↓27 |
↓28 |
Tabelle 3.1: Auflistung der verwendeten Geräte
Geräte |
Bezeichnung |
Hersteller |
Absorptionsmessgerät für |
Tecan Sunrise |
Tecan |
Chemilumineszenzimager |
Chemismart 3000 |
Vilber Lourmat |
Brutschränke |
a) B20 b) HeraCell 240 |
Heraeus Heraeus |
Drehrad |
neoLab-Rotator 2-1175 |
neoLab |
Dünnschichtkammer |
DC-Glastank (Maße: 35×25×12cm) |
Desaga |
Elektroporationsgerät |
Cell Porator |
Life Technologies |
FPLC |
ÄKTAprime |
Amersham Bioscience |
FT-IR-Spektrometer |
IFS-28/B |
Bruker |
Gelelektrophorese-Apparaturen |
a) Gelkammer (Mini) SubCell GT b) Spannungsgerät PowerPack 300 c) Mini Protean 3 |
Bio-Rad Bio-Rad Bio-Rad |
Heizschüttler |
Thermomixer Comfort |
Eppendorf |
Homogenisator |
ULTRA-TURRAX T25 |
IKA®Labortechnik |
Inkubatoren |
a) InnovaTM 4230 b) InnovaTM 43 c) TH25 |
New Brunswick Scientific New Brunswick Scientific Edmund Bühler |
Kamera |
EOS 450D Spiegelreflexkamera |
Canon |
Koloniezählgerät |
Acolyte |
Synbiosis |
Mikroskope |
a) Axiovert 200M b) IMT |
Carl Zeiss Jena Olympus |
pH-Elektrode |
Toledo MP225 pH Meter |
Mettler |
PCR-Cycler |
a) Thermocycler T-Gradient b) FlexCycler c) 7500 Real-time PCR System |
Biometra Analytik Jena Applied Biosystems |
Plattiergerät |
Whitley Spiral Plater |
Meintrup DWS |
Semidry-Elektroblotter |
TE77 |
Pharmacia |
Sterilbank |
Herasafe |
Heraeus |
Tisch-Schüttler |
a) WT12 b) S410 c) Unimax 1010 (in Inkubator TH25) |
Biometra mLw Heidolph |
Ultraschallgerät |
Sonoplus |
Bandelin |
UV/VIS Spektrophotometer |
a) NanoDrop® ND-1000 b) NanoPhotometer c) DU®520 Spectrophotometer |
NanoDrop Implen Beckman Coulter |
UV-Transluminator |
Gel Doc 2000 |
Bio-Rad |
Vortex Mixer |
Vortex Mixer 7-2020 |
neoLab |
Waagen |
a) CP64; b) 1212 MP |
Sartorius AG |
Zentrifugen |
a) Kühlzentrifuge 5415R b) Sorvall RC-5 Superspeed Refrigerated Centrifuge c) Labofuge400 d) Kühlzentrifuge 5810R Rotoren: A-4-62; F-34-6-38 |
Eppendorf Du Pont Instruments Heraeus Eppendorf |
Tabelle 3.2: Auflistung spezieller Materialien
Materialbezeichnung |
Name/Beschreibung |
Artikelnummer |
Hersteller |
AEX-Säulchen |
HiTrap Q FF |
17-6002-33 |
Amersham Bioscience |
Cellophanfolie |
Folie zur Konservierung von Proteingelen |
K422.1 |
Roth |
Chromatographie Papier |
17 CHR |
3017915 |
Whatman |
Cryo-Gefäße |
Zur Lagerung von Glyzerolgefrierkulturen |
E309.1 |
Roth |
Dünnschichtplatten |
Kieselgel 60 WF254s |
1.16484 |
Merck |
Elektroporationsküvetten |
Küvetten für den CellPorator |
11608-031 |
Whatman |
Filter |
a) Rotilabo®Spritzenfilter 13mm b) FP30/0.3 CA-S Sterilfilter |
T056.1 10462200 |
Roth Schleicher & Schuell |
FT-IR Probenrad |
ZnSe Trägermaterial |
A 501-B/3 |
Bruker |
Glasröhrchen |
Gefäß zur Bakterienkultivierung |
231721197 |
Schott |
Kanüle |
26-gauge Sterican Gr.17 |
- |
B.Braun (RKI Lager) |
Küvetten |
Einmal-Küvetten aus PMMA |
P95.1 |
Roth |
Mikrotiterplatten |
96-well, F-Form Immuno-Platten, MaxiSorp, 96-well |
3911925 439454 |
Anicrin Nunc |
Objektträger |
Poly-L-Lysin Objektträger |
L198.1 |
Roth |
PVDF-Membran |
Immobilon-P |
IPVH00010 |
Millipore |
Reaktionsgefäße |
a) 1,5 b) PCR Tubes c) 15/50ml Tubes |
0030.120.086/ 0030 120.094 683201 188271/227270 |
Eppendorf Eppendorf Greiner bio-one Greiner bio-one |
Serologische Pipetten |
10/25ml, steril, BD Falcon |
357530/356535 |
BD Bioscience |
Spritze (Feindosierung) |
Omnifix®-F ohne Kanüle |
9161406V |
B.Braun |
Zellkulturflaschen |
a) 25cm2 b) 75 cm2 c) 175 cm2 |
a) 156367 b) 178891 c) 159910 |
Nunc Nunc Nunc |
Zellkulturplatten |
24-well Cellstar |
662160 |
Greiner bio-one |
Zählkammer |
Neubauer Zählkammer, improved |
T729.1 |
Roth |
Tabelle 3.3: Auflistung der verwendeten Chemikalien
Chemikalienbezeichnung |
Artikelnummer |
Hersteller |
Acrylamid-Bisacrylamid Rotiphorese® Gel 30 |
3029.2 |
Roth |
Agar |
101618 |
Merck |
Agarose |
V3125 |
Promega |
Ammonium-Eisen(II)-Sulfat |
F-1543 |
Sigma-Aldrich |
Ammoniumpersulfat (APS) |
0486 |
Amresco |
Ampicillin Natriumsalz |
A9518 |
Sigma-Aldrich |
Biotin |
47868 |
Sigma-Aldrich |
Bromphenolblau/Xylencyanol |
B3269 |
Sigma-Aldrich |
BSA (Rinderserum Albumin) |
K41-001 |
PAA |
BugBuster® Protein Extraction Reagent |
70584-3 |
Novagen |
Carbenicillin |
69101-3 |
VWR |
Chloramphenicol |
C-1919/ C-0378 |
Sigma-Aldrich |
Chloroform |
102445 |
Merck |
Coomassie, kolloidal (Roti®-Blue) |
A152.1 |
Roth |
3,3’-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid-Hydrat (DAB) |
D5637 |
Sigma-Aldrich |
Diethylether |
100921 |
Merck |
Dimethylsulfoxid (DMSO) |
20385 |
Merck |
Dithiothreitol (DTT) |
P2325 |
Invitrogen |
DNA Isolation Reagent for Genomic DNA |
A3418,0050 |
AppliChem |
dNTP, Nukleotid Mix 10mM |
BIO-39043 |
Bioline |
Eisen (III)-Chlorid |
12321 |
Riedel-de Haën |
Eisessig |
100063 |
Merck |
Ethanol, zur Analyse |
100983 |
Merck |
Ethidiumbromid |
111608 |
Merck |
FKS (Fötales Kälberserum) |
A-15-043 |
PAA |
Formalin |
F8775 |
Sigma-Aldrich |
D-(+)-Glukose |
G7021 |
Sigma-Aldrich |
Glyzerol 86% |
7533.3 |
Roth |
Glyzin |
3908.2 |
Roth |
Guanidinhydrochlorid (GuHCl) |
50940 |
Fluka |
Harnstoff |
3941.2 |
Roth |
Hefeextrakt |
212720 |
BD Bioscience |
Chemikalienbezeichnung |
Artikelnummer |
Hersteller |
HEPES (2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl)-ethansulfonsäure) |
9105.4 |
Roth |
n-Hexan, zur Analyse |
104374 |
Merck |
Isopropyl-β-D-thiogalaktosid (IPTG) |
BIO-37036 |
Bioline |
Kaliumchlorid |
104936 |
Merck |
Kaliumdihydrogenphosphat |
104873 |
Merck |
Di-Kaliumhydrogenphosphat |
105104 |
Merck |
Kaliumhydroxid Plätzchen |
105033 |
Merck |
Kanamycinmonosulfat |
K-1377 |
Sigma-Aldrich |
Legionella α Agarplatten (BCYE) |
1860e |
Heipha |
Legionella Basis Agar |
110242 |
Merck |
Legionella Wachstums-Supplement |
SR 0110C |
Oxoid |
Magnesiumchlorid Hexahydrat |
105833 |
Merck |
Magnesiumsulfat Heptahydrat |
105886 |
Merck |
β-Mercaptoethanol |
M7522 |
Sigma-Aldrich |
METAFECTENETM |
T020-0.2 |
Biontex |
Methanol |
T909.1 |
Roth |
Mucasol |
60434 |
Brand |
Naphtol Blauschwarz |
195243 |
Sigma-Aldrich |
Natriumazetat-Trihydrat |
106267 |
Merck |
Natriumazid |
106688 |
Merck |
Natriumcarbonat |
106392 |
Merck |
Natriumchlorid |
3957.2 |
Roth |
Natriumcitrat |
S-4641 |
Sigma-Aldrich |
Natriumdeoxycholat |
D6750 |
Sigma-Aldrich |
Natrium EDTA (Triplex III) |
108418 |
Merck |
Di-Natriumhydrogenphosphat |
106575 |
Merck |
Natriumhypochlorid-Lösung |
105614 |
Merck |
Natriumthiosulfat |
106512 |
Merck |
Nicotinamid-Adenosin-Dinukleotid (NAD) |
N1511 |
Sigma-Aldrich |
Nonidet P-40 |
74385 |
Fluka |
PeqGOLD RNA PureTM |
30-1020 |
peqLab |
Pepton |
LP0085 |
Oxoid |
Petrolether |
101769 |
Merck |
Phenol |
A156.2 |
Roth |
Phorbol-12-Myristat-13-Azetat (PMA) |
79346 |
Sigma-Aldrich |
ProLong Gold Antifade mit DAPI |
P36931 |
Invitrogen |
2-Propanol, Isopropanol |
6752.4 |
Roth |
Protease Inhibitor Mix FY |
39104.02 |
Serva |
Reference dye (ROX) |
- |
Sequenzierlabor, RKI |
Roti-Nanoquant (zur Proteinbestimmung) |
K880.1 |
Roth |
RPMI 1640 Pulver/Flüssig |
51800-043/E15-840 |
Invitrogen/PMA |
Salzsäure, rauchend |
100317 |
Merck |
Saponin |
4185.1 |
Roth |
Sicapent |
100543 |
Merck |
Silbernitrat |
101512 |
Merck |
Skim Milk Powder |
70166 |
Fluka |
Sodium-Dodezylsulfat (SDS) |
CN30.2 |
Roth |
Sorbitol |
S3755 |
Sigma-Aldrich |
Tetramethylethylendiamin (TEMED) |
2367.3 |
Roth |
Trichloressigsäure |
8789.2 |
Roth |
Tris Base |
T8,760-2 |
Sigma-Aldrich |
Triton X-100 |
T8787 |
Sigma-Aldrich |
Trypanblau (0,4%) |
T8154 |
Sigma-Aldrich |
Trypsin-EDTA |
L11-004 |
PAA |
Trypton |
L47 |
Oxoid |
Tween20 |
817072 |
Merck |
Wasserstoffperoxid (H2O2), 30% |
216763 |
Sigma-Aldrich |
X-Gal, 5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside |
1161 |
Diagnostic Chemicals Ltd. |
YNB (yeast nitrogen base) |
Q300-09 |
Invitrogen |
↓29 |
Tabelle 3.4: Auflistung der verwendeten Lipidsubstrate
Bezeichnung |
Kürzel |
Artikelnummer |
Hersteller |
Cardiolipin |
- |
840012P |
Avanti Polar Lipids |
1,2-Dipalmitoyl-sn-Glyzero-3-Phosphocholin |
DPPC |
850355P |
Avanti Polar Lipids |
1,2-Dipalmitoyl-sn-Glyzero-3-Phospho-N-Methylethanolamin |
MMPE |
42558 |
Fluka |
1,2-Dipalmitoyl-sn-Glyzero-3-Phospho-N,N- |
DMPE |
P0399 |
Sigma-Aldrich |
1,2-Dipalmitoyl-sn-Glyzero-3-Phosphoethanolamin |
DPPE |
850705 |
Avanti Polar Lipids |
1,2-Dipalmitoyl-sn-Glyzero-3-Phospho-rac-1-Glyzerol |
DPPG |
840455P |
Avanti Polar Lipids |
1,2-Dipalmitoyl-sn-Glyzero-3-[Phospho-L-Serin] |
DPPS |
830037 |
Avanti Polar Lipids |
1-Palmitoyl-2-Hydroxy-sn-Glyzero-3-Phosphat |
MPLPA |
857123P |
Avanti Polar Lipids |
1-Lauroyl-2-Hydroxy-sn-Glyzero-3-Phosphocholin |
MLLPC (C12) |
855475P |
Avanti Polar Lipids |
1-Octanoyl-2-Hydroxy-sn-Glyzero-3-Phosphocholin |
MOLPC (C8) |
855275P |
Avanti Polar Lipids |
1-Palmitoyl-2-Hydroxy-sn-Glyzero-3-Phosphocholin |
MPLPC (C16) |
855675P |
Avanti Polar Lipids |
1-Palmitoyl-2-Hydroxy-sn-Glyzero-3-Phosphoethanolamin |
MPLPE |
856705P |
Avanti Polar Lipids |
1-Palmitoyl-2-Hydroxy-sn-Glyzero-3-Phospho-Glyzerol |
MPLPG |
858122P |
Avanti Polar Lipids |
1,2-Dipalmitoyl-rac-Glyzerol |
1,2-DG |
D2135 |
Sigma-Aldrich |
1-Monopalmitoyl-rac-Glyzerol |
1-MPG |
M1640 |
Sigma-Aldrich |
Tripalmitin |
TPG |
T-5888 |
Sigma-Aldrich |
3β-Hydroxy-5-Cholesten (Cholesterol) |
Chol |
C-3045 |
Sigma-Aldrich |
5-Cholesten-3-Palmitat (Cholesterolester) |
CholE |
C-78607 |
Sigma-Aldrich |
Palmitinsäure |
FFA |
P-0500 |
Sigma-Aldrich |
Tabelle 3.5: Auflistung der verwendeten Puffer und Lösungen
Puffer/Lösung |
Bestandteile |
Menge/Konzentration |
PBS Puffer (pH 7,2) zu 1000ml H2Obidest |
KCl KH2PO4 Na2HPO4 NaCl |
0,2 g 0,2 g 1,15 g 8 g |
Tris Puffer (pH 7,5) für Lipidanalyse |
Tris Base |
40 mM |
Kaliumphosphatpuffer 1M, pH 6,0 |
K2HPO4 (1M) KH2PO4 (1M) |
132 ml 868 ml |
Puffer zur Extraktion von Nukleinsäuren |
||
Lysepuffer für P. pastoris |
Tris Base Natrium-EDTA NaCl SDS Triton X-100 |
10 mM 1 mM 100 mM 1 % 2 % |
Lysepuffer für transfizierte A549 Zellen pH 7,4 |
