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Alle Tiere und die an ihnen durchgeführten Experimente wurden in Übereinstimmung des europäischen und deutschen Gesetzes zum Gebrauch von Labortieren durchgeführt (Protokoll- Nr. des Tierversuchantrages GO 347/ 98). Die Anzahl wurde auf ein Minimum beschränkt und alle chirurgischen Eingriffe wurden in tiefer Anästhesie durchgeführt, um unnötiges Leiden der Tiere zu vermeiden. Insgesamt wurden 187 Tieren verwendet, 20 wurden nicht mit in die Auswertung einbezogen, da sie entweder vorzeitig verstorben sind, die ECL nicht vollständig war oder sie bei der Kainatstudie nicht die Stadien 4 und 5 eingeteilt wurden. Abgesehen der Tiere, deren Gewebe für die Black Gold Färbung dienen sollte, wurden die Tiere nicht ausschließlich für diese Dissertationschrift getötet. Andere Organe und Anteile des Gehirnes wurden auch von Mitarbeitern der Arbeitsgruppe verwendet, so dass die Gesamtzahl der Tiere innerhalb der Gruppe minimiert werden konnte.
Für die stereotaktischen Operationen wurden 200 – 300 g schwere männliche Wister Ratten mit einer in 0,9%iger NaCl- Lsg. gelöster Mischung aus 25 mg/ml Ketamine (CuraMed, Pharma GmbH, Karlsruhe, Deutschland), 1,2 mg/ml Xylazine (Bayer, Leverkusen, Deutschland) und 0,35 mg/ml Acepromazine (Sanofi GmbH, Düsseldorf, Deutschland) anästhesiert. Die Tiere wurden in einem stereotaktischen Kopfhalter (Stoelting, USA) eingespannt, das Schädeldach eröffnet und ein Standard-Elektrokoagulator (mit vier einzelnen Pulsen á 2,5 µA für je 3 sec) wurde in Form eines Messers für die Läsion verwendet. Die Läsion erfolgte jeweils nur in der linken Hemisphäre. Dabei wurden in Anlehnung an Paximos et al., (1985) folgende Koordinaten ausgehend von lambda verwendet: frontale Inzision: AP +1,2; L +3,1 zu 6,1; V bis auf die Tiefe des Craniums; sagittale Inzision: AP +1,2 zu + 4,2; L +6,1; V bis auf die Tiefe des Craniums. Die Öffnung des Schädeldaches wurde mit einem Gelaspon Schwamm gefüllt und die Wunde vernäht. Die Überlebenszeiten der Tiere nach der Operation betrugen 1, 3, 5, 10, 15, 21, 28 und 60 Tage (± 0,5 Tage, je 6 Tiere pro Läsionsstadium). 4 adulte, unlädierte Tiere mit identischem Gewicht dienten als Kontrolle.
Tiere, deren Gehirne für die in situ Hybridisierung (ISH) oder die Luxol Fast Blue (LFB) -, Fluoro Jade (FJ) - oder Acetycholinesterase (AChE) - Färbung dienen sollten, wurden mit einer Überdosis des oben genannten Anästhetika betäubt und dekaptiert. Nach Entfernung der Kutis vom Schädeldach wurde die Ossa parietalis vom Foramen magnum aus mit einer Luer- Zange entfernt und das Gehirn entnommen. Dieses wurde in 0,1 M Phosphatpuffer (PB) gewaschen und über flüssigen Stickstoff eingefroren. Die postnatalen Ratten wurden am Tag der Geburt (P0) bzw. 5 (P5), 15 (P15) und 30 (30) Tage nach der Geburt dekaptiert (n= je 6). Das Gehirn wurde, wie oben beschrieben, entnommen und eingefroren.
