2 Material & Methoden

↓14

2.1 Material 

↓15

Die experimentellen Arbeiten der vorliegenden Dissertation wurden in der Klinik für Dermatologie, Venerologie und Allergologie der Charité, Universitätsmedizin Berlin [01/2005-10/2007[, zum Teil am Institute of Cell and Molecular Science of Barts and the London School of Medicine and Dentistry, London, U.K. [10/2005-12/2005] und in der ATV (Angewandte Tumorvirologie), DKFZ, Heidelberg [10/2007-05/2008] durchgeführt. Folgende Gewebeproben, Materialen und Versuchsmethoden kamen dabei zum Einsatz:

2.1.1 Patientenproben

2.1.1.1 Spenderhaut für die Isolation humaner primärer Epithelzellen

Humane Spenderhaut aus routinemäßig durchgeführten Mammareduktionsoperationen diente zur Isolation von HPK und HPF.

2.1.1.2 Spenderhaut für organotypische Hautkulturen

Humane in Glycerol konservierte Spenderhaut, bestehend aus Dermis und Epidermis (Euro Skin Bank, Beverwijk, Niederlande) wurde zur Konstruktion organotypischer Hautkulturen („raft culture“) verwendet.

2.1.2 Eukaryonte Zelllinien und Kulturmedien

↓16

Ca S ki (DKFZ, Heidelberg)

Humane epitheliale Zelllinie aus einem zervikalen SCC, aneuploid, HPV 16 positiv, etwa 500 Kopien pro Zelle, tumorigen bei s.c. Injektion in nu/nu Mäuse, adhärent wachsend (Baker et al., 1987).

HeLa (DKFZ, Heidelberg)

↓17

Humane epitheliale Zelllinie aus einem zervikalen Adenokarzinom, aneuploid, HPV 18 positiv, ca. 50 Kopien pro Zelle, tumorigen bei s.c. Injektion in nu/nu Mäuse, adhärent wachsend  (Boshart et al., 1984; Schwarz et al., 1985).

iHK HPV 16 E7  (DKFZ, Heidelberg)

Humane epitheliale Zelllinie aus mit HPV 16 E7 transfizierten Vorhaut-Keratinozyten, adhärent wachsend (Aguilar-Lemarroy et al., 2002).

↓18

NIH/3T3 (ATCC; American Type Culture Collection)

Murine epitheliale Zelllinie aus embryonalen NIH Swiss Mäusen, adhärent wachsend, „feeder“-Zellen für die Kultivierung primärer humaner Keratinozyten (Rheinwald und Green, 1975).

SCL-II (Dr. Ralf Kriehuber, Universität Rostock)

↓19

Humane epitheliale Zelllinie aus einem differenzierten kutanen SCC, p53 defizient, tumorigen bei s.c. Injektion in nu/nu Mäuse, adhärent wachsend (Tilgen et al., 1983).

p T67 (Clontech, Mountain View, USA)

Von NIH3T3 abgeleitete Fibroblastenzelllinie zur Herstellung infektiöser, nicht replikationsfähigen Retroviren. PT67-Zellen enthalten die gag-, pol- und env- Gene des Moloney-Murine-Leukemia-Virus (MoMuLV) stabil in ihr Genom integriert. Das env-Gen ist vom Typ 10A1 abgeleitet und kodiert für zwei Oberflächenproteine, die an die amphotrophischen zellulären Rezeptoren RAM1 und GALV anbinden können (Miller und Chen, 1996). Die Transfektion mit einem Expressionsvektor, der das retrovirale Verpackungssignal ψ+, sowie das zu untersuchende Fremdgen und einen Selektionsmarker enthält, erlaubt die Produktion von infektiösen, nichtreplikationsfähigen Viren (Retro-XTM System).

2.1.3 Bakterienstämme und Nährmedien

2.1.3.1 Bakterienstämme

↓20

DH5α™-T1R Competent Cells (Invitrogen, Karlsruhe):

F- φ80 lac ZΔM15 Δ( lac ZYA- arg F) U169 deo R rec A1 end A1 hsd R17 (rk-, mk+)

pho A sup E44 λ - thi -1 gyr A96 rel A1 ton A;

chemisch kompetent, geeignet zur Transfektion mittels themischen Schocks

2.1.3. 2 Nährmedien

LB (Luria et al., 1960), 1L, pH7,0

Trypton 10 g, Hefeextrakt 5 g, NaCl 10 g

LB-Agar

15 g Agar-Agar/L LB Medium

SOC (Fertigmedium)

Invitrogen, Karlsruhe

2.1.4 Plasmide und Oligonukleotide

2.1.4.1 Plasmide für Klonierungen

↓21

Tabelle 2.1: Papillomvirus-Plasmide

Plasmid

Größe (nt)

Vektor

Schnittstelle

Bezugsquelle

Referenz

HPV 1

7816

pBR322

BamHI

G. Orth, Institut Pasteur, Paris,F

(Favre et al., 1977)

HPV 4

7353

pBR322

BamHI

G. Orth, Institut Pasteur, Paris,F

(Orth et al., 1978)

HPV 5

7746

pBR322

BamHI

G. Orth, Institut Pasteur, Paris,F

(Ostrow et al., 1982)

HPV 20

7757

pBR322

AvaI

G. Orth, Institut Pasteur, Paris,F

(Kremsdorf et al., 1984)

HPV 38

7400

pUC19

EcoRI

E.-M. de Villiers, DKFZ, Heidelberg

(Scheurlen et al., 1986)

nt, Nukleotide

Tabelle 2.2: Retrovirale Plasmide 

Plasmid

Größe

(nt)

Eigenschaften

Referenz

pLXSN

5874

5´ MoMuSV LTR: 1-589

(Miller und Chen, 1996)

Ψ+ Verpackungssignal: 659-1468

MCS: 1470-1491

NeoR: 1892-2686

AmpR: 5495-4635

nt, Nukleotide

Folgende Plasmide wurden von Dr. Baki Akgül (Universität Köln) zur Verfügung gestellt:

↓22

Tabelle 2.3: Zur Transfektion in pT67 verwendete pLXSN-Plasmide

Plasmid

Referenz

pLXSN HPV 1 E7

(Smola-Hess et al., 2005)

pLXSN HPV 8 E6

(Akgul et al., 2005)

pLXSN HPV 8 E7

(Akgul et al., 2005)

pLXSN HPV 16 E6

(Akgul et al., 2005)

pLXSN HPV 16 E7

(Halbert et al., 1992)

pLXSN RTRX7 E7

(persönliche Mitteilung, Dr. Baki Akgül, Universität Köln)

2.1.4.2 Synthetische Oligonukleotide (primer)

Die spezifischen, HPLC gereinigten Primer wurden von der Firma Metabion (Martinsried) hergestellt. Für die Vervielfältigung von RNA in RT-Reaktionen wurden Oligo(dT)-Primer verwendet.

Oligo (dT)12-18 Primer (0,5 mg/ml)

Invitrogen, Karlsruhe

↓23

Im Folgenden sind verwendete Oligonukleotide für Klonierungen kutaner HPV E6 oder E7 ORF sowie für Expressionsuntersuchungen aufgeführt.

Tabelle 2.4: Synthetische Oligonukleotide für Klonierungen
Schnittstellen für Restriktionsenzyme sind fett markiert, zusätzliche Nukleotide unterstrichen.

Bezeichnung

Oligonukleotid

Sequenz 5´-3´

Position

HPV 1 E6 EcoRI-F

acaccctt gaattccacaggaccagatggcga

93-110

HPV 1 E6 BamHI-R

cg ggatcc cggtcctttagtgctggatttc

559-538

HPV 4 E6 EcoRI-F

tg gaattccagatggcagatggcagac

99-117

HPV 4 E6 BamHI-R

cg ggatcccgctgctcctctcattgtttc

535-515

HPV 4 E7 EcoRI-F

g gaattc caacaatgagaggagcagcgc

517-536

HPV 4 E7 BamHI-R

cg ggatcc cgcattctgcttcatggacaata

884-863

HPV 5 E6 HpaI-F

tgccgc gttaacgattgggttcttctgtaatcagg

175-197

HPV 5 E6 BamHI-R

agctt ggatcccgaatatcttgcacggtgacctc

695-675

HPV 5 E7 EcoRI- F

g gaattc cggaatctgtaggcagtgtaagca

632-654

HPV 5 E7 XhoI-R

ccg ctcgag cggcaccaatcaccaaacccttc

1016-997

HPV 20 E6 EcoRI-F

tg gaattc cagtgcaggcacatggctaca

189-208

HPV 20 E6 BamHI-R

cg ggatcc cgcaatgtgacctctttaccaatca

721-698

HPV 20 E7 EcoRI-F

g gaattc cggaatctgtaggctgtgtaagc

665-686

HPV 20 E7 XhoI-R

ccg ctcgag cggcaatcatccaacccgtctt

1038-1020

HPV 38 E6 EcoRI-F

g gaattc caaggatatatttaaggggcctgt

160-182

HPV 38 E6 BamHI-R

cg ggatcc ctcacgaagagtagcttgtttcc

650-629

HPV 38 E7 EcoRI-F

gaagctt gaattc cggcattgcaaagcaatagaa

603-622

HPV 38 E7 BamHI-R

agctt ggatcc cgcagccttctttaggatcagtacc

948-926

F, vorwärts; R, rückwärts

Tabelle 2.5: Synthetische Oligonukleotide für Expressionsuntersuchungen (RT-PCR)

Bezeichnung

Oligonukleotid

Sequenz 5´-3´

Position

Fragmentgröße

[bp]

