-Chromosom-negativ, aber BCR-ABL positiv waren, wurden ebenfalls eingeschlossen. Alle Studienteilnehmer mussten sich schriftlich einverstanden erklären.
Spezielle Einschlusskriterien für Patienten in chronischer Phase (CSTI571-0113):
Es wurden Patienten eingeschlossen, die entweder refraktär, resistent oder intolerant gegenüber einem IFNα-haltigen Therapieregimes waren. Die Kriterien waren folgendermaßen definiert:
↓42 |
Spezielle Einschlusskriterien für Patienten in akzelerierter Phase (CSTI571-0114):
1. Prozentsatz an Blasten in peripherem Blut oder Knochenmark 15% aber
↓43 |
2. 30%.
3. Prozentsatz an Blasten plus Promyelozyten im peripheren Blut oder Knochenmark 30% (vorausgesetzt, dass weniger als 30% Blasten im Knochenmark vorhanden sind).
4. Periphere Basophile 20%.
↓44 |
5. Thrombozytopenie < 100 x 109/L, unabhängig von der Therapie.
6. Klonale Evolution des leukämischen Klons.
7. Patienten, auf die die Kriterien für eine akzelerierte Phase zutreffen, dürfen vor Studienbeginn nicht in einer Blastenkrise gewesen sein.
↓45 |
Spezielle Einschlusskriterien für Patienten in Blastenkrise (CSTI571-0115):
8. Prozentsatz an Blasten in peripherem Blut oder Knochenmark > 30%.
9. Blastenkrise, definiert nach durchflusszytometrischen Kriterien.
↓46 |
10. Vorliegen extramedullärer Krankheit neben Milz, Lymphknoten und/oder Leberbeteiligung.
Für alle drei Studien galten folgende Ausschlusskriterien: eine mögliche Schwangerschaft, ein „Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) Performance Status Score“ größer als oder gleich 3, eine Kreatininkonzentration, die mehr als doppelt so hoch liegt wie der Höchstwert des Normalbereiches oder eine kardiale Erkrankung vom Grad 3 oder 4 (definiert nach den New York Heart Association (NYHA)-Kriterien).
Weitere Ausschlusskriterien waren speziell definierte pathologische Maximalwerte für Kreatinin, SGOT (AST), SGPT (ALT) und totales Serumbilirubin. Die Patienten mussten ausserdem zytotoxische Substanzen wie Hydroxyurea, AraC, Busulfan, IFNα, Homoharringtonin, Anthrazycline, Mitoxantron, Etoposid, Methotrexat oder Cyclophosphamid zu definierten Zeitpunkten vor dem Therapiebeginn mit Imatinib absetzen.
↓47 |
Im Rahmen dieser Arbeit wurden insgesamt 69 Patienten am Campus Virchow Charité, Humboldt Universität Berlin untersucht. Bei allen Patienten wurde die Diagnose einer BCR-ABL positiven CML durch Knochenmarksaspiration einschliesslich zellulärer, zytogenetischer und molekularer Analyse bestätigt. Zusätzlich zu dieser ersten Analyse wurde in wöchentlichen bzw. maximal monatlichen Abständen bei den Patienten eine Blutbildkontrolle mit Differentialblutbild und alle 12 Wochen eine Knochenmarkspunktion durchgeführt. Während der Studie wurde kein anderes zytoreduktives Medikament verabreicht. Tab. 4 und 5 fassen den klinischen Zustand vor Therapie mit Imatinib zusammen. Hierbei zeigt Tab. 4 die Verteilung des Geschlechtes und das mittlere Alter der Patienten, sowie die Therapiedauer vor Imatinib. Tab. 5 enthält Angaben über die mittlere Leukozytenzahl und die mittlere Thrombozytenzahl (A), sowie Angaben zur Zytogenetik (B) zu Beginn der Therapie mit Imatinib. Die mittleren Blutwerte repräsentieren jedoch nicht das Ergebnis einer vorangegangenen IFNα-Therapie, da laut Studienprotokoll die IFNα-Therapie zwei Wochen vor Beginn der Therapie mit Imatinib abgeschlossen sein musste.
