Axel Hamprecht: Genetische Polymorphismen in Toll-like-Rezeptoren, rheumatoide Arthritis und Höhe von Rheumafaktor im Serum |
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Aus dem Institut für Mikrobiologie und Hygiene
der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin
DISSERTATION
Genetische Polymorphismen in Toll-like-Rezeptoren, rheumatoide Arthritis und Höhe von Rheumafaktor im Serum
Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)
vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin
von Axel
Hamprecht
aus Köln
Abstract
Die rheumatoide Arthritis (RA) ist die häufigste entzündliche Gelenkerkrankung der Welt. Sie verläuft meist chronisch-progressiv und kann schließlich zu Gelenkdestruktion und Invalidität führen. Trotz intensiver Forschungen bleibt die Pathogenese der RA weiterhin unklar. Neuere Untersuchungen weisen auf die wichtige Rolle des angeborenen Immunsystems hin, insbesondere der Toll-like-Rezeptoren (TLRs) TLR2 und TLR9. Genetische Polymorphismen in TLR2 und TLR9 könnten daher zur Erkrankung einer RA prädisponieren, davor schützen oder den Verlauf der RA beeinflussen. Zielsetzung dieser Arbeit war es, die Assoziation zwischen RA-Erkrankung, dem Rheumafaktor (RF)-Serostatus und der Höhe des RF im Serum und genetischen Polymorphismen im TLR2- und TLR9-Gen zu analysieren.
Zur Untersuchung der TLR9-Polymorphismen T-1237C und T-1486C wurde ein real-time-PCR-basiertes Verfahren am LightCycler (LC) etabliert, das den schnellen Nachweis beider Polymorphismen in einer Reaktion mittels fluoreszenzmarkierter Hybridisierungssonden ermöglicht. Desweiteren wurde ein neues Puffersystem verwendet, das die LC-PCR unter Verwendung einer konventionellen Taq-Polymerase zu erheblich günstigeren Kosten ermöglicht.
Die Genotypisierung der DNA von 118 RA-Patienten (89 weiblich, 29 männlich, Durchschnittsalter 56,2 Jahre) und einer geschlechtsgematchten Kontrollgruppe von 118 Personen (Durchschnittsalter 44,1 Jahre) zeigte, dass die TLR9-Polymorphismen T-1486C und T-1237C sowie der TLR2-Polymorphismus G2408A nicht für das Auftreten von RA prädisponieren. Träger des seltenen C-Allels sind signifikant häufiger RF-positiv (p=0,049) und ihre RF-Antikörperspiegel sind höher als bei Patienten, die das C-Allel nicht aufweisen (p=0,023). Der TLR9-Polymorphismus T-1486C könnte daher die Krankheitsausprägung beeinflussen.
Eigene Schlagworte:
Rheumatoide Arthritis,
Rheumafaktor,
Toll-like-Rezeptor,
Genetischer Polymorphismus,
LightCycler PCR
Abstract
Rheumatoid arthritis (RA) is the most common inflammatory joint disease worldwide. It is a chronic progressive disease which can eventually lead to joint destruction and disability. The pathogenesis of RA remains uncertain in spite of the intensive research in this field. Recent data indicate the important role of the innate immune system, especially of the toll like receptors (TLRs) TLR2 and TLR9 in the pathogenesis of RA. Genetic polymorphisms in the TLR2 and TLR9 gene could therefore predispose to RA, protect against it or influence its course.
The aim of this work was to analyse the association of RA, the serostatus of rheumatoid factor (RF) and its levels with genetic polymorphisms in the TLR2 and TLR9 gene.
A new real time PCR based method was developed on the LightCycler (LC) in order to analyse the TLR9 polymorphisms T-1237C and T-1486C. This method permits the fast detection of both polymorphisms in a single reaction using fluorescence labelled hybridization probes. Furthermore, a new reaction mix was developed which allows the use of a conventional Taq polymerase for the LC-PCR at much lower costs.
The genotyping of 118 RA patients (89 female, 29 male; average age 56.2 years) and a control group of 118 healthy individuals (average age 44.1 years) showed that the TLR9 polymorphisms T-1237C and T-1486C and the TLR2 polymorphism G2408A do not predispose to RA disease. The TLR9 polymorphism T-1486C might influence the course of the disease as individuals with the rare C-allele are significantly more frequent RF-positive (p=0.049) and their RF-antibody levels are higher than in patients who do not bear the C-allele (p=0.023).
