3 Zellbiologischer Hintergrund

Die für diese Arbeit relevanten Themengebiete Zellmigration und Zelladhäsion sind in den letzten Jahren Gebiete umfassender Forschung gewesen. Zur Einführung in die zellbiologischen Grundprinzipien werden daher einzelne bedeutende Aspekte aus dem aktuellen Wissensstand aufgegegriffen und für die Bearbeitung der aufgeworfenen Fragen relevante Gesichtspunkte näher erläutert.

3.1  Zellmigration

Die Zellmigration gehört zu den biologischen Prozessen von elementarer Bedeutung. Dabei ist sie sowohl in der Embryogenese, als auch im adulten Organismus sowie bei der Ausbildung von pathologischen Prozessen zu finden. Die Bildung der Keimblätter während der Gastrulation (Keller 2005; Montero und Heisenberg 2004) oder die Entwicklung des Nervensystems (Jones und Trainor 2005) und der Keimbahnen (Molyneaux und Wylie 2004) sind ohne gerichtete Zellmigration nicht möglich. Im adulten Organismus sind das Einwandern der Immunzellen in entzündetes Gewebe (Martin und Leibovich 2005) und die Reepithelialisierung nach Gewebeschäden im Rahmen der Wundheilung (Santoro und Gaudino 2005) prominente Beispiele für Zellmigration. Die Bedeutung der Migration zeigt sich aber auch in der Beteiligung an pathologischen Prozessen. Die Fehlregulation von Immunzellen führt zu chronischen Entzündungen (Luster et al. 2005) und die Metastasierung von Tumorzellen (Friedl und Wolf 2003) stellt eines der großen Probleme in der Krebsbekämpfung dar.

3.1.1  Migrationsformen

Man unterscheidet zwei Hauptformen der Migration. Die amöboide, benannt nach der Amöbe Dictyostelium discoideum, und die mesenchymale Migration, die bei Zellen des Mesenchyms vorherrscht (Friedl 2004). Die Form der Zellen bei der amöboiden Migration entspricht einem Halbkreis. Die Bewegung erfolgt mit der runden Seite des Halbkreises voraus über die Querachse der Zelle und ist als kriechend zu beschreiben
(Lee et al. 1993). Zellen mit mesenchymaler Migration zeigen einen polarisierten Phänotyp. In der klassischen Migrationsform folgt auf eine halbkreisförmige Front der Zellkörper mit einem lang gestreckten Zellausläufer am Zellende. Die Zellform erinnert an einen Trichter und die Bewegung erfolgt entlang der Längsachse der Zelle (Sheetz et al. 1998). Amöboide Migration ist auch in Eukaryoten bei hematopoetischen Stammzellen, Leukozyten und manchen Tumorzellen zu finden. Auf Grund von kurzlebigen, lockeren Adhäsionen erreichen die Zellen bei dieser Migrationsform eine hohe Geschwindigkeit. Beispielsweise bewegen sich Leukozyten mit einer Geschwindigkeit von 2-30 μm / min (Friedl et al. 1998).

Die mesenchymale Migration ist bei Fibroblasten und Zellen mit fibroblasten-ähnlicher Morphologie, wie z. B. Zelllinien aus dem Muskel oder dem Endothel, sowie bei Sarkomazelllinien zu beobachten. Die Migration umfasst hier einen Zyklus aus mehreren Einzelschritten (Cox und Huttenlocher 1998). Nach der Polarisation einer Zelle erfolgt der Vorschub der Zellfront, die Protrusion. Anschließend werden neue Adhäsionspunkte gebildet und verankert. Innerhalb der vorderen 15 Mikrometer der Zellfront wird die Kraft auf das Substrat übertragen (Dembo und Wang 1999). Die Adhäsionen im Bereich des Zellkörpers vermitteln nur kleine Kräfte und sind nicht direkt an der Vorwärtsbewegung der Zelle beteiligt (Beningo et al. 2001). In der elastischen Übergangszone, dem hinteren Bereich der Lamelle, führt die Kontraktion des Aktinzytoskeletts dazu, dass der Zellkörper zusammengezogen wird (Huttenlocher et al. 1995; Munevar et al. 2001a; Sheetz 1994). Wenn die Adhäsion zum Substrat an der Zellfront stärker und am Zellende schwächer ist, bzw. am Zellende aktiv gelöst wird, kann sich die Zelle über die Adhäsionspunkte hinweg vorwärts bewegen (Sheetz et al. 1998). Dabei verhält sich der Zellkörper mechanisch wie eine Art Frachtgut (Munevar et al. 2001a). Die Migrationsgeschwindigkeit bei dieser Migrationsart beträgt nur 0,1-2 μm / min (Abercrombie et al. 1970a+b).

Die Migrationsgeschwindigkeit adhärenter Zellen wird durch die Ausbildung der Protrusionsfront und die Bildung neuer Adhäsionen an der Zellfront (Wessels et al. 1994) sowie durch die Effektivität der Lösung der Adhäsionen am Zellende (Palecek et al. 1998) bestimmt. Welcher der beiden Prozesse die Migration dominiert, hängt vom Substrat ab. Ist die Adhäsion zum Substrat schwach, dominiert die Protrusion. Bei mittlerer und starker Adhäsion zum Substrat ist das Ablösen des Zellendes der geschwindigkeitsbestimmende Schritt für die Zellmigration (Palecek et al. 1998). Bei den meisten Zellen besteht ein direkter Zusammenhang zwischen Adhäsion am Substrat und der resultierenden Migrationsgeschwindigkeit (Huttenlocher et al. 1996; Palecek et al. 1997). Die maximale Geschwindigkeit erreicht die Zelle bei einer mittleren Substrathaftung (DiMilla et al. 1991; DiMilla et al. 1993; Huttenlocher et al. 1996; Palecek et al. 1997), da sie bei schlechterer Substrathaftung nicht genügend stabile Adhäsionspunkte ausbilden kann und bei zu starker Adhäsion die Ablösung des Zellendes verlangsamt erfolgt. Die Migrations-geschwindigkeit wird durch die Anzahl der Liganden im Substrat, der Expression der Integrinrezeptoren in der Zelle und die Integrin-Ligand-Bindungsaffinität bestimmt. Bei maximaler Geschwindigkeit verhalten sich Änderungen in der Ligandenkonzentration auf der Oberfläche des Substrats und bei der Interginexpression reziprok zueinander (Palecek et al. 1997).

