▼ 23 (fortgesetzt) |
Mittels eines einfachen Färbeprotokolls konnte Myelin spezifisch mit Black Gold (BG) innerhalb von drei Stunden angefärbt werden (Abb. 3 - 7). Die Färbung lässt sich sehr gut reproduzieren, sie ist stabil, und Gegenfärbungen sind problemlos möglich und kombinierbar. Sie kann lichtmikroskopisch ausgewertet werden und bietet durch die rotbraune Färbung des Myelins viele Möglichkeiten zur quantitativen Auswertung (Abb. 6). Die hohe Sensivität ließ sich schon lichtmikroskopisch an der Färbung dünn myelinisierter Fasern erkennen, wie z.B. die der Molekularschicht des Gyrus dentatus (Abb. 4, 6). Um die Frage beantworten zu können, welche Komponenten des Myelins Black Gold genau färbt, wurden Schnitte gefärbt, deren Proteingehalt durch Inkubation von Proteinase K und Trypsin stark verringert wurde. Während die Luxol Fast Blue Färbung keinen Unterschied zu den unbehandelten Schnitten zeigte, konnte durch Black Gold kein Myelin mehr detektiert werden. Die Färbung reduzierte sich auf die Hintergrundfärbung (Daten nicht gezeigt). Ultrastrukturellen Analysen zeigten, dass Nuclei und endoplasmatisches Retikulum frei von BG- Partikeln waren (Abb. 3). Die Mehrheit der Partikel befand sich im kompaktem Myelin, aber auch in der äußeren und inneren Schleife der die adulten Axone umgebenen Myelinscheiden. Das Zytoplasma der Axone und die dendritischen Fortsätze zeigten keinen signifikanten Anteil an BG Partikeln (Abb. 3 B, C, D ). Eine Färbung der Niere und der Leber, die nach dem heutigen Wissensstand keine Myelinproteine expremieren, zeigten keine BG- Färbung (Daten nicht gezeigt). Bei der genauen Untersuchung von axotomierten Gewebe konnte pathologisches Myelin eindeutig von physiologischem unterschieden werden, welches in Absatz 5.1.5 genauer beschrieben wird (Abb.7). Mit keinem anderen getesteten Myelin-spezifischen Farbstoff war dies möglich.
Abbildung 3: | ||
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Ultrastrukturelle Lokalisation von Black Gold (BG) im Hippocampus. In (A) ist eine Übersichtsaufnahme aus der Hilus Region dargestellt. Zellkörper (nucleus, nc) weisen kaum BG Partikel (A, D) auf. (B) zeigt eine höhere Vergrößerung aus der Hilus Region; (C) aus dem Stratum lacunosum-moleculare der CA1 Region. BG Partikel sind in allen Schichten der die Axone (ax) umgebenden Myelinscheiden anzutreffen (A - D). Die Pfeile zeigen auf die äußere Schleife (outer loop) der Myelinscheiden; die Pfeilspitzen auf die innere Schleife und die Axonmembran. (D) zeigt die Quantifizierung der BG Partikel in unterschiedlichen Kompartimenten [Nucleus, outer loop (innere Schleife), compact myelin (kompaktes Myelin), inner loop (innere Schleife) und Axon]. Statistische Differenzen sind mit Sternen markiert ( ± S.D. P* < 0,05; P** < 0,01; P*** < 0,001, gemessen mit dem Mann- Whitney U-test). Maßstab in A: 20 µm; in C: 5 µm.
Abbildung 4: | ||
Myelinisierte Axone in der hippocampalen Formation während der postnatalen Entwicklung. Hippocampale Schnitte verschiedener postnataler Entwicklungsstadien [ P5 (A), P12 (B), P17 (C) und P25 (D) ] wurden mit Black Gold (BG) gefärbt. Die Übersichtsaufnahmen sind in der ersten Reihe dargestellt (A1, B1, C1, D1). P5 (A) und P12 (B) zeigen eine diffuse rote Färbung im Hippocampus. Erste BG-positive Fasern sind am P17 (C) in den CA Regionen und im temporalen Cortex sichtbar (C3-C5). Keine myelinisierten Fasern werden in der Molekularschicht des Gyrus dentatus gefunden (C2). Zu beachten ist allerdings, dass entorhinale Fasern zu diesem Zeitpunkt bereits im Gyrus dentatus terminieren. Am P25 (D) sind alle afferenten sowie die intrinsischen Projektionen des Hippocampus deutlich Black Gold positiv. CA: Cornu ammonis; gcl: Körnerzellschicht; ml: Molekularschicht; slm: Stratum lacunosum-moleculare; hi: Hilus; EC: Entorhinaler Cortex, sr: Stratum radiatum; pcl: Pyramidenzellschicht. Maßstab in D1 für alle Übersichtsaufnahmen: 800 µm; Maßstab in D5 für alle Vergrößerungen: 30 µm.