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Tiere, deren Gewebe für die Black Gold Färbung dienen sollte, wurden in tiefer Anästhesie transcardial mit 200 ml steriler 0,9%iger NaCl- Lsg. und anschließend mit 250 ml 0,1 M PB, welches 4% Paraformaldehyd (PFA) und 2% Glutaraldehyd enthielt, perfundiert. Das Gehirn wurde wie oben beschrieben entnommen und in 30% Sucrose, gelöst in 4% PFA, für zwei Tage nachfixiert und anschließend über flüssigen Stickstoff eingefroren. Bei den Kontrolltieren wurde je eine Niere als Negativkontrolle entnommen. Die postnatalen Ratten wurden 5 (P5), 12 (P12), 17 (P17) und 25 (P25) Tage nach Geburt, wie oben beschrieben, perfundiert, das Gehirn entnommen und eingefroren (n= je 6). Das Gewebe wurden bei – 80°C gelagert.
Zur Überprüfung der Vollständigkeit der entorhinalen Cortex Läsion diente für die frühen Überlebensstadien (1- 10 dal) der Farbstoff Fluoro- Jade (FJ) und für die späten Überlebensstadien (10- 60 dal) Acetylcholinesterase (AChE). Es wurden zwei verschiedene Farbstoffe für die Überprüfung verwendet, da der Fluoreszensfarbstofff FJ selektiv degenerierte Neurone sowie deren Fortsätze färbt und damit als früher Degenerationsmarker sehr geeignet ist (Schmued et al., 1997; Savaskan et al., 2000). Für spätere Überlebensphasen ist AChE besser geeignet, da es sich dabei um einen Marker für reaktives Auswachsen (Sprouting) handelt. Er ist daher in den frühen Überlebensstadien weniger sensitiv (Deller und Frotscher, 1997; Deller et al., 1996).
Je Überlebensstadium (1dps und 5 dps) wurden fünf adulte Wistar Ratten (Charles River, Sulzfeld, Deutschland) der Stadien 4 und 5 mit einem Gewicht von 200 - 300 g verwendet. Diese Tiere erhielten eine intraperitoneale Injektion der frisch angesetzten Kainatsäure (10 mg/kg Körpergewicht; Ocean Products, Kanada). Die Kontrolltiere (n = 5) erhielten eine intraperitoneale Injektion rein isotoner Kochsalzlsg. gleichen Volumens. Das Verhalten der Tiere wurde anschließend 12 Stunden per Video beobachtet. Die Schwere der Anfälle wurden wie folgt eingeteilt: 1: Frösteln, starrer Blick, Mund-, Gesichtszuckungen; 2: Schütteln des gesamten Körpers; 3: Vorderpfotenklonus und Kopfnicken; 4: Zurückwerfen; 5: Zurückwerfen und Fallen; 6: wildes Rennen, sich im Kreis drehen, Hüpfen. Nur Tiere des Stadium 4 und 5 wurden für weitere Untersuchungen verwendet. Tiere des Stadiums 6 wurden mit einer intraperitonealen Diazepam- Injektion (10mg/kg Körpergewicht; Ratiopharm, Deutschland) getötet. Tiere für die in situ Hybidisierung wurden ein bzw. fünf Tage nach Kainat- Injektion wie oben beschrieben dekaptiert.
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Für die Fluoro-Jade Färbung wurden die 20µm dicken Schnitte rehydriert, für 15 min in frisch angesetzter 0,06%iger Kaliumpermangranatlsg. inkubiert und 1 min in destilliertem Wasser gewaschen. Gefärbt wurden sie dann für 30 min in 0,001%iger Fluoro- Jade- Lsg. (Histo-Chem., Jefferson, AR, USA), die in 0,1%iger Essigsäure gelöst wurde. Die Schnitte wurden anschließend in destilliertem Wasser gewaschen, luftgetrocknet und mit Entellan (Merck, Deutschland) eingedeckelt.
