Il-Kang Na: Zur Behandlung der chronischen myeloischen Leukämie mit dem selektiven bcr-abl Tyrosinkinaseinhibitor Imatinib: Molekulare Verlaufskontrollen und Untersuchungen zur Resistenzentstehung |
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Aus der Klinik für Innere Medizin mit Schwerpunkt für Hämatologie und Onkologie am Campus Virchow Klinikum der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin
DISSERTATION
Zur Behandlung der chronischen myeloischen Leukämie mit dem selektiven bcr-abl Tyrosinkinaseinhibitor Imatinib: Molekulare Verlaufskontrollen und Untersuchungen zur Resistenzentstehung
Zur Erlangung des akademischen Grades Doctor medicinae (Dr. med.)
vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité –
Universitätsmedizin Berlin
von
Il-Kang
Na
aus Berlin
Dekan: Prof. Dr. med. Martin Paul
Gutachter:
1. Prof. Dr. med. B. Dörken
2. Prof. Dr. med. C. Denzlinger
3. PD Dr. med. habil. E. Schleyer
Datum der Promotion:20.05.05
Meinen Eltern,
In-Soo Na und Young-Eu Na,
gewidmet
ABSTRACT
HINTERGRUND: Der selektive Tyrosinkinase-Inhibitor Imatinib inhibiert das Wachstum von bcr/abl positiven Zellen und stellt somit eine neue Therapieoption in der Behandlung der CML dar. Mittlerweile sind verschiedene Mutationen innerhalb der abl Sequenz beschrieben worden, die eine adäquate Imatinibbindung verhindern und zu einer zellulären Resistenz der CML Zellen führen.
METHODE: Wir untersuchten 69 Patienten unter Behandlung mit Imatinib im Rahmen von laufenden klinischen Studien. Bei Studieneinschluss waren 37 Patienten in chronischer Phase, 21 Patienten in akzelerierter Phase und 11 Patienten in Blastenkrise. Mittels Real-time PCR wurden bcr/abl, WT1, MDR1 und AGP RNA Traskripte aus peripheren Leukozyten quantifiziert. AGP Proteinlevel wurden turbidimetrisch bestimmt. Ausserdem entwickelten wir eine neue, hochsensitive Technik zur Detektion bekannter Mutationen innerhalb der bcr/abl Domäne, indem wir das DNA-Clamping mittels Peptidnukleinsäure (PNA) mit einem Hybridisationssonden-Assay kombinierten.
ERGEBNISSE: 1. Unsere Resultate bestätigen die hämatologische Effizienz von Imatinib in Übereinstimmung mit bereits publizierten Daten. 2. Eine komplette molekulare Remission konnte bei einem Patienten erzielt werden. 3. Wir konnten die bcr/abl Mutationen Thr315Ile, Glu255Lys and Tyr253His mit hoher Sensivität nachweisen. In einem Falle konnte die Gly255Lys Mutation vor der Behandlung detektiert werden.
SCHLUSSFOLGERUNG: Bcr/abl und WT1 mRNA stellen in der Behandlung der CML Verlaufs- und Prognosemarker dar. Ein Zusammenhang zwischen MDR1 mRNA bzw. AGP mRNA und einer Resistenzentwicklung gegenüber Imatinib konnte nicht bestätigt werden.
Durch den PNA-Clamping Assay konnten präexistente und sich entwickelnde bcr/abl Mutationen mit ungünstiger Prognose sicher und frühzeitig detektiert werden. Diese Tatsache ermöglicht eventuell eine Risikostratifizierung der CML und könnte als Model zum individuellen molekularen Monitoring und zur therapeutischen Strategie in anderen malignen Erkrankungen dienen.
Eigene Schlagworte:
CML,,
Imatinib, ,
Resistenz,,
PNA
ABSTRACT
BACKROUND: The selective tyrosine kinase inhibitor imatinib inhibits growth of bcr/abl positive cells and, thus, has become a novel therapeutic option for the treatment of Ph+ leukaemic patients. Various mutations within the abl sequence have been described that prevent adequate imatinib binding to bcr/abl resulting in cellular resistance of CML cells.
