↓17-20 |
Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg): Enhanced Chemilumineszens (ECL) Reagenzien, Protein A-Sepharose®, Rainbow-Proteinmarker, PD-10 Säulen,
Eastman Kodak Company (Stuttgart): Röntgenfilme (X-OMAT AR), Filmentwickler und –fixierer
Genomed (Bad Oeynhausen): JetStar Plasmidisolationssäulen und –puffer (Plasmid Purification Maxi Kit)
E. Merck AG (Darmstadt): Ammoniumpersulfat (APS), Ampizillin, Kanamyzin
Qiagen (Hilden): Qiaquick Gel Extraction Kit
PAA (Cölbe): RPMI, DMEM, Penizillin, Streptomyzin, Trypsin EDTA
R&D Systems GmbH (Wiesbaden): rekombinantes murines GM-CSF, humanes RANTES
Roche Diagnostics (Mannheim): Fugene 6
C. Roth GmbH (Karlsruhe): Agar-Agar, Albumin Fraktion V (BSA), Ammoniumhydrogencarbonat, Cäsiumchlorid, Dimethylsulfoxid (DMSO), Essigsäure, Ethanol, Ethidiumbromid, Ethyldiamintetraessigsäure (EDTA), Glaswolle, Glycerin, Glycin, Hefe-Extrakt, N-2-Hydroxyethylpiperazin-N´-2-ethansulfonsäure (HEPES), Isoamylalkohol, Isopropanol, Kaliumazetat, β-Mercaptoethanol, 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES), Methanol, 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure (MOPS), Natriumazid, Natriumchlorid, Natriumdodecylsulfat (SDS), Natriumhydroxid, Natriumzitrat, Rothiphorese® Gel 30 (30% Acrylamidstammlösung), Pepton aus Casein, Phenol, Salzsäure, Tween®-20, TEMED, Zitronensäure Monohydrat
Sigma-Aldrich (Taufenkirchen): Aprotinin, 4´,6-Diamidino-2-Phenyllindiol Dihydrochloridhydrat (DAPI), Digitonin, FilipinIII, Methyl-β-Cyclodextrin, Natriumfluorid (NaF), Natriumorthovanadat (Na3VO4), Paraformaldehyd, Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), Propidiumjodid (PI)
Stratagene (Amsterdam Niederlande): QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit
Radiochemikalien
↓21 |
[125I]RANTES human, rekombinant 2200 Ci/mmol (NEN Life Science Products, Köln)
[35S] Methionin/Cystein; EXPRE35S35S Protein Labeling Mix 1000 Ci/mmol (NEN, Köln)
[3H] Palmitat (NEN, Köln)
↓22 |
E.coli DH5 α
Für die Klonierung von DNA-Fragmenten sowie die Amplifikation von Plasmid-DNA. Genotyp: F-, endA1, hsdR17, (rK-, mK+), supE44, thi-1, recA1, gyrA96, relA1, Δ(argF-laczya) U169, Φ80dlacZΔM15, λ-
Die Oligodesoxynukleotid-Primer für die Polymerase-Kettenreaktion wurden von der Firma BioTeZ GmbH, Berlin Buch bezogen.
