Ulrike Gemke: Rolle von Calcineurin B bei menschlicher Herzhypertrophie |
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Aus dem Center for Cardiovascular Research
der Medizinischen Fakultät der Charité - Universitätsmedizin Berlin
Dissertation
Rolle von Calcineurin B bei menschlicher Herzhypertrophie
Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)
vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité - Universitätsmedizin Berlin
von
Ulrike
Gemke
aus Bad Driburg
Dekan: Prof. Dr. med. Martin Paul
Gutachter:
1. Prof. Dr. med. V. Regitz-Zagrosek
2. Prof. Dr. T. Eschenhagen
3. Prof. Dr. B. Pieske
Datum der Promotion: 10.02.2006
Inhaltsverzeichnis
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1. Einleitung
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2. Material und Methoden
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2.1. Patientengut und Biopsieentnahme
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2.2. Strategie des Arbeitablaufes
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2.3. Probenaufbereitung für PCR
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2.4. Primerkonstruktion
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2.5. Polymerase Ketten Reaktion (PCR)
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2.6. Probenaufarbeitung für Western Blot
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2.7. Western Blot
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2.7.1. Diskontinuierliche SDS-Gelelektrophorese der Probenproteine
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2.7.2. Comassiefärbung
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2.7.3. Calcineurin B AK
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2.7.4. Western Blot Verfahren
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2.7.5. Anfärbung der Proteine als Kontrollreaktion
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2.7.6. Nachweisreaktion Hybridisierung der AK
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2.7.7. Visualisierung der Nachweisreaktion
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2.7.8. Detektion
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2.8. Quantitative Bestimmung des Anteils an interstitiellem Gewebe (Fibrose, Narben) im Myokard
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2.9. Validierung der Methoden
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2.9.1. RNA-Ausbeute vor und nach Dnase-Verdau
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2.9.2. Etablierung quantitativer PCR
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2.9.2.1. Optimale Spezifität durch Hot-Start-Technik
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2.9.2.2. Optimale Primerkonstruktion
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2.9.2.3. Primeroptimierung für Real-Time-PCR
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2.9.2.4. Validierung der optimalen PCR Zykluslänge
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2.9.3. Validierung der Quantifizierung anhand einer Eichgeraden
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2.9.3.1. Erstellen einer Eichgerade
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2.9.3.2. Auswertung mit Hilfe der Standardgeradengleichung
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2.9.3.3. Kalibrator und externe Standardisierung
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2.9.4. Proteinausbeute
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2.9.5. Etablierung quantitatives Western Blot-Verfahren
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2.9.5.1. Proteineinsatz und Proteinqualität
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2.9.5.2. Optimale Trennbedingungen bei SDS-PAGE
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2.9.5.3. Optimale Transferbedingungen des Western Blot
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2.9.5.4. AK-Optimierung
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2.9.5.5. Versuchskonsistenz und externe Standardisierung
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2.9.6. Etablierung der quantitativen Fibrosemessung
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2.10. Darstellung der Ergebnisse und Statistik
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3. Ergebnisse
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3.1. Untersuchung der krankheitsspezifischen Genregulation
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3.1.1. Regulation von CnB, ANP und BNP mRNA in hypertrophierten Herzen mit DCM, AS und KHK
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3.1.2. Korrelation von ANP, BNP und CnB mRNA in hypertrophierten Herzen
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3.2. Untersuchung des krankheitsspezifischen CnB Proteingehalts
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3.2.1. CnB Proteingehalt in hypertrophierten Herzen mit AS, DCM und KHK
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3.3. Beziehungen zwischen CnB mRNA- und Proteingehalt
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3.4. Krankheitsspezifischer Fibrosegehalt
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3.4.1. Charakterisierung der Kontrollgruppe
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3.4.2. Fibrosegehalt bei DCM
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3.4.3. Fibrosegehalt bei KHK
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3.5. Beziehung zwischen Fibrosegehalt und Gen-bzw. Proteinregulation
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4. Diskussion
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4.1. Wichtigste Ergebnisse
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4.2.
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4.3. CnB spezifische Genexpressionsregulation und Proteingehalt in hypertrophierten Herzen mit DCM
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4.4. CnB spezifische Genexpressionsregulation und Proteingehalt in hypertrophierten Herzen mit ICM nach koronarer Herzerkrankung
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4.5. CnB spezifische Genexpressionsregulation und Proteingehalt in hypertrophierten Herzen mit AS
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4.6. Remodeling-Hypertrophie und veränderte extrazelluläre Matrix
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4.7. Fibrosegehalt der Kontroll-und Patientengruppen
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4.8.
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4.9. Zusammenfassung
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5. Anhang
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6. Literatur
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Danksagung
Tabellen
Bilder
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XDiML DTD Version 4.0 | Zertifizierter Dokumentenserver der Humboldt-Universität zu Berlin | HTML-Version erstellt am: 26.05.2006 |