Tris Base NaCl Natrium-EDTA Triton X-100 Nonidet P-40 |
10 mM 150 mM 1 mM 1 % 0,5 % |
Puffer für die DNA-Gelelektrophorese |
||
50×TAE Puffer (pH 8,0) |
Tris Base Eisessig Na2EDTA |
2,0 M 1,0 M 0,1 M |
DNA Probenpuffer |
Bromphenolblau Glyzerin |
0,25 % (w/v) 30 % |
Puffer für die „ Combined Chain Reaction ” PCR |
||
CCR Puffer (10×) |
Tris Base (pH 8,4) MgCl2 KCl NAD |
200 mM 30 mM 500 mM 5 mM |
Puffer/Lösung |
Bestandteile |
Menge/Konzentration |
|||||
Puffer für die Protein-Gelelektrophorese und Western Blot |
|||||||
SDS PAGE Probenpuffer |
Tris Base (pH 6,8) SDS Glyzerol β-Mercaptoethanol Bromphenolblau |
62,5 mM 2 % 10 % 5 % 0,001 % |
|||||
SDS PAGE Laufpuffer (5×) |
Tris Base Glyzin SDS |
25 mM 384 mM 0,2 % |
|||||
Dehydratisierungslösung für Proteingele |
EtOH Glyzerin (86%) |
20 % 10 % |
|||||
Western Blot Transferpuffer |
Tris Base Glyzin Methanol |
25 mM 192 mM 10 % |
|||||
Western Blot Waschpuffer (PBST-T) |
1×PBS Puffer Tween20 |
500 ml 0,1 % |
|||||
Puffer für die Protein-Silberfärbung |
|||||||
Fixierlösung |
Ethanol Eisessig |
40 % 5 % |
|||||
Sensibilisierungslösung |
Natriumthiosulfat (Na2S2O3) |
0,2 % |
|||||
Färbelösung |
Silbernitrat (AgNO3) |
0,2 % |
|||||
Entwicklerlösung |
Natriumcarbonat (Na2CO3) Formalin |
2 % 0,04 % |
|||||
Stoplösung |
Eisessig |
5 % |
|||||
Puffer zur Proteinreinigung |
|||||||
Resuspensionspuffer für den Zellaufschluss |
Tris Base NaCl Na2EDTA |
50 mM 100 mM 1 mM |
|||||
AEX Protein-Bindepuffer (pH 9,2) |
Tris Base Na2EDTA |
20 mM 5 mM |
|||||
AEX Protein-Elutionspuffer (pH 9,2) |
Tris Base Na2EDTA NaCl |
20 mM 5 mM 1 M |
|||||
GST Glutathion-Elutionspuffer |
Tris-HCl (pH 8,0) Glutathion, reduziert |
50 mM 10 mM |
|||||
Puffer zur Reinigung und Solubilisierung von „ inclusion bodies “ |
|||||||
IB Waschpuffer |
Tris Base (pH 7,5) Na2EDTA DTT Triton X-100 NaCl |
50 mM 10 mM 5 mM 2 % 500 mM |
|||||
IB Resuspensionspuffer |
Tris Base (pH 7,5) Na2EDTA |
50 mM 10 mM |
|||||
IB Solubilisierungspuffer |
Tris Base (pH 8,0) GuHCl |
50 mM 6 M |
|||||
SDS-Trenngel |
SDS-Sammelgel |
||||||
10 % |
12,5 % |
4 % |
|||||
Acrylamid/Bisacrylamid 30% |
3,3 ml |
4,2 ml |
Acrylamid/Bisacrylamid 30% |
530 µl |
|||
1,5M Tris Base (pH 8,8) |
2,5 ml |
2,5 ml |
0,5 M Tris Base (pH 6,8) |
1 ml |
|||
H2O |
4 ml |
3,1 ml |
H2O |
2,4 ml |
|||
10% SDS |
100 µl |
100 µl |
10% SDS |
40 µl |
|||
10% APS |
100 µl |
100 µ |
10% APS |
50 µl |
|||
TEMED |
10 µl |
10 µl |
TEMED |
4 µl |
↓30 |
Tabelle 3.6: Auflistung verwendeter Enzyme, Standards und Antikörper
Enzymbezeichnung |
Artikelnummer |
Hersteller |
|||
Ampligase |
A3210K |
Epicentre |
|||
Benzonase |
70746 |
Novagen |
|||
Klenow Fragment |
M0210S |
NEB |
|||
Lysozym |
L-7651 |
Sigma-Aldrich |
|||
PCR-Sequenzierungs-Polymerase (BigDye 3.1) |
4337035 |
Applied Biosystems |
|||
Pfu DNA Polymerase |
EP0501 |
Fermentas |
|||
Platinum®Taq DNA Polymerase |
10966-034 |
Invitrogen |
|||
Proteinase K |
D3350-02 (Kit) |
Omega Bio-Tek |
|||
Restriktionsendonukleasen |
- |
NEB |
|||
RNase OUTTM Ribonuklease (RNase) Inhibitor |
10777019 |
Invitrogen |
|||
Shrimp alkalische Phosphatase (SAP) |
11 758 250 001 |
Roche |
|||
T4 DNA Ligase |
M0202 |
NEB |
|||
T4 Polynukleotidkinase |
M0236 S |
NEB |
|||
Taq DNA Polymerase |
M0267 |
NEB |
|||
TurboTM DNase |
AM2238 |
Ambion |
|||
Standards für Elektrophoresen |
|||||
Standard |
Bereich |
Artikelnummer |
Hersteller |
||
Gene Ruler DNA Laddermix |
0,1 – 10 kb |
SM0331 |
Fermentas |
||
Unstainded Protein Molecular Weight Marker |
14,4 – 116 kDa |
SM0431 |
Fermentas |
||
PageRulerTM Unstained Protein Ladder |
10 – 200 kDa |
SM0661 |
Fermentas |
||
Macig MarkTM XP |
200 – 220 kDa |
LC5602 |
Invitrogen |
||
Antikörper |
|||||
Bezeichnung (Verdünnung) |
Spender |
Konjugat |
Artikelnummer |
Hersteller/Herkunft |
|
Anti-FlaA (1:500) |
Kaninchen |
- |
- |
Dr. Heuner |
|
Anti-Flag (1:2000) |
Maus |
- |
F3165 |
Sigma-Aldrich |
|
Anti-GFP (1:3000) |
Maus |
- |
G6795 |
Sigma-Aldrich |
|
Anti-GST (B14) (1:1000) |
Maus |
- |
sc-138 |
Santa Cruz |
|
Anti-Kaninchen IgG (1:300) |
Ziege |
Alexa Fluor 488 |
A-11070 |
Invitrogen |
|
Anti-Maus IgG (1:2500) |
Ziege |
HRP |
A9044 |
Sigma-Aldrich |
Tabelle 3.7: Auflistung der verwendeten Analyse-Kits
Produktbezeichnung |
Artikelnummer |
Hersteller |
BigDye Terminator V.3.1 Ready Cycle Sequencing Kit |
4337035 |
Applied Biosystems |
Bulk and RediPack GST Purification Modules |
27-4570-01 |
Amersham |
ChampionTM pET Directional TOPO® Expression Kit |
K160-01 |
Invitrogen |
ECL Western blotting detection reagent |
RPN2106 |
Amersham Bioscience |
Human IL-8 ELISA Set |
555244 |
BD Bioscience |
Nefa C Kit |
994-75409 |
Wako Chemicals |
OneStep RT-PCR Kit |
210212 |
Qiagen |
Pichia Expression Kit |
K1710-01 |
Invitrogen |
Pro-MatrixTM Protein Refolding Guide |
89867 |
Pierce |
PURExpressTM In Vitro Protein Synthesis Kit |
E6800S |
NEB |
RayBio® Human Inflammation Antibody Array 3 |
AAH-INF-3 |
RayBiotech, Inc. |
Silver Staining Kit Protein |
17-1150-01 |
Amersham Bioscience |
T7 Sample System |
L5900 |
Promega |
Wizard Plus Minipreps |
A1460 |
Promega |
Wizard SV Gel und PCR cleanup system |
A9282 |
Promega |
Tabelle 3.8: Auflistung erworbener Plasmide
Plasmidbezeichnung |
Artikelnummer |
Hersteller |
pBAD202/D/TOPO |
K4202-01 |
Invitrogen |
pBCKS+ |
212217 |
Stratagene |
pEGFP-C2 |
6083-1 |
Clontech |
pET28b (+) |
69865-3 |
Novagen |
pET160/GW/D-TOPO |
K160-01 |
Invitrogen |
pGEX-5X-1 |
27-4584-01 |
GE Healthcare |
pGEX-6P-1 |
27-4597-01 |
GE Healthcare |
pcDNA3.1(+) |
V790-20 |
Invitrogen |
pPIC3.5 |
K1710-01 (Kit) |
Invitrogen |
pPIC9 |
K1710-01 (Kit) |
Invitrogen |
↓31 |
Die in der folgenden Liste verwendeten plaB Fragmente haben, außer anderweitig angezeigt, ihren Ursprung ausschließlich in L. pneumophila Stamm Corby. Die Amplifikation der „site-directed“ Mutanten von PlaB (z. B. S85A) erfolgte auf Grundlage des Vektors pJB04, die der Doppelmutanten (z. B. S85A/D203N) auf pJB06-Basis.
Tabelle 3.9: Auflistung erzeugter Plasmide
Plasmid- bezeichnung |
Konstrukt |
Größe des Inserts (bp) |
AB- Resistenz |
Amplifizierungs- Primer |
pJB01 |
pET160/GW/D-TOPO+plaB (Expressionskonstrukt ohne His-tag) |
1685 |
Amp |
plaB_TOPOf/plaB_c1-r |
pJB02 |
pBAD202/D/TOPO + plaB (Expressionskonstrukt + 6×His-Fusion, C-Terminal) |
1446 |
plaB_pBADf/plaB_pBADr |
|
pJB03 |
pET160/GW/D-TOPO+plaB (Expressionskonstrukt + 6×His-Fusion, N-Terminal) |
1664 |
Amp |
plaB_TOPf2/plaB_c1-r |
pJB04 |
pBCKS + plaB |
1585 |
Cm |
plaB_SalIf/plaB_EagIr (=P1/P2) |
pJB06 |
pBCKS + plaB; S85A |
1585 |
Cm |
P1/P2/plaB_S85A |
pJB07 |
pBCKS + plaB; S129A |
1585 |
Cm |
P1/P2/plaB_S129A |
pJB08 |
pBCKS + plaB; S200A |
1585 |
Cm |
P1/P2/plaB_S200A |
pJB09 |
pBCKS + plaB; S229A |
1585 |
Cm |
P1/P2/plaB_S229A |
pJB10 |
pBCKS + plaB; S250A |
1585 |
Cm |
P1/P2/plaB_S250A |
pJB11 |
pBCKS + plaB; D75N |
1585 |
Cm |
P1/P2/plaB_D75N |
pJB12 |
pBCKS + plaB; D203N |
1585 |
Cm |
P1/P2/plaB_D203N |
pJB13 |
pBCKS + plaB; H270N |
1585 |
Cm |
P1/P2/plaB_H270N |
pJB14 |
pPIC3.5 + plaB |
1511 |
Amp |
plaB_Ecof2/plaB_EagIr |
pJB15 |
pPIC9 + plaB |
1511 |
Amp |
plaB_Ecof2/plaB_EagIr |
pJB18 |
pGEX-5X-1 + plaB (Expressionskunstrukt mit GST-Fusion, N-Terminal) |
1511 |
Amp |
plaB_Ecof2/plaB_EagIr |
pJB19 |
pBCKS + plaB; T83G |
1585 |
Cm |
P1/P2/plaB_T83G |
pJB20 |
pBCKS + plaB; D167N |
1585 |
Cm |
P1/P2/plaB_D167N |
pJB21 |
pBCKS + plaB; D342N |
1585 |
Cm |
P1/P2/plaB_D342N |
pJB22 |
pBCKS + plaB; D381N |
1585 |
Cm |
P1/P2/plaB_D381N |
pJB23 |
pBCKS + plaB; H7N |
1585 |
Cm |
P1/P2/plaB_H7N |
pJB24 |
pBCKS + plaB; H339N |
1585 |
Cm |
P1/P2/plaB_H339N |
pJB25 |
pBCKS + plaB; H433N |
1585 |
Cm |
P1/P2/plaB_H433N |
pJB26 |
pBCKS + plaB; H251N |
1585 |
Cm |
P1/P2/plaB_H251N |
pJB27 |
pBCKS + plaB; S85A/S129A |
1585 |
Cm |
P1/P2/plaB_S85A/plaB_S129A |
pJB28 |
pBCKS + plaB; S85A/D203N |
1585 |
Cm |
P1/P2/plaB_S85A/plaB_D203N |
pJB29 |
pBCKS + plaB; S85A/H251N |
1585 |
Cm |
P1/P2/plaB_S85A/plaB_H251N |
pJB31 |
pGEX-6P-1 + plaB; verkürzte Version von PlaB, AS 1-459; GST-Fusion, NTerminal |
1390 |
Amp |
plaB_TOPf2/plaB_truncC_P1 |
pJB32 |
pGEX-6P-1 + plaB; verkürzte Version von PlaB, AS 1-388; GST-Fusion, NTerminal |
1177 |
Amp |
plaB_TOPf2/plaB_truncC_P2 |
pJB33 |
pGEX-6P-1 + plaB; verkürzte Version von PlaB, AS 1-307; GST-Fusion, NTerminal |
941 |
Amp |
plaB_Ecof2/plaB_trunc3Eag |
pJB36 |
pBCKS + plaB; T83V |
1585 |
Cm |
P1/P2/plaB_T83V |
pJB37 |
pBCKS + plaB aus L. spiritensis |
1445 |
Cm |
PlaBspir_BamHI/PlaBspir_NotI |
pJB43 |
pcDNA3.1(+)Flag + plaB |
1498 |
Amp |
plaB_fw_XbaI/plaB_EagIr |
pJB46 |
pET28b (+) + plaB |
1499 |
Amp |
plaB_NdeI_f/plaB_EagIr |
Tabelle 3.10: Auflistung verwendeter Oligonukleotide und Sonden (K=Klonierung)
Primer |
Primer Nr. |
Annealing- Temperatur |
Sequenz |
Anwendung |
AOX1_f |
391 |
54°C |
5’-gACTggTTCCAATTgACAAgC-3’ |
Sequenzierung |
AOX2_r |
392 |
54°C |
5’-gCAAATggCATTCTgACATCC-3’ |
Sequenzierung |
β-actin fw |
865 |
65°C |
5’-CCAACTgggACgACATggAg-3’ |
RT-PCR |
β-actin rv |
866 |
65°C |
5’-CgTAgCCCTCgTAgATgggC-3’ |
RT-PCR |
mip-fw |
- |
60°C |
5’-CTTATAgCATTggTgCCgATTTggg-3’ |
Real-time PCR |
mip-rv |
- |
60°C |
5’-gTTCggTTAAAgCCAATTgAgCgC-3’ |
Real-time PCR |
mip-Sonde |
- |
60°C |
5’-FAM-TCATAgCgTCTTgCATgCCTTT AgCCA-TMR-3’ |
Real-time PCR |
T7Promo |
289 |
54°C |
5’-TAATACgACTCACTATAggg-3’ |
Sequenzierung |
T7Terminat |
290 |
54°C |
5’-gCTAgTTATTgCTCAgCgg-3’ |
Sequenzierung |
pBC_a1_f |
212 |
55°C |
5-ggTTTTCCCAgTCACgA-3’ |
Sequenzierung |
pBC_b1_r |
213 |
55°C |
5’-CgCgCAATTAACCCTCAC-3’ |
Sequenzierung |
pGEX_fw |
605 |
54°C |
5’-gggCTggCAAgCCACgTTTggTg-3’ |
Sequenzierung |
pGEX_rv |
606 |
54°C |
5’-CCgggAgCTgCATgTgTCAgAgg-3’ |
Sequenzierung |
plaB_6A-f |
399 |
60°C |
5’-CACCCATggCTggAgTgTCA-3’ |
RT-PCR |
plaB_b1-r |
235 |
50°C |
5’-CCAgTAAgTACAAAggAATAg-3’ |
Sequenzierung |
plaB_c1-r |
236 |
50°C |
5’-TgCTATATCCAAgTgTAAgAg-3’ |
K pJB01/pJB03 |
plaB_d1 f |
237 |
57°C |
5’-gCATTgAACCgggAAAgTgTg-3’ |
Sequenzierung |
plaB_D75N |
400 |
56°C |
