Jana Droese: Mechanismen der Immunmodulation durch die Geprodukte US11und US28 des Humanen Zytomegalievirus |
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Fachbereich Biologie
Dissertation
Mechanismen der Immunmodulation durch die Geprodukte US11und US28 des Humanen Zytomegalievirus
doctor rerum naturalium
Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I
Jana
Droese
Dekan: Prof. Thomas Buckhout, PhD.
Gutachter:
1. Prof. Dr. Wolfgang Uckert
2. PD. Dr. Ralf Schülein
Datum der Promotion: 15.07.2005
Inhaltsverzeichnis
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1 Einleitung
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1.1
Das humane Zytomegalievirus
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1.2 Das Chemokinsystem
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1.3 G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs)
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1.3.1
Die Struktur G-Protein-gekoppelter Rezeptoren
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1.3.2 Molekulare Mechanismen der Aktivierung von GPCRs
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1.3.3 Die Aktivierung intrazellulärer Signalwege durch Chemokinrezeptoren
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1.3.4 Die Regulation der GPCR-Aktivität
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1.4 Der viral-kodierte Chemokinrezeptor US28
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1.5 Fragestellung
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2 Material
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2.1
Chemikalien und Verbrauchsmaterialien
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2.2 Bakterien
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2.3 Plasmide
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2.4 Oligonukleotide
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2.5 Enzyme
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2.6 Antikörper und Streptavidinkonjugate
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2.7 Geräte und sonstige Materialien
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2.8 Zellen
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2.9 Adenoviren
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2.10 Medien
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2.11 Puffer
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2.11.1
Proteinelektrophorese und Westernblot
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2.11.2 DNA-Gelelektrophorese und Plasmidpräparation
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2.11.3 Zellkultur und zytologische Färbungen
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2.12 Mäuse
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2.13 Peptid
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3 Methoden
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3.1
Nukleinsäure-Techniken
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3.1.1
DNA-Amplifikation mit Hilfe der PCR
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3.1.2 Agarosegelelektrophorese
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3.1.3 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
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3.1.4 Reinigungsmethoden für Nukleinsäuren
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3.1.4.1
Phenol/Chloroform-Extraktion
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3.1.4.2
Präzipitation von Nukleinsäuren mit Alkohol
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3.1.5 Spaltung von DNA durch Restriktionsendonukleasen
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3.1.6 Abspaltung von 5´-Phosphatresten durch alkalische Phosphatase
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3.1.7 Ligation von DNA-Fragmenten
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3.1.8 Herstellung transformationskompetenter Bakterien
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3.1.9 Transformation
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3.1.10
Isolierung von Plasmiden aus Bakterien
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3.1.11 Präparative Plasmidisolierung
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3.2 Einführung von Mutationen in cDNA mittels PCR
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3.2.1
Mutagenese der C-terminalen Serinreste
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3.2.2 Mutagenese der auf Tyrosinresten und Doppel-Leuzinresten basierenden AP-2 Adapterstellen sowie des Cysteinrestes C347 des US28 Rezeptors
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3.2.3 Herstellung der US28 R129A-Mutante
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3.3 Zellkultur
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3.3.1
Kultivierung von Säugetierzellinien
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3.3.2 Transfektion von HEK293A-Zellen mit der Kalziumphosphat-Methode
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3.3.3 Transfektion von HEK293A-Zellen mit Fugene 6
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3.3.4 Amplifikation und Aufreinigung von Adenoviren
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3.3.5 Bestimmung des Adenovirustiters
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3.3.6 Infektion von Säugetierzellen mit Adenovirus
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3.4 Durchflußzytometrie
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3.4.1
Nachweis von Oberflächenmolekülen
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3.4.2 Nachweis intrazellulärer Epitope
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3.5
T-Zellproliferationsassay
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3.5.1
Ausreifung und Aufreinigung dendritischer Zellen aus Knochmarkszellen
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3.5.2 Präparation von Mausmilzzellen
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3.5.3 Durchflußzytometrische Untersuchung der CD8 T-Zellproliferation
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3.6 Immunzytochemie und Immunfluoreszenzmikroskopie
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3.7 Metabolische Zellmarkierung mit Radioisotopen
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3.7.1
Metabolische Zellmarkierung mit [35S] Methionin/Cystein
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3.7.2 Metabolische Zellmarkierung mit [3H] Palmitat
