Johannes Meier : Untersuchungen zur Epidemiologie der Mutter-Kind Übertragung des Humanen Cytomegalievirus auf Frühgeborene und zum molekularen Mechanismus der (Re)aktivierung des Virus während der Laktation |
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Aus dem Institut für Virologie der Medizinischen Fakultät Charité der Humboldt-Universität zu Berlin
Dissertation
Untersuchungen zur Epidemiologie der Mutter-Kind Übertragung des Humanen Cytomegalievirus auf Frühgeborene und zum molekularen Mechanismus der (Re)aktivierung des Virus während der Laktation
Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)
vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin
von Johannes Meier
aus Giessen
Dekan: Prof. Dr. med. Martin Paul
Gutachter:
1. Prof. Dr. Susanna Prösch
2. Prof. Dr. Gerhard Jahn
3. Prof. Dr. Roland R. Wauer
Datum der Promotion: 07. April 2005
Abstract deutsch
Im Rahmen einer prospektiven Studie wurde die Inzidenz der Reaktivierung des Humanen Cytomegalievirus (HCMV) bei stillenden Müttern, sowie die Virusübertragung auf ihre Frühgeborenen untersucht. Mit In vitro Experimenten wurde der Einfluss von Muttermilch auf die Reaktivierung und Replikation vom HCMV untersucht.
Die Muttermilch von 73 Müttern, sowie Urin- und Trachealproben ihrer 89 Frühgeborenen wurden über 2 Monate post partum wöchentlich auf HCMV DNA untersucht. Eine Reaktivierung des Virus wurde bei 95% der latent infizierten Mütter beobachtet. Zu einer Virusübertragung kam es bei 42% der HCMV-positiven Müttern auf ihre gestillten Kinder. Insgesamt infizierten sich 22 der 89 Frühgeborenen im Untersuchungszeitraum, in zwei Fällen kam es zu schweren symptomatischen Krankheitsverläufen. Infizierte Frühgeborene zeigten im Vergleich zu Nicht-Infizierten höhere Inzidenzen von Amnioninfektionssyndrom, respiratory distress syndrome und Bronchopulmonarer Dysplasie. Die Studie bestätigt ein signifikant hohes Risiko einer Übertragung von HCMV durch Muttermilch auf Frühgeborene mit teils schwerwiegendem Verlauf und eine hohe Reaktivierungsrate von HCMV in der laktierenden Brust. Daher wurde ein möglicher Einfluss von Muttermilch auf die Reaktivierung bzw. Replikation von HCMV konstatiert und der Effekt von Muttermilch auf die Aktivität des HCMV Immediate Early (IE)1/2 Enhancer/Promotors, die Virusreplikation und IE Protein Synthese in monozytären Zellen und humanen Lungenfibroblasten untersucht. Sämtliche Milchproben stimulierten den HCMV Immediate Early (IE)1/2 Enhancer/Promotor und die IE Protein Synthese in einer charakteristischen Kinetik, mit höchsten Stimulationsraten durch Molkeproben der 1.-2. Woche post partum, 2-3 Wochen vor dem Zeitpunkt der höchsten Viruslast in der Muttermilch. Durch Promotermutanten und inhibitorische Substanzen wurde gezeigt, dass die Stimulation des IE1/2 Enhancer/Promotors ein multifaktorieller Prozeß ist, an dem Glukokortikoide eine signifikante Rolle spielen.
Eigene Schlagworte:
HCMV, Frühgeborene, Stillen, Reaktivierung
Abstract englisch
In a clinical trial, the incidence of human cytomegalovirus (HCMV) reactivation in breastfeeding mothers, virus transmission to their breastfed preterm infants and the effects of breast milk on HCMV reactivation and replication were studied.