Das Zytoskelett eukaryotischer Zellen besteht aus Mikrotubuli, Intermediärfilamenten und Aktinfilamenten. Alle drei Strukturen sind an der Zellmigration beteiligt, wobei den Aktinfilamenten der größte Anteil zukommt. Dabei sind zwei Hauptbereiche zu unterscheiden. An der Zellfront wird durch die Polarität des Aktins Protrusion ermöglicht und im Bereich des Zellkörpers und des Zellendes dient Aktin mittels der Aktin-Myosin-Wechselwirkung zum Aufbringen und Übertragen von Kräften.

3.1.2.1  Aktinstrukturen der Zellfront

Das filamentöse Aktin (F-Aktin) wird unter Hydrolyse von Adenosintriphosphat (ATP) im Tretmühlenmechanismus durch Polymerisation aus Aktinmonomeren zusammengesetzt. Das entstehende Filament ist polarisiert mit einem schnell wachsenden „Plus“-Ende, an dem die Polymerisation erfolgt, und einem „Minus“-Ende, an dem die Dissoziation von Monomeren überwiegt (Woodrum et al. 1975). Da die Polymerisation am „Plus“-Ende des Filaments kontinuierlich erfolgt, erreichen die Monomere im Verlauf der Polymerisation das „Minus“-Ende des Filaments, wo sie dann abdissoziieren (Wang 1985). Die Polarität der Aktinfilamente wird von der Zelle genutzt um Protrusion zu ermöglichen. Die wichtigsten Strukturen im Zusammenhang mit Protrusion sind Lamellipodien und Filopodien. Bei Lamellipodien handelt es sich um flache, breite, schildartige Strukturen mit einem reich verzweigten Aktinnetzwerk und darin liegenden Aktinfilamentbündeln, den so genannten Mikrospikes (Small 1981). Filopodien enthalten lange, parallele Aktinbündel und sind daher als dünne, zylindrische, nadelähnliche Strukturen zu beschreiben
(Svitkina et al. 2003).

Die Regulation dieser Strukturen erfolgt hauptsächlich durch drei Guanosintri-phosphatasen (GTP-asen) der Rho Familie. Dabei führt eine Aktivierung von Rac1 und Cdc42 zur Ausbildung von Lamellipodien über die Aktivierung des „Actin-related“-Protein-Komplexes (Arp2/3) (Ridley et al. 2003). Ferner vermittelt die Aktivierung von Cdc42 zusätzlich die Bildung von Filopodien an der Zellfront. Unter dem Einfluss von RhoA wird die Aktin-Myosin-Wechselwirkung verstärkt, was für die Ausbildung von Stressfasern benötigt wird (Hall 2005).

Die Aktivierung des Arp2/3-Komplexes löst sowohl die Neubildung von Aktinfasern, als auch die Bildung der y-förmigen Abzweigungen an bestehenden Fasern im Aktinnetzwerk der Lamellipodien aus. Dabei ist unklar, ob Arp2/3 seitlich an ein bestehendes Aktinfilament bindet (Mullins et al. 1998) oder die Verzweigung der Filamente direkt am „Plus“-Ende initiiert (Pantaloni et al. 2000). Für beide Theorien existieren überzeugende experimentelle Belege. Mit zunehmendem Abstand von der Protrusionsfront sinkt der Verzweigungsgrad des Aktinnetzwerkes, was auf das Altern der Aktinfilamente zurück zu führen ist. Nach der Hydrolyse des gebundenen ATPs dissoziiert der Phosphatrest ab. Dadurch sinkt die Affinität des Arp2/3-Komplexes für das Aktinfilament (Blanchoin et al. 2000) und das Filament zerfällt an der Verzweigungsstelle. Proteine der ADF/Cofilin (Actin depolymerizing factor) Familie beschleunigen sowohl die Abdissoziation des Phosphatrestes (Blanchoin und Pollard 1998) als auch die Abdissoziation der Aktineinheiten am „Minus“-Ende des Filaments (Bamburg 1999).

Die Entstehung von Filopodien erfolgt nach dem klassischen Tretmühlenmechanismus und wird mit dem „convergent elongation model“ beschrieben (Svitkina et al. 2003). Filopodien entstehen aus dem Aktinnetzwerk in Lamellipodien mittels veränderter Regulation. Zum einen sind in Filopodien erhöhte Mengen an Fascin zu beobachten. Fascin ist ein Protein, dass die Aktinbündelung vermittelt und demnach auch in Mikrospikes und Stressfasern zu finden ist (Yamashiro et al. 1998). Zum anderen wird das in Lamellipodien vorherrschende „capping“ verändert. Das „capping“ Protein (CP) bindet an die „Plus“-Enden von Aktin und verhindert dadurch die Bindung und Dissoziation von Aktinmonomeren (Schafer und Cooper 1995). Die Notwendigkeit des „cappings“ ist durch die Tunnel-Hypothese zu erklären (Carlier und Pantaloni 1997). Das Aktinzytoskelett ist im „steady-state“ weit vom Gleichgewicht zwischen Auf- und Abbau entfernt, so dass die Polymerisation deutlich bevorzugt wäre. Um trotzdem Protrusion zu ermöglichen, muss die Polymerisation gerichtet sein. Das CP bindet die älteren Filamente und verhindert somit, dass an älteren Filamenten polymerisiert wird. Damit findet Polymerisation nur vorne an der Membran statt, wo vorwiegend die neu gebildeten Filamente lokalisiert sind. In Übereinstimmung mit diesem Modell führt eine Überexpression von CP zu einer erhöhten Migrationsgeschwindigkeit (Hug et al. 1995). Im Falle der Filopodienbildung wird die Bindung des CP, z. B. durch die Bindung von Phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphat (PIP2) an CP, verhindert, so dass lange unverzweigte Filamente entstehen (Wear und Cooper 2004).