METHODS: We investigated 69 CML patients under treatment with imatinib as part of an ongoing clinical trial. At recruitment 37 patients were in chronic phase, 21 patients in accelerated phase and 11 patients in blast crisis. Bcr/abl, WT1, MDR1and AGP RNA transcripts were quantified in peripheral leucocytes by real time PCR. AGP protein levels in plasma were measured by turbidimetric analysis.
By combining peptide nucleic acid (PNA) based DNA clamping with a fluorescence hybridisation probe assay we developed a new and highly sensitive technique for the detection of known mutations within the bcr/abl kinase domain.
RESULTS: 1. Our results demonstrate efficacy of imatinib on the haematological level in accordance with previously published data. 2. Complete molecular remission could be achieved in one patient. 3. We could effectively enhance the detection sensitivity (0,2%) for the BCR/ABL mutations Thr315Ile, Glu255Lys and Tyr253His. In one case the Gly255Lys mutation was detectable before treatment.
CONCLUSION: Bcr/abl and WT1 mRNA are predictive marker in the treatment of CML. Our investigation could not confirm any relation between MDR1 mRNA nor AGP mRNA and a resistance to imatinib. By the PNA clamping assay pre-existing and evolving bcr/abl mutations associated with an unfavorable prognosis could be safely detected. This may facilitate risk stratification in CML and may serve as a model for individualized molecular monitoring and therapeutic strategies in other malignant diseases.
Keywords:
CML,,
imatinib, ,
resistance, ,
PNA
Inhaltsverzeichnis
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1 EINLEITUNG
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1.1 DIE CHRONISCHE MYELOISCHE LEUKÄMIE (CML)
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1.1.1 Historie
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1.1.2 Klinisches Erscheinungsbild der CML
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1.1.3 Hämatologische und zytologische Charakteristika der CML
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1.1.4 Pathomechanismus der CML
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1.1.5 Das Philadelphia-Chromosom
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1.2 DAS CHIMÄRE BCR-ABL PROTEIN
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1.2.1 Mechanismen der BCR-ABL vermittelten Transformation
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1.2.2 Diagnostik der CML
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1.2.3 Bisherige Therapieoptionen bei der CML
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1.2.4 Prognose der CML
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1.3 ECHTZEITFLUORESZENZ-POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
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1.3.1 Das Prinzip der Methode
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1.3.2 Das Prinzip der Taqman-Hybridisierungssonden
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1.3.3 Das Prinzip der HybProbe®-Hybridisierungssonden mittels Lightcycler
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1.3.4 DNA-Schmelzpunktanalysen
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1.4 PEPTIDE NUCLEIC ACID (PNA)-ASSAY
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1.5 DER BCR-ABL SPEZIFISCHE TYROSINKINASEINHIBITOR IMATINIB (STI 571)
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1.5.1 Imatinib – Struktur und Wirkungsmechanismus
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1.5.2 Untersuchung zur Wirkung im zellfreien System
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1.5.3 In vitro-Untersuchung zur Wirkung
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1.5.4 In vivo-Untersuchung zur Wirkung
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1.5.5 Klinische Studien mit Imatinib
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1.6 RESISTENZMECHANISMEN GEGEN IMATINIB UND PROGNOSTISCHE PARAMETER
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1.6.1 Intrinsische Resistenzmechanismen
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1.6.2 Extrinsische Resistenzmechanismen
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1.6.2.1 α1-saures-Glykoprotein (α1sGP, AGP)
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1.6.3 Molekulare Verlaufs- und Prognoseparameter
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2 FRAGESTELLUNG
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3 PATIENTEN, MATERIAL UND METHODEN
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3.1 PATIENTEN
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3.1.1 Klinische Studien
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3.1.2 Klinische Charakteristika des Studienkollektivs
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3.2 REAGENTIEN, OLIGONUKLEOTIDE UND GERÄTE
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3.2.1 Chemikalien, Enzyme, Kits und Rezepte
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3.2.2 Synthetische Oligonukleotide
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3.2.3 Technische Geräte
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3.2.4 Hard- und Software