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In Abbildung 4 ist das Auftreten myelinisierter Fasern im sich entwickelnden Hippocampus mittels des Farbstoffes Black Gold dargestellt. Am postnatalen Tag 5 (P5) konnte man eine diffuse Färbung in der hippocampalen Formation, vor allem in der weißen Substanz, wie dem Alveus und dem Stratum radiatum, erkennen (Abb. 4 A1, A4). Der temporale Cortex hingegen zeigte im selben Entwicklungsstadium keine Färbung (Abb. 4 A5). Auch 12 Tage post partum (P12) waren im Hippocampus und im temporalen Cortex noch keine BG-positive Fasern zu finden (Abb. 4 B1 bis B5). Das Corpus callosum hingegen imponierte durch seine bereits stark myelinisierten Fasern (Daten nicht gezeigt). Die ersten myelinisierten Axone im Hippocampus konnten am postnatalen Tag 17 (P17) dargestellt werden (Abb. 4 C). Diese waren vornehmlich in den Strata oriens und radiata der CA Regionen und im Temporallappen zu finden (Abb. 4 C1, C3- C5). Die Molekularschicht des Gyrus dentatus hingegen weiste noch keine myelinisierten Fasern auf (Abb. 4 C2). Die Anzahl BG-positiver Axone stieg im Laufe der Entwicklung weiter und am P25 waren keine Unterschiede zum adulten Hippocampus mehr erkennbar (Abb. 4 D1 bis D5 ; Abb. 5).
Abbildung 5: | ||
Myelinisierte Fasern im adulten Hippocampus dargestellt mittels der Black Gold (BG) Färbung: BG-positive Fasern imponieren durch eine braun-rote Farbe. Nervenzellkörper sind BG-negativ und wurden mit Malachitgrün gegengefärbt und erscheinen daher in grün. Zu beachten ist die prominente entorhinale Projektion, die im Stratum lacunosum-moleculare des Hippocampus verläuft (A, D). Viele Fasern überkreuzen die hippocampale Fissur, um in der Molekularschicht des Gyrus dentatus zu terminieren (A, D, E). Im Stratum radiatum ist auf die Schaffer- Kollateralen und den Moosfasertrakt mit seinem Urprung in der Körnerzellschicht zu achten, die ebenfalls eine intensive BG- Färbung aufweisen (A-E). Auch die kommissuralen Fasern in der inneren Molekularschicht sind BG-positiv (E). (B) und (C) sind höhere Vergrößerungen der CA1 bzw. CA3 Region aus der Übersichtsaufnahme (A). (E) ist ein Beispiel der Molekularschicht des Gyrus dentatus. CA: cornu ammonis; hf: hippocampale Fissur; hi: Hilus; gcl: Körnerzellschicht; ml: Molekularschicht; iml: innere ml; oml: äußere ml; pcl: Pyramidenzellschicht. Maßstab in A: 900 µm, B: 60 µm, C: 60 µm, D: 520 µm, E: 35 µm.
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Die Verteilung myelinisierter Fasern in der adulten hippocampalen Formation ist in Abbildung 5 dargestellt. Der myelinisierte Tractus perforans ist klar zu erkennen. Er nimmt seinen Ursprung in den Schichten II und III des entorhinalen Cortex (EC). Der Hauptteil terminiert im Stratum lacunosum-moleculare (Abb. 5 A, B, D). Ein weiterer Teil führt vorbei an den Pyramidenzellen des Subiculums, überquert die hippocampale Fissur und endet in der äußeren Molekularschicht des Gyrus dentatus (Abb. 5 A, D, E). Eine weiterer Faserverlauf mit Ursprung im Hilus ist in (C) deutlich dargestellt. Er verläuft im Stratum radiatum der CA3 Region, um an der Grenze von CA2 zu CA3 zu terminieren (Abb. 5 A, C). Dieser Verlauf entpricht exakt der Moosfaserprojektion.