Bei Studien in In-vitro-Kultur konnte gezeigt werden, dass die Konzentrationen der Proteine Arp2/3, Fascin und CP über die Entstehung von Lamellipodien bzw. Filopodien entscheiden. Um mit Arp2/3 beschichteten „Beads“ entstehen in zytoplasmatischen Extrakten entweder Aktinwolken mit einer netzartigen Struktur, wie in Lamellipodien, oder Aktinsterne, mit langen und unverzweigten Filamenten, die gebündelt werden können. Die Filamente der Sterne besitzen eine einheitliche Orientierung, beginnend mit den „Minus“-Enden am „Bead“ und werden kontinuierlich verlängert, wenn die Konzentration an Fascin hoch und an Arp2/3 und CP klein ist. Damit ergibt sich in Aktinsternen eine Filamentstruktur wie in Filopodien (Vignjevic et al. 2003). Inwieweit die im Rahmen dieser Arbeit beobachteten Strukturen mit den hier beschriebenen vergleichbar sind, wird in Abschnitt 6.6 diskutiert werden.

Sowohl in Lamellipodien als auch in Filopodien sind die Aktinfasern mit den schnell wachsenden „Plus“-Enden zur Membran hin orientiert (Small et al. 1978). Die wachsenden Filamente schieben dabei die Membran vorwärts. Theoretisch setzt die lokale Aktinpolymerisation genug Energie frei, um die Membran vorzuschieben. Eine mechanistische Erklärung stellen zwei verschiedene Modelle vor. Im „cortical expansion“ Modell steigt das osmotische Potenzial an der Front, z. B. durch das vermehrte Auftreten von Aktinmonomeren, so dass Wasser einströmt und das Aktinfilamentgel anschwillt (Condeelis 1993). Schlüssiger ist allerdings die Modellvorstellung, dass thermische Energie in Form der Braunschen Molekularbewegung Protrusion ermöglicht. Beim „elastic brownian rachet“ Modell wird die thermische Energie in der Spannung oder Biegung von kurzen Aktinfilamenten gespeichert. Die elastischen Rückstellkräfte lassen die Filamente gegen die Membran zurückschnellen, wobei diese vorgeschoben wird (Mogilner und Oster 1996). Abgesehen von den Kräften, die das Aktin auf die Membran ausübt, ist auch der Widerstand, den die Membran dem Aktin entgegensetzt, von entscheidender Bedeutung. Je größer die Spannung der Membran ist, desto kleiner ist die Protrusion (Raucher und Sheetz 2000).

Aktin ist nicht nur für die Protrusion in den Lamellipodien der Zellen von Bedeutung, sondern spielt vor allem auch beim Nachziehen des Zellkörpers eine wichtige Rolle. Hauptsächlich besteht das Aktinzytoskelett des Zellkörpers aus langen Aktinbündeln, den Stressfasern, die den Zellkörper durchspannen und an einem oder beiden Enden in Adhäsionskomplexen enden. Die einzelnen Aktinfilamente in Stressfasern sind dabei bezüglich ihrer Polarisation alternierend angeordnet (Small 1988). In Herzfibroblasten wurde gezeigt, dass die ventral lokalisierten Aktinfasern aus langen, überlappenden Bündeln bestehen, deren vorwiegende Polarisation sich über die Länge der Bündel in jedem Bündel kontinuierlich ändert. Je näher die Fasern des Bündels der Zellfront sind, desto mehr „Plus“-Enden weisen in die Richtung der Zellfront (Cramer et al. 1997). Zusätzlich zu den Stressfasern können hinter dem Lamellipodium bogenförmige Aktinbündel auftreten, die die Form der Front nachzeichnen, sowie kleine sternförmige Anordnungen im Bereich zwischen der Front und dem Kern (Small 1988).

Eine deutliche Reduzierung der Migrationsrate in Myosin II-negativen Mutanten (Doolittle et al. 1995) legt nahe, dass die Generierung der Kraft zum Nachziehen des Zellkörpers mittels der Aktin-Myosin-Wechselwirkung vermittelt wird. Als mögliche Mechanismen sind ein Kontraktions- und ein Transportmodell beschrieben, die im Zusammenhang mit den in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnissen noch genauer diskutiert werden (Abschnitt 6.3.2). Im Kontraktionsmodell entsteht eine gleichmäßige Spannung in der Zelle und die Vorwärtsbewegung erfolgt durch eine Asymmetrie der Substrathaftung. Dabei kann die Adhäsion an der Zellfront stärker sein oder am Zellende gelöst werden. Beim Transportmodell wird die Zelle direkt vom Myosin II bewegt. Dazu müssen die Aktinfasern eine einheitliche Polarisation aufweisen und dabei fest am Substrat adhärieren. Die Zelle wird vom Myosin II über das Filament hinweg gezogen (Mitchison und Cramer 1996).

Aktinfilamente bilden die Basis für Zellmigration und Zellprotrusion. Die in der Literatur beschriebenen Einflüsse der Mikrotubuli (Small et al. 2002) und der Intermediärfilamente (Djabali 1999) sollen hier nicht näher erläutert werden, da im Rahmen dieser Arbeit auf das Aktinzytoskelett und seine Beteiligung an Migrations- und Adhäsionsvorgängen fokussiert wurde.