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3.3 PROBENGEWINNUNG UND AUFARBEITUNG
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3.3.1 Blutaufarbeitung
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3.3.2 Dextran-Separierung, Serum zur AGP Proteinspiegelbestimmung
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3.3.3 RNS-Extraktion
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3.3.4 Reverse Transkriptase
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3.3.5 DNA-Konzentrationsbestimmung
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3.4 KLONIEREN GENETISCHER FRAGMENTE
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3.5 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR)
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3.5.1 Konventionelle PCR
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3.5.2 Echtzeitfluoreszenz-PCR
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3.5.3 Generierung von Standardkurven
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3.6 MUTATIONSANALYSE IM LIGHTCYCLER©
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3.7 DNA-SEQUENZIERUNG
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3.8 3.8STATISTISCHE AUSWERTUNG
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4 ERGEBNISSE
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4.1 THERAPIEERGEBNISSE
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4.1.1 Hämatologisches Ansprechen
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4.1.2 Zytogenetisches Ansprechen
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4.1.3 Nebenwirkungen
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4.2 AGP SERUMSPIEGEL
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4.3 ERGEBNISSE DER QUANTITATIVEN ECHZEIT-FLUORESZENZ-PCR
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4.3.1 Darstellung von Standardkurven
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4.3.2 bcr-abl mRNS Transkripte
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4.3.3 AGP mRNS Transkripte
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4.3.4 WT1 mRNS Transkripte
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4.3.5 MDR1 mRNS Transkripte
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4.4 4.4ERGEBNISSE DES CLAMPING-PROBE ASSAYS
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4.4.1 Methodenevaluation
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4.4.2 Mutationsnachweis bei therapierefraktären und rezidivierten Patienten
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5 DISKUSSION
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5.1 METHODENDISKUSSION
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5.2 AUSWERTUNG UND VERGLEICH DER STUDIEN CSTI571-0113/ -0114/ -0115
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5.2.1 Hämatologische und zytogenetische Daten der Studie CSTI571-0113
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5.2.2 Hämatologische und zytogenetische Daten der Studie CSTI571-0114
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5.2.3 Hämatologische und zytogenetische Daten der Studie CSTI571-0115
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5.2.4 Nebenwirkungen
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5.3 α1-SAURES-GLYKOPROTEIN (AGP): PROTEINCHEMISCHE UND MOLEKULARBIOLOGISCHE VERLÄUFE
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5.4 DISKUSSION DER BCR-ABL, WT1 und MDR1 mRNS DATEN
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5.5 DISKUSSION DER DATEN DES PNA-CLAMPING ASSAYS
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5.6 AUSBLICK
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6 ZUSAMMENFASSUNG
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ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
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Danksagung
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Eigenständigkeitserklärung
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Publikationsliste
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Literaturverzeichnis
Tabellen
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Tabelle 1. Befunde der einzelnen Phasen der CML im peripheren Blut und Knochenmark.
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Tabelle 2. Hämatologische und zytogenetische Ansprechraten unter Therapie mit Imatinib und IFN+AraC nach einem mittleren Follow-up von 19 Monaten [63]. 95%-Konfidenzintervall in runden Klammern. Definitionen des zytogenetischen Ansprechens: siehe Abschnitt 2.1.4.
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Tabelle 3. bcr-abl – Genmutationen, die bereits beschrieben und lokalsiert worden sind.
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Tabelle 4. Klinische Daten der Patienten vor Beginn der Imatinib-Therapie.
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Tabelle 5. Hämatologische Daten (A) und zytogenetische Daten (B) der Patienten vor Beginn der Imatinib-Therapie.
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Tabelle 6. Chemikalien, Enzyme und Kits, die im Rahmen dieser Arbeit verwendet wurden.