HPV 1 E6 Expr-F

atgctgtcaagggtgtgcta

274-293

195

HPV 1 E6 Exp-R

tgcactctttctccgtttga

468-449

HPV 1 E7 Expr-F

tatgctgtcgttgcttcctg

664-683

115

HPV 1 E7 Exp-R

cgatgttcaaagatcgcaga

778-759

HVP 4 E6 Exp-F

cttctgcagacgattcgaca

134-153

237

HVP 4 E6 Exp-R

tgagcaatttcctccaaatg

370-351

HVP 4 E7 Exp-F

gctgagtgaggaggtcttgc

592-621

159

HVP 4 E7 Exp-R

tgttccaaggtccgtagtcc

750-731

HPV 5 E6 Exp-F

agccgaacaccaacagaaac

211-230

211

HPV 5 E6 Exp-R

acagcacgcaaacacacaat

421-402

HPV 5 E7 Exp-F

ggttgcaggaactgtgaggt

831-850

94

HPV 5 E7 Exp-R

gcagatctccggtcagtagc

924-905

HPV 8 E6 Exp-F

cattgcaggactgttcagtaccg

287-309

258

HPV 8 E6 Exp-R

acaagcagttttgacacctaacgtcta

518-544

HPV 8 E7 Exp-F

tgctgtcaggtcaagctacg

830-849

106

HPV 8 E7 Exp-R

ggcactcaggacacagaagc

935-916

HPV 16 E6 Exp-F

ttgcttttcgggatttatgc

237-256

204

HPV 16 E6 Exp-R

caggacacagtggcttttga

440-421

HPV 16 E7 Exp-F

gctcagaggaggaggatgaa

653-672

109

HPV 16 E7 Exp-R

aaccgaagcgtagagtcaca

761-742

HPV 20 E6 Exp-F

catttggtttttgcatgctg

434-453

234

HPV 20 E6 Exp-R

tcctttccaagagcctctca

667-648

HPV 20 E7 Exp-F

cagcctgaggttcaaccagt

751-770

71

HPV 20 E7 Exp-R

tcctctctctcctgctgctc

821-802

HPV 38 E6 Exp-F

tctgcaacagtttcctcacg

285-304

173

HPV 38 E6 Exp-R

aatttcacggccaaagacag

457-438

HPV 38 E7 Exp-F

agaggaggagccagcataca

741-760

151

HPV 38 E7 Exp-R

ggtgggacacagaagcctta

891-872

RTRX7 E7 Exp-F

agtgaggtgcagcctgaagt

712-731

82

RTRX7 E7 Exp-R

actcctcctccgtttcctgt

793-774

RPS9 – F

atccgccagcgccata

423-438

86

RPS9 – R

tcgatgtgcttctgggaatcc

508-488

F, vorwärts; R, rückwärts

↓24

Im Folgenden sind verwendete Oligonukleotide für Mykoplasmentest und die Überprüfung der Expression der humanen Telomerase Reverse Transkriptase (hTERT) aufgeführt.

Tabelle 2.6: Synthetische Oligonukleotide für Mykoplasmen und hTERT-Expression

Bezeichnung

Oligonukleotid

Sequenz 5´-3´

Myk - F

gggagcaaacaggattagataccct

Myk - R

tgcaccatctgtcactctgttaacctc

hTERT - F

cggaagagtgtctggagcaa

hTERT - R

ggatgaagcggagtctgga

F, vorwärts; R, rückwärts

2.1.5 Antikörper und Enzyme

2.1.5.1 Primärantikörper für Immunhistochemie

In der folgenden Tabelle sind die in dieser Arbeit verwendeten Antikörper für immunhistochemische  Färbungen aufgeführt. Wenn nicht gesondert vermerkt, erfolgte die Verdünnung der Antikörper in BSA Blocklösung mit 10% Ziegenserum und die Inkubation für 1 h bei RT.

↓25

Tabelle 2.7: Primärantikörper für Immunhistochemie bzw. Immuncytochemie

Antikörper

Tier

Klon

Verdünnung

Bezugsquelle

anti-BrdU

Maus

monoklonal

1:50

Acris, Hiddenhausen

(5-Bromodeoxyuridin)

IgG1

MoBu1

SM3005P

Cyclin E

Maus

monoklonal

1:30

Abcam, Cambridge, U.K.

IgG1

HE12

ab3927

Cytokeratin 10

Maus

monoklonal

1:200

Acris, Hiddenhausen

IgG1

VIK-10

SM3042P

Cytokeratin 14

Maus

monoklonal

1:500

Acris, Hiddenhausen

IgG3

LL002

SM1359P

HPV16 E7

Maus

monoklonal

1:2

zymed, Wien, A

IgG1

8C9

28-0006

Involucrin

Maus

monoklonal

1:500

Acris, Hiddenhausen

IgG1

SY5

DM3111

Ki67

Maus

monoklonal

1:50

DAKO, Hamburg

IgG1

MIB-1

M7240

p16INK4a

Maus

monoklonal

1:200

MTM, Heidelberg

IgG2a

E6H4

p53

Maus

monoklonal

1:200

DAKO, Hamburg

IgG2b

Do-7

M7001

Tenascin C

Maus

monoklonal

1:4.000

BioHit

IgG1

DB7

Oy, Helsinki, Finland

2.1.5.2 Sekundärantikörper für Immunhistochemie

In der folgenden Tabelle sind die in dieser Arbeit verwendeten Sekundärantikörper für Fluoreszenz-Immunhistochemie-Experimente aufgeführt. Die Antikörper wurden in BSA Blocklösung verdünnt und 1 h, im Dunkeln, bei RT verwendet.

Tabelle 2.8: Sekundärantikörper für Immunhistochemie 

Antikörper

Tier

IgG-Isotyp

Verdünnung

Bezugsquelle

Alexa Fluor 594

Ziege

IgG2a

1:4.000

Invitrogen, Karlsruhe

anti Maus

A21145

Alexa Fluor 488

Ziege

IgG1

1:4.000

Invitrogen, Karlsruhe

anti Maus

A21121

2.1.5.3 Primärantikörper für Western Blot Analyse

↓26

Im Folgenden sind primäre Antikörper aufgeführt, die für Western Blot Analysen verwendet wurden. Wenn nicht im Besonderen vermerkt, wurden die Antikörper in Blocklösung verdünnt und 2 h bei RT verwendet.

Tabelle 2.9: Primärantikörper für Western Blot Analyse

Antikörper

Tier

Klon

Verdünnung

Bezugsquelle

Aktin

Maus

monoklonal

1:40.000

Mpbio, Solon, USA

IgG1

C4

69100

p53

Maus

monoclonal

1:4.000

Santa Cruz, Heidelberg

IgG2a

Do1

sc-126

Bak

Kaninchen

monoclonal

1:5.000

Abcam, Cambridge, U.K.

IgG

Y164

in BSA Blocklösung

ab32371

HPV 16 E6

Maus

monoclonal

1:500

Euromedex

IgG2a

2E-3F8

Souffelweyersheim, F

2E-3F8

HPV 16 E7

Maus

monoclonal

1:2.000

M.Müller, DKFZ

IgG2a

nm2

2.1.5.4 Sekundärantikörper für Western Blot Analysen

Alle verwendeten Zweitantikörper für Western Blot Analysen sind Peroxidase (HRP) gekoppelt und affinitätsgereinigt. Die Antikörper wurden in Blocklösung verdünnt und 1 h bei RT inkubiert.

↓27

Tabelle 2.10: Sekundärantikörper für Western Blot Analysen

Antikörper

IgG-Isotyp

Verdünnung

Bezugsquelle

Ziege anti Maus

IgG

1:20.000 bis

Dianova, Hamburg

HRP gekoppelt

1:40.000

115-035-062

Ziege anti Maus

IgG2a

1:5.000

Santa Cruz, Heidelberg

HRP gekoppelt

sc-2970

Ziege anti Kaninchen

IgG

1:20.000 bis

Dianova, Hamburg

HRP gekoppelt

1:40.000

111-035-144

Enzyme

Antarktische Phosphatase

New England Biolabs, Frankfurt

 

DNaseI (1U/µl)

Invitrogen, Karlsruhe

Restriktionsenzyme

New England Biolabs, Frankfurt

T4 DNA Ligase

Roche Diagnostics, Mannheim

Taq-Polymerase (5U/µl)

Invitrogen, Karlsruhe

2.1.6 DNA- und Protein-Größenstandards

↓28

Zur Größenbestimmung von DNA-Fragmenten bzw. isolierten Proteinen wurden die im

Folgenden aufgeführten Größenstandards verwendet.

2.1.6.1 DNA-Größenstandards

Low Molecular Weight DNA ladder

New England Biolabs, Frankfurt

100 bp DNA Leiter

Roth, Karlsruhe

1 kb DNA Leiter

Roth, Karlsruhe

2.1.6.2 Proteingrößenstandards 

↓29

Page Ruler prestained

Fermentas, St. Leon-Rot

2.1.7 Reagenzien

Acrylamid/Bis-Acrylamid (29:1), 30 % Lösung

Serva, Heidelberg

Agarose für die Elektrophorese

Roth, Karlsruhe

Ampizillin

Roche Diagnostics, Mannheim

Aqua ad iniectabilia

Braun, Melsungen

Bovines Serum Albumin (BSA)

Biomol, Hamburg

Bromphenolblau

Sigma, Deisenhofen

50x Complete Protease Inhibitor

Roche Diagnostics, Mannheim

ECL-Reagenz

Amersham-Pharmacia, Freiburg

SuperSignal West Ultra Dura / Femto

Pierce, Woburn, USA

Ethidiumbromid-Lösung, 1%

Fluka, Deisenhofen

Fluorescent mounting medium

Dako, Hamburg

Glycerin p.a., 87%

Merck, Darmstadt

Hämalaun (sauer)

Roth, Karlsruhe

Kaisers Glyceringelantine

Merck, Darmstadt

2-Mercaptoethanol

Sigma, Deisenhofen

Magermilchpulver

Roth, Karlsruhe

MG132

Biomol, Hamburg

Nonidet-P40, 10%

Roche Diagnostics, Mannheim

PMSF

Applichem, Darmstadt

Ponceau S

Sigma, Deisenhofen

Ziegenserum

Dianova, Hamburg

Reagenzien für die Zellkultur

↓30

Adenin

Sigma, Deisenhofen

Antibiotic-Antimycotic Solution  (100x)