Breast milk from 73 mothers as well as urine and tracheal aspirates of their 89 infants were screened weekly for HCMV-DNA during 2 months after delivery. HCMV reactivation and virus shedding could be confirmed in 95% of latently infected mothers. Mother-to-child transmission was concluded for 42% HCMV DNA positive mothers. 22 breastfed infants acquired HCMV infection, two of them with severe symptomatic HCMV infection. The infected infants demonstrated higher incidences of amniotic infection, respiratory distress syndrome and bronchopulmonary dysplasia compared to noninfected infants. We could therefore confirm a high incidence of HCMV reactivation in lactating mothers and a significant risk of transmission to preterm infants by breastfeeding with the possibility of severe disease. The high rates of virus reactivation in mothers led us to focus on the effect of human milk on HCMV reactivation and replication in vitro: Breast milk from 12 breastfeeding mothers was tested for their effects on HCMV Immediate Early (IE)1/2 enhancer/promoter activity, viral replication and IE protein expression in monocytic cell lines and human embryonal lung fibroblasts. All milk samples stimulated HCMV IE1/2 enhancer/promoter activity und IE protein synthesis in these cell lines. The effects followed a characteristic kinetics over time: highest stimulation rates were seen with milk whey collected during the first and second week after delivery preceding the peak in viral load for 2-3 weeks. By using promoter mutants and inhibitors it could be demonstrated that stimulation of the IE1/2 enhancer/promoter is a multifactorial effect in which glucocorticoids play a significant role.
Keywords:
HCMV, preterm, breastfeeding, reactivation
Inhaltsverzeichnis
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1
Einleitung
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1.1 Die Familie der Herpesviridae
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1.2 Das Humane Cytomegalievirus (HCMV)
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1.3 Morphologie und Genomstruktur von HCMV
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1.4 Genomexpression und der Immediate Early 1/2-Enhancer/Promotor
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1.4.1 Genomexpression
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1.4.2 Der Immediate Early ½-Enhancer/Promotor
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1.5 Epidemiologie, Übertragung und Klinik der HCMV-Infektion
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1.5.1 Allgemeines
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1.5.2 Kongenitale HCMV-Infektion
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1.5.3 Peri/postnatale HCMV-Infektionen
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1.5.4 HCMV-Infektionen im Erwachsenenalter
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1.6 Latenz und Reaktivierung von HCMV
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1.6.1 Mechanismus und Ort der Latenz
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1.6.2 Mechanismen der HCMV-Reaktivierung
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1.7 Fragestellung der Arbeit
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2 Material und Methoden
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2.1 Zelllinien
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2.1.1 Monozytäre Zelllinien HL-60 und THP-1
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2.1.2 Humane embryonale Lungenfibroblasten (HELF)
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2.2 Virus
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2.3 Plasmide
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2.4 Hormone, Zytokine, Hemmstoffe
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2.5 Patienten und Patientenmaterial
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2.5.1 Patienten
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2.5.2 Gewinnung von Muttermilch und zellfreier Molke
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2.5.3 Gewinnung von Urin, Trachealaspiraten und Pharyngealsekreten
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2.5.4 Serum und Periphere Blutmonozyten (PBMC)
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2.6 Statistik
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2.7 DNA-Isolierung und Polymerase Kettenraktion
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2.7.1 DNA-Isolierung
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2.7.2 Polymerase Kettenreaktion (PCR)
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2.8 Transfektion monozytärer Zellen
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2.9 Gewinnung von Zelllysaten und CAT-Assay
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2.9.1 Ernte der Zellen und Gewinnung der Zelllysate
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2.9.2 Proteinbestimmung der Zelllysate
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2.9.3 CAT-Assay
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2.10 Plaque Test und immunzytochemische Färbung HCMV–infizierter Zellen
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2.10.1 Standard– Plaque Test
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2.10.2 Immunzytochemische Färbung HCMV-infizierter Zellen
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2.11 Western Blot Analysen
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2.11.1 Infektion der HELF-Kulturen
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2.11.2 Western Blot Analysen