↓23-29 |
XbaCCR5-s: 5´-GCT CTAGAGCATGGATTATCAAGTGTCAAGTCCA-3´ (Xba)
CCR5Hind-as: 5´CCCAAGCTTGGGTCACAAGCCCACAGATATTCC-3´ (Hin d III )
Arrestin s: 5´- CAA TAAGCTTACCATGGT TTCCTACAAGTGAAAGTG-3´ (Hin d III )
Arrestin as: 5`- AGATGGATCCCTATCTGTCGTTGAGCCG-3´ (Bam H I )
US28sXba: 5´-GCTCTAGAGCCATGACACCGACGACGACG-3´ (Xba)
US28asHind: 5´-CCCAAGCTTGGGGTATGAAAAGGCCGAGGTAGCGGC-3´ (Hin d III )
US28d1-2s: 5´-GTGGTACCAGGCTACATCGCGGGCAAAGAGTCGC-3´ (Kpn I )
US28d3-5s: 5´-GGTGGTACCACGCCATGGCCTTTGCGCGTCGG-3´ (Kpn I )
US28d3-8s: 5´-GGTGGTACCACGCCATGGCCTTTGCGCGTCGGGCCGCGCCGGCTCGAAGAGAG-3´ (Kpn I )
US28d6-8s: 5´-GGTGGTACCACAGCATGAGCTTTTCGCGTCGGGCCGCGCCGGCTCGAAGAGAG-3´ (Kpn I )
US28d9-12as: 5´-CCCAAGCTTTTATTACGGTATAATTTGTGCGACGCGACACACCTCGTCGGCCAGCGTGTCGGCAGCTGTCTCTCT-3´ (Hin d III )
US28 DRYs: 5´-CACGGAGATTGCACTCGATGCCTACTACGCTATTGTTTAC-3´
US28 DRYas: 5´-GTAAACAATAGCGTAGTAGGCATCGAGTGCAATCTCCGTG-3´
US28 Dillfw: 5´-GAACTACACTGTGCG GCG GCCGAGTTTCGC-3´
US28 Dillrev: 5´-GCGAAACTCGGCCGCCGCACAGTGTAGTTC-3´
US28 seclpfw: 5´-CTCGATCGCGCCGCCCCCGCTATTGTTTACATGAGAGCTCGGCCT-3´
US28seclprev: 5´-TACAGGCCGAGCTCTCATGTAAACAATAGCGGCGGCGCGATCGAG-3´
US28 thirdloopfw: 5´-CAGCTACTGCGCCTACCGCATTTCC-3´
US28 thirdlooprev: 5´-GGAAATGCGGTAGGCGCAGTAGCTG-3´
US28ctermfw: 5´-GATGTATCCTGGGCCCACAGCATGAGC-3´
US28ctermrev: 5´-GCTCATGCTGTGGGCCCAGGATACATC-3´
↓30 |
Invitek GmbH (Berlin):CombiPol DNA Polymerase Mix
NEB GmbH (Frankfurt a. M.): Alkalische Phosphatase (CIP), Restriktionsendonukleasen
Roche Diagnostics (Mannheim):T4 DNA-Ligase
↓31-35 |
Labor Dr. A. Rehm (MDC, RRK):anti-human MHC-Klasse-I-Antikörper HC10 und anti- human MHC-Klasse-I-Antikörper W6/32HL (Barnstable et al., 1978;Stam et al., 1990).
Thilo Mokros (AG Lipp unter der Leitung von Dr. Uta E. Höpken MDC, Berlin)stellte im Rahmen seiner Dissertation die monoklonalen Maus-anti-US28-Antikörper Tub-6 und Tub-45 her (Mokros et al., 2002).
AG Lipp (MDC): Ratte-anti-CXCR5-Antikörper (Hybridom 8B2)
Dr. Martin Oppermann (Institut für Immunologie, Universität Göttingen)stellte den Maus-anti-CCR5-Antikörper R22/7 zur Verfügung (Pollok-Kopp et al., 2003).
Cell Signaling (NEB GmbH, Frankfurt/ a.M.): Kaninchen-anti-Phospho- p44/42 MAPK (Thr202/Tyr204) -Antikörper, Kaninchen-anti- p44/42 MAPK-Antikörper, Peroxidase-gekoppelter anti-Kaninchen-Antikörper
Jackson Immunoresearch Laboratories (Dianova Hamburg):Ratte-anti-Maus-IgG Cy3 gekoppelt, Ziege-anti-Maus-IgG Biotin gekoppelt, Esel-anti-Kaninchen-IgG Cy3 gekoppelt,
Ziege-anti-Maus-IgG und -IgM FITC gekoppelt
Molecular Probes (Leiden, Niederlande): Alexa Fluor® 488 und Alexa Fluor®568, jeweils Streptavidin-gekoppelt
Pharmingen (BD Heidelberg): Biotin-markierter anti-Maus-CD8-Antikörper, anti-Maus- CD11c Biotin markiert, anti-Maus-H-2Ld/Db Biotin markiert,anti-Maus-H-2Kb Biotin markiert, anti-Maus-H-2Db Biotin markiert, anti-Maus-CD86 FITC gekoppelt, anti–Maus-I-Ab FITC markiert, anti–Maus-CD8 APC gekoppelt
R&D Systems GmbH (Wiesbaden): Maus-anti-CCR5-Antikörper Klon 45523.111
Santa Cruz Biotechnology (Heidelberg ): polyklonales Kaninchen-anti-Caveolin-1-Antiserum, affinitätsaufgereinigt
Sigma-Aldrich (Taufenkirchen): Anti-FLAG® monoklonaler Antikörper M2
Southern Biotechnology (Eching): Peroxidase-gekoppelter Ziege-anti-Maus-Antikörper
↓36-39 |
Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg): Geltrockner (Hoefer SE 1160 DryGel Sr.)