3.2  Zelladhäsion an Substraten

Die Interaktion von Zellen mit ihrer Umgebung ist in zwei Bereiche zu unterteilen. Direkte Zell-Zell-Kontakte werden von der Superfamilie der Cadherine vermittelt, während die Interaktion mit der extrazellulären Matrix (ECM) über die Familie der Integrine erfolgt. Cadherine spielen zwar unter anderem bei der Zellerkennung und der Zellsortierung in der Entwicklung eine wichtige Rolle (Takeichi et al. 1988; Takeichi et al. 2000), in dieser Arbeit wird aber die Interaktion der Zelle mit dem Substrat im Mittelpunkt stehen. Die Interaktion der Zelle über Integrine mit der ECM hat Einfluss auf alle Bereiche des Lebenszyklusses einer Zelle. Dabei beeinflussen sich Zelle und ECM gegenseitig. Bei den Proteinen der ECM handelt es sich meist um große Glykoproteine, einschließlich der Gruppe der Kollagene, der Fibronektine, der Laminine und der Proteoglycane (Gumbiner 1996). Die Adhäsionsstrukturen der Integrine mit der ECM werden in Hemidesmosomen und Fokale Adhäsionen (FA) unterteilt. Hemidesmosomen sind adhäsive Strukturen aus der Epidermis, die an Keratinfilamenten verankert sind (van der Flier und Sonnenberg 2001). Fokale Adhäsionen sind weiter verbreitet, binden intrazellulär an das Aktinzytoskelett und bilden verschiedene Kontakte mit ECM. Sie sind vor allem bei migratorischen Prozessen von Bedeutung (Geiger et al. 2001).

3.2.1  Integrine

Die Transmembranrezeptorgruppe der Integrine spielt sowohl bei physiologischen Prozessen, wie Embryogenese (Darribere et al. 2000), Angiogenese (Schwartz et al. 1995), Zelladhäsion und Zellmigration (Cox und Huttenlocher 1998) und Zellzyklus-Kontrolle (Schwartz und Assoian 2001), als auch bei pathologischen Prozessen wie der Metastasierung von Tumorzellen eine wichtige Rolle (Brakebusch et al. 1997; van der Flier und Sonnenberg 2001). Beispielsweise stellt die Interaktion zwischen Integrinen und Rezeptorkinasen, wie dem Epidermis-„Growth-Factor“-(EGF)-Rezeptor, die Basis für das adhäsionsabhängige Wachstum adhärenter Zellen dar (van der Flier und Sonnenberg 2001).

Bei Integrinen handelt es sich um nicht kovalent gebundene Heterodimere vom Typ I der Transmembranproteine (Hynes 1992), die aus einer α- und einer β-Untereinheit zusammengesetzt sind. Physiologisch sind mehr als 20 verschiedene Rezeptoren bekannt (Hynes 1992). Integrine binden an das Laminin der Basallamina, interagieren mit der Gruppe der Kollagene und dem Peptid-Bindungsmotiv Arginin-Glycin-Asparaginsäure (RGD) aus Fibronektin (FN) und Vitronektin (Hynes 2002). Integrine selbst besitzen jedoch keine enzymatische Aktivität. Eine intrazelluläre Aktivierung, z. B. durch die Bindung von Talin (Hynes 2003; Tadokoro et al. 2003), und / oder extrazelluläre Ligandenbindung induziert die Bildung von „Clustern“ und eine Konformationsänderung. Im inaktiven Zustand ist die extrazelluläre Domäne abgeknickt und die intrazellulären Domänen sind lose, evtl. durch Proteine, miteinander verbunden. Bei der Aktivierung werden die extrazellulären Domänen aufgerichtet und der Ligand kann gebunden werden. Bilden sich Homodimere oder Homotrimere aus, neigen diese ebenfalls zur „Cluster“-Bildung und liegen dann in der aktivierten Konformation vor. Extrazellulär ist die Bindung eines Liganden möglich, wenn α- und β-Untereinheiten nebeneinander lokalisiert sind (Hynes 2003). In adhärenten Zellen liegen Integrine in einer konstitutiv-aktivierten Konformation vor.

Bei Integrinen handelt es sich um bidirektionale Transmembranproteine, die nicht nur den Einfluss der ECM auf die Zelle vermitteln („outside-in-signalling“), sondern auch Signale von der Zelle auf die ECM übertragen („inside-out-signalling“). Beispielsweise ist die Anwesenheit von intaktem α5β1 Integrin zur Bildung von Fibrillen aus FN und zum Aufbau der ECM nötig (Hynes 1992).

Die in der Literatur beschriebenen Erkenntnisse wurden in Versuchen gewonnen, in denen eine quasi physiologische Adhäsion auf Proteinen der ECM untersucht wurde. Nichtsdestotrotz adhärieren Zellen auch auf unphysiologischen Substraten, wie Plastik oder Glas in der In-vitro-Kultur. Daher muss es auch dort eine Möglichkeit zur Aktivierung der Integrine geben. Eine Adsorption von Serumproteinen auf der Oberfläche bietet sich dabei als Möglichkeit an. Allerdings sind auch Zellen in serumfreiem Medium in der Lage auf artifiziellen Oberflächen zu adhärieren. Die intrazelluläre Aktivierung des Integrins durch Talinbindung oder die Homodimerbildung kommen da als mögliche Mechanismen in Frage, wenn extrazellulär kein Ligand zur Verfügung steht. Ebenso denkbar wäre, dass Zellen, die unter physiologischen Bedingungen ECM produzieren, in Kultur auf der von ihnen gebildeten Matrix adhärieren.

Durch die Aktivierung der Integrine bilden sich die eigentlichen Adhäsionsstrukturen, die Fokalen Adhäsionen (FA), aus. Dabei handelt es sich um eine Struktur von über 50 Proteinen, die intrazellulär die Anbindung der Integrine an das Aktinzytoskelett vermittelt und diverse Signalkaskaden aktiviert (Grande-Garcia et al. 2005).

Die Bestandteile der FA umfassen neben verschiedenen Kinasen und Phosphatasen sowie Modulatoren von GTP-asen (Zamir und Geiger 2001) auch Brückenproteine, wie Talin oder Vinculin, die die Einzelkomponenten des Komplexes miteinander verbinden (Giancotti und Ruoslahti 1999). Beispielsweise bindet Vinculin in der geschlossenen Form Paxillin, F-Aktin und den Lipidbilayer. Wird zusätzlich noch PI-4,5-bisphosphat gebunden ändert sich die Konformation des Vinculins und es werden Bindungsstellen für
α-Actinin, Talin und das Vasodilator-stimulierte Phosphoprotein (VASP) frei (Zamir und Geiger 2001).