5’-gATAAgCTACgAAATgggCAgCgTT-3’ |
K pJB11 |
plaB_D167N |
404 |
56°C |
5’-gAAAgCTggCTTAATTATgATTgC-3’ |
K pJB20 |
plaB_D203N |
401 |
56°C |
5’-gAATCTggATCCAATggggTggTA-3’ |
K pJB12 |
plaB_D342N |
405 |
56°C |
5’-CACCTTATCAATTATgATCTTTACC-3’ |
K pJB21 |
plaB_D381N |
406 |
56°C |
5’-CTgACTTATTTTCTTAACTACgAT-3’ |
K pJB22 |
plaB_EagIr |
362 |
56-62°C |
5’-gACggCCgAATTgTggCTAgATgAC-3’ |
K pJB04, “site-directed”Mutantenund pJB14/15/18/ 43/46 |
plaB_Ecof2 |
416 |
56°C |
5’-CCggAATTCAggAgCgTTACCATgATTg- TT-3’ |
K pJB14/15/18/33 |
plaB_f1_f |
239 |
56°C |
5’-gCgATgCCTgCAAgTAAAAAg-3’ |
Sequenzierung |
plaB_g1_r |
240 |
55°C |
5’-gATTgCCgCggTCATCAA-3’ |
Sequenzierung |
plaB_h1_f |
372 |
52°C |
5’-gCAgggTAATCTTgggTTTC-3’ |
Sequenzierung |
plaB_H7N |
407 |
56°C |
5’-gTTATCTTCgTCAATggCTggAgT-3’ |
K pJB23 |
plaB_H251N |
490 |
56°C |
5’-CTACCTggACTTTCAAATTCCg -3’ |
K pJB26 |
plaB_H270N |
402 |
56°C |
5’-AATgCAgCCACTAACCCCACgg-3’ |
K pJB13 |
plaB_H339N |
408 |
56°C |
5’-gACCgCggCAATAACCTTAT-3’ |
K pJB24 |
plaB_H433N |
409 |
56°C |
5’-CACAAAATACTTAATCCgAATgAAA-3’ |
K pJB25 |
plaB_pBADf |
350 |
56°C |
5’-AggAgCgTTATgATTgTTATC-3’ |
K pJB02 |
plaB_pBADr |
351 |
56°C |
5’-ACgAAAgAggTATCCATCTATC-3’ |
K pJB02 |
plaB_S85A |
363 |
56°C |
5’-gTATCACTCACgCTACCggTgggCC-3’ |
K pJB06 |
plaB_S129A |
364 |
56°C |
5’-CAgCTTggCAAAgCCCgCCTAg-3’ |
K pJB07 |
plaB_S200A |
365 |
56°C |
5’-ACAggAgAAgCTggATCCgATg-3’ |
K pJB08 |
plaB_S229A |
366 |
56°C |
5’-gATAACggTgAAgCTCTTgTTgTCg-3’ |
K pJB09 |
plaB_S250A |
367 |
56°C |
5’-CTACCTggACTTgCACATTCCg-3’ |
K pJB10 |
plaB_SalIf |
361 |
56°C |
5’-gATgTCgACAAgCTTgAggATTgAg-3’ |
K pJB04 + “site-directed”Mutanten |
plaBspir2r |
429 |
60°C |
5’-gTgTAggAgTTTACggCATC-3’ |
RT-PCR |
PlaBspir_BamHI |
942 |
55°C |
5’-gAggATCCATgATTgTTATCTTCCTACAT-3’ |
K pJB37 |
plaB_NdeI_f |
1271 |
55°C |
5’-AgTCTTCATATgATTgTTATCTTCgTCCA-3’ |
K pJB46 |
PlaBspir_NotI |
943 |
55°C |
5’-gTTAgCggCCgCTCAATCTACCgTTTTT- CC-3’ |
K pJB37 |
plaB_T83G |
403 |
56°C |
5’-TTgCTTgTATCggTCACTCTAC-3’ |
K pJB19 |
plaB_T83V |
611 |
56°C |
5’-TTgCTTgTATCgTTCACTCTACCg-3’ |
K pJB36 |
plaB_TOPOf |
241 |
50°C |
5’-CACCTTgTgAgACAACgATTC-3’ |
K pJB01 |
plaB_TOPf2 |
373 |
55°C |
5’-CACCAgCgTTATgATTgTTATCT-3’ |
K pJB03/31/32 |
plaB_truncC_P1 |
564 |
56°C |
5’-TCAAAggTTgTTgCTgATACggAAA-3’ |
K pJB31 |
plaB_truncC_P2 |
565 |
56°C |
5’-TCATCCACCTTCCATAATATCgTAgTC-3’ |
K pJB32 |
plaB_trunc3Eag |
613 |
56°C |
5’-ACggCCgTCAATgCTCATTTTTCTgAgTC-3’ |
K pJB33 |
plaB_fw_XbaI |
947 |
62°C |
5’-gATCTAgAATgATTgTTATCTTCgTCCA-3’ |
K pJB43 |
RTgyr_a1f |
285 |
55°C |
5’-CACATATggCCggCTTTAgAg-3’ |
RT-PCR |
RTgyr_b1r |
286 |
55°C |
5’-TCgCgCTTgTTTTgCTgAg-3’ |
RT-PCR |
↓32 |
Tabelle 3.11: Auflistung verwendeter Bakterienstämme, Hefen, Zelllinien und Versuchstiere
Bakterienstamm / Zelllinie / Tiere |
Katalog-Nr. |
Herkunft |
Bacillus subtilis ATCC |
6633 |
Dr. Fruth |
Escherichia coli BL21 |
C161003 |
Invitrogen |
Escherichia coli DH5α |
18258-012 |
Invitrogen |
Escherichia coli XA90 |
- |
D. Castor, ETH |
Escherichia coli Top10 |
C664-55 |
Invitrogen |
Klebsiella pneumoniae RKI 508 |
- |
Dr. Fruth |
L. anisa ATCC |
35292 |
Dr. Neumeister |
L. feelii ATCC |
35072 |
Dr. Neumeister |
L. gormanii ATCC |
33297 |
Dr. Neumeister |
L. jordanis ATCC |
33623 |
Dr. Neumeister |
L. longbeachae ATCC |
33462 |
Dr. Neumeister |
L. micdadei ATCC |
33218 |
Dr. Neumeister |
L. micdadei CDC |
F976 |
Dr. Barry Fields |
L. oakridgensis ATCC |
33761 |
Dr. Neumeister |
L. parisiensis ATCC |
35299 |
Dr. Neumeister |
L. pneumophila Sg1 130b |
BAA-74 |
ATCC |
L. pneumophila Sg1 130b plaB1 |
- |
Rydzewski, NG5, RKI |
L. pneumophila Sg1 Corby |
- |
[143] |
L. pneumophila Sg1 Corby plaB1 |
- |
[94] |
L. pneumophila Sg1 L02-705 |
- |
Dr. Lück |
L. pneumophila Sg1 L03-638 |
- |
Dr. Lück |
L. pneumophila Sg3 L04-41 |
- |
Dr. Lück |
L. pneumophila Sg3 L05-410 |
- |
Dr. Lück |
L. pneumophila Sg1 L06-281 |
- |
Dr. Lück |
L. pneumophila Sg1 L07-2 |
- |
Dr. Lück |
L. pneumophila Sg1 L08-147 |
- |
Dr. Lück |
L. pneumophila Sg1 L08336 |
- |
Dr. Lück |
L. pneumophila Sg2 W08-231 |
- |
Dr. Lück |
L. pneumophila Wasserrohr-Isolat #251 |
- |
Robert Koch-Institut |
L. sainthelensis ATCC |
35248 |
Dr. Neumeister |
L. spiritensis ATCC |
35249 |
Dr. Neumeister |
L. steigerwaltii ATCC |
35302 |
Dr. Neumeister |
P. aeruginosa PA01 |
- |
Dr. Häußler |
S. aureus H1 |
- |
Dr. Layer |
P. pastoris GS115 |
K1710-01 (Kit) |
Invitrogen |
P. pastoris KM71 |
K1710-01 (Kit) |
Invitrogen |
Acanthamoeba castellanii |
30234 |
ATCC |
U937 Makrophagen |
CRL-1593.2 |
ATCC |
A549 Epithelzellen |
CCL-185 |
ATCC |
Meerschweinchen, Stamm Hartley, männlich, ca. 250-300g |
- |
Charles River |
Tabelle 3.12: Auflistung verwendeter und erzeugter gentechnisch veränderter Organismen (GVO)
Bezeichnung GVO |
Klon- Nr. |
Konstrukt |
Bemerkung |
E. coli | |||
TOP10 (pJB01) |
6 |
pET160/GW/D-TOPO+plaB |
Klonierung zur Überexpression von PlaB ohne tag |
BL21 (pJB01) |
1 |
pET160/GW/D-TOPO+plaB |
Überexpression von PlaB ohne tag |
TOP10 (pJB02) |
4 |
pBAD202/D/TOPO+plaB |
Klonierung zur Überexpression von PlaB mit C-terminalem 6× His-tag |
BL21 |
1 |
pBAD202/D/TOPO+plaB |
Überexpression von PlaB mit C-terminalem 6× His-tag |
TOP10 (pJB03) |
1 |
pET160/GW/D-TOPO+plaB |
Klonierung zur Überexpression von PlaB mit N-terminalem 6× His-tag |
BL21 (pJB03) |
1 |
pET160/GW/D-TOPO+plaB |
Überexpression von PlaB mit N-terminalem 6× His-tag |
DH5α (pJB04) |
11 |
pBCKS+plaB |
Komplementationsvektor und Kontrollvektor für „site-directed“ Mutanten von PlaB |
DH5α (pJB06) |
3 |
pBCKS+plaB; S85A |
„site-directed“ Mutante S85A |
DH5α (pJB07) |
2 |
pBCKS+plaB; S129A |
„site-directed“ Mutante S129A |
DH5α (pJB08) |
6 |
pBCKS+plaB; S200A |
„site-directed“ Mutante S200A |
DH5α (pJB09) |
2 |
pBCKS+plaB; S229A |
„site-directed“ Mutante S229A |
DH5α (pJB10) |
1 |
pBCKS+plaB; S250A |
„site-directed“ Mutante S250A |
DH5α (pJB11) |
5 |
pBCKS+plaB; D75N |
„site-directed“ Mutante D75N |
DH5α (pJB12) |
5 |
pBCKS+plaB; D203N |
„site-directed“ Mutante D203N |
DH5α (pJB13) |
2 |
pBCKS+plaB; H270N |
„site-directed“ Mutante H270N |
DH5α (pJB14) |
3 |
pPIC3.5+plaB |
Klonierung zur Überexpression von PlaB in P. pastoris, intrazelluläre Version |
DH5α (pJB15) |
8 |
pPIC9+plaB |
Klonierung zur Überexpression von PlaB in P. pastoris, sekretierte Version |
DH5α (pJB18) |
1 |
pGEX-5X-1+plaB |
Klonierung zur Überexpression von PlaB mit N-terminalem GST-tag |
BL21 (pJB18) |
1 sk3* |
pGEX-5X-1+plaB |
Überexpression von PlaB mit N-terminalem GST-tag |
XA90 (pJB18) |
1 |
pGEX-5X-1+plaB |
Überexpression von PlaB mit N-terminalem GST-tag |
DH5α (pJB19) |
2 sk1* |
pBCKS+plaB; T83G |
„site-directed“ Mutante T83G |
DH5α (pJB20) |
3 sk1* |
pBCKS+plaB; D167N |
„site-directed“ Mutante D167N |
DH5α (pJB21) |
10 sk1* |
pBCKS+plaB; D342N |
„site-directed“ Mutante D342N |
DH5α (pJB22) |
2 sk4* |
pBCKS+plaB; D381N |
„site-directed“ Mutante D381N |
DH5α (pJB23) |
4 |
pBCKS+plaB; H7N |
„site-directed“ Mutante H7N |
DH5α (pJB24) |
2 sk1* |
pBCKS+plaB; H339N |
„site-directed“ Mutante H339N |
DH5α (pJB25) |
4 |
pBCKS+plaB; H433N |
„site-directed“ Mutante H433N |
DH5α (pJB26) |
2 |
pBCKS+plaB; H251N |
„site-directed“ Mutante H251N |
DH5α (pJB27) |
1 |
pBCKS+plaB; S85A/S129A |
„site-directed“ Doppelmutante S85A/S129A |
DH5α (pJB28) |
1 sk4* |
pBCKS+plaB; S85A/D203N |
„site-directed“ Doppelmutante S85A/D203N |
DH5α (pJB29) |
2 |
pBCKS+plaB; S85A/H251N |
„site-directed“ Doppelmutante S85A/H251N |
DH5α (pJB31) |
1 |
pGEX-6P-1+plaB; AS 1-459 |
Klonierung verkürzter PlaB-Version; AS 1-459 |
BL21 (pJB31) |
4 |
pGEX-6P-1+plaB; AS 1-459 |
Überexpression verkürzter PlaB-Version; AS 1-459 |
DH5α (pJB32) |
9 |
pGEX-6P-1+plaB; AS 1-388 |
Klonierung verkürzter PlaB-Version; AS 1-388 |
BL21 (pJB32) |
1 |
pGEX-6P-1+plaB; AS 1-388 |
Überexpression verkürzter PlaB-Version; AS 1-388 |
DH5α (pJB33) |
1 |
pGEX-6P-1+plaB; AS 1-307 |
Klonierung verkürzter PlaB-Version; AS 1-307 |
BL21 (pJB33) |
1 |
pGEX-6P-1+plaB; AS 1-307 |
Überexpression verkürzter PlaB-Version; AS 1-307 |
DH5α (pJB36) |
1 |
pBCKS+plaB; T83V |
„site-directed“ Mutante T83V |
DH5α (pJB37) |
1 |
pBCKS+plaB aus L. spiritensis |
Klonierung L. spiritensis plaB in pBCKS-Vektor |
DH5α (pJB43) |
2 |
pcDNA3.1(+)Flag+plaB |
Klonierung plaB zur Transfektion von A549 Zellen; N-terminale Fusion zu FLAG-Epitop |
DH5α (pJB46) |
4 |
pET28b(+)+plaB |
Klonierung von plaB zur in vitro Translation, Shine Dalgarno 7bp vor Startkodon |
L. pneumophila Corby | |||
Wildtyp (pBCKS) |
1 |
pBCKS |
Kontrollstamm für Versuche |
plaB1 (pBCKS) |
1 |
pBCKS |
Kontrollstamm für Versuche |
plaB1 (pKH192) |
- |
pBCKS (Heuner) |
Komplementationsvektor; AS101-Substitution N♢S; von Klaus Heuner |
plaB1 (pJB04) |
1 |
pBCKS+plaB |
Komplementationsvektor und Kontrollvektor für „site-directed“ Mutanten von PlaB |
plaB1 (pJB06) |
1 |
pBCKS+plaB; S85A |
„site-directed“ Mutante S85A |
plaB1 (pJB07) |
1 |
pBCKS+plaB; S129A |
„site-directed“ Mutante S129A |
plaB1 (pJB08) |
1 |
pBCKS+plaB; S200A |
„site-directed“ Mutante S200A |
plaB1 (pJB09) |
1 |
pBCKS+plaB; S229A |
„site-directed“ Mutante S229A |
plaB1 (pJB10) |
1 |
pBCKS+plaB; S250A |
„site-directed“ Mutante S250A |
plaB1 (pJB11) |
1 |
pBCKS+plaB; D75N |
„site-directed“ Mutante D75N |
plaB1 (pJB12) |
1 |
pBCKS+plaB; D203N |
„site-directed“ Mutante D203N |
plaB1 (pJB13) |
1 |
pBCKS+plaB; H270N |
„site-directed“ Mutante H270N |
plaB1 (pJB19) |
1 |
pBCKS+plaB; T83G |
„site-directed“ Mutante T83G |
plaB1 (pJB20) |
1 |
pBCKS+plaB; D167N |
„site-directed“ Mutante D167N |
plaB1 (pJB21) |
1 |
pBCKS+plaB; D342N |
„site-directed“ Mutante D342N |
plaB1 (pJB22) |
1 |
pBCKS+plaB; D381N |
„site-directed“ Mutante D381N |
plaB1 (pJB23) |
1 |
pBCKS+plaB; H7N |
„site-directed“ Mutante H7N |
plaB1 (pJB24) |
1 |
pBCKS+plaB; H339N |
„site-directed“ Mutante H339N |
plaB1 (pJB25) |
1 |
pBCKS+plaB; H433N |
„site-directed“ Mutante H433N |
plaB1 (pJB26) |
1 |
pBCKS+plaB; H251N |
„site-directed“ Mutante H251N |