Für den Nachweis von AChE wurde ein modifiziertes Karnovsky-Roots Protokoll angewandt (Mesulam et al., 1987). Die aufgezogenen und luftgetrockneten Schnitte wurden für 2x 4 min in 0,1 M Maleatpuffer (pH 8,0) inkubiert und anschließend für 2 Stunden in folgender Arbeitslsg. entwickelt: 0,1 M Maleatpuffer mit 0,47 mM Kupfersulfat, 0,05 mM Kaliumhexazyanoferrat, 0,5 mM Natriumcitrat und 0,17 mM Acetylthiocholine- Jodid. Anschließend wurden die Schnitte 2x 4 min in einem 0,1 M Tris- Puffer gespült und für 10 min in 0,5%igen Kobalt- Chlorid/ Tris- Puffer inkubiert. Die Schnitte wurden 4x 4 min in Tris- Puffer gewaschen und dann für 3 min in einer 0,7%igen DAB- Lsg. unter visueller Kontrolle entwickelt. Nach weiteren 3x 3 min Waschen in Tris- Puffer wurden die Schnitte stufenweise dehydriert und mit Entellan eingedeckelt.
Das frisch eingefrorene Gewebe wurde 2 min mit –20°C kaltem Methanol und 5 min in einer Ethanol/ Essigsäure Mischung (96/ 4%) nachfixiert. Die 20 µm dicken Kryostatschnitte wurden bei 60°C für 3 Stunden in LFB- Lsg. [0,1% Luxol Fast Blue gelöst in einer Ethanol/ Essigsäure Mischung (96/ 4%] inkubiert und danach in 96%igen Ethanol gewaschen. Anschließend wurden sie mit 0,05% Li5CO3 für 1min nachfixiert und für wenige Sekunden mit 70%igen Ethanol gewaschen. Die Schnitte wurden mit Harris Haematoxylin für 1- 2 min gegengefärbt und wie oben beschrieben dehydriert und eingedeckelt.
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Zu 10 ml 0,9%iger NaCl Lsg. wurden 20 mg des Black Gold (BG) Granulates (Histo- Chem., Jefferson; USA; Schmued et al., 1999) gegeben und in einer Mikrowelle kurz aufgekocht, um anschließend in einem 60°C warmen Ofen vollständig in Lösung zu gehen. Horizontale Kryostatschnitte von ca. 20 µm Dicke (Figocut 2800, Reichert Jung) wurden in einer 24er Well Platte gesammelt oder auf SuperFrostPlus Objektträgern (Menzel-Glaeser, Berlin, Deutschland) aufgezogen, mit 0,1 M Phosphat Puffer (PB) gewaschen und anschließend bei 60°C für 15 bis 60 min mit der BG- Lsg. gefärbt. Die Färbedauer ist dabei stark abhängig von der Dicke der Schnitte, der Färbetemperatur und dem Alter der BG- Lsg.. Es sollte daher eine regelmäßige Kontrolle der Färbung stattfinden. Die dünnen Fasern der Molekularschicht des Cortex eignen sich dazu besonders. Zur Intensivierung der Färbung wurden die Schnitte für 10 min bei 60°C in 0,2%iger Kaliumtetrachloroaureatlsg. (Sigma-Aldrich, Deutschland) inkubiert. Die Schnitte wurden anschließend mit 2%iger Natriumthiosulfatlsg. (Merck, Darmstadt, Deutschland) für 3 min fixiert. Zwischen jeden Schritt wurden die Schnitte 3x 5 min mit 0,1 M PB gewaschen. Einige Schnitte wurden für 1,5 min in 0,4%iger Malachitgrünlsg. (Sigma-Aldrich, Chemie, Deutschland) gegengefärbt. Die Schnitte wurden anschließend durch destilliertes Wasser und 70%igen Ethanol gezogen, um die Hintergrundfärbung zu minimieren. Die freischwimmenden Schnitte wurden nun aufgezogen, luftgetrocknet, über eine aufsteigende Ethanolreihe dehydriert, mit Xylol gereinigt und mit Entellan eingedeckelt (beides Merck, Deutschland).