Abbildung 6: | ||
Black Gold (BG)- positive Fasern in der Molekularschicht des Gyrus dentatus nach entorhinaler Cortex Läsion: In den Kontrolltieren sind myelinisierte Fasern in der gesamten Molekularschicht anzutreffen (A). Zwei Tage nach Durchtrennung des Tractus perforans hat sich die Anzahl BG-positiver Axone extrem verringert, wobei vor allem die normalerweise horizontal verlaufenden Fasern der äußeren Molekularschicht (OML) verschwunden sind (B, G). 5 dal scheint die OML frei von myelinisierten Axonen zu sein (C, G). Zehn Tage nach Läsion (10 dal) kommt es zu einem Wiederkehren BG-positiver Fasern in der Molekularschicht (D, G). Deren Anzahl steigt in den weiteren Überlebenszeiten und erreicht den Kontrollwert 60 Tage nach Läsion (60 dal) (A, E, F G). In (G) ist die Quantifizierung der De- und Reorganisationsvorgänge im Hippocampus nach Läsion mittels Luxol Fast Blue (LFB), Achetylcholinesterase (AChE) und Black Gold (BG) dargestellt. Dabei wird der prozentuale Anteil der Signaldichte der OML zur gesamten ML angezeigt. Die Signifikanzen sind mit Sternen markiert (± S.D. P* < 0,05; P** < 0,01; P*** < 0,001, gemessen mit dem Mann- Whitney U-test). Mittels LFB Färbung kann nach Läsion keine Änderung der Signaldichte detektiert werden. AChE- positive Fasern verringern sich in den frühen Überlebenszeiten, steigen aber ab 10 dal signifikant an und bleiben auch 60 dal erhöht. gcl: Körnerzellschicht; IML: innere Molekularschicht; OML: äußere Molekularschicht. Maßstab in F: 10 µm.
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Mit dem spezifischen Myelinfarbstoff Black Gold war es möglich, die feinen myelinisierten Fasern der Molekularschicht des Gyrus dentatus zu detektieren (Abb. 6). Zwei Tage nach entorhinaler Cortex Läsion (2 dal) war ein Großteil der vornehmlich horizontal verlaufenden Fasern der äußeren Molekularschicht (OML) verschwunden (Abb. 6 A, B, G). Erste wiederkehrende Fasern waren zehn Tage nach Deafferenzierung (10 dal) in der OML zu beobachten (Abb. 6 D, G). In den späteren Läsionsstadien stieg der Anteil myelinisierter Fasern, so dass 60 dal kein quantitativer Unterschied mehr zu den Kontrolltieren bestand (Abb. 6 E- G). Die Dichte des Sproutingmarkers AChE in der OML nahm in den frühen Überlebenszeiten ab, erreichte 5 dal den Kontrollwert und stieg 10 dal signifikant an (Abb. 6 G). Die Intensität von Acetylcholinesterase (AChE)- positiven Fasern war auch 60 dal noch erhöht. Im Gegensatz dazu konnte mit dem Myelinfarbstoff Luxol Fast Blue (LFB) keine Intensitätsveränderungen festgestellt werden (Abb. 6 G).
Abbildung 7: | ||
Pathologisches Myelin nach Schädigung. (A) zeigt eine hohe Vergrößerung eines Ausschnittes aus dem entorhinalen Cortex eines Kontrolltieres. Die Pfeile weisen auf die von scharf begrenztem Myelin umgebenen Axone. (B) zeigt die von der Läsion affektierte Zone zehn Tage nach Läsion. (C) zeigt eine höhere Vergrößung aus (B). Sternchen markieren die Stelle der Durchtrennung des Tractus perforans. Die Pfeilspitzen deuten auf die eingewanderten Blutzellen hin. Das Myelin wirkt geschwollen, teilweise umgibt es das verbliebene Axon perlschnurartig (B,C). Maßstab in A: 10 µm; in B: 21 µm; in C: 7 µm.
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Myelinisierte Fasern verschwanden zwar aus der äußeren Molekularschicht des Gyrus dentatus (Abb. 6); in unmittelbarer Nähe der axotomierten Neurone fanden sich aber eindeutig pathologische Myelinstrukturen (Abb. 7 B, C). Am distalen Ende der axotomierten Fasern befanden sich große, BG-positive Schwellungen. Die anterograd degenerierten Fasern zeigten eine verschwommene Skizzierung mit einer perlschnurartigen Aufreihungen von Blasen entlang ihrer distalen Segmente (Abb. 7 B, C). Diese Veränderungen wurden in keinem der Kontrolltiere gefunden (Abb. 5, 7 A).