FA und ihre Varianten fibrilläre Adhäsion (FiA) und fokaler Komplex (FC) unterscheiden sich in Morphologie, Größe und subzellulärer Zusammensetzung. Bei FA handelt es sich um flache, längliche Strukturen von einigen Mikrometern Größe, die in der Zellperipherie lokalisiert sind und häufig an FN-freie Bereiche binden. FA werden von αvβ3-Integrin gebildet und enthalten vor allem α-Actinin, Paxillin, Vinculin, Talin und Zyxin sowie hohe Anteile an tyrosinphosphorylierten Proteinen, wie die FA-Kinase (FAK) (Yamada und Geiger 1997). Fibrilläre Adhäsionen (FiA) entstehen an den Enden von FA, sind länger als diese und binden an FN-Fibrillen. Im Unterschied zu FA werden FiA von α5β1-Integrin gebildet und enthalten hauptsächlich Tensin. Der Gehalt an tyrosinphosphorylierten Proteinen ist gering (Zamir et al. 2000). Als Vorläufer der FA sind die Fokalen Komplexe (FC) anzusehen. Dabei handelt es sich um kleine, punktförmige Adhäsionen an den Rändern der Lamellipodien, die bei der Migration und beim „Membran-ruffling“ auftreten (Small et al. 1998; Zamir und Geiger 2001). Im Gegensatz zu FA enthalten sie noch keinerlei Zyxin und nur einen geringen Gehalt an Vinculin und FAK (Zaidel-Bar et al. 2003). FA und FiA treten kurz nach der Bildung als Mischformen auf. Da FiA an deformierbares FN gebunden sind, werden die FiA mittels des Aktomysin-Komplexes in Richtung des Zellzentrums gezogen (Zamir et al. 2000). Diese Dehnung des FN spielt auch im Rahmen des „inside-out-signalling“ zur Einleitung der Fibrillogenese eine Rolle (Pankov et al. 2000). Zusätzlich detektiert die Zelle mit Hilfe ihrer Adhäsionen den Spannungszustand der ECM (Wehrle-Haller und Imhof 2002). Dies ist von Bedeutung, da härteres Substrats von den Zellen zur Adhäsion bevorzugt wird (Lo et al. 2000).

Die erste Beschreibung der Adhäsionsstrukturen erfolgte an Hand elektronen-mikroskopischer Aufnahmen (Abercrombie et al. 1971). Später wurden FA auch mittels Interferenz-Reflexions-Mikroskopie (IRM) detektiert (Abercrombie und Dunn 1975; Izzard und Lochner 1976; Izzard und Lochner 1980). Der Abstand von FA zum Substrat beträgt ungefähr 10-20 Nanometer. Bei FiA ist ein deutlich größerer Abstand von ungefähr 100 Nanometern zu beobachten (Zamir et al. 2000).

Bei migrierenden Zellen müssen die Adhäsionspunkte mit der Verbindung zur ECM Halt bieten, damit die Zelle sich bewegen kann. Dabei werden die Adhäsionspunkte vorne an der Front gebildet und die Zelle schiebt sich darüber hinweg, wobei die Adhäsion ortsfest in Relation zum Substrat bleibt (Izzard und Lochner 1980). Der Lebenszyklus einer Adhäsion lässt sich dabei an Hand vier verschiedener Positionen innerhalb der Zelle einteilen (Smilenov et al. 1999). Die an der Front gebildeten Adhäsionen bleiben ortsfest, bis sie in den Bereich des Kernes gelangen. Während dieses als Reifung bezeichneten Prozesses, wird die Fläche der Adhäsionspunkte kontinuierlich größer. Im Bereich zwischen Kern und Zellende verschwindet ein Teil der Adhäsionen (Ballestrem et al. 2001) und die verbleibenden Adhäsionspunkte üben kaum noch Kräfte auf das Substrat aus (Beningo et al. 2001). Das ändert sich zum Zellende hin, wo Adhäsionen wieder unter Spannung stehen. Je nach Effektivität des Ablösungsprozesses werden die Adhäsionspunkte dann gelöst und die Integrine wandern entlang des Zellausläufers in Richtung der Zellmitte (Lauffenburger und Horwitz 1996) oder sie bleiben auf dem Substrat zurück (Chen 1981a).

Die Adhäsionsfestigkeit von adhärenten Zellen zum Substrat wird durch die Eigenschaften der Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung bestimmt (Cox und Huttenlocher 1998; Huttenlocher et al. 1996). Zur Lösung der Adhäsionen sind zwei verschiedene Ablösungstypen beschrieben (Palecek et al. 1999). Wirken große intrazelluläre Kräfte und die Adhäsion zum Substrat ist gering, wird die Verbindung zwischen der ECM und dem Integrinrezeptor getrennt. Sind die intrazellulären Kräfte hingegen gering und es herrscht eine große Adhäsion zum Substrat, wird die Integrin-Zytoskelettbindung gelöst. Im ersten Fall hinterlässt die Zelle wenig, im zweiten Fall viel Integrin auf der Oberfläche (Palecek et al. 1998). Die Entstehung von Zellspuren am Zellende von migrierenden Zellen ist also unmittelbar mit dem Ablösen des Zellendes vom Substrat verknüpft.

Das Ablösen oder Abreißen des Zellendes über intrazelluläre Kräfte sorgt für eine ruckartige Vorwärtsbewegung des Zellkörpers. Dabei geht dem eigentlichen Abreißen eine aktive ATP-abhängige Kontraktion voraus (Chen 1981a). Eine Hemmung dieser Kontraktion, die durch die Aktin-Myosin-Wechselwirkung verursacht wird, unterbindet die Zellmigration, eine Stimulation kann sie beschleunigen (Chrzanowska-Wodnicka und Burridge 1996; Crowley und Horwitz 1995; Klemke et al. 1997; Wilson et al. 1991).