Auf dem für die ISH, LFB-, AChE oder FJ- Färbung aufgearbeiteten Gewebe ließe sich ebenfalls eine Back Gold- Färbung durchführen. Die Färbezeit muß dabei stark verlängert werden. Sehr fein myeliniesierte Fasern wie die der Molekularschicht, können dabei nur schwer detektiert werden (Meier et al., bisher unpublizierte Daten). Um diese sichtbar zu machen, wurde daher die von Schmued & Slikker (1999) entwickelte Methode optimiert und angewendet. Auf so aufgearbeiteten Gewebe zeigt eine LFB- Färbung keine Färbung (Meier et al., bisher unpublizierte Daten).
Die 20 µm dicken Schnitte wurden bei 37°C für 40 min entweder mit 50 µg/ml Proteinase K (Boehringer, Deutschland; gelöst in 0,01 M Tris, pH 8,0 und 0,1% SDS) oder mit 0,25% Trypsin (gelöst in 0,04% KCl, 0,22% NaHCO3, 0,68% NaCl, 0,1% Glucose) verdaut. Anschließend wurden die Schnitte wie oben beschrieben mit Black Gold oder Luxol Fast Blue gefärbt.
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Pro Läsionsstadium wurden je sechs unterschiedliche Tiere analysiert; vier unlädierte Tiere dienten als Kontrolle. Es wurden sowohl für die LFB-, als auch für die BG- Färbung je zwei unterschiedliche Färbeansätze in die Auswertung miteinbezogen. Zur Bestimmung der Pixel Intensität der abfotografierten Schnitte (Olympus BX-50, Japan) wurde das Computerprogramm Metamorph (Universal Imaging, Downingtown, PA, USA) verwendet. Um den ungelabelten Hintergrund abzuziehen, wurde ein visuell bestimmter Threshold gesetzt. Ein Standardviereck (4,0 mm2) wurde definiert und über die gesamte Molekularschicht des Gyrus dentatus gesetzt. Ein kleineres definiertes Viereck (2,0 mm2) wurde zur Messung der Pixelintensität der äußeren Molekularschicht verwendet. Der Prozentsatz der Faserintensität der äußeren ML zur gesamten ML wurde ermittelt (Ward & Haag, 1999). Anschließend wurde der jeweilige Mittelwert der einzelnen Messungen ins Verhältnis zur unbehandelten Kontrolle (100%) gesetzt. Die Spezifität wurde über den Mann- Whitney U- Test (StatViewII, Abacus, USA) bestimmt (Signifikanzen: P* < 0,05; P** < 0,01; P*** < 0,001).
Für die ultrastrukturellen Untersuchungen wurden die frisch BG gefärbten Schnitte osmiert (1% OsO4 in 6,84% Sucrose für 5 min), in aufsteigender Ethanolreihe dehydriert und in Epon zwischen silikonbeschichteten Objekträgern flacheingebettet. Die an einem Reichert Ultratom angefertigten Schnitte von 70 nm Dicke wurden mit Formvar Film aufgezogen und mit Zitronen- und Harnsäure gefärbt. Für die Untersuchungen diente ein Zeiss EM 900 Elektronenmikrosop. Die Aufnahmen wurden mit Hilfe der Zeiss Axioplan Kamera (Zeiss, Deutschland) angefertigt.
Je fünf Fotos der 7000x, 12 000x, 20 000x und 30 000x Vergrößerung wurden von je drei geblindeten Untersuchern ausgewertet. Dabei wurden die Körner in einem Viereck von 5,25µm2 ausgezählt. Black Gold gefärbtes Nierengewebe der Ratte diente als Negativkontrolle. Die Spezifität wurde über den Mann- Whitney U- Test (StatViewII, Abacus, USA) bestimmt (Signifikanzen: P* < 0,05; P** < 0,01; P*** < 0,001).