plaB1 (pJB27) |
1 |
pBCKS+plaB; S85A/S129A |
„site-directed“ Doppelmutante S85A/S129A |
plaB1 (pJB28) |
1 |
pBCKS+plaB; S85A/D203N |
„site-directed“ Doppelmutante S85A/D203N |
plaB1 (pJB29) |
1 |
pBCKS+plaB; S85A/H251N |
„site-directed“ Doppelmutante S85A/H251N |
plaB1 (pJB36) |
1 |
pBCKS+plaB; T83V |
„site-directed“ Mutante T83V |
plaB1 (pJB37) |
1 |
pBCKS+plaB aus L. spiritensis |
Expression von L. spiritensis plaB in pBCKS-Vektor |
P. pastoris | |||
Pp01 |
1-3 |
pPIC9+plaB |
Überexpression und Sekretion von PlaB in P. pastoris GS115 |
Pp02 |
1 |
pPIC9+plaB |
Überexpression und Sekretion von PlaB in P. pastoris KM71 |
Pp03 |
1/2 |
pPIC3.5+plaB |
Intrazelluläre Überexpression von plaB in P. pastoris GS115 |
Pp04 |
1/2 |
pPIC3.5+plaB |
Intrazelluläre Überexpression von plaB in P. pastoris KM71 |
Tabelle 3.13: Auflistung verwendeter Nährmedien zur Anzucht von L. pneumophila
BYE-Flüssigmedium (BYE: Buffered Yeast Extract) |
BCYE-Agar-Platten (BCYE: Buffered Charcoal Yeast Extract) |
|
10 g Hefeextrakt |
27,5 g Legionella Basis-Agar: |
|
14,45 g Legionella Wachstums-Supplement: |
10 g Hefeextrakt |
|
10 g ACES Puffer |
1,5 g Aktivkohle |
|
2,8 g KOH |
16 g Agar |
|
1,0 g α-Ketoglutarat-Monoessigsäure-Salz |
14,45 g Legionella Wachstums-Supplement: |
|
0,4 g L-Cystein HCl |
10 g ACES |
|
H2Obidest zu 1000 ml |
2,8 g KOH |
|
1,0 g α-Ketoglutarat-Monoessigsäure Salz |
||
0,4 g L-Cystein HCl |
||
H2Obidest zu 1000 ml |
||
Das Legionella Waschstums-Supplement wurde mit Hefeextrakt in H2Obidest gelöst und steril filtriert. |
Der Legionella Basis Agar wurde in H2Obidest suspendiert und autoklaviert. Das Legionella Wachstums-Supplement wurde wie beschrieben angesetzt und nach dem Autoklavieren steril bei 50°C zugegeben. |
↓33 |
Tabelle 3.14: Auflistung der Nährmedien zur Anzucht von E. coli
Luria-Bertani (LB)-Flüssigmedium |
Luria-Bertani (LB)-Agar-Platten |
|
10 g Trypton |
10 g Trypton |
|
5 g Hefeextrakt |
5 g Hefeextrakt |
|
5 g NaCl |
5 g NaCl |
|
H2Obidest zu 1000 ml |
15 g Agar |
|
H2Obidest zu 1000 ml |
||
Die Bestandteile der beiden Medien wurden zunächst in H2Obidest gelöst und anschließend autoklaviert. |
||
SOB-Medium (pH 7,0) (Super Optimal Broth Medium) |
SOC-Medium (Super Optimal Broth-Derivat) |
|
20 g Trypton |
98 ml SOB-Medium |
|
5 g Hefeextrakt |
1 ml 2M Mg2+ Stammlösung (20,33 g MgCl2 × H2O und 24,65 g MgSO4 x 7 H2O je 100ml Stammlösung) |
|
0,584 g NaCl | ||
0,186 g KCl |
1 ml 2M Glukose Stammlösung (36,04 g Glukose je 100 ml Stammlösung) |
|
H2Obidest zu 1000 ml | ||
Die Bestandteile wurden zunächst in H2Obidest gelöst und anschließend autoklaviert. |
Vor der Zugabe der Lösungen zum SOB-Medium wurde die Mg2+-Stammlösung autoklaviert und die Glukose-Stammlösung steril filtriert. |
Tabelle 3.15: Auflistung der Nährmedien zur Anzucht von P. pastoris
YPD Kulturmedium (Yeast Extract Peptone Dextrose Medium) |
MD Selektivagar (Minimal Dextrose Medium) |
|
10 g Hefeextrakt |
100 ml 10× (13,4%) YNB |
|
10 g Pepton |
2 ml 500× (0,02%) Biotin |
|
20 g Dextrose (Glukose) |
100 ml 10× (20%) Glukose |
|
optional: 20 g Agar für Festmedium |
20 g Agar |
|
H2Obidest zu 1000 ml |
H2Obidest zu 1000 ml |
|
Hefeextrakt und Pepton wurden in H2O gelöst und autoklaviert. Anschließend wurde die steril filtrierte Glukoselösung zugegeben. |
Wasser und Agar wurde vor Zugabe der steril filtrierten Bestandteile autoklaviert. |
|
BMGY/BMMY Kulturmedium (Buffered Glycerol or Methanol-complex-Medium) | ||
10 g Hefeextrakt | ||
20 g Pepton | ||
100 ml 1M Kaliumphosphatpuffer pH 6.0 | ||
100 ml 10× (13,4%) YNB | ||
2 ml 500× (0,02%) Biotin | ||
100 ml 10× (10%) Glyzerol oder 100 ml 10× (5%) Methanol | ||
H2Obidest zu 1000 ml | ||
Hefeextrakt, Pepton und H2O wurden vor Zugabe der steril filtrierten Bestandteile autoklaviert. |
PYG Kulturmedium (Peptone-Yeast Extract-Glucose) |
Infektionsmedium |
|
20 g Pepton |
Bestandteile wie PYG Kulturmedium ohne Pepton, Hefeextrakt und Glukose |
|
1 g Hefeextrakt | ||
10 ml 400mM MgSO4 × 7 H2O | ||
10 ml 40mM CaCl2 × 2 H2O | ||
10 ml 250mM Na2HPO4 × 7 H2O | ||
10 ml 250mM KH2PO4 | ||
10 ml 5mM Fe(NH4)2(SO4)2 × 6 H2O |
Alle Bestandteile, außer Glukose, wurden in H2Obidest gelöst und autoklaviert. Anschließend wurde die steril filtrierte Glukoselösung dazugegeben. |
|
2,5 g NaCitrat × 2 H2O | ||
50 ml 2M Glukose | ||
900 ml H2Obidest |
↓34 |
RPMI Kultur- und Infektionsmedium mit 10 % FKS (Roswell Park Memorial Institute Medium) |
||
RPMI 1640 Pulver oder Flüssigmedium | ||
10 % hitzeinaktiviertes FKS | ||
Das Medium wurde nach Angaben des Herstellers angesetzt. |
Tabelle 3.18: Auflistung verwendeter Antibiotika und deren Endkonzentration im Medium
Antibiotikum |
Stammlösung |
Endkonzentration für L. pneumophila (µg/ml) |
Endkonzentration für E. coli (µg/ml) |
Ampicillin (Amp) |
100 g/l H2Obidest |
- |
100 |
Carbenicillin (Carb) |
100 g/l H2Obidest |
- |
100 |
Chloramphenicol (Cm) |
30 g/l EtOH |
6 |
30 |
Kanamycinmonosulfat (Km) |
50 g/l H2Obidest |
25 |
50 |
Die Stammlösungen wurden steril filtriert, Aliquots bei -20°C gelagert und den autoklavierten Medien in den angegebenen Endkonzentrationen zugesetzt. |
Tabelle 3.19: Verwendete Software und Internet-Datenbanken
Datenbank |
Adresse |
Biocyc |
http://www.biocyc.org/ |
COILS Server |
http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html |
Compute pI/MW tool |
http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html |
Kyte-Doolittle Hydropathy Plot |
http://gcat.davidson.edu/rakarnik/kyte-doolittle.htm |
NCBI |
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ |
PEDANT |
http://pedant.gsf.de/ |
ProtCompB |
http://linux1.softberry.com/berry.phtml |
PSITE |
http://linux1.softberry.com/berry.phtml |
Sequenz-Alignment |
http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html |
SignalP 3.0 |
http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ |
Programme |
Hersteller |
Acolyte (Koloniezählprogramm) |
Synbiosis |
Bio 1D |
Vilber Lourmat |
Lasergene 8 |
DNASTAR, Inc. |
Magellan V5.03 |
Tecan |
Opus 5.0 |
Bruker |
Origin 8.0 |
OriginLab |
PrimeView & PrimeView Evaluation |
Amersham |
Prism 5 |
GraphPad Software, Inc. |
Quantity One |
Bio-Rad |
RayBio® Human Inflammation Antibody Array III and 3.1 Analysis Tool |
RayBiotech, Inc |
↓35 |
Bei –80°C gelagerte Legionellen wurden mittels einer sterilen Impföse auf BCYEα Agar ausgestrichen („Mutterplatte“) und nach 2 Tagen Inkubation bei 37°C entweder für ca. 1 Monat bei 4°C gelagert oder wiederum auf BCYEα Agar überimpft („Tochterplatte“). Die plaB Kanamycinresistenzkassetten-Insertionsmutante von L. pneumophila wurde zuerst auf antibiotikahaltigen (s. Tabelle 3.18) Mutterplatten ausgestrichen, zur weiteren Verwendung aber auf BCYEα-Platten ohne Antibiotikum kultiviert. Plasmidtragende Bakterien wurden grundsätzlich auf BCYE-Agarplatten mit entsprechenden Antibiotikakonzentrationen angezogen (s. Tabelle 3.18).
Für Infektionen wurden die Kulturen für 2 bis 3 Tage bei 37°C auf Festagar inkubiert. Flüssigkulturen hingegen wurden auf Festmedium für 1 1/2 Tage bei 37°C bebrütet und anschließend zum Animpfen einer Vorkultur in BYE-Nährbouillon mit/ohne Antibiotika verwendet. Diese Vorkultur wurde über Nacht bei 37°C und 250rpm geschüttelt. Nach photometrischer Bestimmung der optischen Dichte bei 660nm wurde die Hauptkultur auf eine OD660 von 0.3-0.4 eingestellt und unter Schütteln bis zur späten (OD660 ~2,0) exponentiellen Phase kultiviert.
Zur Herstellung von Zellpelletlysaten und Kulturüberständen für Aktivitätstests erfolgte die Zellernte mittels Zentrifugation bei 5.000 × g für 5min. Kulturüberstände wurden mit 1/50 Volumen an 300mM NaN3 versetzt und bei 4°C, Bakterienpellets bis zum Zellaufschluss bei –20°C gelagert.
↓36 |
Die Kultivierung von E. coli Wildtypen (s. Tabelle 3.11) und die der mit Plasmiden transformierten Stämme (s. Tabelle 3.12) erfolgte aus Glyzerolstockkulturen (s. 3.2.1.4) auf entsprechenden LB-Agarplatten für 18-24h bei 37°C. Ebenso wie bei L. pneumophila wurden E. coli Stämme auf Tochterplatten überimpft, davon Vorkulturen inokuliert und anschließende Hauptkulturen bei Erreichen einer OD660 ~2.0 geerntet. Die Induktion der Expression eines in trans enthaltenen Gens erfolgte durch Zugabe von IPTG (Endkonzentration 1mM) zu Beginn der frühen exponentiellen Phase (OD660 der Kultur von 0,6 bis 0,8). Die Expression wurde für 4h bei 37°C fortgeführt und die Zellen anschließend durch Zentrifugation geerntet und weiterverarbeitet (s. 3.2.11.4).
Zur Anzucht der E. coli Zellen für die Präparation von extrachromosomaler DNA wurden entsprechende Kolonien gepickt und auf eine frische antibiotikahaltige LB-Agarplatte überimpft, bevor diese zur Inokulation der Präparationskultur verwendet wurde. 2ml einer Übernachtkultur (OD660 ca. 2,5) wurden pelletiert und anschließend die plasmidale DNA extrahiert (s. 3.2.3.3).
Nach Wachstum auf YPD- oder MD-Selektiv-Agarplatten (s. Tabelle 3.15) für 24h erfolgte die Kultivierung von P. pastoris bei 250rpm und 30°C (Tischinkubator) in YPD-Flüssigmedium zur Extraktion chromosomaler DNA. Für die Überexpression erfolgte die Anzucht der Vorkulturen in BMGY, bevor die Zellen zur Induktion der Proteinexpression bei OD660 von 4 bis 5 geerntet (5.000 × g, 5min) und auf eine Ausgangssuspension von OD660 ~0,9 in BMMY-Flüssigmedium eingestellt wurden. Methanol wurde im 24h-Takt zu einer Endkonzentration von 0,5% des Kulturvolumens zugegeben, um die Expression des Zielproteins aufrecht zu erhalten.
↓37 |
Zur Erzeugung von Langzeitkulturen wurden L. pneumophila, E. coli und P. pastoris (s. Tabelle 3.12) 1-2 Tage auf den zugehörigen Selektivagarplatten angezogen, bis sich ein gut bewachsener Rasen gebildet hatte. Anschließend wurde eine volle Impföse des jeweiligen Stammes in der zugehörigen Nährbouillon ohne Antibiotika resuspendiert und im Volumenverhältnis 1:1 mit sterilem Glyzerol vermischt. Die Lagerung der Kulturen erfolgte bei -80°C.