Tabelle 4. Klinische Daten der Patienten vor Beginn der Imatinib-Therapie.
CSTI571-0113 |
CSTI571-0114 |
CSTI571-0115 |
insgesamt |
|
Patientenzahl |
37 |
21 |
11 |
69 |
Geschlecht (M : F) |
18 : 19 |
10 : 11 |
4 : 7 |
32 : 37 |
Mittl. Alter [Jahre] |
55,2 (23-80) |
54,8 (29-73) |
59,3 (32-82) |
56,4 (23-82) |
Mittl. Therapiedauer vor |
43,6 (7-184) |
51,1 (1-149) |
31,8 (7-74) |
126,5 (1-184) |
A: | ||||
CSTI571-0113 |
CSTI571-0114 |
CSTI571-0115 |
insgesamt |
|
Mittl. Leukozytenzahl [109/L] |
12,1 (3,4-96) |
56,1 (4,5-150) |
42,4 (0,3-182) |
36,7 (0,3-182) |
Mittl. Thrombozyt.-Zahl [109/L] |
420,8 (90-1134) |
546 (20-1650) |
217,3 (9-877) |
394,7 (9-1650) |
↓48 |
B: | |||
CSTI571- Studie (Patienten in n) |
0113 (n=37) |
0114 (n=21) |
0115 (n=11) |
Ph-positive Metaphasen: | |||
100% positiv |
31 (83.8%) |
18 (85,7%) |
10 (90,9%) |
weniger als 100% positiv |
5 (13.5%) |
2 (9,5%) |
1 (9,1%) |
Im Karyogramm zytogenetisch negativ |
| ||
Punctio sicca |
1 (4,8%) | ||
Andere chromosomale Aberrationen |
4 (10,8%) |
10 (48%) |
6 (54,5%) |
Tabelle 6. Chemikalien, Enzyme und Kits, die im Rahmen dieser Arbeit verwendet wurden.
Reagenzien |
Firma |
10x PCR Puffer PE |
Perkin Elmer Cetus, USA |
10x PCR Puffer Gibco |
Gibco BRL, Eggenstein |
Agarose |
Serva, Heidelberg |
Ammoniumchlorid |
Merck, Darmstadt |
Ampli Taq DNS Polymerase (5U/µl) |
Perkin Elmer Cetus |
Aqua dest. |
Braun, Melsungen |
Bovine Serum Albumin (BSA) |
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Freiburg |
Chloroform |
Merck, Darmstadt |
DEPC- Wasser |
Carl Roth Gmbh, Karlsruhe |
Desoxynukleosidtriphosphate–Set (dNTPs) (10mM) |
Gibco BRL, Eggenstein |
Dextran |
Roth, Karlsruhe |
Dinatriumsalz-Dihydrat (EDTA-Titriplex) |
Merck, Darmstadt |
DNS-Leiter 123 bp |
Gibco BRL, Eggenstein |
DTT (0.1mM) |
Gibco BRL, Eggenstein |
EDTA |
Merck, Darmstadt |
Eisessig (Essigsäure 100%) |
Merck, Darmstadt |
Ethanol |
Serva, Heidelberg |
Ethidiumbromid |
Serva, Heidelberg |
Gibco Taq Polymerase Platinum (5U/µl) |
Gibco BRL, Eggenstein |
Glycerol |
