Molekulare Mechanismen kutaner humaner Papillomviren (HPV) während der Hautkarzinogenese
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)im Fach Biologie
eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin
Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Dr. h.c. Christoph Markschies
Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Lutz-Helmut Schön
Gutachter:
1. Prof. Dr. med. Detlef H. Krüger
2. PD Dr. rer. nat. habil Ingo Nindl
3. Prof. Dr. rer. nat. Frank Rösl
Tag der Abgabe: 04. September 2008
Tag der mündlichen Prüfung: 02. Juli 2009
Meinen Eltern gewidmet
Zusammenfassung
In den letzen Jahren gab es durch epidemiologische und molekularbiologische Studien vermehrt Hinweise, dass kutane humane Papillomviren (HPV) ursächlich an der Entstehung nicht-melanozytärer Hauttumore (engl. NMSC) beteiligt sind. Mukosale HPV sind verglichen mit kutanen Typen besser charakterisiert und stellen das kausale Agens für Gebärmutterhalskrebs (Karzinom der Zervix uteri) dar. Die Expression der viralen Onkogene E6 und E7 mukosaler Hochrisiko-HPV-Typen ist für die Initiation und Aufrechterhaltung des transformierten Phänotyps in Zervixkarzinomen essentiell. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung molekularer Mechanismen der viralen Proteine E6 und E7 kutaner HPV-Typen.
Die E6 oder E7 Gene der verschiedenen HPV-Typen 1, 4, 5, 8, 20, 38 und RTRX7, welche in vivo mit kutanen benignen oder malignen Läsionen assoziiert sind, wurden untersucht. Natürliche Wirtszellen dieser Viren, humane primäre Keratinozyten (HPK) der Haut, wurden mit rekombinanten, für E6 oder E7 kodierenden Retroviren infiziert. Die Analysen erfolgten in Monolayer-Kultur (undifferenzierte Keratinozyten) oder in organotypischen Hautmodellen (Induktion der Keratinozytendifferenzierung).
Die Expression von E6 oder E7 führte in Monolayer-HPK zu einer Verlängerung der Lebensspanne und zu einer deutlich erhöhten Verdoppelungsrate. Eine Telomeraseaktivierung, die charakteristisch für immortale Zellen ist, wurde nur in HPV 8 E6 positiven HPK nachgewiesen. In organotypischen Hautmodellen induzierte das E7 Protein von HPV 1, 4 und 38 starke Veränderungen in der Differenzierung sowie eine Zunahme der Proliferation. Weiterhin wurde eine Aufhebung der normalen Zellzykluskontrolle in suprabasalen HPV 5 E7 oder HPV 8 E7 beobachtet. Hinweise auf ein starkes invasives Potential von E7-infizierten HPK wurden für HPV 8 E7 bestätigt und für HPV 4 E7, HPV 38 E7 und RTRX7 E7 erweitert.
Molekulare Mechanismen der viralen Gene E6 und E7 kutaner HPV unterscheiden sich von mukosalen Typen. Das Mehrstufenmodell der Karzinogenese beinhaltet eine Reihe fundamentaler Zelltransformationen, die für eine Tumorgenese nötig sind. In dieser Arbeit beschriebene Mechanismen der Modulation der Zelldifferenzierung und Zellproliferation durch die kutanen HPV-Typen 4, 5, 8 und 38 können unter Umständen zur Induktion und Progression früher Stadien von Plattenepithelkarzinomen (SCC) beitragen.
summary
In the last years epidemiologic and molecular biological studies accumulated increasing evidence that cutaneous human papillomaviruses are etiologically involved in the formation of non-melanoma skin cancer (NMSC). Mucosal HPV types are better characterised compared to cutaneous types and they are the causative agent for cervical cancer (carcinoma of the Zervix uteri). Essentiell for the initiation and maintenance of the transformed phenotype in cervix carcinoma is the expression of the viral oncogenes E6 and E7 of the mucosal high-risk HPV types. The presented work aims to identify the underlying molecular mechanisms of the viral proteins E6 and E7 of cutaneous HPV types.
The E6 and E7 genes of the different HPV types 1, 4, 5, 8, 20, and RTRX7, which are in vivo associated with cutaneous benign or malignant lesions, were studied. Natural host cells of these viruses, human primary keratinocyts (HPK) of the skin, were infected with recombinant E6 and E7 encoding retroviruses. The following analyses were performed in monolayer culture (non-differentiated keratinocytes) or in organotypic skin culture (induction of keratinocyte differentiation).
The expression of E6 and E7 elongated the life span of monolayer HPK and significantly increased the doubling rate. An activation of the telomerase, characteristic for immortalized cells, was only detected in HPV 8 E6 positive cells. In organotypic skin cultures E7 of HPV 1, 4 and 38 induced drastic changes in differentiation and proliferation. Additionally an impairment of the normal cell cycle control in suprabasale HPV 5 E7 and 8 E7 cultures was seen. Hints for a strong invasive potential of E7 infected HPK were proven for HPV 8 E7 and expanded to HPV 4 E7, HPV 38 E7 and RTRX E7.
The viral E6 and E7 genes of cutaneous and mucosal HPV types exhibit different molecular mechanisms. The multistep model of carcinogenesis includes a series of fundamental cell transformations necessary for tumorigenesis. Mechanisms for the modulation of cell differentiation and proliferation by cutaneous HPV types 4, 5, 8 and 38 described in this work could potentially contribute to the induction and progression of early stages of squamous cell carcinoma.
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