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Es wurden folgende antisense- Oligonukleotide verwendet, die alle von Carl Roth (Karlruhe, Deutschland) synthetisiert wurden und deren Spezifität durch BLAST GenBank (www.nicmb.gov) bestätigt wurde (siehe auch Abbildung 2):
Nogo-A I(GenBank: AJ242961): 5`- TTC CAC ATT AGC TCT AGC AGC CAG CAC ATC CCT ACT TC – 3´, komplementär zu den Basen 1402- 1440
Nogo-A II(GenBank: AJ242961): 5`- GCT CTG GAG CTG TCC TTC ACA GGT TCT GGG GTA CTG GGG AAA GAA GC – 3´, komplementär zu den Basen 1521-1568; (Josephson et al., 2001)
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Nogo-B (GenBank: AJ242962): 5`- TCT CTC CAG TAG AGG AGG TCA ACA ACC ACT GAG CCG GAG CCC CTG CGC TT –3´, komplementär zu den Basen 680- 730
Nogo-C (GenBank: AJ242963): 5´- ACT GCA AAA TTC TCC CTG AGA CAT GAA ACA CCC GCT TCC C- 3´; komplementär zu den Basen 13- 53
Nogo-A/B (GenBank: AJ242961): 5`- TCC AGT TCC TCT AGG TCC TCG TCG TCC TCC TCC T – 3´, komplementär zu den Basen 382- 416
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Nogo-pan (GenBank: AJ242961): 5`- GGG GAA GAC AAG TGT GAC TAC AAT GAG ATC CAT ACA CAG CAG C – 3´, komplementär zu den Basen 3922- 3965
Ng66R (GenBank: AY028438): 5´- TTG TTG GCA AAC AGG TAG AGG GTC ATG AGT - 3´; komplementär zu den Basen 680- 710
MBP (GenBank: NM017026): 5´- ACT ACT GGG TTT TCA TCT TGG GTC CTC TGC GAC TTC T -3´; komplementär zu den Basen 257- 294
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Abbildung 2: | ||
Schema der drei Nogo Transkripte und die Position der verwendeten Sonden: Die drei unterschiedlichen Isoforme, das 4,6 kb lange Nogo-A, das 2,6 kb lange Nogo-B und das 1,7 kb lange Nogo-C Transkript, entstehen durch alternativen Promotor Gebrauch und /oder alternatives Splicen eines einzelnen Genes. Das Oligonukleotid Nogo-A/B ist spezifisch für die beiden Splicevarianten Nogo-A und Nogo-B (rote Region), währenddessen das Oligonukleotid Nogo-pan aufgrund des gemeinsamen 188 Aminosäure langen C-Terminus alle drei Nogo Gene (blaue Region) detektiert. Die Oligonukleotide Nogo-A I, Nogo-A II, Nogo-A/B und Nogo-A pan ergaben das gleiche Expressionsmuster wie das Nogo-A spezifische Oligonukleotid allein. Die Oligonukleotide Nogo-A I, Nogo-A II, Nogo-B und Nogo-C sind spezifisch für das jeweilige Gen. Die rote Region markiert die Nogo-A und Nogo-B spezifische Sequenz, die grüne Region zeigt die allein für Nogo-A spezifische Region und die gelbe Region spiegelt die spezifischen 150 bp der Nogo-C mRNA wieder.