PAA, Pasching, A

Calcein-AM

Invitrogen, Karlsruhe

Choleratoxin

Sigma, Deisenhofen

Collagenase D

Roche Diagnostics, Mannheim

Cryo-SFM Einfriermedium

Promocell, Heidelberg

Dispase

Gibco, Eggenstein

DMEM

Invitrogen, Karlsruhe

DMEM/F12

Invitrogen, Karlsruhe

DMSO

Merck, Darmstadt

EpiLife Medium (M-EPI-500-CA)

Invitrogen, Karlsruhe

FCS

Biochrom, Berlin

FuGene6

Roche Diagnostics, Mannheim

Genitizin (G418)

PAA, Pasching, A

Human Keratinocyte Growth Supplement

Invitrogen, Karlsruhe

Hydrocortisone

Sigma, Deisenhofen

Insulin

Sigma, Deisenhofen

Lyothyronine

Sigma, Deisenhofen

Mytomicin C

Sigma, Deisenhofen

PBS mit Ca

PAA, Pasching, A

PBS ohne Ca

PAA, Pasching, A

Penizillin 10.000 U/ml/Streptomyzin 10.000 U/ml

Gibco, Eggenstein

Polybrene (Hexadimethrinbromid)

Sigma, Deisenhofen

Transferrin

Sigma, Deisenhofen

Triiodothyronin

Sigma, Deisenhofen

Trypanblau

Sigma, Deisenhofen

Trypsin/EDTA-Lösung

Gibco, Eggenstein

Trypsin-Inhibitor

Sigma, Deisenhofen

2.1.8 Puffer und Lösungen

Alle Lösungen wurden, falls nicht anders angegeben, in Wasser (ddH2O) angesetzt und autoklaviert.

BSA-Blocklösung

5% BSA

in TBS, steril filtrieren

Blocklösung für Western Blot

5% Magermilchpulver

in TBST

DEPC- Wasser

0,1% Diethylpyrocarbonat

autoklavieren

DNA-Ladepuffer 6x

1x TE (pH 7,5)

30% Glycerin

0,25% Bromphenolblau

Lagerung bei 4°C

DTT

0,1 M Stocklösung

immer frisch ansetzen

EDTA

0,5 M EDTA, pH 8,0

Lysepuffer für Gesamtzellextrakte

20 mM Tris-HCl, pH 7,4

1% NP40

150 mM NaCl

5 mM EDTA

25 mM NaF

1% SDS

SDS-Sammelgel

125 mM Tris-HCl, pH 6,8

5% Acrylamid/Bisacrylamid

0,1% SDS

0,04% APS

0,075% TEMED

SDS-Trenngel

35 mM Tris-HCl, pH 8,8

7,5%-12% Acrylamid

0,1% SDS

0,04% APS

0,075% TEMED

SDS-Probenpuffer (5x)

312,5 mM Tris-HCl, pH 6,8

25% β-Mercaptoethanol

10% Glycerol

10% SDS

0,01% Bromphenolblau

SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophoresepuffer

125 mM Tris

(SDS-PAGE Puffer, 5x)

960 mM Glycin

0,5% SDS

Ponceau-Rot-Lösung

0,2% Ponceau S

3% Essigsäure

Proteaseinhibitoren (Zugabe in Lysepuffer)

0,05 mM PMSF

1x Complete (50x)

0,01 mM MG-132

TAE–Laufpuffer 50x

2 M Tris-Base

0,25 M Natriumacetat

0,05 M EDTA pH 8,0

mit 1 M Essigsäure auf pH 7,8 einstellen

TE-Puffer 100x

1 M Tris-Base

0,1 M EDTA pH 8,0

mit HCl pH 7,75 einstellen, autoklavieren

TBS 10x

100 mM Tris-HCl, pH 7,5

1 M Natriumchlorid

TBST 1x

10 mM Tris-HCl pH 7,5

100 mM Natriumchlorid

0,001% Tween 20

Western Blot-Puffer (semidry)

25 mM Tris-Base

190 mM Glycin

0,038% SDS

20% Methanol

↓31

Medien und Lösungen für die Zellkultur

DMEM

500 ml Fertigmedium

Zugabe von:

10% FCS

100 U/ml Penicillin

100 µg/ml Streptomycin

Einfriermedium

jeweiliges Kulturmedium mit 10% DMSO

Zelllinien

sterilfiltrieren durch 0,22 µm Filter,

bei –20°C lagern

Keratinozytenmedium

EpiLife Medium

(Basalmedium mit 60µM CaCl2) versetzt

mit Human Keratinocyte Growth Supplement

Enkonzentration:

boviner Hypophysenextrakt 0,2% v/v

bovines Insulin 5 µg/ml

Hydrocortisone 0,18 µg/ml

bovines Transferrin 5 µg/ml

huEGF 0,2 ng/ml

RM+ Medium

DMEM, 60% versetzt mit

DMEM / Hams F12 (1:1), 30%

FCS, 10%

Enkonzentration:

Penicillin-Streptomycin 0,01%

Hydrokortison 0,4 mg/ml

Choleratoxin 10-10 M

Transferrin 5 mg/ml

Triiodothyronin 2x10-11 M

Adenin 1,8 x10-4 M

Insulin 5 mg/ml

EGF 10 ng/ml

Trypanblau-Lösung

0,25 % Trypanblau in PBS lösen

sterilfiltrieren

Trypsin/EDTA

Fertiglösung von Invitrogen, Karlsruhe

0,5 g/l Trypsin

0,2 g/l Na2EDTA x 4 H2O

2.1.9 Verbrauchsmaterial

↓32

Sterile Einwegmaterialien wie Pipetten, Pipettenspitzen, Eppendorfgefäße (0,2; 0,5; 1,5 und 2 ml), Kryoröhrchen (2 ml; 4 ml), Schraubdeckel-Röhrchen (1,5; 15 und 50 ml), Zellkulturflaschen (T25, T75, T175) und –schalen (60 mm, 100 mm) wurden von Falcon/Becton Dickinson, Heidelberg; Sarstedt, Nümbrecht; und Eppendorf, Hamburg bezogen. Spezielle Verbrauchmaterialien sind nachfolgend aufgeführt:

BD Falcon HTS Fluoroblok™ Inserts

mit 8 µm Porengröße

Becton-Dickinson, Heidelberg

Einmalspritzen (steril)

Becton-Dickinson, Heidelberg

Fujifilm Super RX (Röntgenfilm)

Fuji, Bedfort, UK

Polystyrolröhrchen

Greiner, Nürtingen

PVDF-Transfer Membran

GE Healthcare, München

Sterilfilter Minisart Plus

Sartorius, Göttingen

Whatmann 3 MM Papiere

Schleicher und Schüll, Dassel

2.1.10 Kommerzielle Kits

Folgende kommerziellen Kits wurden in dieser Arbeit verwendet:

↓33

100 mM dNTP Set

Herstellung von dNTPs

Invitrogen,

PCR Grade

Karlsruhe

BCATM Protein Assay Kit

Bestimmung der Proteinkonzentration

Pierce, USA

Woburn,

Deoxyribonuclease I

DNase-Verdau von RNA

Invitrogen,

Amplification Grade

Karlsruhe

LSAB2-System-HRP-Kit

Immunohistochemie

Dako, Hamburg

inkl. AEC-Chromogen-Substrat

Plasmid-Maxi-Kit

Präparation großer DNA Mengen

Qiagen, Hilden

aus Bakterien

QIAquick Gelextraction Kit

Isolation von DNA-Fragmenten aus

Qiagen, Hilden

Agarose-Gelen

Retro X-System

Herstellung von Retroviren

Clontech,

Mountain View,

USA

RNeasy Plus Mini-Kit

Präparation von Gesamt-RNA aus

Qiagen, Hilden

humanen Zellen

SuperScript™ First-Strand

Reverse Transkription

Invitrogen,

Synthesis System

Karlsruhe

2.1.11 Geräte

Neben Laborgeräten wie Tischzentrifuge, Thermomixer, Vortexer, pH-Meter, Heiz- und Magnetrührer wurden nachfolgende Geräte verwendet:

Inkubationsschüttler Innova 4200

Thermo Scientific, Waltham, USA

Begasungsbrutschrank

Heraeus, Hanau

Blotkammer (semidry) TE77

Amersham-Pharmacia, Freiburg

Casy 1 cellcounter

Innovatis, Bielefeld

Geldokumentationssystem

Syngene Cambridge, UK

Hybridisierungsofen, Hybrid Mini

Bachhofer, Reutlingen

Thermocycler Mastercycler Gradient

Eppendorf, Hamburg

Mikroskop, Axiovert 10

Zeiss, Jena

Mikroskop, Axioplan 2

Zeiss, Jena

Mikroskop-Kamera PowerG3

Canon, Krefeld

Mini-PROTEAN Tetra Cell (Protein-Minigele)

BioRad, München

Neubauer-Zählkammer

Bender&Hobein, Bruchsal

Spannungsgerät EPS 600

Amersham-Pharmacia, Freiburg

Spektrofluorometer Lambda FLUORO 320

BIO-TEK Instruments, Winooski, USA

Spektrophotometer Multiscan MS

Labsystems, Vienna, USA

Sterile Werkbank Herasafe

Thermo Scientific, Waltham, USA

Waldmann UV-Meter

Waldmann, Villingen-Schwenningen    

Waldmann UV-181

Waldmann, Villingen-Schwenningen    

Minifuge T (mit freischwingendem Rotor)

Heraeus, Hanau

2.2 Molekularbiologische Methoden

↓34

Reaktionsschritte und Inkubationszeiten wurden, wenn nicht anders angegeben, bei RT durchgeführt. Detaillierte Protokolle und verwendete Lösungen sind aus Molecular Cloning (Sambrook et al., 1989) entnommen. Zur Vermehrung von Plasmid-DNA wurden chemisch kompetente E. coli Bakterien (DH5α) transformiert. Für die Selektion der transformierten Bakterien wurde dem verwendeten Nährmedium ein Antibiotikum zugesetzt, für welches das jeweilige Plasmid ein Resistenzgen besaß. Zur Erhaltung des Plasmids in der Bakterienzelle enthielten alle nachfolgenden Schritte das erforderliche Antibiotikum in einer Arbeitskonzentration von 50-100 μg/ml.