Die in flüssigem Stickstoff in Kulturmedium (PYG bzw. RPMI) + 10% DMSO eingefrorenen Zellen wurden bei 37°C im Brutschrank aufgetaut und 2min bei 1.000 x g zentrifugiert. Das Zellpellet wurde anschließend in Kulturmedium resuspendiert und erneut bei 1.000 x g für 10min pelletiert. Daraufhin wurden die Zellen erneut in Kulturmedium resuspendiert (10ml) und in ein Kulturgefäß überführt. Nach 3 (A. castellanii) bzw. 10 Tagen Inkubation (U937, A549) bei 37°C und 5% CO2 wurden die Zellen erstmalig passagiert. Anschließend wurden die Zellen in Intervallen von 3 bis 4 Tagen regelmäßig passagiert (maximal 30-mal), wobei das Verhältnis von 1:10 bis 1:12 (v/v), Zellen zu Wachstumsmedium, bei den jeweiligen Inkubationslängen berücksichtigt wurde.
Zur quantitativen Bestimmung der Bakterienlast mittels real-time PCR Analyse, wurden 50mg Lungengewebe von allen Tieren, dies entsprach 50µl Homogenisat, mit 1ml des „DNA Isolation Reagent for Genomic DNA“ (AppliChem) vermischt. Die Isolierung erfolgte nach Angaben des Herstellers, mit Ausnahme, dass die präzipitierte DNA nicht sedimentiert, sondern mittels einer sterilen Pipettenspitze in ein neues Reaktionsgefäß überführt wurde. Nach Zugabe von 100µl H2O wurde die DNA über Nacht bei 55°C inkubiert, um eine maximale Löslichkeit der Nukleinsäure zu erreichen.
↓38 |
Nach der Methode von Harju et al. [120] wurden 2ml einer Übernachtkultur pelletiert (16.000 × g, 2min) und in 200µl Lysispuffer (s. Tabelle 3.5) resuspendiert. Die Zelllyse erfolgte nach der „freeze and thaw“-Methodik. Hierzu wurden die Ansätze abwechselnd in flüssigen Stickstoff getaucht, bis die Lysate komplett gefroren waren, und anschließend in einem 95°C warmen Wasserbad wieder zum Auftauen gebracht. Nach dreimaligem Wiederholen des Vorganges und abschließendem starken Vortexen für 30sek, wurden die Ansätze mit 200µl Chloroform vermischt, erneut für 2min geschüttelt (Vortexer Mixer) und für 3,5min bei 16.000 × g und Raumtemperatur (RT) zentrifugiert. Die obere wässrige Phase wurde in ein neues Gefäß überführt, mit 400µl eiskaltem EtOH vermischt und für 5min bei RT inkubiert, um die Präzipitation des Nukleinsäurekomplexes zu ermöglichen. Die Pelletierung der DNA erfolgte für 6min bei 16.000 × g (RT). Erhaltenes Präzipitat wurde 1× mit 500µl an 70%igem (v/v) EtOH gewaschen, erneut 4min bei 16.000 × g zentrifugiert und im 37°C-Inkubator getrocknet. Die Konzentration der in 30µl H2O solubilisierten DNA wurde anschließend bei 260nm im Spektrophotometer (Nanodrop-Gerät) bestimmt. Die Lagerung der Nukleinsäure erfolgte bei -20°C.
Die Isolierung von Plasmid-DNA erfolgte mittels des Kits „Wizard ® Plus SV Minipreps DNA Purification System“ der Firma Promega nach dem Protokoll des Herstellers. Die hiermit gewonnene DNA wurde quantitativ durch Messung der optischen Dichte bei 260nm im Spektrophotometer bestimmt und für weitere Experimente wie z. B. der „site-directed “ Mutagenese, Restriktion durch Endonukleasen und Sequenzierreaktionen verwendet.
Die Isolierung erfolgte mit Hilfe des peqGOLD RNAPureTM Reagenz (PeqLab), einer optimierten Guanidinisothiocyanat/Phenol-Methode zur Extraktion von RNA humanen, tierischen und bakteriellen Ursprungs. Hierbei wurde, nach Angaben des Herstellers, 1ml peqGOLD RNAPureTM zu 500µl einer Bakterienkultur der OD660=2, oder 1ml der Reagenz pro well einer 24-well Zellkuturplatte zugegeben und mit dem empfohlenen Protokoll fortgefahren. Isolierte RNA wurde in 40µl H2O gelöst und quantitativ/qualitativ im Spekrophotometer untersucht.
↓39 |
Um nach erfolgter Ligation von Fragmenten reine und aufkonzentrierte DNA zu erhalten, wurde die Nukleinsäure mittels EtOH gefällt. Die zu fällende Lösung wurde mit einer Endkonzentration an 0,3M Natriumazetat pH7,0 und dem doppelten Volumenanteil an unvergälltem 95%igen (v/v) EtOH vermischt und anschließend für 15min bei 16.000 × g und 4°C sedimentiert. Der Überstand wurde verworfen, das unsichtbare DNA-Präzipitat mit 70% (v/v) EtOH versetzt und erneut zentrifugiert. Das Pellet wurde anschließend für ca. 15min bei 37°C getrocknet, in 2µl sterilem 10%igem (v/v) Glyzerol aufgenommen und sofort in E. coli DH5α transformiert.
Die Auftrennung der Nukleinsäuren erfolgte mittels 1 bis 2%igen (w/v) Agarosegelen in 1×TAE-Puffer. Die Proben wurden mit etwa 0,2 Volumenanteilen Probenpuffer (s. Tabelle 3.5) versetzt und bei 105 bis 140V bis zur angestrebten Laufstrecke aufgetrennt. Die anschließende Färbung der Nukleinsäurebanden erfolgte für ca. 20 Minuten im Ethidiumbromid-Bad (2μg/ml EtBr in 1×TAE) und wurde im UV-Transluminator bei 254nm dokumentiert.
Bei präparativen Gelen wurden die Banden mit einem Skalpell aus dem Gel geschnitten und unter Verwendung des „Wizard SV Gel & PCR cleanup System“ eluiert.
↓40 |
Die Restriktion mittels Typ II Restriktionsendonukleasen erfolgt spezifisch innerhalb ihrer, meist palindromer, Erkennungssequenz an doppelsträngiger DNA. Alle Restriktionsenzyme wurden von der Firma New England Biolabs (NEB) erworben und mit den zugehörigen Puffern in die jeweiligen Reaktionen eingesetzt. Für den Verdau von 1µg DNA wurden 10U an Enzym in einem Reaktionsvolumen von meist 20µl verwendet und für 2-12h bei 37°C (Temperatur ist abhängig von dem verwendeten Enzym) inkubiert. Zur Überprüfung erfolgter Restriktion wurden die Fragmente auf ein 1%iges (w/v) Agarosegel aufgetragen und elektrophoretisch ihrer Größe nach aufgetrennt.
Wenn von Interesse, wurde der geschnittene Vektor mit Hilfe einer alkalischen Phosphatase (Schrimp Alkaline Phosphatase, SAP, Roche) dephosphoryliert, um eine Religation des Vektors zu minimieren. Hierzu konnte der hitzeinaktivierte Restriktionsenzym/DNA-Mix ohne einen zusätzlichen Reinigungsschritt verwendet werden. Nach Zugabe von SAP-Puffer und 1U an SAP-Enzym wurde der Ansatz 60min bei 37°C inkubiert und anschließend für 15min bei 65°C inaktiviert.
Um die Puffer- und Enzymreste zu entfernen, wurden die Fragmente mittels des „Wizard SV Gel & PCR cleanup System“ (Promega) entweder direkt aus dem PCR-Ansatz oder nach erfolgter Elektrophorese aus dem Gel ausgeschnitten und gereinigt. Die Konzentrationsbestimmung für anschließende Ligationsansätze (s. 3.2.6.2) wurde mit Hilfe des Nanodrop-Gerätes durchgeführt.
↓41 |
Die Ligation der DNA-Fragmente erfolgte mit Hilfe der DNA Ligase des Bakteriophagen T4. Dabei wurde die Ligation meist in einem Reaktionsvolumen von 10µl durchgeführt. Ungefähr 50ng an Vektor-DNA wurde im molaren Verhältnis von 1:3 mit dem zu insertierenden DNA-Fragment vermischt und unter Zugabe von 400U T4 DNA Ligase für 15-18h bei 16°C oder für 3h bei 25°C inkubiert. Anschließend wurden die Reaktionsansätze für 10min bei 65°C hitzeinaktiviert und mittels EtOH-Fällung (s. 3.2.4) für die Transformation in die jeweiligen Bakterienstämme vorbereitet.
Die Polymerase Kettenreaktion (PCR) dient der exponentiellen Amplifikation von Nukleotid-Fragmenten. In dieser Arbeit wurde zu Klonierungszwecken die DNA-Polymerase aus Pyrococcus furiosus (Pfu DNA-Polymerase) und zur Überprüfung positiver Klone, mittels Kolonie-PCR, die DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus (Taq DNA-Polymerase) verwendet. Die Reaktionsansätze wurden in einem Volumen von 25μl angesetzt und hatten folgende Zusammensetzung:
Tabelle 3.20: Reaktionsansatz für eine Standard- und Kolonie-PCR
Komponente |
[µl] |
Stocklösung |
Finale Konzentration |
DNA |
1 Kolonie (Kolonie-PCR) oder 20-200 ng DNA |
- |
- |
Puffer |
2,5 |
10-fach konzentriert |
1-fach konzentriert |
dNTPs |
0,25 |
10 mM jedes dNTP |
0,1 mM jedes dNTP |
Oligonukleotid 1 |
0,25 |
50 µM |
0,5 µM |
Oligonukleotid 2 |
0,25 |
50 µM |
0,5 µM |
DNA-Polymerase |
1µl (Pfu) oder 0,25µl (Taq) |
2,5 U/µl oder 5 U/µl |
0,1 U/µl oder 0,05 U/µl |
steriles H2O |
zu 25µl Gesamtansatz |
- |
- |
↓42 |
Die Annealingtemperatur wurde den Oligonukleotiden spezifisch angepasst. Für die Kolonie-PCR wurden die zu untersuchenden Zellen vor der PCR mit PCR-Puffer und Wasser für 10min bei 99°C lysiert. Anschließend wurde der Enzym-Primer-Mix zugegeben und folgendes Standard-Programm zur Amplifikation der gewünschten Produkte verwendet:
Tabelle 3.21: Programm für eine Standard-und Kolonie-PCR
Reaktionsschritt |
Anzahl der Zyklen |
Temperatur |
Zeit |
1. Denaturierung |
1 |
95°C |
4 min |
2. Denaturierung |
30 |
95°C |
40 sek |
3. Primer-Bindung (Annealing) |
30 |
50-65°C |
40 sek |
4. Synthese (Elongation) |
30 |
72°C |
1-2 min |
5. Finale Elongation |
1 |
72°C |
10 min |
6. Pause |
∞ |
4°C |
∞ |
Amplifizierte DNA-Fragmente wurden auf 1%igen (w/v) Agarosegelen elektrophoretisch überprüft und gegebenenfalls weiter gereinigt.
↓43 |
Für die zielgerichtete Substitution von Basenpaaren wurde die Methode der „Combined Chain Reaction“ (CCR) nach Bi und Stambrook angewendet [27]. Bei dieser speziellen Art der PCR-Technik wird ein dritter Primer, der die gewünschte Mutation trägt, zu dem PCR-Ansatz gegeben und im laufenden Syntheseprozess von einer thermostabilen Ligase (Ampligase) mit dem fortlaufenden Nukleotidstrang verknüpft. Um dies zu ermöglichen, muss das Oligonukleotid am 5’-Ende phosphoryliert sein. Die Phosphorylierungsreaktion von insgesamt 500pmol an Mutageneseprimer wurde in 1× T4 DNA-Ligasepuffer und 5U an T4 Polynukleotidkinase in einem Gesamtvolumen von 20µl für 1h bei 37°C durchgeführt. Die Reinigung des hitzeinaktivierten (20min bei 65°C) Ansatzes erfolgte mittels EtOH-Fällung (s. 3.2.4). Das Pellet wurde in 30µl sterilem H2O resuspendiert und auf eine Endkonzentration von 20ng/µl an phosphorylierten Oligonukleotiden für die anschließende CCR Reaktion eingestellt. Zur Herstellung von Einfachmutanten wurde pJB04 als Ausgangsplasmid gewählt, für die Doppelmutanten diente pJB06 (S85A-PlaB) als Amplifikationsgrundlage.
Tabelle 3.22: Reaktionsansatz für eine „Combined Chain Reaction“ (CCR)
Komponente |
[µl] |
Stocklösung |
Finale Konzentration |
Plasmid pJB04/pJB06 |
1 |
20 ng/µl |
1 ng/µl |
CCR Puffer |
2 |
10-fach konzentriert |
1-fach konzentriert |
dNTPs |
0,5 |
10 mM jedes dNTP |
0,25 mM jedes dNTP |
BSA |
2 |
4 mg/ml |
0,4 mg/ml |
Oligonukleotid 1 |
1 |
20 ng/µl |
1 ng/µl |
Oligonukleotid 2 |
1 |
20 ng/µl |
1 ng/µl |
Mutagenese Primer |
1 |
20 ng/µl |
1 ng/µl |
Pfu Polymerase |
0,5 |
2,5 U/µl |
0,062 U/µl |
Ampligase |
0,6 |
5 U/µl |
0,15 U/µl |
steriles H2O |
zu 20µl |
- |
- |
Das PCR-Programm für die CCR stellte sich wie folgt zusammen:
↓44 |
Tabelle 3.23: PCR-Programm für eine CCR-Reaktion
Reaktionsschritt |
Anzahl der Zyklen |
Temperatur |
Zeit |
1. Denaturierung |
1 |
96°C |
2 min |
2. Denaturierung |
30 |
96°C |
30 sek |
3. Primer-Bindung (Annealing) |
30 |
56°C |
30 sek |
4. Synthese (Elongation) |
30 |
72°C |
4 min |
5. Finale Elongation |
1 |
72°C |
7 min |
6. Pause |
∞ |
4°C |
∞ |
Die erhaltenen Fragmente wurden auf ihre Reinheit mittels eines 1%igen (w/v) Agarosegels untersucht, gereinigt, mit den Restriktionsendonukleasen SalI und EagI geschnitten und in den, mit diesen Enzymen, linearisierten Vektor pBCKS (s. Tabelle 3.8) ligiert.
Für die quantitative Bestimmung der Bakterienlast in Meerschweinchen wurde Gesamt-DNA aus den infizierten Lungen extrahiert (s. 3.2.3.1) und 50ng in Zweifachbestimmung mittels einer Legionella-spezifischen mip (macrophage infectivity potentiator) Gen-Sonde in der real-time PCR analysiert. Die Sonde trug ein 5’-FAM-Fluorophor (Fluorescein) und einen 3’-TMR (tetramethylrhodamine)-Quencher. Anschließend wurden die Werte auf das Ausgangsvolumen, sprich der Lungenmenge, hochgerechnet und demnach als Bakterienlast pro Lunge angegeben (mip Kopienzahl/Lunge). Die PCR und das zugehörige Programm setzten sich wie folgt zusammen:
↓45 |
Tabelle 3.24: Reaktionsansatz für eine real-time PCR
Komponente |
[µl] |
Stocklösung |
Finale Konzentration |
DNA |
10 |
variabel |
2 ng/µl |
Platinum Taq Puffer |
2,5 |
10-fach konzentriert |
1-fach konzentriert |
dNTP Mix |
2 |
2,5 mM jedes dNTP |
0,2 mM jedes dNTP |
MgCl2 |
0,8 |
50 mM |
1,6 mM |
Oligonukleotid 1 |
0,75 |
10 µM |
0,3 µM |
Oligonukleotid 2 |
0,75 |
10 µM |
0,3 µM |
Mip-Sonde |
0,25 |
10 µM |
0,1 µM |
ROX |
0,25 |
10 µM |
0,1 µM |
Platinum Taq |
0,1 |
5 U/µl |
0,02 U/µl |
steriles H2O |
7,6 |
- |
- |
Tablle 3.25: Programm für eine real-time PCR:
Reaktionsschritt |
Anzahl der Zyklen |
Temperatur |
Zeit |
1. Initiale PCR-Aktivierung |
1 |
95°C |
10 min |
2. Denaturierung |
45 |
95°C |
15 sek |
3. Annealing und Elongation |
45 |
60°C |
1 min |
4. Pause |
∞ |
4°C |
∞ |
Für die Bestimmung der Gen-Expression wurde die Methodik der reversen Transkription angewandt. Hierzu wurde isolierte RNA (s. 3.2.3.4) von DNA-Kontaminationen durch den Einsatz von TurboTM DNase (Ambion) befreit. 2U Enzym pro 1µg RNA und 1µl RNaseOUTTM wurden in einem Reaktionsvolumen von 10µl für 1h bei 37°C inkubiert, bevor die DNase durch Temperaturerhöhung auf 75°C für 10min inaktiviert wurde. 1µl des DNase-Restriktionsansatzes wurde in weiterführenden RT-PCR-Experimenten eingesetzt. Einzelsträngige cDNA-Synthese und anschließende Amplifikation des Produktes wurde mit Hilfe des „OneStep RT-PCR“ Kits der Firma Qiagen durchgeführt.