Gibco BRL, Eggenstein |
Isoamylalkohol |
Merck, Darmstadt |
Kaliumhydrogencarbonat |
Merck, Darmstadt |
Magnesiumchlorid [MgCl2] (50mM) |
Gibco BRL, Eggenstein |
Na-Acetat |
Merck, Darmstadt |
Natriumchlorid [NaCl] |
Merck, Darmstadt |
Nusieve (GTG-Agarose) |
FMC-Products |
Paraffinöl |
Merck, Darmstadt |
PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung (10x)) |
Gibco BRL, Eggenstein |
Proteinase K |
Merck, Darmstadt |
Pd(N)6 Random Hexamer Primer |
Amersham Biosciences GmbH, Freiburg |
Reagenzien |
Firma |
RNSclean |
Thermo Hybaid, Ashford, Middlesex, UK |
SDS (Dodecylsulfat-NaCl) |
Serva, Heidelberg |
Saccharose |
Serva, Heidelberg |
Superscript |
Invitrogen GmbH, Karlsruhe |
Trishydroxymethylaminomethan (Tris) |
Merck, Darmstadt |
Kits: | |
Qiaquick Gel Extraktions Kit |
Qiagen, Hilden |
Topo-TA Cloning Kit |
Invitrogen GmbH, Karlsruhe |
└► M13 Primer forward/ reverse (siehe 3.2.2) |
Rezepte
↓49 |
Dextranlösung: |
20 g Dextran |
(steril, 4°C, 5%) |
3,504 g NaCl |
400 ml Aqua dest. |
|
10x Lysepuffer: |
8,02 g 1,5M Ammoniumchlorid |
1,0 g 0,1M Kaliumhydrogencarbonat |
|
0,037 g EDTA mit 2H2O = Titriplex III |
|
100 ml Aqua dest. |
|
STE: |
1 ml 1 M Tris (pH 8,0) |
2 ml 5 M NaCl |
|
0,2 ml 0,5M EDTA (pH 8,0) |
|
96,8 ml Aqua dest. |
|
Proteinase K: |
100 mg gelöst in 5ml Aqua dest. |
(20 mg/ml, 20°C) | |
Na-Acetat: |
204,12 g ad 500 ml Aqua dest. |
(3 M, 20°C) | |
TE-Puffer: |
2ml 0,5M EDTA (pH 8,0) |
(pH 8,0 / 20°C) |
10ml 1M Tris (pH 8,0) |
1000ml Aqua dest. |
|
TAE-Puffer (1x): |
2,42 g Tris |
0,57 ml Eisessig |
|
1 ml EDTA (pH=0,8 / 0,5M) |
|
500 ml Aqua dest. |
|
Gelladepuffer: |
Succhrose (40%) |
Bromphenolblau (0,05-0,25%) |
|
10 ml Aqua dest. |
Sämtliche in dieser Arbeit verwendete Oligonukleotide wurden von TIB MOLBIOL, Berlin, synthetisiert. Tab. 7 listet die Oligonukleotide auf, die für die quantitative Echtzeitfluoreszenz-PCR verwendet wurden.
Tab. 8 stellt die Oligonukleotide zusammen, die im Rahmen der Mutationsanalyse und für den PNA-Clamping Assay verwendet wurden.