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3.8 Zellextraktion mit Detergenz
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3.9 Immunpräzipitation
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3.10 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
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3.11 Immunblots
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3.11.1
Transfer von Proteinen auf Nitrozellulosemembranen (Westernblot)
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3.11.2 Immunfärbung von Proteinen
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3.11.3 Immundetektion von Mitogen aktivierten Proteinkinasen (MAPK) im Immunblot
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3.11.4 Chemilumineszenz-Nachweis
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3.12 Bestimmung der NF-κB-Aktivierung mit Hilfe des Luziferase-Assays
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3.13
Internalisierung von [125I]-markiertem RANTES
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4 Ergebnisse
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4.1
Rolle des HCMV-kodierten US11-Proteins auf die DC-vermittelte Aktivierung von T-Zellen
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4.1.1
US11 vermindert die Expression von Maus-MHC-Klasse-I-Molekülen
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4.1.2 Die Expression des US11-Proteins in dendritischen Zellen vermindert die Expression von H2-Db-Molekülen
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4.1.3 Die Proliferation von zytotoxischen T-Zellen wird nicht durch US11-Expression in DCs beeinflußt
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4.2
Molekulare Untersuchungen des US28-Rezeptors
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4.2.1
US28 weist eine vorwiegend intrazelluläre Verteilung auf
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4.2.2 US28 vermittelt eine konstitutive Umlagerung von β-Arrestin-2-GFP in vesikuläre Strukturen
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4.2.3 US28 und β-Arrestin-2-GFP befinden sich in unterschiedlichen subzellulären Kompartimenten
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4.2.4 Herstellung der phosphorylierungsdefizienten Mutanten
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4.2.5 Die durch den US28-Rezeptor vermittelte Umlagerung von Arrestin-Molekülen wird durch die Phosphorylierung und das DRY-Motiv bestimmt
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4.2.6 Das DRY-Motiv reguliert die konstitutive und Liganden induzierte Signalleitung des US28-Rezeptors
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4.2.6.1
Das DRY-Motiv des US28-Rezeptors reguliert die konstitutive Aktivierung von NF-κB
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4.2.6.2
Das DRY-Motiv des US28-Rezeptors vermittelt die RANTES-induzierte Aktivierung von MAPK
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4.2.7 Die Internalisierung des US28-Rezeptors erfolgt unabhängig von β-Arrestin und der konstitutiven Signalleitung
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4.2.8 Dynamin reguliert die Internalisierung des US28-Rezeptors
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4.2.8.1
Die Oberflächenexpression des US28-Rezeptors wird durch Dynamin reguliert
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4.2.9
US28 befindet sich in der Detergenz-unlöslichen Zellfraktion
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4.2.10 US28 und Caveolin 1 befinden sich in unterschiedlichen Kompartimenten
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4.2.11 Die Internalisierung des US28-Rezeptors wird durch Filipin III und hyperosmolare Saccharose gehemmt
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4.2.12 Die Internalisierung der phosphorylierungsdefizienten Mutante folgt den gleichen Wegen wie der wt-Rezeptor
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4.2.13 Die Endozytose des US28-Rezeptors wird unabhängig von der Palmitylierung des C-Terminus reguliert
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4.2.14 US28 kolokalisiert mit dem AP-2-Komplex
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4.2.15 Das Dileuzinmotiv reguliert eine schnelle Internalisierung des US28-Rezeptors
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5 Diskussion
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5.1
Bedeutung des US11-Proteins bei Aktivierung von CTLs
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5.2 Die Internalisierung des US28-Rezeptors
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5.2.1
Die Internalisierung des US28-Rezeptors wird nicht durch die Aktivierung vonSignalwegen reguliert
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5.3 Strukturelle Voraussetzungen der US28-Rezeptorendozytose
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5.3.1
Die phosphorylierungsdefizienten Mutanten US28 S1-12A und US28 STA internalisieren über die gleichen Wege wie der wt-Rezeptor
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5.3.2 Bedeutung der Palmitylierung des US28-Rezeptors für die Rezeptorinternalisierung
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5.3.3 Ein C-terminales Dileuzin-Motiv reguliert die Kinetik der US28-Internalisierung
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5.4 Die intrazelluläre Sortierung des US28-Rezeptors
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5.5 US28-vermittelt eine konstitutive Umlagerung von Arrestin-Molekülen in US28-freie Vesikel
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5.6 Strukturelle Vorausetzung des US28-Rezeptors für die Aktivierung intrazellulärer Signalwege
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5.7 Die Rolle des US28-Rezeptors während der HCMV-Infektion
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5.8 Ausblick
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6 Zusammenfassung / Summary
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Abkürzungen
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Literaturverzeichnis
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Danksagung
Tabellen
Bilder
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DiML DTD Version 4.0 | Zertifizierter Dokumentenserver der Humboldt-Universität zu Berlin | HTML-Version erstellt am: 01.12.2006 |