Keywords:
rheumatoid arthritis,
rheumatoid factor,
toll like receptor,
LightCycler PCR,
genetic polymorphism
Dekan: Prof. Dr. med. Martin Paul
Gutachter:
1. Prof. Dr. med. Ralf Schumann
2. Prof. Dr. med. Andreas Krause
3. Prof. Dr. med. Eicke Latz
Datum der Promotion: 18.07.2005
Teile dieser Arbeit sind bereits veröffentlicht unter
Hamann, L.*, Hamprecht, A.*, Gomma, A. und Schumann, R.R. (2004)
Rapid and inexpensive real-time PCR for genotyping functional polymorphisms within the Toll-like receptor -2, -4, and -9 genes.
J Immunol Methods 285, 281-91
*contributed equally
Inhaltsverzeichnis
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1
Einleitung
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1.1 Entzündung und Krankheitsabwehr
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1.2 Rheumatoide Arthritis
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1.2.1 Definition und Epidemiologie
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1.2.2 Pathologische Charakteristika
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1.2.3 Rheumafaktor
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1.2.4 Diagnostik
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1.2.5 Therapie
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1.2.6 Ätiologie und Pathogenese
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1.2.7 Verlauf und Prognose
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1.3 Genetische Polymorphismen und Krankheitsdisposition
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1.3.1 Methoden zur SNP-Erkennung
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1.4 Regulation der Immunantwort
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1.4.1 Angeborenes und adaptives Immunsystem
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1.4.2 Toll-like-Rezeptoren
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1.5 Rheumatoide Arthritis und das angeborene Immunsystem
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2 Aufgabenstellung
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3 Materialien und Methoden
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3.1 Patientenproben
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3.2 Chemikalien und Reagenzien
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3.3 Enzyme
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3.4 Puffer
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3.5 Synthetische Oligonukleotide
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3.6 Kitsysteme
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3.7 Einwegmaterialien
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3.8 Geräte
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3.9 Software
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3.10 Molekularbiologische Methoden
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3.10.1 Isolierung von DNA durch Phenol-/Chloroform-/Isoamylextraktion und Ethanolpräzipitation
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3.10.2 Genotypisierung durch Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen (RFLP) und Hybridisierungssonden
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3.10.3 Real-time-PCR-basierte Genotypisierung von Polymorphismen am LightCycler mittels eines neuen Reaktionsmixes
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3.10.3.1
Genotypisierung der TLR9-Polymorphismen T-1486C und T-1237C
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3.10.3.2
Genotypisierung des TLR-2-Polymorphismus G2408A
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3.10.4 Genotypisierung durch Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen
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3.10.4.1 RFLP des TLR9-Polymorphismus T-1486C
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3.10.4.2 RFLP des TLR9-Polymorphismus T-1237C
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3.10.4.3 RFLP des TLR2-Polymorphismus G2408A
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3.10.5 Agarose-Gelelektrophorese von PCR-Produkten für analytische Zwecke
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3.10.6 Bestimmung der DNA-Konzentration von genomischer DNA
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3.10.7
Cycle Sequencing von PCR-Produkten
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3.11 Statistische Auswertung
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4 Resultate
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4.1
Analyse der Transkriptionsfaktorbindungsstellen an den Positionen der TLR9-Polymorphismen T-1237C und T-1486C
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4.2 LightCycler-PCR zur Detektion der TLR9-Polymorphismen T-1486C und T-1237C
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4.3 RFLP zur Detektion der TLR9-Polymorphismen T-1237C und T-1486C
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4.4 Der TLR9-Polymorphismus T-1237C bei RA-Patienten und Gesunden
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4.4.1 Verteilung der Genotypen des T-1237-Polymorphismus
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4.4.2 Allelhäufigkeiten des T-1237-Polymorphismus
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4.5 Der TLR9-Polymorphismus T-1486C bei RA-Patienten und Gesunden
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4.5.1 Verteilung der Genotypen des T-1486C-Polymorphismus
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4.5.2 Allelhäufigkeiten des T-1486C-Polymorphismus
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4.6 Der TLR2-Polymorphismus G2408A bei RA-Patienten und Gesunden
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4.6.1 Verteilung der Genotypen des G2408A-Polymorphismus
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4.7 TLR-Polymorphismen bei RF-positiven und RF-negativen RA-Patienten
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4.8 Rheumafaktorspiegel in Abhängigkeit vom TLR9- und TLR2-Genotyp
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5 Diskussion