↓50 |
Funktion |
Name |
Primer-/ Sondensequenzen |
Actin [forward] |
RS-3 |
5´- AgCCTCgCCTTTgCCgA |
Actin [reverse] |
PS -Actin as |
5´- CTggTgCCTggggCg |
Actin- Sonde |
QT -Actin 6-FAM |
5´- 6FAM-CCgCCgCCCgTCCACACCCgCC XT p |
AGP [forward] |
α1 sGP |
5'- CCACCCTggACCAgATCACT |
AGP [reverse] |
α1 sGP04 rev |
5'- ATgTAggTCTTggTgTCCCTgA |
AGP- Sonde |
TM - α1 sGP01 |
5'- 6FAM-gCAAgTggTTTTTATATCgCATCggCCTT XT C p |
bcr-abl [forward] |
b2a2 |
5´- AgCATTCCgCTgACCATCA |
bcr-abl [reverse] |
abl 3 (78) |
5´- gCgTgATgTAgTTgCTTgggAC |
bcr-abl Sonde |
TM abl 3 |
5´- 6FAM-TTTgggCT XT CACACCATTCCCCATTg p |
MDR1 [forward] |
MDR103 |
5'- CCCATCATTgCAATAgCAggA |
MDR1 [reverse] |
MDR103 rev |
5'- gTTCAAACTTCTgCTCCTgAgTAC |
MDR Sonde |
TM- MDR101 |
5'- FAM-TTgTTgAAATgAAAATgTTgTCTggACAAgCACTgT XT- p |
WT 1 [forward] |
ET ex 6up |
5´- ACAgggTACgAgAgCgATAACCA |
WT 1 [reverse] |
WT ex 67re |
5´- CACACgTCgCACATCCTgAAT |
WT 1 Sonde |
TM WT fin |
5´- 6FAM-CAACgCCCATCCTCTgCggAgCCCA XT p |
M13- Primer [forward] |
5’- gTAAAACgACggCCA - 3’ |
|
M13- Primer [reverse] |
5’- CAggAAACAgCTATgAC - 3’ |
|
Funktion |
Name |
Primer-/ Sondensequenzen |
Forward Primer Thr315Ile |
ABLx4 F |
5'- TggggTCTgCACCCgCgCgC |
Forward Primer Glu255Lys und Tyr253His |
ABLx56 FM |
5'- CTATggTgTgTCCCCCAACTA |
Reverse Primer Thr315Ile, Glu255Lys und Tyr253His |
ABLx6 R |
R 5'- AgTggCCATgTACAgCAgCA |
Sensor Sonde Thr315Ile |
Sensor [T]s |
5'- gTTCTATATCATCA T TgAgTTC -LC Red 705 |
Sensor Sonde Glu255Lys |
Sensor 255 |
5'- CCCTCgTACACCA T CCCgTACT -LC Red 705 |
Sensor Sonde Tyr253His |
Sensor Val |
5'- CCCTCgTACACC A CCCCgTAC -LC Red 705 |
Anchor Sonde Thr315Ile |
Anchor |
5´- Red 640-gACCTACgggAACCTCCTggACTAC-p |
Anchor Sonde Glu255Lys und Tyr253His |
255 Anchor |
5'- LC Red 640-CCCCCgCCCAgCTTgTgCTTCA-p |
PNA Thr315Ile |
STI-T315 |
5'- TTCTATATCATCACTgAgTT |
PNA Glu255Lys und Tyr253His |
Y253E255 |
5'- CgTACACCTCCCCgTACT |
Abb. 6 zeigt schematisch die Positionen der einzelnen synthetischen Oligonukleotide zueinander, die in Tab. 8 aufgelistet sind.
↓51 |
Abbildung 6: Schematische Darstellung der Oligonukleotid-Positionen. Die Primer sind als Pfeile dargestellt und überspannen Exon 4 bis 6 der c-abl cDNS-Sequenz. Die Anchorproben tragen das Fluorochrom LC Red 640 für den Energietransfer, wogegen die Sensorproben mit einem Akzeptorfluorochrom LC 705 markiert sind und komplementär zu den spezifischen Mutationen sind. Die Balken symbolysieren die PNA [143]. | ||
Tabelle 9. Technische Geräte, die im Rahmen dieser Arbeit verwendet wurden.