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3 Ergebnisse
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3.1 Untersuchungen zur Inzidenz von HCMV-Reaktivierungen während der Lakation in der laktierenden Brust und zur Virustransmission auf das gestillte Frühgeborene
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3.1.1 Inzidenz von DNAlaktia und DNAemia in stillenden Müttern in den ersten beiden Monaten nach Entbindung
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3.1.2 Untersuchungen zur Inzidenz der HCMV Übertragung auf das Frühgeborene
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3.1.3 HCMV-Infektionen der Frühgeborenen
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3.2 Einfluss von Molke auf die Virusreplikation und IE 1/2-Proteinsynthese in HCMV-infizierten HELF
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3.2.1 Effekt von Molke auf die HCMV-Replikation in HELF
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3.2.2 Effekt von Molke auf die HCMV-Immediate Early Proteinsynthese
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3.3 Einfluss von Molke auf die Aktivität des HCMV IE1/2-Enhancer/Promotors in HL-60 und THP-1 Zellen
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3.3.1 Einfluss von Molke auf die Aktivität des HCMV IE1/2-Enhancer/Promotor in HL-60 und THP-1 Zellen
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3.3.2 Kinetik der Stimulation des IE1/2-Enhancer/Promotors durch Molke stillender Mütter in den ersten Monaten der Laktation
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3.4 Untersuchungen zum Mechanismus der Molke-vermittelten Stimulierung des HCMV IE1/2-Enhancer/Promotors
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3.4.1 Untersuchungen zur Rolle von Glukokortikoiden im Prozess der molkevermittelten HCMV IE1/2-Enhancer/Promotorstimulation in HL-60 Zellen
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3.4.2 Untersuchung zur Rolle von TNFα und cAMP im Prozess der molkevermittelten HCMV IE1/2-Enhancer/Promotorstimulation in HL-60 Zellen
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3.4.3 Einfluss von humanem Prolaktin und Epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) auf die Aktivität des HCMV IE1/2-Enhancer/Promotors in HL-60 Zellen
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4 Diskussion
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4.1 HCMV-Reaktivierung in stillenden Müttern und Übertragung auf Frühgeborene
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4.2 Einfluss von Muttermilch auf die Reaktivierung und Replikation von HCMV
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5 Zusammenfassung
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Abkürzungsverzeichnis
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Literaturverzeichnis
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Anhang
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Lebenslauf
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Danksagung
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Erklärung
Tabellen
Bilder
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Abb. 1: Strukturschema des HCMV Das reife Viruspartikel hat einen Durchmesser von 150 – 200 nm. In seinem Inneren befinden sich das Virus-Core, eine fibrilläre Nukleoproteinmatrix, mit der das doppelsträngige, lineare DNA Genom assoziiert ist. Es wird von einem ikosaedrischen Kapsid umgeben.
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Abb. 2: Genomstruktur von HCMV. Erläuterungen im Text (Ho et al., 1991)
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Abb. 3: Schematische Struktur der Haupt-IE 1/2-Promotorregion Die repetitiven Sequenzen im HCMV IE1/2-Enhancer/Promotor sind als (21-bp Repeat), (19-bp Repeat), (18-bp Repeat), (17-bp Repeat) und (13-bp Repeat) dargestellt, die an sie bindenden Transkriptionsfaktoren (links) wurden durch Pfeile zugeordnet. (Mocarski et al., 2001)
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Abb. 4: Schematische Darstellung der HCMV IE1/2-Enhancer/Promotor Region und Lokalisation der Bindungsstellen für verschiedene Transkriptionsfaktoren (dargetellt als Pfeile). Die Lokalisation der Mutationen in den repetitiven Sequenzmotiven der verwendeten pRR55-Mutanten p17mut3, p18mut4 und p19mut5 sind durch X symbolisiert.
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Abb. 5: HCMV- und β-Globin PCR aus Molkeproben von 6 Müttern. Links: Die HCMV-PCR amplifizierte ein 123 bp DNA Fragment bei Anwesenheit von HCMV-DNA in der Molke (hier nur Mutter 5 links). Als Positivkontrolle wurde DNA aus AD169-infizierten Fibroblasten verwendet. Rechts: Nachweis von β-Globin DNA in HCMV-negativen Molkeproben der Mütter 1-4. Das Amplifikat ist 268 bp lang. Als Positivkontrolle diente DNA aus Plazentagewebe. M= 100 bp Längenmarker; Roche.
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Abb. 6: Korrelation von mütterlichen HCMV-Serostatus, HCMV-DNAlaktia und HCMV- Übertragung auf das Frühgeborene.
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Abb. 7: Einfluss von Molke und Dexamethason auf die HCMV-Replikation in HELF. Konfluente HELF-Kulturen wurden mit AD169 (m.o.i=0,02) infiziert und in An- und Abwesenheit von Molke (110 µl/ml) von 8 verschiedenen Müttern oder Dexamethason (Dexa 5x10-5M) kultiviert. Nach Anfärbung infizierter Zellen mit dem HCMV-spezifischen Antikörperklone E13 wurde die Anzahl der Foci pro Well bestimmt. Die Anzahl der CPE in der unbehandelten Viruskontrolle wurde „1“ gesetzt. Die aufgeführten Ergebnisse sind Mittelwerte und Standardabweichungen aus je 3 unabhängigen Experimenten.