Abbildung 8 | ||
Expression der Nogo Gene und von MBP im sich entwickelnden Hippocampus. Dargestellt ist die in situ Hybridisierung von horizontalen Schnitten in verschiedenen postnatalen Entwicklungsstadien. Nogo-A, -B und -66R mRNA wird bereits am postnatalen Tag 0 (P0) von den hippocampalen Neuronen exprimiert. Nogo-C mRNA ist erst am P15 signifikant nachweisbar. Am P30 sind alle Nogo Transkripte sowie deren Rezeptor in den neuronalen Zellschichten des Hippocampus nachweisbar, wobei Nogo-A mit dem stärksten Signal imponiert. Im Gegensatz dazu ist die MBP mRNA erstmals am P15 im Neuropil nachweisbar; kein Hybridisierungssignal hingegen zeigt sich in den Neuronen. Am P30 ist MBP in den Strata lacunosa- moleculare, Strata oriens und vor allem in der Fimbria und der vorderen Kommissur nachweisbar. Maßstab: 900 µm.
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Nogo-A, -B und -66R mRNA wurde im sich entwickelnden Hippocampus erstmalig am postnatal Tag 0 (P0) detektiert, dem ersten untersuchten Zeitstadium (Abb. 8). Ein deutliches Hybridisierungssignal zeigte sich in den Pyramidenzellen der CA1 bis CA3 Regionen und ein schwächeres im Präsubiculum. In der Körnerzellschicht des Gyrus dentatus konnte nur eine leichte mRNA Expression entdeckt werden. Kein Hybridisierungssignal fand sich in der Molekularschicht, den Strata lucidum, radiatum, lacunosum- moleculare und oriens. Die mRNA Expression von Nogo-A und Nogo- 66R verblieb von P15 bis zur Adoleszens unverändert, nur in der Hilus Region verringerte sich die Ng-66R mRNA Konzentration. Nogo-B Transkript wurde bis zur Adoleszens in allen hippocampalen Neuronen gefunden, seine Konzentration verringerte sich aber vor allem im Cortex und im Subiculum. Eine deutliche Nogo-C mRNA Expression konnte erstmals in den neuronalen Zellschichten des Gyrus dentatus und der CA1 bis CA3 Region am P15 nachgewiesen werden. In der Hilus Region und im Entorhinalen Cortex zeigte sich nur ein sehr schwaches Signal. Dieses Expressionsmuster blieb bis zur Adoleszens unverändert.
Im Gegensatz zu der neuronalen Expression der Nogo Gene wurde MBP mRNA in keiner Zellschicht des Hippocampus gefunden. Das erste Signal konnte am P15 im hippocampalen Neuropil detektiert werden. Am stärksten imponierte es in den Strata oriens und radiata der CA Regionen (Abb. 8).
Abbildung 9: | ||
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Zelluläres Verteilungsmuster von Nogo-A mRNA im adulten Hippocampus. (A) zeigt in der Übersichtsaufnahme das nicht radioaktive Hybridisierungsmuster von Nogo-A mRNA in der hippocampalen Formation. Nogo-A expremierende Neurone befinden sich in den Schichten II und III, nicht aber in der Schicht I des Entorhinalen Cortex (B, C). (C) ist eine höhere Vergrößerung aus (B). Pfeile verweisen auf die stark gefärbten Neurone der Schicht II und III. Nogo-A mRNA positive Neurone finden sich auch in der Körnerzellschicht des Gyrus dentatus, während die Molekularschicht ausgespart bleibt (D). (E) ist eine Vergrößerung der Fimbria fornix aus (A). In der weißen Schicht kann dort Nogo-A mRNA in Oligodendrozyten gefunden werden (Pfeile). (F) zeigt die sense Probe, auf der kein Hybridisierungssignal gefunden werden kann. Der Pfeil in (G) zeigt eine Nogo-A expremierende Zelle im Gyrus dentatus, (H) die korrespondierende Nissl Färbung und (I) die Kernfärbung. ec: Entorhinaler Cortex; gcl: Körnerzellschicht; ml: Molekularschicht; hi: Hilus; CA: Cornu ammonis; ff: fimbria fornix. Maßstab in A: 200 µm; in B: 40 µm; in F (für C, D, E, F): 35 µm; in I (für G, H, I): 20 µm.