Gerät |
Hersteller |
ABI PRISM 7700 SDS® |
Applied Biosystems, Foster CityUSA |
Bio Doc CCD-Camera |
Biometra, Göttingen |
Gene Quant® II (Spektrophotometer) |
Pharmacia Biotech |
LightCycler® |
Roche |
Megafuge® 1.0 |
Heraeus Instruments |
MicroAmp® Optical Caps |
Perkin Elmer, Foster City, USA |
MicroAmp® Optical Tubes |
Perkin Elmer, Foster City, USA |
Polyethylen-Reaktionsgefäße (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 ml) |
Eppendorf, Hamburg |
Polyethylenröhrchen (10 ml) |
Falcon, New Jersey, USA |
Reax® 2000 |
GFC |
TRIO®-Thermoblock |
Biometra |
Video Graphik Printer UP-890 CE |
Sony |
WIDE MINI SUB CELL® (Gelelektrophoresekammer) |
Biorad |
Zentrifuge 5403 |
Eppendorf, Hamburg |
Die Arbeit wurde auf einem IBM-kompatiblem Personal-Computer realisiert. Als Textverarbeitung kam MS Office 2000® (Microsoft Inc. Redmond, USA) zum Einsatz. Abbildungen wurden mit MS Excel®, Origin, Paint und Adobe Photoshop erstellt und bearbeitet. Die statistische Auswertung erfolgte durch das Programm SPSS, SPSS GmbH Software. Auf folgende Internetresourcen wurde zurückgegriffen: Medline/ Pubmed: http://www.ncbi.nlm.nih.govhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov
↓52 |
Blutproben wurden in sterile Heparinröhrchen entnommen und anschliessend sofort zur Weiterbearbeitung ins Labor gebracht.
10 ml Heparinblut wurden mit 2 ml Dextranlösung (steril, 4°C, 5%) versetzt und zur Sedimentation über 40 min bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Der daraufhin abgenommene Überstand wurde anschliessend über 6 min bei 1100 Umdrehungen/min (Upm) zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand zur Bestimmung des AGP Proteinspiegels verwendet. Die Zellen wurden in 10 ml Lysepuffer (1x) suspendiert und über 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Es folgte ein weiterer Zentrifugationsschritt für die Zellen in Lysepuffer (1x) über 6 min bei 1100 Upm. Der bei diesem Schritt entstandene Überstand wurde erneut verworfen und die resultierenden Zellen sogleich weiterverarbeitet.
Der AGP Proteinspiegel wurde in Zusammenarbeit mit Herrn Dr. Christian Müller im Institut für Labormedizin und Pathobiochemie, Campus Virchow, Charité, Humboldt Universität Berlin, durch immunoturbidimetrische Analyse im COBAS INTEGR400 System mit Hilfe einer COBAS INTEGRA AGP Kassette bestimmt. Dieser Assay basiert auf einer Mischung aus AGP Präzipitat mit spezifischem Antiserum, die turbidimetrisch bei 340nm analysiert wurde.
↓53 |
Die Blutproben der Studienpatienten wurden wöchentlich – vor und während der Therapie mit Imatinib – entnommen und direkt nach Dextran-Separierung analysiert. Der Assay war kalibriert für eine AGP Proteindetektion in einem Bereich von 16-400 mg/dl bei erwarteten Normalwerten von 50-120 mg/dl [112].
Die aus der Separierung resultierenden Zellen wurden in 1,5ml Reaktionsgefässen zunächst mit 900l RNSclean Detergenz und anschliessend mit beigefügtem 100l Chloroform-Isoamylalkohol resuspendiert. Nach 5 min auf Eis wurden die Reaktionsgefässe mit 13000-14000 Upm 30 min zentrifugiert. Der Überstand, max. 600 l, wurde sofort in ein neues Reaktionsgefäss überführt, welches schon 600 l gekühltes Isopropanol beinhaltete. Hierbei befanden sich in der Unter- und Interphase DNS und Proteine.
Um die somit gewonnene RNS zu präzipitieren, wurden die Reaktionsgefässe Weiterverarbeitung 15 min auf Eis gestellt. Anschliessend wurde 15 min auf höchster Stufe zentrifugiert, der Überstand abgehoben und verworfen. Es folgte eine Resuspendierung der RNS mit 500l Ethanol (steril, 4°C, 75%) und ein erneutes Zentrifugieren der Proben für nochmals 15 min bei 12000 Upm. Der Überstand wurde danach vollständig abgehoben und verworfen.
↓54 |
Nach Verdunsten des Restalkohols wurde die RNS in DEPC/H2O gelöst.