Beckman Instruments GmbH (Heidelberg): Beckman L7t55 Ultrazentrifuge
Becton-Dickinson GmbH (Heidelberg): Durchflußzytometer (FACScan™)
Berthold GmbH (Bad Wildbach): Gammazähler (Wallac 1470 WIZARD®), Luminometer (Luminat LB 9507)
Eppendorf (Hamburg): Reaktionsgefäße 0,5, 1,5 und 2,0 ml, Thermomixer comfort
Greiner GmbH (Nürtingen): Mikrobiologische Zellkulturschalen ∅ 10 cm, sterile 15 ml Röhrchen
Heraeus (Hanau): Brutschränke, Tischzentrifugen Biofuge pico und fresco
Leica (Bensheim): Fluoreszenzmikroskop Leica DM IRBE
Nerbe plus GmbH (Winsen/Luhe): sterile, RNase-/DNase-freie Filter-Pipettenspitzen
Nunc GmbH (Wiesbaden): Einfrierröhrchen Cryotube 2 ml
PALL (VWR International GmbH, Darmstadt): Acrodisc® sterile Spritzenfilter, 25 mm, 0,45 µm Porengröße
TPP: Zellkulturschalen und -flaschen, sterile 15 ml und 50 ml Zentrifugenröhrchen
Carl Zeiss Mikroskopie (Göttingen): AxioCam™ color Digitalkamera für die Mikroskopie, Zeiss LSM für die Konfokale Mikroskopie
↓40 |
HEK293A Subklon von HEK293-Zellen, der fest an der Plastikzellkulturschale haftet (HEK293: Ad5 transformierte, humane, embryonale Nierenzellinie; epithelial) (Quantum Biotech. Inc. ATCC CRL-1573)
MCA205 Methylcholantren induzierte Fibrosarkom Zellinie, wurde freundlicherweise von der Gruppe von Prof. Dr. Thomas Blankenstein (MDC) zur Verfügung gestellt
Adenoviren, die für US11 und LacZ kodieren waren in der Arbeitsgruppe von Dr. A. Rehm vorhanden.
LB-Medium
5 g Hefe-Extrakt, 10 g Bacto-Trypton, 5 g NaCl ad 1 l ddH2O, autoklaviert
LB-Medium zur Vektorselektion
100 mg Ampizillin / l LB-Medium
30 mg Kanamyzin / l LB-Medium
Feste Nährböden wurden durch Zugabe von 15 g Agar-Agar auf 1 l Medium hergestellt. Der Agar löste sich durch das Autoklavieren (20 min bei 120°C, 2 bar).