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5.1 Real-time-PCR zur Detektion der TLR9-Polymorphismen T-1237C und T-1486C
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5.1.1 Vor- und Nachteile gegenüber der bisherigen Methode zur TLR9-Genotypisierung
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5.2 Assoziation von genetischen Polymorphismen in TLR9 und TLR2 mit dem Auftreten von rheumatoider Arthritis
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5.2.1 Der TLR9-Polymorphismus T-1486C
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5.2.2 Der TLR9-Polymorphismus T-1237C
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5.2.3 Der TLR2-Polymorphismus G2408A
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5.3 TLR9- und TLR2-Polymorphismen bei RF-positiven und -negativen Patienten und Höhe von RF bei verschiedenen Genotypen
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5.3.1 Bedeutung des TLR9-Genotyps für die Rheumafaktor-Produktion
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5.4 Fehlermöglichkeiten und Grenzen dieser Studie
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5.5 Ausblick
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6 Zusammenfassung
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Literaturverzeichnis
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Abkürzungsverzeichnis
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Erklärung an Eides statt
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Danksagung
Tabellen
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Tab. 1: TLRs mit ihren wichtigsten Liganden (modifiziert nach Takeda et al, 2003)
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Tab. 2: Primer für Standard-PCR
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Tab. 3: Primer für real-time-PCR
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Tab. 4: Sonden für real-time-PCR Fluoreszein (FL), LightCycler Red-640 (LC Red640), LightCycler Red-705 (LC Red705)
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Tab. 5: Parameter für die LC-PCR zur TLR9-Genotypisierung (Roche-Puffer)
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Tab. 6: Parameter für die LC-PCR zur TLR9-Genotypisierung (ABgene-Puffer)
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Tab. 7: Parameter für die LC-PCR zur G2408A-Genotypisierung (Roche-Puffer)
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Tab. 8: Parameter für die LC-PCR zur G2408A-Genotypisierung (ABgene-Puffer)
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Tab. 9: PCR-Parameter zur Genotypisierung des T-1486C-Polymorphismus mittels RFLP
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Tab. 10: PCR-Parameter zur Genotypisierung des T-1237C-PM mittels RFLP
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Tab. 11: PCR-Parameter zur Genotypisierung des G2408A-PM mittels RFLP
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Tab. 12: Parameter zum Cycle-Sequencing von PCR-Produkten
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Tab. 13: Schmelzpunkte der Sonden
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Tab. 14: Häufigkeit der verschiedenen Genotypen im TLR9-Polymorphismus T-1237C Fallzahl (N), Freiheitsgrade (Fg)
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Tab. 15: Häufigkeit der verschiedenen Allele im TLR9-Polymorphismus T-1237C Freiheitsgrade (Fg), Odds ratio (OR), Konfidenzintervall (KI)
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Tab. 16: Häufigkeit der verschiedenen Genotypen des TLR9-Polymorphismus T-1486C
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Tab. 17: Häufigkeit der verschiedenen Allele im TLR9-Polymorphismus T-1486C
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Tab. 18: Häufigkeit der verschiedenen Genotypen des TLR2-Polymorphismus G2408A
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Tab. 19: Allelhäufigkeit des TLR9-Polymorphismus T-1237C bei RF-positiven und RF-negativen Patienten; Freiheitsgrade (Fg), Odds ratio (OR), Konfidenzintervall (KI)
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Tab. 20: Allelhäufigkeit des TLR9-Polymorphismus T-1486C bei RF-positiven und RF-negativen Patienten
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Tab. 21: Allelhäufigkeit des TLR2-Polymorphismus G2408A bei RF-positiven und RF-negativen Patienten (χ2-Test nicht anwendbar, da zwei Zellwerte < 5)
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Tab. 22: T-1486C-Genotypen bei RF-positiven und –negativen RA-Patienten (χ2-Test nicht anwendbar, da ein Zellwert < 5)
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Tab. 23: RF-Werte (ELISA, units/ml) bei den verschiedenen TLR2- und TLR9-Genotypen C: Alle Träger eines C-Allels (Genotypen CT und CC)
Bilder
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Abb. 1: Akute und chronische Inflammation Nach einer Verletzung entwickelt sich abhängig von Mediatoren und weiteren Faktoren die akute oder chronische Entzündung, die schließlich zur kompletten Wiederherstellung (restitutio ad integrum), zur Abszessbildung oder zur Reparation führen (verändert nach Cotran, 1999a)
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Abb. 2: Signaltransduktion bei IL-1R/TLR/Toll (nach Dunne und O’Neill, 2003) Nach Bindung eines Liganden (z.B. LPS) kommt es über mehrere Adaptermoleküle zur Aktivierung eines Transkriptionsfaktors (NF-κB oder Dorsal), der die Expression verschiedener Gene induziert. Interleukin (IL), IL-1 receptor-associated kinase (IRAK), tumor necrosis factor receptor-associated factor 6 (TRAF6), Inhibitor von κB (IκB), nuclear transcription factor κB (NF-κB), Peptidoglykan (PGN), IL-1-Rezeptor (IL-1R), Adapterproteine MD-2 und MyD88, Lipopolysaccharid (LPS)
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Abb. 3: Das TLR9-Gen mit einer Auswahl von SNPs Der Austausch der Basen ist gekennzeichnet, die Lage der SNPs ist jeweils relativ zum Translationsstart (Startcodon=0) angegeben. Der Transkriptionsstart (TS) liegt bei – 638 bp (nach Lazarus et al., 2003).