Mit der radioaktiven in situ Hybridisierung konnte gezeigt werden, dass die Nogo Gene und deren Rezeptor in den neuronalen Zellbänden des Hippocampus exprimiert werden. Da mittels der nicht- radioaktiven in situ Hybridisierung die zelluläre Verteilung detaillierter untersucht werden kann und zusätzlich die Möglichkeit einer Co-Lokalisation besteht, wurde sie anschließend für Nogo-A durchgeführt (Abb. 9). Nogo-A Transkript wurde in den Pyramiden- und Körnerzellen des Hippocampus, in den entorhinalen Neuronen der Schichten II- IV, aber auch in den Oligodendrozyten der weißen Substanz gefunden (Abb. 9 A, E). Die Nissl- positiven Körnerzellen des Gyrus dentatus gaben ein starkes Hybridisierungssignal, währenddessen im hippocampalen Neuropil nur wenige Nogo-A positive Zellen gefunden wurden (Abb. 9 D).
Nogo-A
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Abbildung 10: | ||
Expressionsmuster und quantitative Auswertung von Nogo-A mRNA im Rattengehirn nach Läsion. (A) zeigt die Expression von Nogo-A Transkripten auf horizontalen Gehirnschnitten einer unlädierten Kontrolle, 1 Tag nach Entorhinaler Cortex Läsion (1 dal), 5 dal, 10 dal und 28 dal, die mit der radioaktiven in situ Hybridisierung mit dem Nogo-A I Oligonukleotid detektiert wurde. Pfleile markieren die Expressionsänderungen im ipsilateralen Cortex. Eine starke Hochregulierung in der CA Region, dem DG und Hilus ist bereits 1 dal zu sehen. 10 dal hat die mRNA Konzentration in den CA Regionen bereits die Kontrollwerte erreicht, in den Hilusregionen aber zeigt sich eine signifikante Runterregulation. 28 dal sind in allen Regionen keine Konzentrationsunterschiede zu den Kontrollwerten mehr zu verzeichnen. Die sense Probe wurde mit einen Überschuß an unmarkiertem Oligonukleotid durchgeführt. Die Sterne markieren die Stelle der Läsion. Maßstab: 3,75 mm.
(B) zeigt die quantitative Auswertung der Nogo-A mRNA Expression im ipsi- und contralateralen Cortex und im Hippocampus. Die zeitliche Änderung der mRNA Expression nach ECL wurde mittels in situ Hybridisierung und einer anschließenden densiometrischen Messung für folgende Regionen ausgewertet: Cortex, Körnerzellschicht (gcl); Pyramidenzellschicht der CA1 und CA3 Region und Hilus. In jeder Gruppe wurden 6 unterschiedliche Tiere (n= 12) gemessen. Der Mittelwert von 15 Messungen wurde ermittelt und dieser zusammen mit der jeweiligen Standartabweichung als Prozentangabe zu der auf 100% normierten Kontrollgruppe dargestellt. Statistische Signifikanzen sind mit Sternen markiert (P* < 0,05; P** < 0,01; P*** < 0,001; Mann- Whitney U- Test). Diese zeigen die Signifikanz einer Konzentrationsänderung des jeweiligen Wertes gegenüber der mRNA Konzentration der Kontrollwerte.
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In den adulten Kontrolltieren wurde Nogo-A mRNA vornehmlich in den Pyramidenzellen der CA1 bis CA3 Regionen und zu einem geringeren Anteil auch im Gyrus dentatus exprimiert (Abb. 10). Bereits 1 Tag nach Entorhinaler Läsion (1 dal) wurde eine massive Hochregulation der mRNA deutlich. Eine mehr als 20fache Steigerung konnte im ipsi- aber auch im contralateralen Cortex zu diesem Zeitpunkt gemessen werden. Das Maximum wurde auf der contralateralen Seite 3 dal erreicht und auf der ipsilateralen Seite 5 dal, wo die Nogo-A mRNA Konzentration um das 34fache erhöht war (Fig. 10 A, B). 28 dal erreichte die mRNA Konzentration im ipsi- und contralateralen Cortex die Kontrollwerte. Die ipsilaterale Körnerzellschicht zeigte ebenfalls 1 dal eine signifikante Hochregulierung der Nogo-A mRNA, die bis 10 dal bestehen blieb und bereits 15 dal die Ausgangswerte wieder erreichte. Die Körnerzellen der contralateralen Seite zeigten keine Veränderungen der Nogo-A mRNA Konzentration. Während es in den Pyramidenzellen der CA1 Region auf keiner Seite der Läsion zu einer Konzentrationsänderung kam, zeigten die Pyramidenzellen der CA3 Region schon 1 dal eine signifikante Hochregulation, die auf der ipsilateralen Seite bis 10 dal und auf der contralateralen Seite sogar bis 21 dal anhielt. Die Hilus Region beider Seiten zeigte bereits 1 dal eine 30fache Erhöhung der Nogo-A mRNA Konzentration, anschließend kam es aber 15 dal und 21 dal zu einer massiven Runterregulation, so dass die Konzentration unter die Kontrollwerte fiel. Diese wurden erst 28 dal erreicht (Abb. 10 A, B).