2.2.1 Transformation kompetenter Bakterien

Die Transformation des E.coli-Stammes DH5α erfolgte nach Protokoll der Firma Invitrogen.

2.2.2 Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterien

2.2.2.1 Plasmid-Präparation in kleinem Maßstab (DNA MiniPrep)

Für die Präparation von Plasmid DNA in kleinem Maßstab wurde eine 5 ml LB-Übernachtkultur durch Picken einer Bakterien-Einzelkolonie von einer LB-Agarplatte angeimpft und über Nacht bei 37°C im Bakterienschüttler inkubiert. Am Folgetag wurde die Plasmid-DNA durch einen alkalischen Zellaufschluss, anschließende Neutralisation und eine Ethanol-Fällung isoliert. Je nach Größe der DNA-Pellets wurde die DNA in 20–50 μl 1x TE gelöst und bei –20°C gelagert. Die Ausbeute lag etwa bei 20 μg pro Präparation.

2.2.2.2 Plasmid-Präparation in großem Maßstab ( DNA MaxiPrep)

↓35

Zur Präparation von Plasmid-DNA in großen Mengen wurden 500 ml LB-Medium mit dem entsprechenden Antibiotikum mit einer 5 ml LB-Übernachtkultur angeimpft und über Nacht bei 37°C im Bakterienschüttler inkubiert. Für die Isolierung der Plasmid-DNA wurde das Plasmid-Maxi-Kit der Firma Qiagen verwendet. Die Vorgehensweise entsprach den Herstellerangaben. Das Prinzip dieses Kits beruht auf einer modifizierten alkalischen Lyse, wobei die Plasmid-DNA an eine Anionenaustauschersäule gebunden und nach Waschschritten durch einen Puffer mit hoher Salzkonzentration von der Säule eluiert wird. Je nach Größe der erhaltenen DNA-Pellets wurde die DNA in 50–200 μl 1x TE gelöst und bei –20°C gelagert. Die Ausbeute lag bei etwa 100 μg pro Präparation.

2.2.3 Agarose-Gelelektrophorese

Die Agarose-Gelelektrophorese wird zur Trennung von DNA Fragmenten nach Größe eingesetzt. Es wurden TAE-Agarosegele (1-3% (w/v) Agarose und 0,1 μg/ml Ethidiumbromid) verwendet. Bei konstanter Spannung von 70 - 120 V wurden die Fragmente getrennt. Ein DNA-Größenmarker wurde stets zur Größenbestimmung der Fragmente aufgetragen. Ethidiumbromid interkaliert sequenzunspezifisch in doppelsträngige DNA und führt nach Anregung mit UV-Licht zu Emission, welche fotografisch dokumentiert werden kann.

2.2.4 Isolierung von DNA-Fragmenten aus einem Agarosegel

Für die Isolation von DNA-Fragmenten aus einem Agarose-Gel wurde das QIAquick Gel Extraction Kit gemäß den Angaben des Herstellers eingesetzt. Zur Kontrolle der Reinheit und der isolierten DNA-Menge wurde ein Aliquot auf einem Agarosegel analysiert.

2.2.5 Spaltung von DNA durch Restriktionsendonukleasen

↓36

Restriktionsendonukleasen sind in der Lage, spezifische DNA-Abschnitte zu erkennen und zu schneiden. In der Regel wurde ein Restriktionsverdau in einem Volumen von 20 μl durchgeführt. Für den Verdau wurden bis zu 2 μg des zu schneidenden Plasmids oder PCR Produkts eingesetzt, 2 μl des 10fach konzentrierten Endonukleasepuffers zugegeben und der Ansatz mit 1-10 Einheiten der entsprechenden Endonuklease(n) versetzt. Zum Auffüllen auf 20 μl wurde Aqua dest. verwendet. Die Reaktion wurde nach Herstellerangaben mindestens 1 h durchgeführt.

2.2.6 Dephosphorylierung von DNA

Nach dem Verdau von Plasmid-DNA durch Restriktionsendonukleasen wurde die Vektor-DNA am 5´-Terminus mittels antarktischer Phosphatase dephosphoryliert, um eine Religation des Vektors mit sich selbst zu verhindern. Die Klonierungseffizienz kann durch diesen Schritt erheblich gesteigert werden. Nach dem Restriktionsverdau wurden dem Ansatz 1 μl der Phosphatase und die entsprechende Menge des 10fach-konzentrierten Phosphatasepuffers zugegeben. Die DNA wurde 30 Minuten bei 37°C dephosphoryliert. Anschießend erfolgte die Inaktivierung der Phosphatase bei 65°C für 5 Minuten.

2.2.7 Ligation von DNA-Fragmenten mit Vektor-DNA

Die Ligation von hydrolisierten und dephosphorylierten Plasmiden erfolgte mit T4 DNA Ligase. Diese katalysiert die Knüpfung von Phosphodiesterbindungen zwischen benachbarten 3´-Hydroxyl- und 5´-Phosphatenden doppelsträngiger DNA. Die aufgereinigten DNA-Fragmente wurden in einem molaren Verhältnis von 3:1 mit Vektor-DNA nach Herstellerangaben ligiert. Die Ligation erfolgte entweder 1 h bei RT oder über Nacht bei 16°C. Um die Ligationseffizienz zu bestimmen, wurde jeweils ein Ansatz ohne DNA-Fragment, d.h. nur der Vektor verwendet.

2.2.8 Klonierung kutaner E6 oder E7 ORF in den retroviralen Vektor pLXSN

↓37

Die verschiedenen E6 oder E7 ORF wurden mit spezifischen Primern aus den jeweiligen HPV Plasmiden kloniert. Die folgenden Polymerasekettenreaktionen (PCR) wurden mit den in Tabelle 2.4 angegebenen Primern, welche am 5´ Ende Restriktionsschnittstellen enthalten, in entsprechenden Kombinationen durchgeführt:

Komponenten

finale

Konzentration

Volumen

pro 25 µl

Ansatz

HPV DNA

100 ng

1-4 µl*

dNTPs (2 mM)

0,2 mM

2,5 μl

10x Puffer (inkl. 15mM MgCl2)

1x

2,5 μl

Qiagen Taq (5U/µl)

1,5 U

0,3 μl

Vorwärts Primer (100 µmol)

0,5 µM

0,125 μl

Rückwärts Primer (100 µmol)

0,5 µM

0,125 μl

PCR Wasser

-

14,45-18,45 µl*

*Abhängig von der DNA-Konzentration und Qualität

Die PCR-Reaktionen wurden, wie alle nachfolgenden PCR-Reaktionen, mit dem Mastercycler Gradient durchgeführt. Folgendes Temperaturprogramm wurde verwendet:

↓38

Start-Denaturierung

2

min

94°C

30 Zyklen:

Denaturierung

30

s

94°C

Annealing*

1

min

56-62°C

Elongation*

1-2

min

72°C

Termination

4

min

72°C

Abkühlung

4°C

*Die Annealingtemperatur wurde durch die Schmelztemperatur der jeweiligen Primer, die Elongationszeit durch die Fragmentlänge festgelegt. Die verwendete Taq-Polymerase sythetisiert 1 kb in einer Minute.

Die amplifizierte DNA wurde, nach einem präparativen Restriktionsverdau mit entsprechenden Restriktionsenzymen, im Agarosegel aufgetrennt und aus dem Gel isoliert. Anschließend erfolgte die Ligation mit dem retroviralen Vektor pLXSN. Nach Transformation der Konstrukte in chemisch kompetente E.coli-Bakterien wurden die klonierten pLXSN-HPV E6 oder E7-Plasmide durch DNA MaxiPrep gewonnen. Die viralen E6 oder E7 Inserts wurden abschließend mittels eines analytischen Restriktionsverdaus nachgewiesen (Abbildung 2.1) und durch eine Sequenzanalyse (Fa. Eurofins MWG Operon, Ebersberg) verifiziert (Daten nicht gezeigt). Die Nukleotidsequenzen stimmten mit den Angaben der Gen Bank überein (Tabelle 2.11).

Tabelle 2.11: Klonierte pLXSN-HPV E6 oder E7-Plasmide

pLXSN-HPV E6 oder E7

Gen Bank/Accession number *

HPV 1 E6

NC_001356

HPV 4 E6

NC_001457

HPV 4 E7

NC_001457

HPV 5 E6

NC_001531

HPV 5 E7

NC_001531

HPV 20 E6

U31778

HPV 20 E7

U31778

HPV 38 E6

U31787

HPV 38 E7

U31787

* Gen Bank/Accession numbe r des jeweiligen HPV Typs, verifiziert mit NCBI PubMed.

↓39

Abbildung 2.1: Analytischer Restriktionsverdau von pLXSN-HPV E6 oder E7.

HPV E6 oder E7 ORF wurden in pLXSN kloniert und die Plasmide mit den entsprechenden Restriktionsenzymen doppelt verdaut. pLXSN-HPV E6 oder E7 (1) unverdaut, (2) nach Doppelverdau. Die Fragmente wurden in einem 1% Agarosegel separiert. Spezifische virale Inserts wurden für alle HPV-Typen erhalten. Marker: 1 kb DNA Leiter. Kb, Kilobasen.

2.2.9 Isolierung von Gesamt-RNA aus humanen Zellen

Arbeiten mit RNA erforderte RNase-freie Bedingungen und wurde daher mit RNase-freien, gestopften Spitzen und sehr sorgfältig durchgeführt. Für die Präparation der RNA wurde das RNeasy Mini Kit nach Herstellerangaben verwendet. Mit dieser Methode wurde aus bis zu 5x 106 Zellen Gesamt-RNA (gRNA) gewonnen. Nach DNase Behandlung mit Deoxyribonuclease (Deoxyribonuclease I Amplification Grade Kit) nach Angaben des Herstellers, wurde die RNA für die Reverse Transkription eingesetzt.