Die Nogo-A I, Nogo-A II, Nogo-A/B, Nogo-pan Oligonukleotide zeigten bei der Auswertung ein nahezu identisches Expressionsmuster. Im weiteren Verlauf dieser Arbeit wird daher auf eine genauere Beschreibung der Ergebnisse der ISH der Oligonukleotide Nogo-A II, Nogo-A/B, Nogo-pan verzichtet. Horizontale Kryostatschnitte von ca. 20µm Dicke (Figocut 2800, Reichert Jung) wurden auf SuperFrostPlus Objektträgern (Menzel-Glaeser, Berlin, Deutschland) aufgezogen und in 4% PFA für 10 min fixiert, mit 0,1 M PB (pH 7,4) für 5 min gewaschen, dehydriert und in unvergällten Reinstalkohol bei 4°C gelagert. Die Oligonukleotide (0,3 pmol) wurden gemäß Herstellerangaben unter Verwendung von terminaler Transferase (Boehringer, Mannheim, Deutschland) mit [α-35S]dATP (DuPont NEN, Boston, USA) radioaktiv endmarkiert. Die radioaktiven Proben wurden anschließend über BioSpin6 Chromatography Säulen gereinigt (BioRad). Für die Hybridisierung wurden die markierten Sonden mit dem Hybridisierungsmix gemischt [50% Formamid, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM PB (pH 7,0), 2x SSC, 5 mM EDTA (pH 8,0), 10% Dextransulfat, 10 mM DTT, 10 mM β- Merkaptoethanol und 200 ng/µl tRNA]. Die Hybridisierung erfolgte über 16 Stunden bei 42°C in einer feuchten Kammer. Die Schnitte wurden gewaschen (1x 60 min in 0,1x SSC bei 56°C, 1x 5min in 0,05x SSC bei Raumtemperatur) und in einer aufsteigenden Ethanolreihe dehydriert. Für die Autoradiographie wurden die Schnitte 5 bis 21 Tage einem Kodak X-OMAT AR Röntgenfilm ausgesetzt. Als Negativkontrolle wurde die in situ Hybridisierung unter Zugabe von einem 100- fachen Überschuß an unmarkierten Oligonukleotiden zur radioaktiv markierten Probe durchgeführt und anschließend gleich weiterbehandelt. Die Schnitte wurden anschließend Nissl gegengefärbt. Die in situ Schnitte wurden dazu in absteigender Ethanolreihe rehydriert, in PBS gewaschen, mit Nissl (Kresylviolettacetat, Sigma, Deutschland) gefärbt, anschließend dehydriert und mit Hypermount eingedeckelt.
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Für jedes der sieben Läsionsstadien sowie für die beiden Kainatstadien wurden je sechs unterschiedliche Tiere analysiert, vier unlädierte Tiere dienten als Kontrolle. Für jedes Transkript und jedes Tier wurden mindestens zwei in situ Hybridisierungs- Ansätze in die Auswertung miteinbezogen. Zur Bestimmung der Pixel Intensität der eingescannten (Micotek Scan Maker 636) Autoradiographien wurde das Computerprogramm Metamorph (Universal Imaging, Downingtown, PA, USA) verwendet. Um den ungelabelten Hintergrund abzuziehen, wurde ein visuell bestimmter Threshold gesetzt. Ein Standardviereck (1,5 mm2) wurde definiert und in je 15 verschiedenen Positionen der Pyramidenzellschicht der CA1-, der CA2/CA3- Region, der Körnerzellschicht des Gyrus dentatus, dem Hilus und dem Cortex gesetzt. Der jeweilige Mittelwert der einzelnen Meßwerte jeder untersuchten Region wurde für jedes Überlebensstadiums ermittelt. Die Mittelwerte der unbehandelten Kontrolle wurden für jede Region auf 100% normiert. Die Mittelwerte der Überlebenstadien wurden dann für jede Region ins Verhältnis zur Kontrolle gesetzt und zeigen somit die prozentuale Konzentrationsänderung der mRNA im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Die Spezifität wurde über den Mann- Whitney U- Test (StatViewII, Abacus, USA) bestimmt (Signifikanzen: P* < 0,05; P** < 0,01; P*** < 0,001).