Nogo-B
Abbildung 11: | ||
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Expressionsmuster und quantitative Auswertung von Nogo-B mRNA im Rattengehirn nach Läsion. (A) zeigt die Expression von Nogo-B Transkripten auf horizontalen Gehirnschnitten einer unlädierten Kontrolle, 1 Tag nach Entorhinaler Cortex Läsion (1 dal), 3 dal, 5 dal und 28 dal, die mit der radioaktiven in situ Hybridisierung mit dem Nogo-B Oligonukleotid detektiert wurde. Die sense Probe zeigt einen adulten Gehirnschnitt, der mit einem 100fachen Überschuß an unmarkierten Oligonucleotid durchgeführt wurde. Die Sterne markieren die Stelle der Läsion. Pfleile weisen auf die starke Hochregulation im ipsilateralen Cortex hin. 1 dal kommt es in allen Zellschichten des Hippocampus zu einer signifikanten Erhöhung der Nogo-B mRNA Konzentration, die sich in späteren Überlebensstadien wieder reduziert. Auf eine Abbildung von 10 dal wurde zu Gunsten der früheren Überlebensstadien verzichtet. Maßstab: 3,75 mm.
(B) zeigt die quantitative Auswertung der Nogo-B mRNA Expression im ipsi- und contralateralen Cortex und im Hippocampus. Die zeitliche Änderung der mRNA Expression nach ECL wurde mittels in situ Hybridisierung und einer anschließenden densiometrischen Messung für folgende Regionen ausgewertet: Cortex, Körnerzellschicht (gcl); Pyramidenzellschicht der CA1 und CA3 Region und Hilus. In jeder Gruppe wurden 6 unterschiedliche Tiere (n= 12) gemessen. Der Mittelwert von 15 Messungen wurde ermittelt und dieser zusammen mit der jeweiligen Standartabweichung als Prozentangabe zu der auf 100% normierten Kontrollgruppe dargestellt. Statistische Signifikanzen sind mit Sternen markiert (P* < 0,05; P** < 0,01; P*** < 0,001; Mann- Whitney U- Test). Diese zeigen die Signifikanz einer Konzentrationsänderung des jeweiligen Wertes gegenüber der mRNA Konzentration der Kontrollwerte.
Das Hybridisierungssignal von Nogo-B war im Vergleich zu Nogo-A weniger prominent (Abb. 10, 11). Die höchste mRNA Konzentration im adulten Kontrolltier konnte in den Pyramidenzellen der CA Regionen detektiert werden. Bereits 1 Tag nach entorhinaler Cortex Läsion (1 dal) kam es im ipsilateralen Cortex zu einer starken Hochregulierung, die ihr Maximum 3 dal mit einer 20fachen Erhöhung gegenüber den Kontrollwerten erreichte. 10 dal waren die Ausgangswerte wieder erreicht. Der contralaterale Cortex zeigte nur eine dezente, aber signifikante Hochregulierung in den frühen Überlebensstadien (Abb. 11 A, B). Eine signifikante Hochregulierung wurde in allen hippocampalen Zellschichten in den frühen Überlebensstadien beobachtet, sie erreichten die Kontrollwerte in der Zeit, in der axonales Auswachsen (Sprouting) sein Maximum erreicht. Die ipsilaterale Körnerzellschicht und die Hilusgegend zeigten 1 dal ihr höchstes Hybridisierungssignal, welches sich 15 dal wieder auf die Ausgangswerte reduziert hatte. Die Pyramidenzellen der CA Regionen derselben Seite zeigten ebenfalls 1 dal ein Maximum an Nogo-B mRNA. Während die mRNA Konzentration der CA1 Region bereits 5 dal die Kontrollwerte erreicht hatte, blieben sie in der CA3 Region bis 21 dal signifikant erhöht. Auf der contralateralen Seite zeigten die Körner- und die Pyramidenzellen der CA3 Region eine signifikante Erhöhung des Nogo-B Transkriptes zwischen 1 und 10 dal. Die anderen untersuchten Regionen blieben unverändert (Abb. 11).