Die Reverse Transkription wurde wie im folgenden beschrieben durchgeführt (Tab. 10 zeigt hierbei den Ansatz (Reaktionsmix) für 1000 ng RNS):
Tabelle 10. Ansatz für die Reverse Transkription
Reagenz |
Konzentration |
Menge |
Random hex Primer |
100 µM |
1,0 µl |
DNTP (ATP, CTP, TTP, GTP) |
2,5 mM |
5,0 µl |
10x PCR-Puffer (Perkin Elkmer) |
2,0 µl |
|
DTT |
0,1 M |
2,0 µl |
RNSase-Inhibitor |
1,0 µl |
|
Superscript |
0,7 µl |
↓55 |
Zum Schluss wurden die Proben erneut für 1-2 min auf Eis gestellt und zur Aufbewahrung der cDNS bei -20°C gelagert.
Ein Aliquot der zu messenden DNS-Lösung wurde mit Aqua dest. oder TE-Puffer 1:50 verdünnt. Die Bestimmung der DNS-Konzentration erfolgte spektrophotometrisch (Quarzküvette, 1 cm Schichtdicke) durch Messung der Absorption bei einer Wellenlänge von 260 nm und 280 nm. Dabei entspricht die Extinktion von 1 bei doppelsträngiger DNS ungefähr einer Konzentration von 50 µg/ml (Sambrook et al. 1989). Um den Reinheitsgrad der DNS-Lösung zu ermitteln, wurde der Quotient der Extinktionen bei OD260/OD280 bestimmt.
↓56 |
Zur Erstellung von Standardkurven wurde die cDNS der jeweiligen Gene (AGP, MDR1, bcr-abl und WT1) mit spezifischen Primern aus Normalblut-cDNS in einer konventionellen PCR amplifiziert und dann in einen pCR2.1 Vector (TOPO TA Cloning Kit, Invitrogen, Leek, Niederlande) kloniert.
Einem Restriktionsverdau durch HindIII und XbaI (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland) folgte die Reamplifizierung mit M13-Primern und die anschliessende Aufreinigung der Plasmidfragmente (PCR Purification Kit, Qiagen, Hilden, Deutschland). Die Molekülzahl wurde durch eine optische Dichtemessung in einem Photometer bestimmt.
Tab. 11 zeigt den Ansatz für eine konventionelle PCR, die im Rahmen der Klonierung genetischer Fragmente verwendet wird.
↓57 |
Tabelle 11. Ansatz für eine konventionelle PCR.
Reagenz |
Konzentration |
Menge |
5` Primer |
10 µM |
1,25 µl |
3` Primer |
10 µM |
1,25 µl |
10x PCR-Puffer (Perkin Elmer) |
5,0 µl |
|
dNTP |
2,5 mM |
4,0 µl |
Ampli-Taq-Polymerase (Perkin Elmer) |
0,25 µl |
|
CDNS |
1,0/2,0 µl |
|
Aqua dest. |
bis zu einem Gesamtvolumen |
Die quantitative Echtzeitfluoreszenz-PCR für das Fusionstranskript des Major-bcr-abl und für das WT1 Transkript wurde in unserer Arbeitsgruppe durchgeführt und ist auch bereits publiziert [99,100]. Als quantitative Referenz benutzen wir das β-Actintranskript, das von Primern/ Sonde quantifiziert wird, ohne Pseudogene zu amplifizieren [100].
Tabelle 12. PCR-Ansatz für die Echtzeitfluoreszenz-PCR via Taqman.
Reagenz |
Konzentration |
Menge |
5` Primer |
10 µM |
2,5 µl |
3` Primer |
10 µM |
2,5 µl |
Sonde |
10µM |
0,5 µl |
dNTP |
2,5 mM |
4,0 µl |
10x PCR-Puffer (Gibco GBR) |
5,0 µl |
|
TE-Puffer (pH 8,0) |
0,8 µl |
|
MgCl2 |
50 mM |
4,5 µl |
Gibco-Taq-Platinum-Polymerase |
0,25 µl |
|
DNS-Probe |
2,0 l |
|
Aqua dest. |
27,95 µl |
|
Gesamt |
50,0 µl |
↓58 |
Tab. 13 stellt die jeweiligen PCR-Bedingungen für die einzelnen Gene dar.