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Abb. 8: Lichtmikroskopische Aufnahme der CPEs in unbehandelten (A und C) und molkebehandelten (B und D) AD169 - infizierten HELF. Die infizierten Zellen wurden mit dem HCMV-spezifischen Antikörper E13 (Kap. 2.10.) angefärbt. A und C: 2.5-fache Vergrößerung, B und D: 10-fache Vergrößerung. Für das hier dargestellte Experiment wurde Molke der Mutter „I“ verwendet.
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Abb. 9: Einfluss von Molke und Dexamethason auf die Virusausbreitung in HELF. HELF wurden mit AD169 (m.o.i=0,02) infiziert und unter An- und Abwesenheit von Molke (110 µl/ml) von 8 verschiedenen Müttern oder Dexamethason (Dexa 5x10-5M) kultiviert. Nach Anfärbung infizierter Zellen mit dem anti-HCMV-AK E13 wurde die Anzahl infizierter Zellen in 5 repräsentativen CPEs ausgezählt, gemittelt und relativ zur Viruskontrolle errechnet. Hierzu wurde die Anzahl infizierter Zellen pro CPE in der unbehandelten Viruskontrolle „1“ gesetzt. Die aufgeführten Ergebnisse sind Mittelwerte und Standardabweichungen aus je 3 unabhängigen Versuchen
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Abb. 10: Einfluss von Molke oder Dexamethason auf die Synthese der HCMV IE Proteine IE1 und IE2. A. Immunoblots für HCMV IE1 und IE2 Protein und Aktin HELF wurden mit AD169 (m.o.i. = 1) infiziert und 3 Tage in An- und Abwesenheit von Molke (300 µl/ml) verschiedener Mütter oder Dexamethason (Dexa 5x10-6M) kultiviert. Je 40 µg Protein wurden elektrophoretisch aufgetrennt und nach Transfer auf Nitrozellulosemembran mit dem anti-HCMV Antikörper E13 im Immunoblot angefärbt. Die Abbildung zeigt einen von 3 repräsentativen Blots. Nach „Strippen“ der Membran wurde der Blot mit anti-Aktin Antikörpern inkubiert. B. Semiquantitative Auswertung der Immunoblots Die quantitative Auswertung der Immunoblots erfolgte mittels Farbdichtemessung der Banden im linearen Skanbereich. Es wurde jeweils die Dichte der mit anti-HCMV AK E13 angefärbten Banden relativ zur unbehandelten Kontrolle errechnet. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichung der relativen Bandendichten aus drei unabhängigen Versuchen.
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Abb. 11: Einfluss steigender Konzentrationen von Molke auf die CAT-Expression in pRR55 transfizierten HL-60 Zellen. HL-60 Zellen wurden mit pRR55 transient transfiziert und unter An- und Abwesenheit steigender Menge Molke von drei verschiedenen Müttern kultiviert. Nach 30 Stunden wurde die CAT-Expression gemessen. Die CAT-Expression in der unbehandelten Kontrolle wurde „1“ gesetzt. Dargestellt sind die relativen CAT-Expressionswerte aus 3 unabhängigen Experimenten.
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Abb. 12: Einfluss von Molke auf die CAT-Expression in pRR55-transfizierten HL-60 und THP-1 Zellen. HL-60 und THP-1 Zellen wurden parallel mit pRR55 transfiziert und unter An- und Abwesenheit identischer Molkeproben (200 µl/600 µl) kultiviert. Die CAT-Expression der jeweiligen unbehandelten Kontrolle wurde „1“ gesetzt. Die relativen CAT-Expressionen unter Zugabe von Molkeproben 3 verschiedener Mütter von je 3 verschiedenen Abnahmezeitpunkten sind dargestellt. Abgebildet sind die Ergebnisse von drei Einzelexperimenten.