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Tabelle 7. Synthetische Oligonukleotide, die im Rahmen der quantitativen Echtzeitfluoreszenz-PCR verwendet wurden. „FAM“ steht für ein 6-Carboxy-Fluorescein Phosphoramidit, „X“ für ein 6-Carboxy-Tetramethyl-Rhodamin und „p“ für eine Phosphatgruppe. Die M13-Primer wurden bei der Klonierung eingesetzt.
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Tabelle 8. Synthetische Oligonukleotide, die zur Mutationsanalyse und für den PNA-Clamping Assay verwendet wurden. Bei LC Red 640 und 705 handelt es sich um Fluorochrome.
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Tabelle 9. Technische Geräte, die im Rahmen dieser Arbeit verwendet wurden.
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Tabelle 10. Ansatz für die Reverse Transkription
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Tabelle 11. Ansatz für eine konventionelle PCR.
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Tabelle 12. PCR-Ansatz für die Echtzeitfluoreszenz-PCR via Taqman.
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Tabelle 13. Zyklusbedingungen für die PCR mittels Taqman für die einzelnen Gene.
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Tabelle 14. PCR-Ansatz für eine Mutationsanalyse im Lightcycler.
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Tabelle 15. Klinische Daten der Patienten mit Rezidiv und ohne Rezidiv im Vergleich. N= Anzahl der Patienten.
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Tabelle 16. Klinische Daten zum hämatologischen Ansprechen und Rezidiveintritt, sowie die Anzahl refraktärer Patienten in den einzelnen CSTI571-Studien während der Imatinib-Therapie. N = Anzahl der Patienten.
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Tabelle 17. Darstellung der zytogenetischen Ergebnisse der Chronische Phase-Studie (CSTI571-0113) nach 3, 6 und 9 Monaten. Definitionen für komplettes, partielles und major Ansprechen siehe Kapitel 1.2.3. Suffizient waren die Analysen, wenn sie entweder mehr als 20 oder mehr als 10 analysierbare Metaphasen aufwiesen. N [%] = Anzahl der Patienten mit jeweiligen Ansprechen [Prozent zur Gesamtzahl]. ng= Gesamtzahl der Patienten.
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Tabelle 18. Darstellung der zytogenetischen Ergebnisse der Akzelerierte Phase-Studie (CSTI571-0114) nach 3, 6 und 9 Monaten. Definitionen für komplettes, partielles und major Ansprechen siehe Kapitel 2.1.4. Suffizient waren die Analysen, wenn sie entweder mehr als 20 oder mehr als 10 analysierbare Metaphasen aufwiesen. N [%] = Anzahl der Patienten mit jeweiligen Ansprechen [Prozent zur Gesamtzahl]. ng= Gesamtzahl der Patienten.
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Tabelle 19. Darstellung der zytogenetischen Ergebnisse der Studie der Blastenkrise (CSTI571-0115) nach 3 Monaten. Definitionen für komplettes/ Major und partielles Ansprechen siehe 2.1.4. Suffizient waren die Analysen, wenn sie entweder mehr als 20 oder mehr als 10 analysierbare Metaphasen aufwiesen. n [%]= Anzahl der Patienten mit jeweiligen Ansprechen [Prozent zur Gesamtzahl]. ng= Gesamtzahl der Patienten.
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Tabelle 20. Hämatologische und nicht hämatologische Nebenwirkungen.
Bilder
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Abbildung 1a: abl-Gen und korrespondierendes ABL-Protein. Schematisch gezeigt wird das abl-Gen, wie auch das dazu korrespondierende ABL-Protein. Die einzelnen Rechtecke repräsentieren die Exons. Pfeile (↑) kennzeichnen die Bruchstellen. Das abl-Gen besitzt zwei alternative Exone. TK steht für Abbildung 1: die kennzeichnende Tyrosinkinasedomäne. Die Länge der Fusionsproteine variiert mit der Größe der BCR-Sequenz. Die ABL-Sequenz ist in allen Fusionsproteinen konstant. (Abbildung modifiziert aus [141, 142]).