2.2.10 Reverse Transkription mit anschließender Amplifikation durch Polymerasekettenreaktion (RT-PCR)

Die Reverse-Transkriptase-Reaktion (RT-Reaktion) wurde mit dem SuperScript™ First Strand Synthesis System durchgeführt, wobei pro Ansatz 500 ng gRNA eingesetzt wurden. Als Primer dienten Oligo-dT-Primer, die am Poly-A-Schwanz der mRNA binden und Bindungsstellen für Primer bei Amplifizierungen des 3’UTRs beinhaltet. Alle nachfolgenden Reaktionen wurden in einem Reaktionsgefäß (0,2 ml) im Mastercycler Gradient durchgeführt und erfolgten nach dem Protokoll des Herstellers. Nach der Transkription wurde die RNA durch Zugabe von RNAse H degradiert. Die cDNA wurde bei –20°C gelagert und ohne weitere Aufreinigung in PCR Reaktionen eingesetzt. Der zweite Schritt, die Amplifikation spezifischer cDNA-Regionen zum Expressionsnachweis, bestand aus einer PCR. Für diese wurde 1 μl der Gesamt-cDNA aus dem ersten Schritt eingesetzt. Die PCR wurden mit den in Tabelle 2.5 angegebenen HPV-spezifischen Primern in entsprechenden Kombinationen durchgeführt. Folgender Ansatz wurde für die PCR verwendet:

↓40

Komponenten

finale

Konzentration

Volumen

pro 25 µl

Ansatz

cDNA

1 µl

dNTPs (2 mM)

0,2 mM

2,5 μl

10x Puffer (inkl. 15mM MgCl2)

1x

2,5 μl

Qiagen Taq (5U/µl)

1,5 U

0,3 μl

Vorwärts Primer (100 µmol)

0,5 µM

0,125 μl

Rückwärts Primer (100 µmol)

0,5 µM

0,125 μl

[RPS9 vorwärts Primer (100 µmol)

0,5 µM

0,125 μl

RPS9 rückwärts Primer (100 µmol)

0,5 µM

0,125 μl]

PCR Wasser

18,45 µl

Für die in dieser Arbeit verwendete semiquantitative Analyse wurde zu den spezifischen Primern zusätzlich RPS9-Primer zur Normalisierung der Proben verwendet. Folgendes Temperaturprogramm wurde verwendet:

Start-Denaturierung

2

min

94°C

30 Zyklen:

Denaturierung

30

sec

94°C

Annealing*

1

min

56-62°C

Elongation*

1-2

min

72°C

Termination

4

min

72°C

Abkühlung

4°C

↓41

*Die Annealingtemperatur wurde durch die Schmelztemperatur der jeweiligen Primer, die Elongationszeit durch die Fragmentlänge festgelegt.

2.2.11 hTERT-PCR

Zum Expressionsnachweis der humanen Telomerase Reverse Transkriptase (hTERT), einer Untereinheit der humanen Telomerase, wurde eine PCR mit den in Tabelle 2.6 angegebenen Primern durchgeführt. hTERT-Primersequenzen und PCR-Bedingungen wurden aus der Literatur modifiert, verwendet (Nakamura et al., 1997). Das spezifische PCR-Produkt hat eine Größe von 146 bp. Für die Untersuchungen wurden jeweils infizierte HPK der Passage 3 verwendet.

↓42

Komponenten

finale

Konzentration

Volumen

pro 25 µl

Ansatz

cDNA

-

1 µl

dNTPs (2 mM)

0,2 mM

2,5 μl

10x Puffer (inkl. 15mM MgCl2)

1x

2,5 μl

Qiagen Taq (5U/µl)

1,5 U

0,3 μl

Vorwärts Primer (100 µmol)

0,5 µM

0,125 μl

Rückwärts Primer (100 µmol)

0,5 µM

0,125 μl

PCR Wasser

-

18,45 µl

Folgendes Temperaturprogramm wurde verwendet:

Start-Denaturierung

2

min

95°C

35 Zyklen:

Denaturierung

45

sec

95°C

 

Annealing

30

sec

60°C

 

Elongation

2

min

72°C

 

Termination

4

min

72° C

Abkühlung

4°C

2.2.12 Mykoplasmen-PCR

↓43

Der Nachweis von Mycoplasmen beruht auf der Amplifikation einer hoch konservierten Region der 16s rRNA im Genom verschiedener Mykoplasmentypen mit den in Tabelle 2.6 angegebenen Primern. Das spezifische PCR-Produkt hat eine Grösse von 270 bp. Eine Positivkontrolle (Zellkulturüberstand einer, mit Mykoplasmen infizierten Zelllinie) wurde mitgeführt. 

Komponenten

finale

Konzentration

Volumen

pro 25 µl

Ansatz

Zellkulturüberstand

-

3,0 µl

dNTPs (2 mM)

0,2 mM

2,5 μl

10x Puffer (inkl. 15mM MgCl2)

1x

2,5 μl

Qiagen Taq (5U/µl)

1,0 U

0,2 μl

Vorwärts Primer (100 µmol)

0,8 µM

0,2 μl

Rückwärts Primer (100 µmol)

0,8 µM

0,2 μl

PCR Wasser

-

16,4 µl

Folgendes Temperaturprogramm wurde verwendet:

↓44

Start-Denaturierung

10

min

95°C

39 Zyklen:

Denaturierung

45

sec

95°C

 

Annealing

45

sec

55°C

 

Elongation

45

sec

72°C

 

Termination

10

min

72°C

Abkühlung

4°C

2.3 Zellbiologische Methoden 

2.3.1 Kultivierung eukaryonter Zelllinien 

2.3.1.1 Allgemeine Arbeitsbedingungen

Das Arbeiten mit Säugerzelllinien erfordert sterile Bedingungen, um Kontaminationen mit Bakterien oder Hefen zu vermeiden. Dazu wurden alle Zellarbeiten an dafür vorgesehenen Werkbänken unter sterilen Bedingungen durchgeführt. 

2.3.1.2 Kulturbedingungen

Eukaryonte Zelllinien wurden als adhärent wachsende Kulturen in Zellkulturflaschen aus Kunststoff bei 37°C und 5% CO2 in einem Brutschrank bei 95% Luftfeuchtigkeit inkubiert. Als Kulturmedium diente DMEM („Dulbecco´s modified Eagle Medium“), dem 10% fetales Kälberserum (FCS, hitzeinaktiviert 30 min bei 56°C) und 1%  Antibiotic-Antimycotic Solutio n  zugesetzt wurden. Vor Erreichen eines konfluenten Zellrasens wurden die Kulturen routinemäßig geteilt. Dazu wurde der Zellrasen mit PBS gewaschen und mit Trypsin/EDTA-Lösung bei 37°C inkubiert, bis die Zellen sich makroskopisch ablösten. Die Trypsinierung wurde mit Kulturmedium gestoppt und die Zellsuspension 1:3 bis 1:10 verdünnt ausgesät. 

2.3.1.3 Einfrieren und Auftauen

↓45

Zum Einfrieren wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen und anschließend mit Trypsin- EDTA von der Matrix der Kulturschale gelöst. Die Zellen wurden in Medium aufgenommen und abzentrifugiert (1000 rpm, 5 min), mit PBS gewasche und nach dem Entfernen des Überstandes in Einfriermedium (Vollmedium mit 10% DMSO) resuspendiert und in Einfrierröhrchen überführt. Nach einer eintägigen Lagerung der Zellen bei -80°C wurden die Zellen langfristig in N2 (gasförmige Phase) aufbewahrt. Das Auftauen der Zellen wurde schnell durchgeführt: Die Zellen wurden in einem 37°C Wasserbad aufgetaut, abzentrifugiert (1000 rpm, 5 min), mit PBS gewaschen, anschließend in vorgewärmtes Medium aufgenommen und in entsprechenden Kulturflaschen ausgesät.

2.3.1.4 Nachweis von Mycoplasmen

Mycoplasmen sind parasitär, intra- und extrazellulär lebende Bakterien, deren Kontaminationen in Zellkulturen Ergebnisse verfälschen können. Zum Nachweis von Mycoplasmen wurden routinemäßige 14 tägig 2 ml des jeweiligen Zellkulturmediums abgenommen, bei -20°C gelagert und 3 µl als DNA-Vorlage in einer Mycoplasmen-PCR (Abschnitt 2.2.12) eingesetzt.

2.3.2 Isolierung von HPK und HPF aus Hautgewebe

Brusthautgewebe, kaukasischer Patienten, welches routinemässig im Rahmen von Schönheitsoperationen entfernt worden war, wurde bis zur Aufarbeitung in Transportmedium (Keratinozytenmedium, 1% „Antibiotic-Antimycotic Solution“) bei 4°C gelagert. Es erfolgte ein Waschschritt mit PBS und die Entfernung subkutanen Fettgewebes. Dann wurde das Gewebe mittels eines Skalpells in schmale (max. 1,5 cm breit, 4 cm lang) longitudinale Streifen geschnitten, die wiederum im 90 Grad Winkel, ähnlich eines Kammes, alle 2 mm eingeschnitten wurden. Die bearbeiteten Streifen wurden in ein 50 ml Falconröhrchen überführt, anschließend mit Dispaselösung (2,4 U/ml in PBS) bedeckt bei 4°C ü.N. inkubiert. Am Folgetag wurden die Gewebestreifen in eine mit PBS gefüllte Petrischale gegeben. Mittels einer feinen Pinzette wurde die Epidermis abgezupft. Die bräunlichen Epidermisstücke wurden in ein separates Falconröhrchen mit PBS gegeben und 10 min bei 1000 rpm zentrifugiert. Anschließend wurde das PBS abgenommen und 0,25% Trypsin Lösung (ca. 20 ml) zugegeben. Die Epidermis wurde für 15 min bei 37°C im Wasserbad inkubiert, wobei alle 5 min stark gevortext wurde. Nach Zugabe derselben Menge Trypsin-Inhibitor (1 mg/ml), zur Neutralisation des Trypsins, wurde die Zellsuspension durch Falcon Zellsiebe (100 µm und anschließend 40 µm) passiert. Das Filtrat (eine Zellsuspension hochangereichert mit HPK) wurde 10 min bei 900 rpm zentrifugiert. Die Keratinozyten wurden anschließend in Keratinozytenmedium resuspendiert und je 3x 107 Zellen in 75 cm2, mit Kollagenase beschichtete, Kulturflaschen gegeben. Zur Gewinnung primärer Fibroblasten wurde die verbliebene Dermis mittels Schere und Skalpell mechanisch zerkleinert, in ein Falconröhrchen gegeben und in 15 ml Kollagenase D-Lösung (0,03 g auf 60 ml DMEM) 1-2 h bei 37°C schüttelnd inkubiert. Die Fibroblastensuspension wurde ebenfalls gesiebt und das Filtrat pelletiert. Das Zellpellet wurde in DMEM (10% FCS) resuspendiert und je 5x107 Fibroblasten in 175 cm2 Zellkulturflaschen kultiviert.