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Nogo-C
Abbildung 12: | ||
Expressionsmuster und quantitative Auswertung von Nogo-C mRNA im Hippocampus nach Läsion. (A) zeigt die Expression von Nogo-C Transkript horizontal angeschnittener Hippocampi einer unlädierten Kontrolle, 3 Tag nach Entorhinaler Cortex Läsion (3 dal), 10 dal, 21 dal und 28 dal, die mit der radioaktiven in situ Hybridisierung mit dem Nogo-C Oligonukleotid detektiert wurde. Die sense Probe wurde mit einen Überschuß an unmarkiertem Oligonukleotid durchgeführt. Die korrespondierende Nissl- Färbung ist ebenfalls dargestellt. Eine starke Erhöhung des Hybridisierungssignals ist in allen Zellregionen des ipsilateralen Hippocampus 3 dal zu sehen. Eine signifikante Runterregulation wird 10 dal deutlich. Die Ausgangswerte werden 21 dal erreicht. Hi: Hilus; gcl: Körnerzellschicht; CA: Cornu ammonis. Maßstab: 400µm.
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(B) zeigt die quantitative Auswertung der Nogo-C mRNA Expression im ipsi- und contralateralen Hippocampus. Die zeitliche Änderung der mRNA Expression nach ECL wurde mittels in situ Hybridisierung und einer anschließenden densiometrischen Messung für folgende Regionen ausgewertet: Körnerzellschicht (gcl); Pyramidenzellschicht der CA1 und CA3 Region und Hilus. In jeder Gruppe wurden 6 unterschiedliche Tiere (n= 12) gemessen. Der Mittelwert von 15 Messungen wurde ermittelt und dieser zusammen mit der jeweiligen Standartabweichung als Prozentangabe zu der auf 100% normierten Kontrollgruppe dargestellt. Statistische Signifikanzen sind mit Sternen markiert (P* < 0,05; P** < 0,01; P*** < 0,001; Mann- Whitney U- Test). Diese zeigen die Signifikanz einer Konzentrationsänderung des jeweiligen Wertes gegenüber der mRNA Konzentration der Kontrollwerte.
Nogo-C mRNA wurde zu keinem Zeitpunkt nach ECL im Cortex der ipsi- oder contralateralen Seite reguliert (Daten nicht gezeigt). Die Nogo-C mRNA Konzentration der ipsilateralen hippocampalen Zellregionen begann während der frühen Überlebensstadien zu steigen und erreichte ihr Maximum 3 dal (Abb. 12 A, B). Mit Ausnahme der Hilus Region sank die Konzentration von Nogo-C Transkript 10 und 15 dal unter die der Kontrollwerte, um diese 28 dal wieder zu erreichen (Abb. 12 A, B).
Ng-66R
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Abbildung 13: | ||
Expressionsmuster und quantitative Auswertung von Ng-66R mRNA im Rattengehirn nach Läsion. (A) zeigt die Expression von Ng-66R Transkripten auf horizontalen Gehirnschnitten einer unlädierten Kontrolle, 1 Tag nach Entorhinaler Cortex Läsion (1 dal), 5 dal, 10 dal und 28 dal, die mit der radioaktiven in situ Hybridisierung mit dem Ng-66R Oligonukleotid detektiert wurde. Pfleile markieren die Expressionsänderungen im contralateralen Cortex. Die Sterne markieren die Stelle der Läsion. Die sense Probe wurde mit einen Überschuß an unmarkiertem Oligonukleotid durchgeführt. Maßstab: 3,75 mm.
(B) zeigt die quantitative Auswertung der Ng-66R mRNA Expression im ipsi- und contralateralen Cortex und im Hippocampus. Die zeitliche Änderung der mRNA Expression nach ECL wurde mittels in situ Hybridisierung und einer anschließenden densiometrischen Messung für folgende Regionen ausgewertet: Cortex, Körnerzellschicht (gcl); Pyramidenzellschicht der CA1 und CA3 Region und Hilus. In jeder Gruppe wurden 6 unterschiedliche Tiere (n= 12) gemessen. Der Mittelwert von 15 Messungen wurde ermittelt und dieser zusammen mit der jeweiligen Standartabweichung als Prozentangabe zu der auf 100% normierten Kontrollgruppe dargestellt. Statistische Signifikanzen sind mit Sternen markiert (P* < 0,05; P** < 0,01; P*** < 0,001; Mann- Whitney U- Test). Diese zeigen die Signifikanz einer Konzentrationsänderung des jeweiligen Wertes gegenüber der mRNA Konzentration der Kontrollwerte.