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Abbildung 1b: bcr-Gen und korrespondierendes BCR-Protein. Schematisch gezeigt wird das bcr-Gen, wie auch das dazu korrespondierende BCR-Protein. Die einzelnen Rechtecke repräsentieren die Exons. Pfeile (↑) kennzeichnen die Bruchpunkt-Clusterregionen (break point cluster regions: mBCR, MBCR und μBCR), welche in den 190-kD, 210-kD oder 230-kD Onkoproteine resultieren. M = major, m = minor und μ = micro (Abbildung modifiziert aus [141, 142]).
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Abbildung 2: Prinzip der quantitativen Echtzeitfluoreszenz-PCR via TaqMan. Die Taq-Polymerase hydrolisiert die Sonde durch ihre intrinsische 5´-3´-Nukleaseaktivität. Die räumliche Nähe, und damit der Fluoreszenz-Energietransfer, zwischen Reporter und Quencher wird auf diese Weise unterbrochen. Der Reporter emittiert nun ein Fluoreszenzsignal. Bei Reporter und Quencher handelt es sich um zwei verschiedene Fluorochrome. Forward Primer, Reverse Primer und die Sonde sind spezifische Oligonukleotide (Roche Handbuch).
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Abbildung 3: Energieübertragung im LightCycler©. Im Gegensatz zur Real-time PCR via TaqMan kommt es hier gerade nur dann zu Fluoreszenzemission, wenn sich Donor und Akzeptor in räumlicher Nähe befinden. Donor und Akzeptor stellen zwei verschiedene Fluorochrome dar. Hv ist die Lichtenergie, die den Donor anregt. Dadurch kommt es zu einem Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) [www.unizh.ch/ wwwikc/ md2003/landt_2003.pdf].
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Abbildung 4: Mutationsanalyse durch Erstellen von Schmelzkurven. Ein Mismatch oder Match zwischen Oligonukleotiden und spezifischer Gensequenz lässt sich durch eine Verschiebung in der ersten Ableitung der Schmelzkurve (dF/dt) unterscheiden. Spezifische Oligonukleotide, die 1-5 Nukleotide (nt) auseinander liegen, tragen den Fluoreszenz-Donor und den Fluoreszenz-Akzeptor [www.unizh.ch/wwwikc/ md2003/landt_2003.pdf].
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Abbildung 5: Schema der Struktur des Wirkungsmechanismus von Imatinib (STI 571). Imatinib blockiert die Adenosintriphosphatbindungsstelle und hemmt somit kompetitiv sowohl die ABL- als auch BCR-ABL Tyrosinkinase [aus dem Editorial, NEJM, 2001, 344, April 5, S. 1084].
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Abbildung 6: Schematische Darstellung der Oligonukleotid-Positionen. Die Primer sind als Pfeile dargestellt und überspannen Exon 4 bis 6 der c-abl cDNS-Sequenz. Die Anchorproben tragen das Fluorochrom LC Red 640 für den Energietransfer, wogegen die Sensorproben mit einem Akzeptorfluorochrom LC 705 markiert sind und komplementär zu den spezifischen Mutationen sind. Die Balken symbolysieren die PNA [143].
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Abbildung 7. Die Abbildung zeigt die medianen AGP Werte der Patienten in der Studie CSTI571-0113 (A), Studie CSTI571-0114 (B) und CSTI571-0115 (C). Nur in A und B sind die Patienten mit und ohne Rezidiv getrennt dargestellt. Auf der x-Abbildung 2: Abbildung 3: Achse ist die Therapiedauer und auf der y-Achse die AGP Plasmaproteinkonzentration angegeben. Die horizontale Linie begrenzt den oberen Normwert für die AGP Plasmakonzentration [120 g/dl]. Die Anzahl der Patienten zum Zeitpunkt 0 wird durch n angegeben.