↓46

Tabelle 2.12: Verwendete Patientenproben und durchgeführte Untersuchungen

Alter

[Jahre]  

Geschlecht

Gewebe

Untersuchungen

20

w

Brust

Immortalisierungsuntersuchungen

h-TERT Untersuchungen

24

w

Brust

Invasionsuntersuchungen

21

m

Brust

Organotypische Hautkulturen

24

w

Brust

Bak Untersuchungen

w, weiblich; m männlich

2.3.3 Kultivierung von HPK

2.3.3.1 Kulturbedingungen und Passagieren

Primärkulturen von HPK wurden in Keratinozytenmedium bei 37°C und 5% CO2 gehalten. Zum Passagieren wurden die 70% bis 90% konfluent gewachsenen Zellen mit PBS gewaschen und mit Trypsin/EDTA bei RT inkubiert. Nach einigen Minuten wurde vorsichtig gegen die Zellkulturflasche geklopft bis sich nahezu alle Zellen vom Boden gelöst hatten. Die abgelösten Zellen wurden mit demselben Volumen an Trypsin-Inhibitor (1 mg/ml) versetzt, mit PBS gewaschen und je nach Dichtegrad in frischem Medium ausgesät. Zellzählungen erfolgten mit dem Casy 1 cellcounter bzw. mit einer Neubauer Zählkammer. Die Zellvitalität wurde routinemäßig mit Trypanblaufärbung oder automatisch mit dem Casy 1 cellcounter überprüft.

2.3.3.2 Einfrieren und Auftauen

Die Zellen wurden nach subkonfluenten Wachstum abtrypsiniert, mit PBS gewaschen und 10 min bei 1000 rpm pelletiert. 2-5x 106 Zellen wurden in 2 ml Cryo-SFM-Einfriermedium aufgenommen und in Kryoröhrchen überführt. Die Kryoröhrchen wurden im Mr. Frosty, einem mit Isopropanol isolierten Behälter, über 24 h langsam auf –80°C (1°C/min) abgekühlt und anschließend in N2 (gasförmige Phase) gelagert. Eingefrorene Zellen wurden im Wasserbad bei 37°C aufgetaut, mit PBS gewaschen, in 10 ml Medium aufgenommen und 10 min bei 1000 rpm zentrifugiert. Das Pellet wurde dann in frischem Medium resuspendiert und in eine Zellkulturflasche überführt.

2.3.4 Bestrahlung humaner Zelllinien 

2.3.4.1 Das Waldmann UV-181 Bestrahlungsgerät

↓47

Für UV-B Bestrahlungen der Keratinozyten wurde ein Waldmann UV-181 Bestrahlungsgerät verwendet. Die aktuelle Leistung der UV 6 Kompaktstrahler (Emmisionspeak 320 nm) wurde werkseitig vor Auslieferung gemessen und vor Beginn der Bestrahlungen nochmals mit einem Waldmann UV-Meter bestätigt. Die Direkteingabe von Dosiswerten erfolgte in J/cm2  (60 mJ/cm2  entspricht beispielsweise 0,006 J/cm2) über das Tastaturfeld des Bestrahlungsgerätes.

2.3.4.2 UV-B Bestrahlung von HPK

In 10 cm Schalen kultivierte HPK wurden vor der UV-B Bestrahlung mit PBS gewaschen, in der Mitte der Bestrahlungsfläche positioniert und mit einer UV-B Dosis von 25 mJ/cm2 bestrahlt. Nach der Bestrahlung wurden die Zellen mit 10 ml Keratinozytenmedium bis zur Ernte weiter kultiviert.

2.3.5 Herstellung rekombinanter Retroviren mit dem Retro X-System

Mit dem Retro X-System können rekombinante infektiöse, aber replikationsinkompetente Retroviren hergestellt werden (Abbildung 2.2). So ist es möglich, ein fremdes Gen in eine Vielzahl verschiedener Säugerzellen einzubringen und stabil in das Wirtsgenom proliferierender Zellen zu integrieren. Die Integration erfolgt über die LTR-Integrationssequenzen, die gleichzeitig als Promotoren für das Fremdgen fungieren (Naviaux und Verma, 1992). Das System besteht aus der Verpackungszelllinie pT67, die auf der Mausfibroblastenzellinie NIH/3T3 basiert und die Strukturgene gag, pol und env des MoMuLV Typ 10A1 in ihr Genom integriert hat und einem retroviralen Vektor. Als Verpackungszelllinie wurde in den hier beschriebenen Experimenten pT67, als retroviraler Vektor pLXSN verwendet. Dieser wurde mittels des Transfektionsreagenzes Fu G ene6 in die Verpackungszelllinie transfiziert. Der Vektor pLXSN besitzt neben den 5’- und 3’-LTR, das amphotrophe Verpackungssignal Ψ+, welches in Kombination mit den gag-, pol- und env-Genen der Verpackungszelllinie rekombinante Viren produziert. Diese Viren können ein breites Spektrum an Säugerzellen infizieren.

↓48

Abbildung 2.2: Schematische Darstellung der Herstellung rekombinanter Retroviren und Infektion von HPK mit dem Retro X-System. 

Kutane E6 oder E7 ORF wurden in den retroviralen Vektor pLXSN kloniert (1) und in die Verpackungszelllinie pT67 transfiziert (2). Hier integriert die Vektor-DNA in das Genom (a) und wird in RNA transkribiert (b). Die virale RNA wird verpackt (c) und mittels Knospung ins Kulturmedium abgegeben (d). Die retroviralen Überstände werden filtriert und bei -80°C gelagert (3). Abschließend werden HPK mit diesen rekombinanten Retrivoren infiziert (4).

Um sicher zu stellen, daß keine replikationskompeteneten Viren durch Rekombinationsereignisse während der Zellproliferation entstehen, wurden Kontrollexperimente durchgeführt. Zum einen wurden HeLa und NIH/3T3 Zellen für 3 Tage mit Zellkulturüberständen infizierter selektionierter HPK inkubiert und anschließend 7 Tage mit G418 (500 µg/ml) selektioniert. HeLa und NIH/3T3 Zellen starben ab. Auch mittels PCR wurden keine Neomyzingen-Sequenzen, möglicherweise integrierter Retroviren, in HeLa bzw. NIH/3T3 Zellen amplifiziert (Daten nicht gezeigt). Es kann also davon ausgegangen werde, das mittels des gewählten Retro X-Systems replikationsinkompetente Viren erzeugt und verwendet wurden.

2.3.5.1 Transfektion von pLXSN-HPV E6 oder E7 in pT67 und Gewinnung viraler Überstände

Die Verpackungszelllinie pT67 wurde mit 15 ml Kulturmedium in 10 cm Zellkulturschalen kultiviert und in subkonfluentem Zustand mit verschiedener pLXSN-HPV E6 oder E7 Plasmid-DNA transfiziert. Am Tag der Transfektion wurden pro Ansatz 3 µl FuGene6 zu 97 µl DMEM in einem 1,5 ml Eppendorfgefäß gegeben, resuspendiert und für 10 min inkubiert. Diese Mischung wurde anschließend tropfenweise in ein zweites 1,5 ml Eppendorfgefäß mit 1-2 µg vorpipettierter pLXSN-HPV Plasmid-DNA gegeben. Das Gemisch wurde für weitere 20 min bei RT inkubiert. Von den pT67 wurde die Hälfte des Mediums abgenommen, die DNA/Fu G ene6-Lösung tröpfchenweise auf die Zellen pipettiert und anschließend für 5-7 h bei 37°C und 5% CO2 im Brutschrank inkubiert. Danach wurden 5 ml frisches Kulturmedium dazu gegeben und die Zellen weiter bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. 48 h nach der Transfektion begann die Selektion der transfizierten pT67 mit Genitizin (G418, 500 µg/ml). Alle 2-3 Tagen wurde das mit G418 versetzte Kulturmedium erneuert. Als Positivkontrolle wurden nichttransfizierte pT67 mitgeführt. Um eine Population 100% transfizierter Zellen zu erhalten, wurde eine etwa einwöchige Selektion mit G418 durchgeführt und die selektionierten pT67-Zellklone anschließend gepoolt expandiert. pT67 produziert infektiöse, nicht replikationsfähige Retroviren, die ins Kulturmedium abgesondert werden. Zur Gewinnung der Virusüberstände wurden die jeweiligen pT67-Zelllinien in 175 cm2 Zellkulturflaschen mit 30 ml Medium kultiviert. Bei einer Konfluenz von etwa 80-90% wurde das Medium abgezogen und durch 16 ml frisches Kulturmedium ersetzt. Die Zellen wurden nun bei 32°C und 5% CO2 inkubiert. Die retroviralen Überstände wurden 24 h später abgenommen, filtriert (0,45 µm), in 4 ml Kryoröhrchen aliquotiert und bei -80°C gelagert.