Reicht die von der Zelle durch Aktomyosin-Kontraktion aufgebrachte Kraft nicht aus, um die Integrine von der Oberfläche abzureißen, wird die Ablösung des Zellendes Calpain-abhängig (Palecek et al. 1999). Die Protease Calpain schneidet nicht nur direkt die
β-Untereinheiten des Integrin (Glading et al. 2002), sondern auch viele Proteine der FA, wie die Fokale Adhäsions Kinase (FAK) oder Talin. Dadurch zerfällt der Adhäsions-komplex und die Verbindung zum Aktinzytoskelett wird aufgehoben (Beckerle et al. 1987; Cooray et al. 1996).

Intrazelluläre Signalkaskaden spielen beim Auf- und Abbau von Adhäsionen und den damit verbundenen Prozessen ebenfalls eine wichtige Rolle. Die zentrale Kinase in diesem Zusammenhang ist die FAK (Parsons 2003). Diese Kinase bindet an verschiedene zytoskelettassoziierte Proteine der FA, wie Paxillin (Schaller und Parsons 1995; Turner und Miller 1994) oder Talin (Chen et al. 1995), ist aber vor allem auch der Startpunkt vieler Signalkaskaden. Diese führen beispielsweise zu einer Erhöhung der Kontraktilität der Zelle oder zum Lösen der Verbindung der Aktinfilamente untereinander, da beispielsweise phosphoryliertes α-Actinin nicht mehr an Aktin bindet (Mitra et al. 2005). Zellen ohne FAK bilden daher vermehrt größere Adhäsionen aus und migrieren schlechter (Alahari et al. 2002; Webb et al. 2002).

Bei der Deaktivierung der Signalwege im Zusammenhang mit Adhäsion kommt der Gruppe der Protein-Tyrosin-Phosphatasen (PTP) ein besondere Bedeutung zu (Stoker 2005). Beispielsweise führt der Verlust der Protein-Tyrosin-Phosphatase-PEST (PTP-PEST) zu einer erhöhten Anzahl von Adhäsionen und einer reduzierten Ausbreitung und Migrationsrate (Tamura et al. 1998).

Die Konzentration von intrazellulärem Ca²⁺ ist ebenfalls ein potenter Regulator vieler Zellprozesse, wie Exozytose, Gentranskription, Zellkontraktion und Zellproliferation (Berridge et al. 2003). Im Falle von Zellhaftung und Zellmigration stabilisieren und destabilisieren Ca²⁺-Ströme die Zell-Substrat-Adhäsion von verschiedenen Zelltypen (Sjaastad und Nelson 1997). In migrierenden 3T3-Fibroblasten konnten beispielsweise Einflüsse auf die Kontraktilität der Zelle und die Zusammensetzung der Adhäsionspunkte beobachtet werden (Munevar et al. 2004).

Während der Migration von Fibroblasten bilden die Zellen lange Zellausläufer, die sprunghaft nachgezogen werden. Dabei reißt der Ausläufer kurz vor dem Ende ab und ein Teil des Zellmaterials bleibt an der Oberfläche zurück (Bard und Hay 1975; Chen 1981a; Chen 1981b). Da dieses Abreißen des Ausläufers von der Substratoberfläche nicht durch Lösen der Integrinbindung geschieht, wurde dieser Prozess auch als „membrane ripping“ bezeichnet (Lauffenburger und Horwitz 1996). Insgesamt ist dem von Zellen zurückgelassenen Material lange keine große Aufmerksamkeit zu Teil geworden, da die Strukturen mit konventioneller Lichtmikroskopie nicht zugänglich sind. Genauere Beschreibung erfolgte dann unter Zuhilfenahme von hochauflösenden Mikroskopie-techniken wie der „Atomic-Force“-Mikroskopie (AFM), der „Scanning-Electron“-Mikroskopie (SEM) und der Interferenz-Reflexions-Mikroskopie (IRM) (Fuhr et al. 1998).

3.4.1  Morphologische Beschreibung

Die meisten Untersuchungen wurden an Spuren von L929-Fibroblasten durchgeführt. Bei diesen Zellspuren handelt es sich um hoch organisierte Strukturen, die aus filamentösen Bereichen mit Verzweigungen bestehen. Die Filamente besitzen eine Breite zwischen 60 und 100 Nanometern und eine Höhe von 100-130 Nanometern (Fuhr et al. 1998). Verzweigungspunkte sind meist etwas höher und erreichen zwischen 200-400 Nanometer an Höhe. Die beobachteten Verzweigungswinkel liegen zwischen 90 und 100 Grad und sind erstaunlich konstant. Einmal abgelegte Spuren werden von den Zellen nicht mehr aufgenommen und können von anderen Zellen überwandert werden, ohne dass dabei eine Veränderung an Zelle oder Spur zu erkennen ist. Daher kann es zu überkreuzten Spuren von zwei verschiedenen Zellen kommen. Allerdings können auch einzelne Teile einer Zellspur überlappen oder sich kreuzen (Zimmermann et al. 1999). Zellspuren können mehrere 100 Mikrometer lang werden. Die genaue Morphologie einer Zellspur hängt sowohl vom Zelltyp als auch von der verwendeten Oberfläche ab. Allerdings können einige Grundmotive definiert werden (Fuhr et al. 1998).

Die Zellspur unterteilt sich in drei Bereiche. Der erste Teil der Spur ist das so genannte „near field“. Dieser Teil der Spur befindet sich direkt am Zellkörper und ist noch mit der Zelle verbunden. Daher ist die Lage dieses Spurbereiches während der Migration der Zelle veränderlich und Material aus diesem Teil kann von den Zellen wieder resorbiert werden. Der zweite Teil wird als „transitional field“ bezeichnet und ist von variabler Länge. Dieser Teil der Spur hat Haftung zum Substrat und ist ebenfalls noch mit der Zelle verbunden. Allerdings wird bereits dieser Teil fast vollständig von der Zelle zurückgelassen. Der dritte Teil bezeichnet den Anfang der Spur und ist daher am weitesten von der Zelle entfernt („far field“). Dieser Teil der Spur haftet stark am Substrat und ist vollständig von der Zelle getrennt. Der gesamte Materialverlust bei Entstehung einer Zellspur beträgt normalerweise zwischen 0,3 und 0,7 Prozent des Gesamtzell-volumens und kann bis auf maximal 1 Prozent ansteigen. Zellspuren im eigentlichen Wortsinn umfassen nur den zweiten und dritten Teil (Fuhr et al. 1998).