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Abbildung 8. Diese Abbildung zeigt die seriellen Standardver-dünnungsreihen (101 bis 107 Kopien) von β-Actin(A), bcr-abl(B), WT1(C), MDR1(D) und AGP(E) mRNS. Auf der x-Achse ist jeweils die PCR-Zykluszahl und auf der y-Achse die relative Reporterfluoreszenz dargestellt. Die Steigung m wird bestimmtdurch eine Ausgleichsgerade, die durch die 1. Ableitungen der einzelnenStandardverdünnungen gezogen wird. Die Korrelation (korr.) der1.Ableitungen im Ctzur Ausgleichsgeraden stellt ein Mass für die Genauigkeit der jeweiligen Standardverdünnung dar.
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Abbildung 9. Verläufe der medianen [bcr-abl/β-actin] mRNS Ratio (y-Achse, logarhythmisch) für die einzelnen Studienkollektive im Verlauf der Therapie (x-Achse, linear). N stellt die Anzahl der Patienten dar.
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Abbildung 10. Diese Abbildung zeigt die Verläufe der medianen [AGP/β-actin] mRNS Ratio (y-Achse, logarhythmisch) für die einzelnen Studienkollektive im Verlauf der Therapie (x-Achse, linear). N ist die Anzahl der Patienten. In A und B werden die nicht rezidiverten und rezidivierten Patienten getrennt dargestellt.
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Abbildung 11. Diese Abbildung zeigt die Verläufe der medianen [WT1/β-actin] mRNS Ratio (y-Achse, logarhythmisch) für die einzelnen Studienkollektive im Verlauf der Therapie (x-Achse, linear). N ist die Anzahl der Patienten.
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Abbildung 12. Diese Abbildung zeigt die Verläufe der medianen [MDR1/β-actin] mRNS Ratio (y-Achse, logarhythmisch) für die einzelnen Studienkollektive im Verlauf der Therapie (x-Achse, linear). N ist die Anzahl der Patienten.
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Abbildung 13. stellt die Verdünnung von Tyr253His cDNA in Wildtyp-cDNA dar. Die Tyr253His cDNA, die aus dem Blut eines Patienten synthetisiert wurde, der diese Mutation entwickelte, wurde in Wildtyp cDNA eines gesunden Spenders verdünnt und anschliessend im etablierten PNA-Clamping Assay gemessen. NTK = non-Template-Kontrolle; WTK = Wildtyp-Kontrolle.
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Abbildung 14. Longitudinale Messungen der detektierten Mutation Thr315Ile und der bcr-abl mRNS bei Patienten 1, die refraktär gegenüber der Imatinib-Therapie war. A zeigt die Schmelzkurven der cDNA, während B die quantitative bcr-abl Last als Ratio zwischen Ziel- und Kontroll-Template (-Aktin) darstellt. Die Zeit der Imatinib-Therapie ist in Wochen angegeben. HR = Hämatologische Resistenz. NTK = non-Template-Kontrolle; WTK = Wildtyp-Kontrolle.
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Abbildung 15. Longitudinale Messungen der detektierten Mutation Glu255Lys und der bcr-abl mRNS bei Patient 3, der refraktär gegenüber der Imatinib-Therapie war. A zeigt die Schmelzkurven der cDNA, während B die quantitative bcr-abl Last als Ratio zwischen Ziel- und Kontroll-Template (-Aktin) darstellt. Die Zeit der Imatinib-Therapie ist in Wochen angegeben. NTK = non-Template-Kontrolle; WTK = Wildtyp-Kontrolle.
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Abbildung 16. Longitudinale Messungen der detektierten Mutation Tyr253His und der bcr-abl mRNS bei Patient 4, die refraktär gegenüber der Imatinib-Therapie war. A zeigt die Schmelzkurven der cDNA, während B die quantitative bcr-abl Last als Ratio zwischen Ziel- und Kontroll-Template (-Aktin) darstellt . Die Zeit der Imatinib-Therapie ist in Wochen angegeben. NTK = non-Template-Kontrolle; WTK = Wildtyp-Kontrolle
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DiML DTD Version 4.0 | Zertifizierter Dokumentenserver der Humboldt-Universität zu Berlin | HTML-Version erstellt am: 07.06.2005 |