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Abb. 4: Genotypisierung am LightCycler
A: Prinzip der LightCycler-PCR. Die Sensorsonde hybridisiert mit dem DNA-Bereich, in dem der SNP vorliegt. Das 3’-Ende der Sensorsonde ist mit Fluoreszein markiert (Donor-Fluorophor). Die Ankersonde bindet wenige Basenpaare entfernt vom 3’-Ende der Sensorsonde. Das 5’-Ende der Ankersonde ist mit LightCycler Red markiert (Akzeptor-Fluorophor)
B: Prinzip des FRET. Wird der Donor-Fluorophor durch einen Lichtimpuls (hν) angeregt, kommt es zur Energieübertragung auf den Akzeptor-Fluorophor. Bei niedrigen Temperaturen kommt es sowohl beim Wildtyp-Allel (linke Abb.) wie auch beim mutierten Allel (rechte Abb.) zum FRET.
C: Bei höheren Temperaturen löst sich die Sonde bei Vorliegen des mutierten Allels (SNP), während sie beim Wildtyp-Allel noch bindet. Es kann daher bei Existenz des mutierten Allels keine Energie
über
tragung mehr stattfinden.D: Resultierende Schmelzkurven. Das Wildtyp-Allel weist einen höheren Schmelzpunkt (SP) als das mutierte Allel auf (verändert nach Roche AG, 1998)Fluorescein (FL), Schmelzpunkt (SP), Lichtimpuls (hν)
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Abb. 5: Erste negative Ableitung der Schmelzkurven, Darstellung der Schmelzpunkte (SP) Die homozygote Mutante (HM) weist einen niedrigen Schmelzpunkt auf, bei Vorliegen des Polymorphismus in heterozygoter Form (HZ) treten zwei Schmelzpunkten auf. Der Wildtyp (WT) hat einen höheren Schmelzpunkt als die homozygote Mutante.
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Abb. 6: Prinzip der TLR9-LightCycler-PCR Fluoreszein (FL), LightCycler Red (LCred), Primer TLR9s/TLR9as, Polymorphismen T-1486C und T-1237C. Die Länge des PCR-Produktes beträgt 499 Basenpaare.
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Abb. 7: Neue c-Rel/NF-κB-Bindungsstelle durch den T-1237C-Polymorphismus
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Abb. 8: Zusätzliche Sp-1-Bindungsstelle durch T/C-Austausch beim T-1486C-Polymorphismus
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Abb. 9: Repräsentative Schmelzkurven des T-1237C-Polymorphismus A: Roche FastStart, dargestellt sind Schmelzkurven der Genotypen TT, CT und CC B: ABgene, Schmelzkurven der Genotypen TT, CT und CC
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Abb. 10: Repräsentative Schmelzkurven des T-1486C-Polymorphismus A: Roche FastStart, Schmelzkurven der Genotypen TT, CT und CC B: Abgene, Schmelzkurven der Genotypen TT, CT und CC
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Abb. 11: Prinzip des RFLP A: T-1237C-Polymorphismus. Durch den Austausch von Thymin durch Cytosin entsteht eine zusätzliche BstN I-Restriktionschnittstelle. B: T-1486C-Polymorphismus. Durch den T/C-Austausch fällt die beim Wildtyp-Allel vorhandene Afl II-Schnittstelle bei der Mutante weg. ▲ kennzeichnet die Schnittstelle eines Restriktionsenzymes, bp= Basenpaare
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Abb. 12: T-1237C-Polymorphismus, Gelelektrophorese mit charakteristischem Bandenmuster nach BstN I-Verdau Proben des TT-Genotyp zeigen Fragmente der Längen 108 bp und 27 bp, Proben des CC-Genotyps Fragmente von 60, 48 und 27 bp. Bei heterozygoten Proben (CT) führt der BstN I-Verdau zu Fragmenten aller vier möglichen Längen (27, 48, 60 und 108 bp). bp= Basenpaare
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Abb. 13: T-1486-Polymorphismus, Gelelektrophorese mit charakteristischem Bandenmuster nach Afl II-Verdau Proben des TT-Genotyps zeigen nach Verdau Banden der Länge 327 und 172 bp. Proben des CC-Genotyps besitzen keine Afl II-Schnittstelle, die Fragmentlänge beträgt daher 499 bp.
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DiML DTD Version 4.0 | Zertifizierter Dokumentenserver der Humboldt-Universität zu Berlin | HTML-Version erstellt am: 14.11.2005 |