↓46 |
Tabelle 3.26: Reaktionsansatz für eine RT-PCR
Komponente |
[µl] |
Stocklösung |
Finale Konzentration |
RNA |
1 |
~ 100 ng/µl |
5 ng/µl |
OneStep RT-PCR Puffer |
4 |
5-fach konzentriert |
1-fach konzentriert |
dNTP Mix |
0,8 |
10 mM jedes dNTP |
0,4 mM jedes dNTP |
RT-PCR Enzym-Mix |
0,8 |
- |
- |
Oligonukleotid 1 |
0,3 |
50 µM |
0,75 µM |
Oligonukleotid 2 |
0,3 |
50 µM |
0,75 µM |
steriles H2O |
12,8 |
- |
- |
Das RT-PCR-Profil wurde nach Angaben des Herstellers erstellt, wobei die Annealing-Temperatur der Oligonukleotide an das jeweilige Experiment angepasst wurde. Für die Amplifikation von plaB wurden die Primer plaB_6A-f und plaBspir2r verwendet (s. Tabelle 3.10).
Tabelle 3.27: Programm für eine Einschritt-RT-PCR
Reaktionsschritt |
Anzahl der Zyklen |
Temperatur |
Zeit |
1. Reverse Transkription |
1 |
50°C |
30 min |
2. Initiale PCR-Aktivierung |
1 |
95°C |
15 min |
3. Denaturierung |
30-50 |
95°C |
40 sek |
4. Primer-Bindung (Annealing) |
30-50 |
54-60°C |
40 sek |
5. Synthese (Elongation) |
30-50 |
72°C |
1 min |
6. Finale Elongation |
1 |
72°C |
10 min |
7. Pause |
∞ |
4°C |
∞ |
↓47 |
Um noch vorhandene DNA-Kontaminationen auszuschließen, wurde bei jedem Experiment ein Ansatz mitgeführt, der nach dem Schritt der reversen Transkription zu den anderen Proben in den Thermocycler gestellt wurde. Nach erfolgter Reaktion wurden die Amplifikate auf einem 2%igen (w/v) Agarosegel analysiert.
Basierend auf der Didesoxy-Methode nach Sanger [236] wurde die DNA-Sequenzierung mit Hilfe von „ABI BigDye Terminator 3.1 Premi x“ (s. Tabelle 3.6) und Plasmid-DNA (in H20bidest gelöst) durchgeführt. Der Reaktionsansatz und das PCR-Profil wurden wie folgt zusammengesetzt:
Tabelle 3.28: Reaktionsansatz für eine Sequenzierungs-PCR
Komponente |
[µl] |
Stocklösung |
Finale Konzentration |
DNA |
variabel |
~ 300 ng/µl |
30 ng/µl |
ABI Puffer |
1,5 |
5-fach konzentriert |
0,75-fach konzentriert |
BigDye 3.1 |
1 |
- |
- |
Oligonukleotid |
0,5 |
10 µM |
0,5 µM |
steriles H2O |
zu 10 µl |
- |
- |
↓48 |
Tabelle 3.29: PCR-Programm für eine Sequenzierungs-Reaktion
Reaktionsschritt |
Anzahl der Zyklen |
Temperatur |
Zeit |
1. Denaturierung |
1 |
96°C |
2 min |
2. Denaturierung |
25 |
96°C |
10 sek |
3. Primer-Bindung (Annealing) |
25 |
50-58°C |
5 sek |
4. Synthese (Elongation) |
25 |
60°C |
4 min |
6. Pause |
∞ |
4°C |
∞ |
Die elektrophoretische Auftrennung und Floureszensdetektion erfolgte durch Mitarbeiter des Robert Koch-Institutes. Die Analyse der Daten wurde mit Hilfe der Lasergene SeqMan Software (s. Tabelle 3.19) durchgeführt.
Damit Zellen in der Lage sind, ein DNA-Molekül aufzunehmen, muss deren physiologischer Zustand an die Transformationsbedingungen angepasst werden. Dies kann unter Anwendung der folgenden Methoden geschehen.
↓49 |
E. coli DH5α und BL21 Stämme (s. Tabelle 3.11) wurden über Nacht auf LB-Agarplatten angezogen und zum Animpfen einer 50ml SOB-Vorkultur verwendet. Diese wurde für ca. 16h unter Schütteln bei 37°C inkubiert, um anschließend 0,5ml der Kultur in 500ml frischen SOB-Mediums zu überführen und sie für weitere 2-3 Stunden bis zum Erreichen einer OD660 von 0,8 schütteln zu lassen. Anschließend wurde das gesamte Kulturvolumen in der gekühlten (4°C) Sorvall RC-5 Zentrifuge für 10min bei 5.000 x g sedimentiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet zweimal mit je 500ml eiskaltem 10%igen (v/v) Glyzerol suspendiert und erneut 20min bei 13.000 x g und 4°C abzentrifugiert. Das nach dem letzten Waschschritt erhaltene Zellpellet wurde in 2ml eiskaltem 10%igen (v/v) Glyzerol aufgenommen, zügig in 20-80µl Aliquots aufgeteilt und bis zum Gebrauch bei –80°C gelagert.
Zur Erzeugung elektrokompetenter L. pneumophila wurde Koloniematerial von einer 2-3 Tage auf BCYE-Agar gewachsenen Kultur mit einer Impföse entnommen und in 1,5ml PBS-Puffer suspendiert und bei 4.500 × g abzentrifugiert. Das so gewonnene Zellpellet wurde zweimal mit 1,5ml eiskaltem 10%igen (v/v) Glyzerol gewaschen. Anschließend wurden die Zellen in 45μl 10%igem (v/v) Glyzerol resuspendiert, in 2 Aliquots aufgeteilt und bis zum Gebrauch bei -80°C aufbewahrt.
Elektrokompetente Pichia-Zellen wurden nach dem Protokoll von Lin-Cereghino et al. [168] hergestellt. Hierzu wurden die Stämme P. pastoris GS115 und KM71 in 15ml YPD-Medium (s. Tabelle 3.15) inokuliert und über Nacht bei 30°C und 200rpm im Tischinkubator geschüttelt. Anschließend wurden die Hefezellen in 240ml YPD-Flüssigmedium auf eine OD600 von ca. 0,2 eingestellt, erneut inkubiert und bei einer OD600 von 0,8 geerntet (Sorvall, 1.500 × g, 5min, 4°C). Das Zellpellet wurde anschließend in 50ml YPD/0,02M HEPES (steril filtriert) resuspendiert und 1,25ml 1M DTT tropfenweise zugegeben. Nach 15min Inkubation bei 30°C und 150rpm, wurden 250ml steriles H2O zugegeben und die Zellen erneut sedimentiert. Es folgten zwei Waschschritte mit zuerst 250ml und dann 150ml sterilem H2Obidest. Nach dem letzten Waschschritt wurden die Zellen in 10ml 1M Sorbitol (steril filtriert) resuspendiert, pelletiert und in einem finalen Volumen von 1ml 1M Sorbitol aufgenommen, in 40µl und 80µl Aliquots aufgeteilt und bis zur Elektroporation bei -80°C gelagert.
↓50 |
Um DNA als linearisiertes Fragment oder als zirkuläres Plasmid in die Zellen einzubringen und diese damit zu „transformieren“, muss die Zellemembran temporär permeabilisiert werden. Dies geschieht durch das Anlegen eines elektrischen Feldes im sogenannten Elektroporator und führt zur Porenentstehung und somit erleichterten Aufnahmen von DNA Molekülen.
a) E. coli
20µl elektrokompetenter Zellen (s. 3.2.7.1) wurden mit 2µl, in Glyzerol resuspendiertem, Ligationsansatz in einer vorgekühlten Elektroporationsküvette und auf Eis vermischt. Die DNA-Aufnahme erfolgte im eisgekühlten Cell Porator bei 330µF, 200 DC Volt und 4kΩ. Transformierte Zellen wurden in 1ml vorgewärmtem SOC-Medium für 1h bei 37°C geschüttelt und anschließend 100µl der Suspension auf Selektivagar ausgebracht. Die restlichen 900µl wurden für 2min bei 3.200 × g pelletiert, der Überstand abgenommen und die Zellen im Mediumrücklauf erneut resuspendiert und als Ganzes ausplattiert. Die Platten wurden für 18 - 24h bei 37°C im Brutschrank inkubiert und gewachsene Kolonien in anschließender Kolonie-PCR (s. 3.2.6.3) auf die Aufnahme des Plasmides überprüft.
↓51 |
b) L. pneumophila
Die Elektroporation von Legionellen wurde ähnlich zu der von E. coli Zellen durchgeführt. 20µl elektrokompetenter L. pneumophila wurden mit 20ng des entsprechenden Plasmides vermischt und anschließend im Cell Porator bei 330µF, 400 DC Volt und 4kΩ transformiert. Die Inkubation der Zellen in 2ml BYE-Bouillon erfolgte für 4-5h unter ständigem Schütteln bei 37°C. Ausplattiert wurde analog zu der Vorgehensweise von E. coli, wobei die Inkubation der Platten für 3-4 Tage bei 37°C vollführt wurde.
c) P. pastoris
↓52 |
Für die Transformation von P. pastoris Zellen musste die plasmidale DNA in einem vorausgehenden Schritt linearisiert werden. Hierzu wurden 15µg pJB14 und pJB15 (s. Tabelle 3.9) mit 20U SalI in NEB3-Puffer/BSA in einem Gesamtvolumen von 20µl für 16h bei 37°C inkubiert und anschließend bei 65°C für 20min hitzeinaktiviert. Der Ansatz wurde mit Hilfe des „Wizard SV Gel & PCR cleanup System“ gereinigt und die Konzentration mittels Absorption bei 260nm bestimmt. Für die Transformation wurden 1µg linearisierter DNA mit 40µl elektrokompetenter P. pastoris Stämme GS115 oder KM71 (s. Tabelle 3.11) vermischt, auf Eis in einer vorgekühlten Küvette kurz inkubiert und mit den Elektroporator-Einstellungen 1.500 V, 200Ω und 25µF transformiert. Nach sofortiger Zugabe von 1ml 1M Sorbitol wurden die Hefen für 1,75h bei 30°C und 200rpm inkubiert, 100µl und der Rest auf MD-Selektivagar (s. Tabelle 3.15) ausgebracht und bei 30°C inkubiert, bis Einzelkolonien sichtbar wurden. Je 8 Kolonien wurden gepickt und erneut über Nacht bei 30°C auf frischen Platten bebrütet. Da sich die Kolonie-PCR für P. pastoris als ungeeignet herausstellte, wurde von den „breitgestrichenen“ Kolonien chromosomale DNA isoliert (s. 3.2.3.2) und 1µg DNA mittels PCR und den Primern plaB_Ecof2 und plaB_EagIr auf die Insertion des plaB Gens überprüft. Positive Klone wurden als Glyzerolgefrierkulturen konserviert (s. 3.2.1.4).
Zur Etablierung der Transfektion von A549 Lungenepithelzellen wurden 2×105 A549 Zellen in RPMI + 10% FKS, in 12-well Platten ausgesät und über Nacht bei 37°C und 5%CO2 inkubiert, bis sich eine optische Konfluenz von 90-100% eingestellt hatte. Dies entspricht einer realen Konfluenz der Zellen von 30-60% und ist als optimal anzusehen, um bestmögliche Resultate mit dem Transfektionsreagenz METAFECTENETM zu erzielen. Nach erfolgter Inkubation wurde das Medium abgenommen und die Zellen 1× mit RPMI gewaschen und 1ml serumfreies Medium zu jedem Well zugegeben. Für die Bestimmung des optimalen Verhältnisses von DNA zu dem Lipid-Transfektionsreagenz wurden diese in unterschiedlichen Mengen miteinander in serumfreien RPMI gemischt. Zuerst wurden Plasmidmengen von 100ng – 2µg in 50µl RPMI gegeben, parallel dazu erfolgte die Zugabe von je 1,5µl oder 3µl METAFECTENETM pro 500ng DNA in ebenfalls 50µl RPMI. Anschließend wurde die DNA-Lösung zu der METAFECTENETM-Suspension pipettiert und ohne jeglichen Mischvorgang für 20min bei RT inkubiert. Danach erfolgte die tropfenweise Zugabe der Lösung zu dem konfluenten Zellrasen. Transfektionsreagenz ohne DNA und der Vektor pEGFP-C2 (zur Überprüfung der Transfektionseffizienz) wurden als interne Kontrollen mitgeführt. Nach 5h Inkubation erfolgte ein Mediumwechsel, wobei serumfreies RPMI abgenommen und durch 1ml RPMI + 10% FKS ersetzt wurde. Nach 24h und 48h erfolgte die Überprüfung der Transfektion mittels Fluoreszenzmikroskopie der Transfektionskontrolle pEGFP-C2, die im Durchschnitt um die 50% bei 500ng transfiziertem Vektor erreichte.
Die Bestimmung freier Fettsäuren erfolgte durch Abnahme des Überstandes und Detektion der Fettsäuren mit Hilfe des „ Nefa C “ Kits (Wako), wobei RPMI + 10% FKS als Leerwert mitgeführt wurde. Zur Bestimmung der Protein-Expression mittels Western Blot Analyse wurden die Zellen mit einem Zellschaber und durch Zugabe von 100µl Proteinladepuffer vom Wellboden gelöst und für 10min bei 99°C lysiert. Anschließende elektrophoretische Auftrennung und Detektion der Antigene (GFP und Flag-Peptid) erfolgte wie in 3.2.10.4 beschrieben.
↓53 |
Die Aktivität von exprimiertem PlaB wurde durch Lipidhydrolyse (s. 3.2.12.3) der Zelllysate bestimmt. Hierzu wurden 200µl A549-Lysepuffer (s. Tabelle 3.5) zu den Zellen (ohne Überstände) gegeben, die Suspension in ein 1,5ml Reaktionsgefäß überführt und für 20min auf Eis inkubiert. Weitere Zelllyse erfolgte durch Vortexen und mittels einer „26-gauge“ Kanüle durch wiederholtes Auf- und Abziehen der Suspension. Die Inkubation mit entsprechenden Lipidsubstraten wurde in 1:10 und 1:100 Verdünnungen in 40mM Tris pH 7,5 über 18h bei 37°C und 100rpm durchgeführt. Die freigesetzten Fettsäuren wurden wie im unteren Abschnitt beschrieben detektiert (s. 3.2.12.4).