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Die Ng-66R mRNA wurde nach Läsion im Cortex signifikant hochreguliert (Abb. 13 A, B). Obwohl auf beiden Seiten 1 dal das jeweilige Konzentrationsmaximum erreicht wurde, sank die Konzentration auf der ipsilateralen Seite bereits 3 dal auf Kontrollniveau, während die Werte auf der contralateralen Läsionsseite bis einschließlich 21 dal signifikant erhöht blieben. Die ipsilaterale Körnerzellschicht und alle contralateralen Zellschichten zeigten einen biphasischen Konzentrationsverlauf mit einer maximalen Erhöhung 3 dal und einer maximalen Erniedrigung 15 dal. 28 dal wurden die Ausgangswerte wieder erreicht. Die ipsilaterale Hilusregion zeigte zu keinem Zeitpunkt eine Änderung im Gehalt des Ng-66R Transkriptes. Die Pyramidenzellen der ipsilateralen CA1 und CA3 Region zeigten eine dezente Hochregulation 1 dal (Abb. 13 A, B).
Abbildung 14: | ||
Nogo-A mRNA Expression nach Kainat-induziertem Anfall: (A) zeigt die Nogo-A Expression auf horizontalen Gehirnschnitten der Kontrolltiere (intraperitoneale NaCl- Injektion); (B) ein Tag nach Anfall (1dps), (C) fünf Tage nach Anfall (5dps) und (D) zeigt die quantitative Auswertung der Nogo-A mRNA Expression in den hippocampalen Zellschichten. Eine starke Hochregulation kann in der CA1, CA2 und im DG 5dps beobachtet werden. In jeder Gruppe wurden 5 unterschiedliche Tiere (n= 10) gemessen und als Prozentangabe zu der auf 100% normierten Kontrollgruppe dargestellt. Statistische Signifikanzen sind mit Sternen markiert (P* < 0,05; P** < 0,01; P*** < 0,001, Mann- Whitney U- Test). Maßstab: 400 µm.
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Die Nogo-A mRNA Expression wurde in einem weiteren Modell der synaptischen Plastizität getestet. Während des ersten Tages nach dem Kainat-induzierten Anfall, in dem neuronale Apoptose und axonale Degeneration dominieren, konnte keine Regulationänderung gefunden werden (Abb. 14). Aber fünf Tage nach dem Anfall (5dps), also der Zeit, in der es zu einer Reexpression von GAP-43, als Marker für axonales Aussprossen, kommt, wird eine signifikante Hochregulation der Nogo-A mRNA in allen Zellschichten des Hippocampus sichtbar (Abb. 14).
Abbildung 15: | ||
Nogo-A Expression und quantitative Auswertung während der Entwicklung und nach Läsion. Gezeigt wird die Nogo-A Protein Expression und Quantifizierung von Gesamtproteinextrakten aus postnatalem Hippocampus (1), adultem Hippocampus (2) und einem deafferenzierten Hippocampus 5 dal (3). Statistische Signifikanzen sind mit Sternen markiert (P* < 0,05; P** < 0,01; P*** < 0,001; Mann- Whitney U- Test). Als Kontrolle im gleichen Versuchsansatz diente β- Actin (Meier et al., 2003, Fig. 14).
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Die starke Hochregulation der Nogo-A mRNA Expression nach ZNS Schädigung führte zu einer signifikanten Erhöhung der Nogo-A Translation im Hippocampus (Abb. 15). Es konnte ebenfalls gezeigt werden, dass während der Entwicklung eine gegenüber der Adoleszens erhöhte Nogo-A Protein Konzentration vorliegt (Abb.15). Der Vergleich der Nogo-A Proteinmenge im sich entwickelnden Hippocampus (P0 vs. A) korreliert gut mit der in der in situ Hybridisierung gefundenen Transkription. Die hier gefundenen Befunde deuten also darauf hin, dass eine veränderte Nogo Transkription eine gleichseitig veränderte Nogo Translation nach sich zieht.
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