Eine Zellspur setzt sich aus linearen und nichtlinearen Bereichen zusammen. Bei den linearen Bereichen kann man gerade Linien sowie die davon abgeleiteten Strukturen, wie bogenförmige Linien, Linienenden, Verzweigungen, Kreuzungen und sogar Kreise bzw. Schlaufen voneinander unterscheiden. Die nichtlinearen Bereiche setzen sich aus Kugeln und knotenförmigen Verdickungen bzw. Verzweigungen zusammen. Eine typische Spur besteht aus Linienelementen mit Verzweigungen.

	Abbildung 3 : Schematische Darstellung einer Zelle mit Zellspur. Der Verzweigungsgrad des „transitional Field“ ist von der Migrationsgeschwindigkeit abhängig (s. 3.4.3)

Zur weiteren Charakterisierung wurde die Zusammensetzung der Spur untersucht. Fluoreszenzfärbungen zeigten, dass es sich bei den Zellspuren um membranumhüllte Strukturen handelt (Zimmermann et al. 2001). In den kontinuierlichen Bereichen konnte ferner F-Aktin gefunden werden. Segmentiere Bereiche enthalten kein F-Aktin mehr, allerdings konnte mit Antikörpern globuläres Aktin detektiert werden. Zusätzlich wurde in den dickeren Verzweigungspunkten β-Tubulin nachgewiesen. Proteine der FA wurden nicht gefunden (Fuhr et al. 1998). Bei der Analyse von Oberflächenrezeptoren wurde der Transferinrezeptor CD 71 (Zimmermann et al. 2001) und das MHC I Molekül in der Membran von Zellspuren detektiert.

Die Anzahl der Zellen, die Spuren hinterlassen, hängt von der Zellart ab. L929-Fibroblasten z. B. hinterlassen viele Zellspuren, wohingegen 3T3-Fibroblasten nur wenige Spuren erzeugen (Fuhr et al. 1998). Die Betrachtung des „near field“ kann Hinweise auf die Entstehungsmöglichkeiten einer Zellspur geben. Die Autoren schlagen eine Art „membran ruffling“ wie bei der Bildung von Lamellipodien an der Zellfront vor. Die Membran wird zusammen mit dem Aktinzytoskelett vorgeschoben und wieder zurückgezogen. Bei der Retraktion bieten die Aktinfasern mehr Widerstand als die Membran und bleiben zurück, so dass sich eine Zellspur bildet (Fuhr et al. 1998).

Eine interessante Beobachtung konnte später bei Lebendbeobachtungen im „near field“ von Spuren der Zelllinie L929 gemacht werden. Dieser Bereich erscheint bei der Beobachtung mittels IRM zuerst punktförmig, nach einer Stunde erkennt man jedoch an derselben Stelle vollständige Spuren (Richter et al. 2000). Dieses Phänomen wurde nicht weiter untersucht, da Zellen nur unter normaler Durchlichtbeleuchtung mobil waren. Beobachtung mittels IRM bietet zwar genügend Kontrast, um die Zellspuren zu sehen, führt aber dazu, dass die Zellen nicht mehr migrierten. Zur Erklärung des Phänomens wurde von Richter et al. (2000) vorgeschlagen, dass die Spuren innerhalb der Stunde in das Beobachtungsfeld eingesunken sein könnten. Im Rahmen dieser Arbeit konnten ähnliche Effekte beobachtet werden (s. 5.4.2).

Im Allgemeinen ist das „far field“ von Zellspuren der Zelllinie L929-stark verzweigt. Das daran anschließende „transitional field“ ist von variabler Länge und entweder genauso stark oder geringer verzweigt (Fuhr et al. 1998). Dabei kann der Verzweigungsgrad mit der Migrationsgeschwindigkeit der Zellen korreliert werden. Stark verzweigte „transitional fields“ werden von langsam wandernden Fibroblasten gebildet und schneller wandernde Zellen hinterlassen gering verzweigte Spuren, siehe Abbildung 3 (Richter et al. 2000).

Wenn Zellspuren altern, fangen sie an zu segmentieren und bilden kugelförmige Elemente. Die Segmentierung einer Spur beginnt erst, nachdem die Spur mit der Zelle nicht mehr verbunden ist. Daher beobachtet man Segmentierung immer zuerst am Ende, d. h. dem ältesten Teil der Spur. Durch osmotischen Stress, wie die Behandlung mit hypotonem Medium (Fuhr et al. 1998) oder permanente Beleuchtung, wie z. B. während mikroskopischer Beobachtung (Richter et al. 2000) kann die Segmentierung der Spuren beschleunigt werden.

In der Literatur sind derartige Prozesse bereits näher beschrieben worden. Wird bei adhärenten Zellen das Aktinzytoskelett aktiv zerstört, ziehen sich die Zellen zusammen und runden sich ab. Dabei bleiben sternförmig um den Zellkörper Zellausläufer zurück, die noch am Substrat haften. Während die Adhäsionsfläche verkleinert wird, ist die Membran von Ausläufer zu Ausläufer gespannt und daher leicht nach innen gekrümmt. Irgendwann runden sich die Zellen vollständig ab und der Ausläufer bleibt auf dem Substrat zurück und wird von der Zelle getrennt. Durch Entnetzung bilden sich dabei entlang des Ausläufers zuerst Einschnürungen, aus denen dann kleine Kugeln oder Perlen entstehen (Bar-Ziv et al. 1999). Bei diesem als „pearling“ bezeichneten Prozess handelt es sich um ein generelles Phänomen, das bei unter Spannung stehenden tubulären Strukturen beobachtet werden kann und für Lipidbilayer theoretisch beschrieben wurde (Bar-Ziv und Moses 1994).