RNA-Extraktion (von ca. 2×105 Zellen) und anschließende RT-PCR zur Überprüfung der Transkription transfizierter Templates wurde durch Zugabe von 1ml peqGOLD RNAPureTM und des „ OneStep RT-PCR “ Kits nach den Angaben der Hersteller durchgeführt (s. 3.2.3.4 und 3.2.6.6). Zur Amplifikation von plaB wurden die Primer PlaB_6A_f und plaB_spir2r, für die der endogenen β-Aktin-Kontrolle die Oligonukleotide β-actin fw und β-actin rv verwendet (s. Tabelle 3.10).
Für die Testung der bakteriziden Eigenschaften von PlaB wurden L. pneumophila Corby Wildtyp und die plaB Mutante plaB1 für 2 Tage bei 37°C und auf BCYE-Festagar kultiviert. Die auf Inhibition durch Legionellen zu untersuchenden Bakterienstämme E. coli, P. aeruginosa, K. pneumoniae, B. subtilis und S. aureus (s. Tabelle 3.11) wurden für 1 Tag auf LB-Agarplatten inkubiert. Anschließend wurden die Legionellen auf eine Zellzahl von 1×107/100µl, alle anderen Bakterienstämme auf 1×105/100µl in PBS-Puffer eingestellt und im Verhältnis 1:1 (je 100µl) vermischt und für 5min bei 16.000 × g sedimentiert. Die Suspension wurde für 20h bei 37°C inkubiert und nach erneutem Mischen 1:10 (entspricht Wert 0, s. Ergebnisse 4.3.3) und im Weiteren bis 10-4 in PBS-Puffer verdünnt. Je 10µl der Verdünnungen wurden auf LB-Agarplatten getropft, um das Legionellenwachstum zu unterdrücken. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert und das Waschtum der Konkurrentenstämme anschließend mit einer digitalen Spiegelreflexkamera EOS 450D dokumentiert.
↓54 |
Zur Entfernung denaturierender Agenzien, wie z. B. Guanidinhydrochlorid (GuHCl), oder zur Konzentrierung des Proteingehalts einer Probe wurde die Trichloressigsäure-Ethanol-Präzipitation nach Lebendiker (http://wolfson.huji.ac.il/purification/) angewandt. Hierzu wurden 10µl Probe mit 90µl H2O vermischt und durch die Zugabe von 100µl einer 20%igen (w/v) TCA-Lösung für 20min auf Eis inkubiert. Nach erfolgter Pelletierung für 15min, 16.000 × g bei 4°C, wurde das Pellet 2× mit 100µl reinem eiskalten EtOH gewaschen und das Pellet anschließend in SDS-Proteinauftragepuffer resuspendiert und auf ein Polyakrylamidgel aufgetragen.
Die Konzentrationsbestimmung von Proteinen erfolgte nach der Bradford-Methode und nach den Angaben des Herstellers der Färbelösung „Roti Nanoquant“ (s. Tabelle 3.3).
Um die größenabhängige Auftrennung von Proteinen zu erreichen, wurden 10 oder 12,5%ige SDS-Tris-Polyakrylamidgele nach der Methode von Laemmli [158] verwendet (s. Tabelle 3.5). Die Proben wurden mit je 5µl reduzierendem Protein-Probenpuffer versetzt, 90s bei 99°C denaturiert und in SDS-Laufpuffer (s. Tabelle 3.5) bei konstanten 40mA und bei Raumtemperatur (RT) aufgetrennt. Zur Detektion der Proteine im Gel wurden die zwei folgenden Färbemethoden angewandt:
↓55 |
a) Coomassie-Färbung von Proteinen
Nach der Elektrophorese wurde das Gel über Nacht in kolloidal Coomassie-Färbelösung nach dem Rezept des Herstellers und unter leichtem Schütteln inkubiert. Die Entfärbung des Hintergrundes wurde durch anschließende Inkubation in H2Obidest vollführt und das Gel nach 30min in Fixierlösung (s. Tabelle 3.5) zwischen zwei Cellophanfolien getrocknet und so konserviert.
b) Silberfärbung von Proteinen
↓56 |
Zur Erhöhung der Detektionsgrenze bei geringem Proteinanteil wurde die Nachweismethode der Silberfärbung entweder mit Hilfe des „Silver Staining Kit“ nach den Vorgaben des Herstellers (Amersham) oder nach Gharahdaghi et al. [107] und eigens hergestellten Lösungen angewandt (s. Tabelle 3.5). Die Reaktionszeiten des eigenen Protokolls richteten sich nach denen des kommerziell erworbenen Systems von Amersham.
Bei der Methodik des Western Blots werden Proteine, die elektrophoretisch aufgetrennt wurden (s. 3.2.10.3), auf eine Membran übertragen und mit spezifischen Antikörpern nachgewiesen (s. Tabelle 3.6). Nach erfolgter Elekrophorese wurden das Gel und die PVDF-Membran, die bereits mit 100%igem Methanol aktiviert wurde, für 10min bei RT in Transferpuffer (s. Tabelle 3.5) geschüttelt. Der Proteintransfer wurde anschließend nach Anleitung des Herstellers des verwendeten Semidry-Elektroblotter (Pharmacia) durchgeführt. Hierzu wurden 4, in Transferpuffer getränkte, Whatman Papierstücke anodenseitig in den Blotter gelegt, darauf die äquilibrierte PVDF Membran, dann das SDS-PAGE Gel und abschließend weitere 4 Lagen Whatman Papier. Nach Auflegen der Kathode wurden Proteine mit 0,8mA/cm2 Gel für 1h bei RT auf die Membran übertragen. Nach Beendigung des Proteintransfers wurde die Membran entweder für 1h bei RT oder über Nacht bei 4°C in PBS mit 5% Milchpulver inkubiert. Nach Absättigung der freien Bindungsstellen und kurzem Schwenken der Membran in PBS-Puffer erfolgte die Zugabe des primären Antikörpers (s. Tabelle 3.6) für 1h bei RT. Anschließend wurden drei 10-minütige Waschschritte in PBS-T Lösung vorgenommen, gefolgt von der Inkubation der Sekundärantikörperlösung, welche Meerrettich-Peroxidase gekoppelte Anti-Maus-IgG Antikörper enthielt (1h unter leichtem Schwenken). Nach drei abschließenden Waschschritten mit PBS-T für je 10min erfolgte die Detektion des Zielproteins mit dem „ECL Plus Western Blotting Detection Reagent“ (Amersham). Da die Peroxidase die Oxidation von Luminol unter alkalischen Bedingungen katalysiert und die dabei auftretende Chemilumineszenz mittels einer hochauflösenden CCD-Kamera aufgenommen werden kann, wurde zur Detektion ein Chemilumineszenz-Imager der Firma Vilber Lourmat verwendet. Alternativ zu dieser Detektionsmethode wurde ein kolorimetrischer Nachweis der Proteine mit 3,3’-Diaminobenzidin (DAB) als HRP-Substrat durchgeführt. Hierbei wurde die Membran in 15ml PBS mit einer Spatelspitze DAB und unter Zugabe von 0,024% H2O2 inkubiert, bis die gesuchten Banden sichtbar wurden.
Proteine können, nach erfolgter Expression, ihren biochemischen Eigenschaften nach über verschiedene chromatographische Verfahren zur Reinheit gebracht werden. Folgende Expressionssysteme und Reinigungsmethoden wurden nach Angaben der Hersteller oder nach eigenem Protokoll durchgeführt.
↓57 |
Wie bereits in 3.2.1.2 beschrieben, wurden 500ml E. coli-Kulturen der beginnenden exponentiellen Phase (OD660 0,6 – 0,8) mit einer Endkonzentration von 1mM IPTG zur Proteinproduktion induziert. Nach 4h Inkubation wurden die Zellen bei 10.000 × g für 10 – 20min bei 4°C pelletiert und bis zum Zellaufschluss bei -20°C gelagert. Der Zellaufschluss und die anschließende Proteinreinigung sind in 3.2.11.4 beschrieben.
P. pastoris plaB-Positive sowie die Kontrollstämme GS115 und KM71 wurden über Nacht in 10ml BMGY-Flüssigmedium angezogen. Anschließend wurde gerade soviel Zellmaterial abgenommen und abzentrifugiert, dass nach dem Suspendieren in 20ml BMMY eine OD660 von 0,8 – 0,9 erreicht werden konnte. Die Induktion der Proteinexpression erfolgte durch Zugabe von Methanol zu einer Endkonzentration von 0,5% alle 24h. Alle Inkubationsschritte wurden bei 30°C im Tischinkubator unter 250rpm ständigem Schütteln durchgeführt. Die Probenentnahme von je 1ml (5min, 5000 × g, 4°C) und die Messung der optischen Dichte bei 660nm erfolgte nach 0’, 5,5’, 19’, 25’, 48’, 72’ und 96 Stunden. Insgesamt wurden je 2 Klone für die intrazelluläre Expression beider Stämme (s. Tabelle 3.12) und 2 Klone für die sekretierte Version der Stämme KM71 und GS115 auf die Expression von plaB überprüft. Dies erfolgte durch Elektrophorese von 20µl Kulturüberstand oder durch auf eine OD von 1 eingestellte Zellpellets in einem 10%igen Polyakrylamidgel und anschließender Silber- oder Coomassiefärbung (s. 3.2.10.3). Weiterhin wurden die Überstände der PlaB-sekretierenden Stämme auf Enzymaktivität mittels Lipidhydrolyse (s. 3.2.12.3) untersucht.
Mit der Methode der in vitro Translation lassen sich schwer zu reinigende Proteine, z. B. Enyzme, die in „inclusion bodies“ aggregieren, in einem zellfreien System transkribieren und translatieren. In dieser Arbeit wurden zwei Expressionssysteme verwendet, ein „T7 Sample System“ mit Extrakten aus E. coli, Kaninchen-Retikulozyten und Weizenkeimlingen der Firma Promega, und das „PURExpress TM in vitro Protein Synthesis Kit“, erworben von NEB. Letzteres beruht auf einem hochreinen System rekombinant hergestellter Enzyme des Syntheseapparates, die gleichzeitig als His-Fusionsproteine vorliegen und so durch inverse Affinitätschromatographie aus dem Translationsansatz entfernt werden können. Zudem ist durch die kontrollierten Bedingungen der Abbau des Zielgens bzw. Proteins, vermittelt durch Nukleasen und Proteinasen eines rohen Zellextraktes, vermindert.
↓58 |
Die Durchführung richtete sich ganz nach den Angaben der Hersteller, wobei die eingesetzte Plasmidmengen 1µg bei den Ansätzen des „T7 Sample System“ und 250ng bei denen des „PURExpress TM in vitro Protein Synthesis Kit“ entsprachen. Da sich das „T7 Sample System“ aus vier verschiedenen Extrakten zusammensetzt, von denen 2 bevorzugt mit linearer DNA arbeiten, wurde der eingesetzte Vektor pJB03 für diese Ansätze vorher mit ZraI linearisiert und anschließend mit Hilfe des „Wizard SV Gel & PCR cleanup System“ gereinigt.
Nach erfolgter Expression in E. coli BL21 (s. 3.2.11.1) wurde das Zellpellet in den zugehörigen Puffern resuspendiert und aufgeschlossen:
a) Anionentausch chromatographie
↓59 |
Für den Zellaufschluss wurde das Zellpellet einer BL21 (pJB01) Kultur in 1/10 des ursprünglichen Kulturvolumens in Resuspensionspuffer (s. Tabelle 3.5) aufgenommen und nach Zugabe von 1× Proteaseinhibitormix 4× 30sek mit Ultraschall und einer Amplitude von 65% auf Eis lysiert. Die Abtrennung der unlöslichen Fraktion erfolgte durch Zentrifugation bei 10.000 × g für 20min. Der Überstand nach Zelllyse wurde anschließend mittels Lipidhydrolyse (s. 3.2.12.3) auf Aktivität von PlaB hin überprüft. Darauf folgend wurde 1/5 des Überstandvolumens 1:10 mit dem Proteinbindepuffer der Anionentauschchromatographie vermischt und auf die ebenfalls mit Proteinbindepuffer äquilibrierte 1ml HiTrapTM Q FF Säule (Amersham) geladen. Die Beladung und Reinigung wurde an dem FPLC-System ÄktaPrime mit einer Flussrate von 1ml/min durchgeführt. Nachdem die ersten 4 Fraktionen mit 10ml fraktioniert wurden, wurde durch Anlegen des Elutionsgradienten, ein Stufengradient mit jeweils um 10% steigender NaCl-Konzentration (0-100%), mit 2ml fraktioniert. Im Chromatogramm als relevant erscheinende Fraktionen (bezüglich des Proteingehalts) wurden mittels Lipidhydrolyse auf lipolytische Aktivität untersucht. Anschließend wurde die Proteinmenge bestimmt (s. 3.2.10.2) und mit Hilfe der SDS-PAGE auf den Reinheitsgrad des PlaB-Enzyms untersucht.
b) GST-Affinitätschromatographie
Das Zellpellet einer BL21 (pJB18) Kultur wurde in 1/20 des Kulturvolumens mit PBS-Puffer resuspendiert und mit einer Spatelspitze Lysozym, 1mM EDTA und 1× Proteaseinhibitormix für 30min bei 4°C auf einem Drehrad inkubiert. Die vollständige Zellyse wurde durch dreimaliges Schallen der Suspension mit einer Ultraschallsonde für 30sek und einer Amplitude von 65% herbeigeführt. Anschließend wurde die Lösung für 30min bei 9.000 × g und 4°C sedimentiert und der Überstand vor Beladung der Glutathion-Sepharose mit 100U Benzonase von DNA-Kontaminationen befreit und steril filtriert. Die Reinigungsschritte wurden nach Angaben des Herstellers des „Bulk and RediPack GST Purification Modules“ durchgeführt. Das Ausgangsvolumen der Glutathion-Sepharose 4B Suspension wurde auf 500µl festgelegt und entsprechend frisch aus der mitgelieferten Originalsuspension der Sepharose hergestellt. Nach erfolgter Bindung wurden die Beads dreimal mit 1/200 des Kulturvolumens mit PBS gewaschen und die Proteine anschließend in drei Elutionsschritten mit je 1/2000 an Glutathion-Elutionspuffer für 1min bei RT inkubiert und damit von der Sepharose eluiert. Alle zwischenzeitlichen Zentrifugationsschritte erfolgten für 5min bei 500 × g und RT. Um zu überprüfen, ob nach der Elution noch Proteinreste an den Kügelchen gebunden waren, wurden diese erneut in 1/2500 des Kulturvolumens in PBS resuspendiert, davon 1/6 abgenommen, bei 16.000 × g für 1min sedimentiert, die Kügelchen in 15µl Proteinauftragepuffer aufgenommen und der Überstand nach 90sek bei 99°C ebenfalls auf das Polyakrylamidgel aufgetragen.