2.3.6 Infektion von HPK mit rekombinanten Retroviren

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Die zu infizierenden primären Keratinozyten wurden 48 h vor der Infektion mit einer Dichte von 2x 105/T25 Kulturflaschen in Keratinozytenmedium ausgesät. Zur Infektion wurde das Medium der Keratinozyten abgenommen und durch serumfreies DMEM mit Polybrene (5 μg/ml Endkonzentration) ersetzt. Die Zellen wurden für 10 min bei 37°C vorinkubiert, zwischenzeitlich die retroviralen Überstände (je 4 ml) aufgetaut und mit Polybrene (5 μg/ml Endkonzentration) versetzt. Danach wurde das Kulturmedium der Zellen abgenommen und durch die präparierten Überstände ersetzt. Die Kulturflaschen wurden nun 1 h mit 350 g zentrifugiert. Anschließend wurden die Zellen mit PBS gewaschen und in Keratinozytenmedium weiter kultiviert. Nach 48 bis 72 h schloss sich eine ca. fünftägige Selektion mit G418 (100 μg/ml Medium) an. Als Positivkontrolle wurden nichttransfizierte HPK mitgeführt. Anschließend wurden die selektionierten Zellklone gepoolt, weiter expandiert und für Untersuchungen verwendet.

2.3.7 Langzeitkultur zur Immortalisierung infizierter HPK

Um mit E6 oder E7 infizierte HPK zu immortalisieren, wurden diese langzeitkultiviert. Die Untersuchungen erfolgten jeweils im Dreieransatz. Infizierte HPK wurden in Passage 3 mit einer Dichte von 1x105 Zellen in T25 Kulturflaschen in Keratinozytenmedium ausgesät. Bei Erreichen einer Konfluenz von ca. 80% wurden die Zellen trypsiniert und mit dem Casy 1 cellcounter gezählt. Anschließend wurden wiederum 1x105 Zellen in frische T25 Kulturflaschen in Keratinozytenmedium ausgesät. Dieser Modus wurde bis zum Absterben der Zellen beibehalten. Ermittelte Zellzahlen wurden dokumentiert und die Populationsverdopplungen (population doublings, PD) wie folgt berechnet:

Primäre Zellen vermehren sich durch exponentielles Wachstum. Ausgehend von einer einfachen Teilung der Mutterzelle in zwei Tochterzellen ergibt sich mathematisch:

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N = N 02 n

wobei N die Endzellzahl (gezählte Zellzahl), N 0 die Anfangszellzahl (ausgesäte Zellzahl) und n die Anzahl der Generationen ist, die während des exponentiellen Wachstums durchlaufen wird. Die Anzahl der Generationen n wird auch als PD bezeichnet. Nach n aufgelöst ergibt sich folgende Gleichung:

n (PD) = (log10 N – log10 N 0)/log10 2

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Die PD wurden jeweils für die verschiedenen infizierten HPK berechnet. Um PD darzustellen, wurde deren Mittelwert errechnet, die PD über die Kulturdauer für HPV E6 oder E7 addiert und die erhaltenen Werte gegen die Zeit, in einem Diagramm, aufgetragen. Dabei ist der Tag 0 der Zeitpunkt an dem die infizierten HPK ausgesät wurden.

2.3.8 Invasionstest mit infizierten HPK

Um die Invasionsfähigkeit infizierter HPK zu untersuchen, wurde ein MatrigelTM-Invasionstest, mittels BD Falcon HTS Fluoroblok™ Inserts, verwendet. Diese Methode zur Quantifizierung des Invasionspotenzials von Zellen, durch eine Basalmenbran-ähnliche Substanz, mittels des sogenannten "Boyden chamber assay" wurde erstmals von Albini beschrieben (Albini et al., 1987). Der hier verwendete Test ist ein in vitro Assay, um die Migration von Zellen durch ihre natürliche Barriere zu beobachten und zu quantifizieren. Matrigel ist eine lösliche Präparation aus dem Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Sarkom. Die Zusammensetzung aus Laminin, Kollagen IV und weiteren Substanzen ähnelt der humanen Basalmembran, welche in vivo von invadierenden Keratinozyten überwunden werden kann. Die Auswertung der Zellinvasion erfolgte photometrisch über die Anfärbung gewanderter Zellen mit Calcein-AM. Dieses membranpermeable Molekül wird im Inneren einer intakten, vitalen Zelle in Calcein umgewandelt, was in einer starken, grünen Fluoreszenz resultiert.

In einem Vorversuch wurde analysiert, ob SCL-II Zellen durch Matrigel invadieren und dementsprechend als Pk geeignet sind. Nach 24 h waren die SCL-II Zellen häufiger durch  unbeschichtete, als durch die mit Matrigel™ beschichteten Fluoroblok™-Einsätze (Abbildung 2.3) eingewandert. Im Vergleich zu NIH/3T3-Zellen (in der Literatur beschriebene Negativkontrolle) sind einzelne SCL-II-Zellen nach 24 h invasiv durch die Poren der Matrigel Fluoroblok-Einsätze gewandert.

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Abbildung 2.3: Fluoreszenzmikroskopische Darstellung der Invasion von SCL-II Zellen (Vorversuch zum Matrigel-Invasionsassay).  

Jeweils 150.000 Zellen wurden in mit Matrigel beschichteten Fluoroblok-Einsätzen für 24 h inkubiert und anschließend mit Calcein-AM gefärbt und an der Unterseite der Fluoroblok-Einsätze fluoreszenzmikroskopisch dokumentiert. A SCL-II ohne Calcein-AM B SCL-II ohne Matrigel C NIH/3T3 mit Matrigel D SCL-II mit Matrigel. SCL-II wachsen nach 24 h durch die Matrigelbeschichtung (Pfeile), NIH/3T3 sind nicht invasiv. 

An Tag 1 erfolgte der Austausch des Kulturmediums, für die semikonfluent gewachsenen Zelllinien SCL-II (Pk) sowie NIH/3T3 (Nk), auf serumfreies DMEM mit 0,2% BSA, um eine Synkronisation der Zellen zu erreichen. Infizierte HPK später Passagen wuchsen bereits semikonfluent in serumfreiem Medium. BD Falcon HTS Fluoroblok™ Einsätze wurden ü.N. bei 4°C aufgetaut und anschließend für 2 h in serumfreiem DMEM mit 0,2% BSA rehydriert. An Tag 2 wurden die mit E6 oder E7 infizierten HPK sowie die SCL-II und NIH/3T3 trypsiniert, zweimal in PBS gewaschen und mit dem jeweiligen serumfreien Medium auf 1x106 Zellen/ml Medium resuspendiert und in 50 ml Falconröhrchen bei 4°C bereitgestellt. Jeweils 600 µl des Kulturmedium, mit 10% FCS als Chemotaxin, wurden in die Wells einer 24-Well Platte gegeben. Anschließend wurden je 150 µl der vorbereiteten Zellsuspension (entspricht 150.000 Zellen) in die mit Matrigel beschichteten Fluoroblok Einsätze gegeben, diese in den Wells plaziert und die Zellen bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Nach 24 h wurden die Zellen mit Calcein AM gefärbt. Das FCS-haltige Medium wurde aus den Wells entfernt und durch 600 µl einer 5 µM Calcein-AM Lösung ersetzt. Die Fluoroblok™ Einsätze wurden nun in der Calcein-AM Lösung für 30 min bei 37°C, in Alufolie, inkubiert. Anschließend wurde zweimal mit PBS gewaschen und frisches serumfreies Kulturmedium in die Wells gegeben. Die Fluoreszenzemission gewanderter Zellen an der Unterseite der Fluoroblok™ Einsätze wurde nach 24 h mit dem Spektrofluorometer bei 485 nm bestimmt. Dabei wurden adhärente Zellen an der Unterseite der Fluoroblok-Einsätze berücksichtigt, nicht jedoch Zellen im Medium. Die Untersuchungen erfolgten zweimal, jeweils im Doppelansatz. Für die Datenauswertung wurden die gemessenen Werte gemittelt, der Blankwert (Fluoroblok-Einsätze mit Kulturmedium, ohne Zellen) abgezogen und die erhaltenen Werte in einem Diagramm aufgetragen.

2.3.9 Organotypische Hautkulturen („raft - culture ) mit infizierten HPK

In Glycerol gelagerte Spenderhaut, bestehend aus Epidermis und Dermis, wurde zweimal mit PBS gewaschen und 10 Tage in antibiotikahaltigem PBS, (1% Antibiotic-Antimycotic Solution) bei 37°C gelagert. Das antibiotikahaltige PBS wurde alle 2 bis 3 Tage gewechselt. Nach dieser Inkubationszeit wurde die Epidermis mittels eines Skalpells abgeschabt. Die Dermis wurde mehrmals mit PBS gespült und dann in 1,5 x 1,5 cm große Quadrate geschnitten, die in 6 Well-Platten positioniert wurden. Auf das Stratum reticulare (Unterseite der Dermis) wurden nun jeweils ein Edelstahlring (Durchmesser: 1,2 cm) positioniert. Anschließend wurden primäre, humane Fibroblasten geerntet, gezählt und in RM+ Medium auf eine Zellzahl von 5x 105 Zellen/ml eingestellt. 1 ml dieser Suspension wurde in den vorbereiteten Ring pipettiert, zusätzlich 4 ml RM+ Medium in das Well gegeben und über Nacht bei 37°C und 10% CO2 inkubiert. Am nächsten Morgen wurde das Medium abgezogen, der Edelstahlring entfernt und auf das Stratum papillare (Oberseite der Dermis) möglichst deckungsgleich positioniert. In Keratinozytenmedium kultivierte infizierte HPK wurden geerntet, ausgezählt und auf eine Konzentration von 3,5x 105 Zellen/ml in RM+ Medium eingestellt. 1 ml dieser Suspension wurde in den Ring gegeben und das Well mit 4 ml RM+ Medium befüllt. Am folgenden Tag wurde der Ring entfernt. Als Konfluenzkontrolle wurde jeweils ein Well (Durchmesser ebenfalls 1,2 cm) einer 24 Well-Platte mit ebenfalls 3,5x 105 Keratinozyten kultiviert. Nach Erreichen von ca. 95% Konfluenz im Kontrollwell wurde die Dermis 4 bis 6 h in frischem RM+ Medium inkubiert. Danach setzte man die Dermis, in 6 Well-Platten, auf Edelstahlgitter. Es wurde gerade soviel RM+ Medium in die Schale gegeben, dass die Dermis von unten benetzt und wie ein Floß (engl.: raft) im Medium positioniert war. An jedem zweiten Tag erfolgte ein Mediumwechsel. Am 10. Tag wurden die Hautkulturen für 2 h mit BrdU (50 μM) versetztem RM+ Medium inkubiert. Die Fixierung erfolgte für 24 h in 4% gepuffertem Paraformaldehyd (PFA), anschließend wurden die organotypischen Hautkulturen in Paraffin eingebettet. Zur immunhistochemischen Untersuchung wurden 4 µm Paraffinschnitte angefertigt und auf entsprechende Objektträger aufgebracht. Jeweils vier Schnitte wurden mit spezifischen monoklonalen Antikörpern, sowie ohne Primärantikörper als Negativkontrolle inkubiert und mikroskopisch ausgewertet.