Zellspuren von anderen Fibroblasten wie z. B. der Linie 3T3 unterscheiden sich morphologisch deutlich von L929-Spuren. Bei 3T3-Zellen wurden deutlich weniger Spuren gefunden, die auch nur im „near field“ kontinuierlich zu sehen waren (Fuhr et al. 1998). Daher gehen die Autoren davon aus, dass Spuren von 3T3-Zellen weniger stabil sind, schneller segmentieren und verschwinden. Grundsätzlich wurden Spuren bei diesen Zellen nur an Zellausläufern gefunden und nicht direkt an den Zellkörper anschließend.

Die Bildung von Zellspuren beschränkt sich nicht nur auf langsam migrierende Fibroblasten, sondern wurde auch bei Makrophagen und Sarcomazellen sowie bei humanen Osteosarcomazellen gefunden (Fuhr et al. 1998). Invasive Melanomzellen hinterlassen membranumhüllte Fragmente, die polymerisiertes Aktin und Integrin β1 enthalten können (Mayer et al. 2004). Bei schnell migrierenden Keratinozyten unterteilen sich die hinterlassenen Makroaggregate in zwei Gruppen, die sich in Aussehen, Lokalisation und Integrinzusammensetzung unterscheiden (Kirfel et al. 2003). Dabei entstehen die größeren Aggregate aus der Adhäsion von FA und die kleineren als Rückstände von Hemidesmosomen (Rigort et al. 2004).

Der Zustand von Zellen in ihrem natürlichen Gewebeverband ist beeinflusst von der Zellumgebung. Dabei sind lösliche Faktoren sowie direkte Zell-Zell-Kontakte und die Interaktion mit der ECM zu berücksichtigen. Prominentes Beispiel für die Wichtigkeit des Einflusses der Umgebungsmatrix ist der Prozess der Anoikis. In adhärenten Zellen wird Apoptose ausgelöst, wenn die Zellen den Kontakt zur Umgebung verlieren (Grossmann 2002; Reddig und Juliano 2005). Eine Disfunktion in diesem Bereich führt unter anderem zur Metastasierung von Krebszellen (Wang 2004). Daher sind die Prozesse, die der Wechselwirkung von Zellen mit der Matrix zu Grunde liegen, bedeutende Untersuchungsgebiete.

Die physiologische Umgebung der Zellen ist in vivo nicht homogen. Vom gleichmäßigen nanostrukturierten Netzwerk der Basalmembran bis hin zum strukturierten Gerüst aus Fibrinfibrillen mit Abständen von einigen Mikrometern im Bindegewebe oder während der Wundheilung ist ein breites Spektrum an verschiedenen Formen der Strukturierung der Zellumgebung zu finden (Abrams et al. 2000; Wezemann 1998). Die meisten wichtigen Erkenntnisse über die Interaktion von Zellen mit der Umgebungsmatrix wurden mit homogen beschichteten Substraten gewonnen (Zamir und Geiger 2001), auch wenn diese Substrate nicht die konkrete in-vivo Situation wiederspiegeln. Für weitere Fortschritte beispielsweise auf dem Gebiet des „Tissue Engineerings“ wird es von Nöten sein, die Strukturierung der physiologischen Matrix in die Untersuchungen miteinzubeziehen.

Zur Strukturierung der Substratoberfläche können zwei Wege beschritten werden. Der erste Weg beruht auf der Beeinflussung der Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung. Dabei werden auf antiadhäsiven Oberflächen adhäsive Bereiche durch die Beschichtung mit FN oder anderen Matrixproteinen geschaffen. Mit diesem Ansatz konnte gezeigt werden, dass Zellen sich ab einer Mindestgröße (Durchmesser ≥25 μm) auf einzelnen adhäsiven Inseln ausbreiten (Chen et al. 1997). Liegen die adhäsiven Punkte unter dieser Größe (0,6-9 μm²), ist es für Zellen auch möglich an mehreren Punkten zu haften. Dabei dürfen die Abstände 25 Mikrometer aber nicht überschreiten (Lehnert et al. 2004). Bei der Adhäsion an mehreren Punkten spannt sich das Zytoskelett zwischen den adhäsiven Punkten auf und die Zelle nimmt eine dementsprechende Form an. Interessanterweise gibt es für diesen Vorgang auch eine untere Grenze. Werden die Abstände zwischen den Adhäsionsbereichen kleiner als 2 Mikrometer, erkennt die Zelle das Substrat als unstrukturiert und homogen (Lehnert et al. 2004). Interessante Ergebnisse konnten auch mit Strukturen im Nanometerbereich erzielt werden. So wurde mit Hilfe von nanostrukturierten Oberflächen der optimale Abstand für das „Clustern“ der Integrine bestimmt (Arnold et al. 2004).

Bei den bisher beschriebenen Experimenten ist festzustellen, dass nicht nur die Adhäsionsfläche, sondern auch die Geometrie und Anordnung der Adhäsionen eine Rolle spielt, so dass sich Zellen an vorgegebene Strukturen anpassen. Daher ist anzunehmen, dass es auch Einflüsse auf die Zellen gibt, die sich aus der rein topographischen Strukturierung der Substrate ableiten lassen. Mit diesem Ansatz gelang es Jungbauer und Kollegen morphologische Veränderungen von genetisch modifizierten Melanozyten durch eine strukturierte Oberfläche zu neutralisieren (Jungbauer et al. 2004). Zudem lässt sich die Zellmigration von Neutrophilen entlang von Linienstrukutren auf dem Substrat ausrichten (Tan und Saltzman 2002). Ebenso konnte ein Effekt auf das Proliferationsverhalten von Epithelzellen der Kornea durch strukturierte Oberflächen gezeigt werden (Liliensiek et al. 2006). Diese Beispiele zeigen, dass auch der topographische Einfluss des Substrats auf die Zellen großen Einfluss haben kann. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Einfluss von Strukturen untersucht, deren Größe sich oberhalb der makromolekularen und unterhalb der zellulären Ebene befindet. Dieser Bereich von 100 Nanometern bis hin zu einigen Mikrometern ist technisch schwer zugänglichen. Auf der zellulären Ebene liegen einzelne Adhäsionen in dieser Größenordnung.