Horizontale, 20 µm dicke Kryostatschnitte wurden für 10 min in 65°C warmem 1x PBS fixiert, anschließend für je 15 min 2x in aktiven 0,1% DEPC und in 5x SSC gewaschen. Die Schnitte wurden 2 Stunden bei 25°C mit je 200 µl Hybridisierungspuffer [25% Formamid, 4x SSC, 5x Denhardts, 50 mM NaH2PO4/ Na2HPO4 (pH 7,0), 0,1 mM EDTA, 1mg/ml Heringssperma und 1mg/ml Hefe t-RNA] prähybridisiert und anschließend 2x 10 min mit 2x SSC gewaschen. Die Hybridisierung erfolgte für 16 Stunden bei 25°C in 200 µl Hybridisierungspuffer (siehe oben) mit 1 µg des komplementären (antisense) Dig- gelabelten Oligonukleotids (5´ Dig- ACA TTA GCT CTA GCA GCC AGC ACA TCC CTA-3´), welches komplementär zu den Basen 1406- 1436 der Nogo-A Ratten cDNA ist. Das Oligonukleotid wurde von Tip Molbiol (München, Deutschland) hergestellt; dessen Spezifität wurde in der BLAST Genbank [www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST] bestätigt. Das nicht komplementäre (sense) Oligonukleotid diente als Kontrolle. Die Schnitte wurden nach der Hybridisierung 2x 15 min in 2x SSC; 2x 20 min in 1x SSC und 3x 30 min in 0,25x SSC gewaschen. Die Schnitte wurden 2x 5 min in Dig1-Lsg. (100 mM Tris und 150 mM NaCl, pH 7,5) gehalten und anschließend für 30 min mit Dig2-Lsg. [1% Blocking-Lsg. (Roche 1093657) in Dig1 gelöst] geblockt. Für zwei Stunden wurde der Alkaliphosphatase-gekoppelte Anti-Digoxigenin Antikörper (IgG, 1: 1000 gelöst in Dig1) bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Schnitte 3x 15 min in Dig1 und 1x 15 min in Dig3 (100 mM Tris-HCl, pH 9,5; 100 mM NaCl, 50 mM MgCL2) gewaschen. Die Färbung wurde bei 25°C über Nacht in NBT/ BCIP Stocklsg. (DIG Nucleic Acid Detection Kit, Roche; 1 175 041) und 1mM Levamisol entwickelt. Die Reaktion wurde mit Dig4 (10 mM Tris- HCl und 10 mM EDTA, pH 7,5) für 1 min abgestoppt und 30 Sekunden in destillierten Wasser und 30 min in Leitungswasser gewaschen. Die Schnitte wurden mit flourenszierendem Nissl-Farbstoff (Moleculare Probe, Niederlande) für 5 min gegengefärbt, in PBS gewaschen und anschließend mit dem Kernfarbstoff HOECHST 33528 (1: 12 000) für 2 min gefärbt. Die Schnitte wurden feucht mit HydroMount eingedeckelt (National Diagnostics, USA).
Gesamtprotein Extrakte wurden auf ein SDS- Polyacrylamid Elekrophoresegel aufgetragen (20µg/ Spur). Nach der Proteintrennung wurden sie auf die Hybond ECL Nitrozellulose Membran (Amersham Pharmacia Biotech, Deutschland) aufgetragen. Es wurde der monoklonale Maus anti-Nogo-A α-RatII-C7 Antikörper (Prof. Martin Schwab, Zürich, Schweiz) verwendet; der monoklonale β-Actin Maus Antikörper (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Deutschland) diente als Kontrolle. Der Immunoblot und das Ponceau-gefärbte Gel wurde wie oben beschrieben unter Verwendung von MetaMorph densiometrisch ausgewertet.
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Die Dokumentation der in situ Hybridisierungsschnitte erfolgte mittels der Zeiss Axioplan Kamera (Deutschland) für die Cortex- Messung und mittels der Olympus BX-50 (Japan) für die Hippocampusmessungen, während für die Farbaufnahmen der BG Färbung die Olympus IX-70 Kamera (Japan) verwendet wurde. Digitale Bilder oder eingescannte Fotoabzüge wurden in CorelDRAW zusammengefasst und beschriftet. Eine digitale Bildbearbeitung im Sinne von Verstärkung von Kontrast und/oder Intensität fand nicht statt.
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