↓43 |
Bindungsmedium (BM), für Internalisierungsexperimente
RPMI 1640 ohne Bicarbonat; 0,2% BSA; 10 mM HEPES pH 7,4; Sterilfiltration
Saures Medium, Waschmedium bei Internalisierungsexperimenten
RPMI 1640 ohne Bicarbonat; 0,2% BSA; 10 mM MES; pH 2,5 (HCl); Sterilfiltration
↓44-48 |
⇒Isolation Detergenz-resistenter Membranen
25 mM Pipes, pH 6,5; 150 mM NaCl, 1% TX-100, 1 mM PMSF
⇒ Laufpuffer
50 mM Tris, 0,38 mM Glycin, 0,1% SDS
⇒ Lysepuffer für die Zellextraktion mit Detergenz
PBS pH 7,3; 1% TX-100, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF (frisch vor Gebrauch zusetzen)
⇒ NET-Puffer
50 mM Tris, pH 7.4, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0.5% NP-40
⇒ PBS/T- Puffer für das Waschen von Immunoblots
PBS; 0,1% Tween-20
⇒ Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)
Sammelgelpuffer 0,5 M Tris pH 6,8; 0,4% SDS
Trenngelpuffer 1,5 M Tris pH 8,8; 0,4% SDS
Gellösungen SDS-PAGE |
Trenngel 12,5 % |
Sammelgel |
ddH2O |
16,75 ml |
7,5 ml |
Puffer |
12,5 ml |
3,13 ml |
Acrylamidlösung (Rotiphorese® Gel 30, 30 % Acrylamid; 0,8 % Bisacrylamid) |
20,75 ml |
1,8 ml |
10 % APS (ddH2O) |
250 µl |
90 µl |
TEMED |
25 µl |
9 µl |
⇒ 2x Protein-Probenpuffer für die SDS-PAGE
↓49-54 |
125 mM Tris/HCl pH 6,8; 4% SDS; 0,2% Bromphenolblau; 20% Glycerin; 5% ß-Mercaptoethanol
⇒ TBS/T-Puffer für das Waschen von Immunblots
20 mM Tris pH 7,6; 140 mM NaCl; 01% Tween-20
⇒ Transferpuffer, Westernblot
25 mM Tris, 192 mM Glycin, 20% Methanol
⇒ P1, P2, P3 für den alkalischen Schnellaufschluß von Bakterien:
P1 (Zellsuspension): 50 mM Tris/HCl pH 8, 10 mM EDTA, 100 mg/l RNase A
P2 (Zellyse): 200 mM NaOH, 1% SDS
P3 (Neutralisation): 3,1 M Kaliumazetat, ad Essigsäure pH 5,5
⇒ 10x DNA-Probenpuffer
30% Ficoll 400, 0,25% Bromphenolblau, 0,25% Xylene-Cyanol FF, 30% Glycerol
⇒ TAE-Puffer (50x), für die Agarosegelelektrophorese
242 g Tris, 57,1 ml Eisessig, 37,2 g Na2EDTA·2H2O ad 1l ddH2O
⇒ Transformationspuffer (TfP) zur Herstellung chemokompetenter Bakterien
TfPI: 75 ml ddH2O; 0,75 g KCl; 1 g MnCl2·4H2O; 0,3 g Kaliumazetat; 0,15 g CaCl2; 15 ml Glycerin auf pH 5,5 mit 0,2 M Eisessig einstellen, ddH2O auf 100 ml, steril filtrieren
TfPII: 75 ml ddH2O; 0,21 g MOPS; 0,08 g KCl; 1,1 g CaCl2; 15 ml Glycerin; pH 6,8 mit 0,5 M NaOH einstellen; ddH2O auf 100 ml, sterilfiltrieren
↓55-57 |
⇒ 2x HBS Puffer, für die Kalziumphosphat-Transfektion
50 mM HEPES pH 7,1; 280 mM NaCl; 1,5 mM Na2HPO4
⇒ 10x Lysepuffer, für Erythrozyten
89,9 g NH4Cl, 10 g KHCO3, 0,37 g EDTA pH 7,3
⇒ Mowiollösung, für die Mikroskopie
24 ml einer 0,2 M Tris/HCl pH 8,5- Lösung, 12 g Glycerin, 4,8 g Mowiol 4-88,
30-40 min bei 50°C rühren, abzentrifugieren, Lagerung bei 4°C
⇒ PBS
0,14 M NaCl; 2,7 mM KCl; 8,1 mM Na2HPO4; 1,5 mM KH2PO4 pH 7,3
C57BL/6 wt Tiere
LCMV P-14 transgene C57BL/6 Rag-/- Mäuse, die transgen für einen T-Zellrezeptor sind, der das LCMV-P14-Peptid gp33-41 auf MHC-Klasse-I-H2-Db-Molekülen erkennt, wurden freundlicherweise von der Gruppe Prof. Dr. Thomas Blankenstein (MDC, Berlin) zur Verfügung gestellt (Gladow et al., 2004).
↓58 |
Peptid zur Beladung der dendritischen Zellen gp33 des LCMV P14-Proteins
(gp33-41)-KAVYNFATC (Biosynthan, Berlin)
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DiML DTD Version 4.0 | Zertifizierter Dokumentenserver der Humboldt-Universität zu Berlin | HTML-Version erstellt am: 01.12.2006 |