2.4 Proteinchemische Methoden 

2.4.1 Präparation von Gesamtzellextrakten

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Zur Herstellung von Gesamtzellextrakten wurden die Zellen mit Hilfe eines Zellschabers von dem Kulturschalenboden abgelöst. Das Zell-Medium-Gemisch wurde in ein 15 ml Falconröhrchen überführt und bei 1.200 rpm und 4°C für 10 min abzentrifugiert. Anschließend wurde das Pellet mit 1 ml kaltem PBS gewaschen und in ein Eppendorf- Reaktionsgefäß gefüllt. Nach erneuter Zentrifugation bei 3000 rpm, 4°C und 3 min lang, wurde der Überstand abgenommen und das Pellet in ca. 3fachem Volumen an Lysepuffer resuspendiert und 30 min auf Eis lysiert. Anschließend wurde das Proteinlysat für 5 min sonifiziert, um die genomische DNA zu zerstören. Durch Zentrifugation bei 14.000 rpm und 4°C wurden unlösliche Trümmer sedimentiert. Der Proteinüberstand wurde in ein frisches vorgekühltes Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Vor dem Auftrennen des Proteingemischs mittels SDS-PAGE wurde die Proteinkonzentration bestimmt. Überschüssige Proteinlysate wurden mit SDS-Probenpuffer versehen und nach dem Aufkochen (5 min, 95°C) bei -80°C gelagert.

2.4.2 Bestimmung der Proteinkonzentration

Für die Bestimmung der Proteinkonzentration in Gesamtzellextrakten wurde der BCA Protein Assay Kit verwendet. Hierbei handelt es sich um einen auf Bicinchonsäure (BCA) basierenden Farbassay zum Nachweis und Quantifizierung von Proteinen. Diese Methode verbindet die Reduktion von Cu+2 zu Cu+1 durch Proteine in alkalischer Umgebung mit einer hochsensitiven Farbnachweis von Kupferkationen (Cu+1) durch eine Lösung mit Bicinchonsäure (Smith et al., 1985). Die BCA-Moleküle bilden einen Komplex mit den reduzierten Kupferionen, was zu einer violetten Verfärbung führt, welche bei einer Wellenlänge von 570 nm am Spektrophotometer Multiscan MS gemessen wurde. Die Durchführung erfolgte nach Herstellerangaben.

2.4.3 SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Für die Auftrennung der Proteine nach Größe wurde die SDS-PAGE eingesetzt (Laemmli, 1970). Es wurden 12%ige Acrylamid-Trenngele mit einem 5%igen Acrylamid-Sammelgel verwendet. Die Elektrophorese erfolgte in einer Kammer des ProteanII Tetra Cell Systems. Die Zusammensetzung der Gele und des Laufpuffers sind in Abschnitt 2.1.8 angegeben. Nach dem Gießen des Trenngels wurde das Gel zur Polymerisation mit Isopropanol überschichtet. Anschließend wurde der Alkohol abgegossen, mit ddH2O gespült und das Trenngel mit dem Sammelgel überschichtet. Vor der Beladung mittels einer Hamilton-Pipette wurden die Proteinlösungen mit SDS Ladepuffer versetzt und 5 min bei 95°C denaturiert. Der Lauf erfolgte bis zum Einlaufen in das Trenngel bei 80 V und während der Auftrennungsphase bei 120 V.

2.4.4  Western B lot-Analyse

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Die Western B lot-Analyse wird für den Nachweis von Proteinen mittels spezifischer Antikörper verwendet. Die Proteine wurden mittels SDS-PAGE nach der Größe aufgetrennt und anschließend mit einer Blotapparatur (semidry) auf eine PVDF-Membran übertragen. Zuerst wurden drei Whatman-Papiere, in dem entsprechenden Blotpuffer getränkt, auf der Blotapparatur platziert. Die Membran wurde mit Methanol benetzt und anschließend in Blotpuffer äquilibriert. Anschließend wurde die Membran auf das Whatman-Papier aufgebracht, das Gel darauf gelegt und abschließend nochmals drei mit Puffer getränkte Whatman-Papiere darübergeschichtet. Der Proteintransfer erfolgte 40-60 min bei konstanten 6-12 V. Zur Absättigung freier Antikörperbindestellen wurde die Membran mindestens 1 h bei RT in Blocklösung geschüttelt. Anschließend wurde die Membran mit dem Erstantikörper inkubiert. Im Folgenden wurde die Membran dreimal 10 min mit TBS-T gewaschen, um überschüssige Antikörperlösung zu entfernen. Die Inkubation der Membran mit dem Zweitantikörper erfolgte 1 h bei RT. Anschließend wurde erneut dreimal 10 min mit TBS-T gewaschen. Die Visualisierung der Protein-Antikörperkomplexe erfolgte durch Chemilumineszenz unter Verwendung der SuperSignal West Ultra Dura / Femto-ECL Substate. Die Signale wurden mit Röntgenfilmen detektiert.

2.4.5 Immunhistochemische Untersuchungen

Für immunhistochemische Untersuchungen wurden mit einem Mikrotom 4 µm dicke Schnitte der Paraffinblöcke angefertigt. Die einzelnen Schnitte wurden in einem Wasserbad bei 56°C geglättet auf Adhäsiv-Objektträger aufgezogen und bei 56°C 2 h getrocknet. Die Entparaffinierung und Rehydrierung der Schnitte erfolgte durch serielle Inkubation für jeweils 5 min in einem Tauchbad von 100%igem Xylol (I) und (II), Xylol/ Ethanol 1:2, 100% Ethanol, 90% und 70%igem Ethanol bei RT. Anschließend wurden die Präparate in destilliertem Wasser für 10 min belassen und dann für 10 min in kaltem H2O2 (3% in Methanol) zur Absättigung der endogenen Peroxidase inkubiert. Vor der Immunfärbung wurden die Paraffinschnitte in vorgekochtem Zitratpuffer (10 mM, pH 6.0) für 20-30 min in einem Dampfdrucktopf aufgekocht, um durch die Fixierung veränderte Epitope zu demaskieren. Nach Abkühlung der Schnitte auf RT wurden sie zweimal für 5 min in TBS gespült. Alle Inkubationen der Objektträger mit Antikörpern und Enzym-Konjugaten wurden in einer feuchten Kammer durchgeführt. Um unspezifische Bindungsstellen für den Antikörper abzusättigen, wurden die Schnitte mit normalem IgG-Ziegenserum (10%ig in TBS) für 30 min blockiert. Anschließend wurden je 100 µl der Antikörperlösung auf die Schnitte getropft und bei RT für 1 h oder über Nacht bei 4°C inkubiert. Am Folgetag wurden die Schnitte dreimal für je 5 min in TBS gespült. Die Darstellung der Antikörper-Antigen-Komplexe erfolgte einerseits, mittels der „markierten Avidin-Biotin-Methode“, mit dem LSAB2-Kit nach Angaben des Herstellers. Als Chromogen für die Peroxidase wurde AEC verwendet, welches in einem roten Farbumschlag resultiert. Zur Gegenfärbung wurden die Schnitte 5-10 min in saurem Hämalaun inkubiert und für 10 min unter fließendem Leitungswasser gespült. Abschließend wurden jeweils etwa 100 µl Kaisers Glyceringelatine, die im Mikrowellenherd auf 50°C erwärmt worden war, über die Gewebsschnitte geschichtet und je ein Deckglas aufgebracht. Für Immunfluoreszenz-Doppelfärbungen wurden andererseits Zweitantikörper verwendet, welche mit verschiedenen Chromophoren gekoppelt waren. Primärantikörper wurden gleichzeitig, wie oben beschrieben, eingesetzt. Die Zweitantikörper wurden ebenfalls gemischt und im Dunkeln 1 h inkubiert. Das Einbetten der Gewebeschnitte erfolgte mit Fluorescent mounting medium, dem DAPI zur Anfärbung der DNA, direkt zugeben wurden (Endkonzentration: 0,5µg/ml). Bei jeder Serie von Färbungen wurde jeweils eine Positivkontrolle mitgeführt, um sicherzustellen, dass ein negatives Ergebnis nicht aufgrund einer fehlerhaften Anwendung der Methode entstanden war. Entsprechend wurde auch parallel eine Negativkontrolle eingesetzt, d.h. der spezifische Antikörper wurde nicht zugegeben. Die Auswertung der immunhistologisch gefärbten Schnitte erfolgte mit dem Zeiss Axioplan2-Mikroskop sowohl in Hellfeld als auch in Fluoresenz.


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24.01.2014