Tabelle 13. Zyklusbedingungen für die PCR mittels Taqman für die einzelnen Gene.
PROGRAMM |
BCR-ABL |
AGP |
MDR1 |
WT1 |
ACTIN |
1. Initiale Denaturierung |
5 min bei 95°C |
5 min bei 95°C |
5 min bei 95°C |
5 min bei 95°C |
5 min bei 95°C |
2. Denaturierung |
1 min bei 95°C |
1 min bei 95°C |
1 min bei 95°C |
1 min bei 95°C |
1 min bei 95°C |
3. Annealing/Extension |
1 min bei 65°C |
1 min bei 63°C |
1 min bei 63 °C |
1 min bei 62°C |
1 min bei 67°C |
Zyklen (für 2 und 3) |
45 |
45 |
45 |
45 |
45 |
4. Abkühlung |
4°C |
4°C |
4°C |
4°C |
4°C |
Zur Quantifizierung der PCR-Produkte durch die Echtzeitfluoreszenz-PCR wird eine Standardkurve des jeweils zu bestimmenden Gens benötigt. Nach Aufreinigung und Konzentrationsbestimmung der klonierten Fragmente (siehe 3.3.4) wird eine Verdünnungsreihe hergestellt, die einen Bereich von 107 bis 100 Moleküle pro 100ng DNS in TE-Puffer, pH 8.0 und Aqua dest. umfasst.
↓59 |
Im Anschluss an eine Echtzeitfluoreszenz-PCR im LightCycler© kann durch Schmelzen – langsames Aufheizen von 45°C bis zu 85°C – im selben Ansatz eine qualitative Information über das Zielsequenzerzielt werden.
Diese Methode eignet sich vor allem zur Genotypisierung und Mutationsdetektion.
mrs:
Tabelle 14. PCR-Ansatz für eine Mutationsanalyse im Lightcycler.
Reagenz |
Konzentration |
Menge |
dNTP |
2,5 mM |
4,0 µl |
10x PCR-Puffer (Gibco GBR) |
2,5 µl |
|
TE-Puffer (pH 8,0) |
0,3 µl |
|
MgCl2 |
50 mM |
2,0 µl |
Bovines Serumalbumin (BSA) |
600 µg/ml |
0,3 µl |
5` Primer |
10 µM |
1,5 µl |
3` Primer |
10 µM |
1,5 µl |
Sonde |
10µM |
1,0 µl |
Anchor |
10µM |
1,0 µl |
Gibco-Taq-Platinum-Polymerase |
0,25 µl |
|
DNS-Probe |
1,0 l |
|
Aqua dest. |
9,65 µl |
|
Gesamt |
25,0 µl |
↓60 |
Ausgewählte PCR-Produkte wurden durch die Firma Agowa direkt von einem automatischen Sequenzer (ABI 710, Applied Biosystem) analysiert.
Um den Einfluss der Behandlung mit Imatinib auf CML-Patienten in chronischer Phase, akzelerierter Phase und Blastenkrise zu analysieren, wurde eine zweifaktorielle nicht-parametrische Varianzanalyse mit den Faktoren: molekulare Parameter und Zeit erstellt. Die statistische Auswertung erfolgte mit Unterstützung von Tanja Schink aus dem Institut für Medizinische Biometrie, Campus Charité Mitte, Humboldt-Universität Berlin [113].
© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme. | ||
DiML DTD Version 4.0 | Zertifizierter Dokumentenserver der Humboldt-Universität zu Berlin | HTML-Version erstellt am: 07.06.2005 |