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Abb. 13: Einfluss von Molke verschiedener Mütter auf die Aktivität des HCMV IE1/2-Enhancer/Promotors im Verlauf der Laktation HL-60 Zellen wurden mit pRR55 transfiziert, in An- und Abwesenheit von 200 μl Molke/600 μl Medium kultiviert und die CAT-Expression nach 30 Stunden gemessen. Dargestellt sind die CAT-Expressionswerte relativ zur unbehandelten Kontrolle, die „1“ gesetzt wurde. Die Molkeproben wurden von 5 HCMV-seroSpositiven (A) und 5 HCMV-seronegativen Müttern (B) während der ersten 5 bis 7 Wochen nach Entbindung gesammelt. Die dargestellten Ergebnisse sind Mittelwerte und Standardabweichungen aus drei unabhängigen Versuchen.
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Abb. 14: Einfluss von Molkeproben einer Mutter auf die Aktivität des IE1/2-Enhancer/Promotors im Verlauf von 6 Monaten nach Entbindung HL-60 Zellen wurden transient mit pRR55 transfiziert, 30 Stunden unter An- und Abwesenheit von 200 μl Molke/ 600 μl Kulturmedium kultiviert und die CAT-Expression gemessen. Molkeproben einer Mutter (Mutter W) von unterschiedlichen Abnahmezeitpunkten (1.-6. Monat der Laktation) wurden getestet. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen der relativen CAT- Expressionswerte aus drei unabhängigen Versuchen.
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Abb. 15: CAT-Expression in pRR55 und p17mut3 transfizierten HL-60 Zellen nach Behandlung mit Molke. HL-60 Zellen wurden parallel mit pRR55 und p17mut3 transfiziert und mit 200 μl Molke/600 µl Medium bzw. 5x10-6M Dexamethason (Dexa) kultiviert. Nach 30 Stunden wurde die Promotoraktivität im CAT-Assay gemessen und relativ zur unbehandelten Kontrolle errechnet. Zur vergleichenden Darstellung der Aktivität beider Promotorkonstrukte nach Behandlung mit Molke wurde die in pRR55-transfizierten HL-60 Zellen gemessene CAT-Expression 100% gesetzt (schwarze Säulen). Die Abbildung zeigt je 2 unabhängige Versuche pro Molkeprobe bzw. Mittelwerte und Standardabweichung aus 7 unabhängigen Versuchen (Dexa).
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Abb. 16: Antagonisierender Effekt von RU-486 auf die CAT-Expression in Dexamethason- und Molke -behandelten pRR55-transfizierten HL-60 Zellen. Mit pRR55 transfizierte HL-60 Zellen wurden unter Zugabe von 200 μl /600 µl Molke oder 5x10-6M Dexamethason (Dexa) mit 3 μl DMSO oder 3 µl RU-486 (5 mg/ml DMSO) kultiviert. Nach 30 Stunden wurde die CAT-Expression gemessen und die relative CAT-Expression errechnet. Dargestellt ist ein repräsentativer Versuch von 3 unabhängigen Experimenten mit Molkeproben der Mütter W und J.
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Abb. 17: CAT-Expression in pRR55 und p18mut4 (A) oder p19mut5 (B) transfizierten HL-60 Zellen nach Behandlung mit Molke.
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Abb. 18: Einfluss von Prolaktin auf die IE1/2-Enhancer/Promotoraktivität in pRR55-transfizierten HL-60 Zellen. HL-60 Zellen wurden mit pRR55 transient transfiziert und in Anwesenheit steigender Konzentrationen Prolaktin für 30 Stunden inkubiert. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen der CAT-Expression relativ zur unbehandelten Kontrolle (“1“) aus drei unabhängigen Versuchen.
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Abb. 19: Einfluss des Epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) auf die IE1/2-Enhancer/Promotoraktivität in pRR55-transfizierten HL-60 Zellen. HL-60 Zellen wurden transient mit pRR55 transfiziert und in Anwesenheit von steigenden Konzentrationen EGF für 30 Stunden inkubiert. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen der CAT-Expression relativ zur unbehandelten Kontrolle (“1“) aus drei unabhängigen Versuchen.
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XDiML DTD Version 4.0 | Zertifizierter Dokumentenserver der Humboldt-Universität zu Berlin | HTML-Version erstellt am: 31.07.2006 |