↓60 |
Zur Reinigung von Einschlusskörperchen, den sogenannten „inclusion bodies“ (IB) wurde das Zellpellet einer 500ml Kultur BL21 (pJB01) mit 5ml/gNassgewicht der Zellen an „BugBuster Extraction Reagent“, 2.5 Kilounits/g Lysozym, 15µl Benzonase (375U) und 15µl 1× Proteaseinhibitor für 20min bei RT auf einem Drehrad inkubiert. Die Pelletierung erfolgte anschließend bei 15.000 × g und 4°C für 20min. Für weiterführende Rückfaltungsexperimente wurde das Pellet 2× mit 1/33 des Kulturvolumens an IB-Waschpuffer (s. Tabelle 3.5) und nach dem empfohlenen Protokoll des „Pro-Matrix TM Protein Refolding Guide“ (Pierce) behandelt. Anschließend wurden die „inclusion bodies“ 2× in 1/33 an IB-Resuspensionspuffer aufgenommen, 15min bei 15.000 × g und 4°C sedimentiert und das Nassgewicht der IBs bestimmt. Da die Reinheit der Einschlusskörperchen noch ungenügend war, wurden zusätzliche Reinigungsschritte unternommen. Das IB-Pellet wurde erneut mit 1/100 des Kulturvolumens an BugBuster, einer Spatelspitze an Lysozym, 50U Benzonase und 5µl 1× Proteaseinhibitor behandelt, gewaschen und resuspendiert, wie bereits angegeben. Eine Abtrennung weiterer Proteine wurde durch Inkubation des Pellets in 50mM Tris pH 8,0, 10mM EDTA und 4M Urea erreicht. Die so erhaltenen „inclusion bodies“ wurden mit 1ml IB-Solubilisierungspuffer/20mg Nassgewicht (s. Tabelle 3.5) für 50h bei 4°C inkubiert und die verbleibenden unlöslichen Bestandteile für 20min bei 20.000 × g und 4°C abzentrifugiert. 1/500 der solubilisierten Lösung wurde mittels TCA-Ethanolfällung (s. 3.2.10.1) von GuHCl befreit und auf den Solubilisierungsgrad mit Hilfe der SDS-PAGE überprüft.
Die in Abschnitt 3.2.11.5 gewonnenen und solubilisierten „inclusion bodies“ wurden mittels Roti Nanoquant auf ihren Proteingehalt untersucht (s. 3.2.10.2). Nachfolgende Rückfaltungs-ansätze wurden nach den Angaben des „Pro-Matrix TM Protein Refolding Guide“ (Pierce) zusammengesetzt. Dieser basiert auf einer Rückfaltung durch Verdünnung der denaturierten Proteine (1:20) in entsprechenden Puffersystemen mit die Faltung beeinflussenden Additiven. Die als Grundlage verwendeten Rückfaltungspuffer kombinieren hier die zwei Denaturierungsagenzien L-Arginin und Guanidin in verschiedenen Molaritäten, da diese in geringen Konzentration die Aggregation von Proteinen unterdrücken, die native Form der Enzyme aber nicht beeinflussen sollen. EDTA wurde ebenfalls in allen Reaktionen zur Stabilisierung des Redoxzustandes in einer Konzentration von 1mM mitgeführt. Die durchschnittliche Rückfaltungszeit wurde auf 24h festgelegt. Weiterhin wurde die Proteinkonzentration im Rückfaltungsansatz variiert, da diese eine entscheidende Rolle im Aggregationsprozess (viel Protein ♢ leichtere Aggregation) spielt. Es wurden Ansätze mit 25µg/ml und 100µg/ml an Proteinendkonzentration untersucht. Da die Temperatur einen enormen Einfluss auf die Reaktionsgeschwindigkeit der Faltung nehmen kann, wurden die Rückfaltungsansätze bei verschiedenen Temperaturen von 4°C, 20°C und 30°C inkubiert. Weiterhin war nicht bekannt, welchen Disulfidstatus das PlaB-Enzym besitzt, daher wurden Rückfaltungsexperimente in unterschiedlichen Redoxumgebungen zur eventuellen Bildung von Disulfidbrücken angesetzt, aber auch der Zustand unter ständiger Reduktion des Systems durch Zugabe von 5mM DTT untersucht. Polyethylenglycol (PEG) kann die Aggregation durch Bindung an die hydrophoben Bereiche der Faltungsintermediate verhindern, daher wurde das Agens im molaren Verhältnis von 2:1 und 4:1 zu PlaB in Puffern mit geringen Denaturierungsmittelkonzentrationen eingesetzt. Letztendlich wurde der Einfluss der divalenten Kationen CaCl2/MgCl2 zu je 2mM (ohne EDTA-Zusatz) und der eines natürlichen Substrates von PlaB (MPLPC in einer Endkonzentration von 3mM + 0,2% Triton X-100) untersucht.
Nach dem Erreichen der gewünschten Zelldichte (meist OD660=2) in den angezogenen Flüssigkulturen wurde 1ml Kulturvolumen entnommen und bei 5.000 × g für 5min abzentrifugiert. Anschließend wurden die Kulturüberstände von den Zellpellets getrennt. Die Kulturüberstände wurden mit einer finalen Konzentration von 3mM mit Natriumazid versetzt und bei 4°C gelagert. Die Zellpellets wurden bis zur Verwendung bei -20°C weggefroren. Die Zelllyse wurde durch Zugabe von 0,1 % Triton X-100 und 50μl Lysozym (10mg/ml) für 30min bei 37°C durchgeführt. Anschließend wurden die lysierten Zellpellets mit einer „26-gauge“ Kanüle homogenisiert und mit 40mM Tris-HCl pH 7,5 auf das Ausgangsvolumen (1ml) aufgefüllt.
↓61 |
1×106 ausdifferenzierte U937 Makrophagen wurden analog zu der in Abschnitt 3.2.14.2 beschriebenen Vorgehensweise mit einer MOI=1 infiziert. Nach den angegebenen Zeitpunkten wurden die Zellüberstände abgenommen und mit einem 0,2µm Filter steril filtriert. Die Zellen wurden in Anwesenheit von 200µl 40mM Tris pH 7,5 entweder durch wiederholtes Auf-und Abziehen durch eine Pipettenspitze oder durch Abschaben der Zellen mit einem, durch reinen EtOH desinfizierten, Metallspatel vom Wellboden abgelöst. Je 100µl wurden in 2 neue Reaktionsgefäße überführt, von denen ein Teil der Zellen bis zur RNA-Extraktion bei -20°C gelagert wurde, der andere durch 10-minütige Inkubation in einem Ultraschallbad lysiert und bis zur Bestimmung der phospholipolytischen Aktivität ebenfalls bei -20°C weggefroren wurde. Für den Verdau von Lipidsubstraten wurde das Zelllysat durch Zugabe von 40mM Tris-Puffer (s. Tabelle 3.5) wieder auf das Ausgangsvolumen der Infektion gebracht und unverdünnt in das Hydrolyseexperiment (3h Inkubation) eingesetzt.
Zur Untersuchung der lipolytischen Aktivität wurden verschiedene Substrate (s. Tabelle 3.4) mit L. pneumophila Zelllysaten und Kulturüberständen als auch Zelllysaten der U937 Infektion oder Überstände der plaB-Expression in P. pastoris inkubiert. Gleichermaßen wurden auch E. coli Zelllysate oder Fraktionen der Proteinreinigung behandelt. Hierzu wurden die Lipide mit einer Endkonzentration von 13,4 mM und unter Zusatz von 6mM NaN3, 1% Triton X-100 und 40mM Tris-HCl (pH 7,5, 25°C) angesetzt. Die Substrate wurden für 10min bei RT und anschließend für 30 min bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Zur Förderung der Mizellen-Bildung erfolgte eine Ultraschallbehandlung von jeweils drei 15sek andauernden Intervallen bei einer Intensität von 65 %. Danach wurden die Substrate in einem Verhältnis 1:1 mit den zu analysierenden Proben versetzt (je 25 μl) und variable Zeitspannen in einer 96-Loch-Mikrotiterplatte bei 37°C und 150 rpm oder 100rpm über Nacht inkubiert. Dabei richteten sich die Inkubationsdauer und die jeweiligen Verdünnungen nach den spezifischen experimentellen Bedinungen. Als Beispiel sei hier die Inkubationszeit und die Verdünnung von plaB-exprimierenden Vektoren (z. B. pJB04) in der L. pneumophila plaB Mutante vermerkt: Die 1:100 Verdünnung eines Zelllysates erreichte ihr Detektionsmaximum für DPPG-Hydrolyse unter Standardbedingung nach 30-45min Inkubationszeit bei 37°C.
Die Negativkontrollen der Kulturüberstände, BYE-Bouillon für L. pneumophila bzw. LB-Bouillon für E. coli, und 40mM Tris-Puffer für die Zellpelletlysate wurden stets mitgeführt und als Basiswert bei anschließenden Kalkulationen vom Probenwert subtrahiert. Bei Messungen der Phospholipaseaktivität von U937 Infektionsüberständen diente RPMI + 10% FKS als Hydrolysekontrolle. Im Anschluss an die Inkubation der Lipid-Proben-Suspension erfolgte die Bestimmung der Menge freigesetzter Fettsäuren.
↓62 |
Die durch lipolytische Enzymaktivitäten freigesetzten Fettsäuren konnten mit Hilfe des „Nefa C“ Kits der Firma Wako Chemicals nachgewiesen werden. Dies wurde nach den Angaben des Herstellers durchgeführt. Durch den im Kit enthaltenen Oleinsäurestandard wurde die Konzentration der freien Fettsäuren anhand einer Standardkurve mit Hilfe der folgenden Standardkonzentrationen 0/ 0,2/ 0,4/ 0,6/ 0,8 und 1,0 mM freie Fettsäuren, bestimmt.
Die Extraktion verschiedener Lipidspezies, z. B. aus der Zellmembran von Bakterien oder aus dem Lungengewebe von Meerschweinchen, erfolgte nach der Methode von Bligh und Dyer [29]. Hierzu wurde eine 100µl-Probe mit 400µl Methanol und 200µl Chloroform für 30min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden 280µl H2Obidest sowie 200µl Chloroform zugegeben und für eine gründliche Durchmischung der Phasen 10min bei Raumtemperatur auf dem Drehrad inkubiert. Danach wurde zur Phasentrennung 2min bei 2.000 × g zentrifugiert und die Chloroformphase (Lipidphase) in ein neues Reaktionsgefäß überführt und 1/3 unter Vakuum evaporiert. Der restliche extrahierte Ansatz und die lyophilisierten Lipide wurden bei -20°C gelagert. Die getrockneten Lipide wurden vor der Dünnschichtchromatographie in 25µl Chloroform/Methanol (2:1 v/v) aufgenommen und je 10µl auf Kieselgelplatten aufgetragen. Zur Detektion der polaren Lipide aus bakteriellen Zellmembranen wurde die beladene Kieselgelplatte in einen Glastank gestellt und mit einem polaren Laufmittel, bestehend aus n-Propanol:Propionsäure:Chloroform und H2O (30:20:20:10 (v/v/v/v), [67]) für 6h verschlossen inkubiert.
Bei der Verarbeitung von 50µl Lungengewebe aus Meerschweinchen wurden 2 zusätzliche Chloroformwaschschritte (mit je 100µl) vor der Evaporation eingefügt, um etwaige Reste vorhandener Lipide zu extrahieren. Die Chloroformphasen wurden vereinigt, je 50µl davon evaporiert, vollständig auf Kieselgelplatten aufgetragen und mittels 3 unterschiedlicher Laufmittel im Glastank entwickelt. Für polare Substanzen wurde ein Laufmittel, bestehend aus einem Chloroform:Methanol:Wasser-Gemisch [65:25:4 (v/v/v)], verwendet. Die Trennung apolarer Lipide erfolgte mittels einer Lösung an n-Hexan:Diethylether und Essigsäure [70:30:4 (v/v/v)], wohingegen die von Cholesterol und seiner veresterten Form mit Hilfe von Petrolether:Diethylether und Essigsäure [90:10:1 (v/v/v)] durchgeführt wurde. Zur Detektion der Lipide wurden die Kieselgelplatten kurz in Wasser gewaschen, anschließend für 10min mit 0,2% Naphtol Blauschwarz in 1M NaCl inkubiert und schließlich mit 1M NaCl gespült, bis die Lipidspots klar erkennbar waren [206]. Als Lipidreferenzen wurden je 2µl entsprechender Lipidlösungen (10mg/ml) mit auf die Kieselgelplatten aufgetragen.
↓63 |
In Anlehnung an Kirby und Mitarbeiter [150] wurden 37,5µl humane Erythrozyten in 10ml PBS für 5min bei 10.000 × g sedimentiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde zweimal in je 10ml PBS gewaschen und letztendlich in 10ml PBS-Puffer resuspendiert. Zu untersuchende Bakterien wurden für 1 Tag auf Platte (entweder BCYE- oder LB-Agarplatten mit entprechenden Antibiotikas) kultiviert und in PBS-Puffer auf eine OD660 von 0,3 eingestellt. Anschließend wurden 400µl der Blutzellsuspension mit 400µl der Bakterienlösung vermischt, 2min bei 16.000 × g pelletiert und bis zur Vermessung bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Bei den angegebenen Zeitpunkten (s. Ergebnisse) wurde die Suspension für 5sek stark geschüttelt (Vortexer), erneut abzentrifugiert und je 100µl in einer Mikrotiterplatte und bei einer Wellenlänge von 415nm (Absorptionsmaximum von Hämoglobin) vermessen. Als Lysekontrolle wurden anstelle der Bakterien 400µl Ethanol (100%) eingesetzt, als Negativkontrolle diente PBS-Puffer.
Zur Extraktion von LPS aus L. pneumophila wurde die Hälfte an Bakterienkultur einer dicht bewachsenen BCYEα-Agarplatte, die für 2 Tage bei 37°C bebrütet worden war, abgenommen und in 3ml PBS resuspendiert und zum Abtöten der Keime autoklaviert. Anschließend wurde die Suspension für 5min stark geschüttelt (Vortexer Mixer) und 25min bei 2500 rpm und 4°C abzentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und mit 12ml unvergälltem EtOH versetzt und über Nacht bei -20°C inkubiert. Erfolgte Präzipitate wurden für 15min bei 2500 rpm (4°C) sedimentiert und das entstandene Pellet für 2-3h bei RT getrocknet. Um DNA-Spuren zu entfernen, wurde das Pellet in 500µl PBS Puffer suspendiert und mit 25U Benzonase für 24h behandelt. An dieser Stelle wurde das Protokoll für eine Lagerungseinheit bei -20°C unterbrochen. Extrahiertes LPS wurde weiterhin durch Inkubation mit 100µg Proteinase K bei 56°C für 2h von Proteinkontaminationen befreit und anschließend durch Zugabe der gleichen Volumeneinheit (500µl) an 2× Proteinladepuffer für 30min bei 65°C erhitzt. Die so erhaltenen Proben wurden im Vergleich der Stämme Corby Wildtyp und der plaB Mutante plaB1 auf einem 12,5%igen SDS-Polyakrylamidgel mittels Silberfärbung untersucht.
A. castellanii Amöben wurden für 3 Tage in PYG-Medium bei 37°C + 5% CO2 kultiviert, anschließend durch Klopfen von der Kulturflasche gelöst und die Zellzahl in einer Neubauer Zählkammer durch Gegenfärbung mit Trypanblau bestimmt. Nach Zentrifugation wurden die Zellen in einer Dichte von 1×105 Zellen/ml in Infektionsmedium resuspendiert und je 1ml in die entsprechenden 24-well Reaktionsplatten gegeben.
↓64 |
Die 2 Tage bei 37°C auf BCYEα-Agar inkubierten L. pneumophila wurden mit einer sterilen Impföse in PBS überführt und auf eine OD660 von 0,3 (1-5×108 Zellen je ml) eingestellt. Die Suspension wurde anschließend 105-fach mit Infektionsmedium verdünnt und so auf eine Zellzahl von 1×103 Bakterien/ml gebracht. Das Verhältnis von Bakterien zu Amöben wird als MOI (multiplicity of infection) bezeichnet und entspricht in diesem Ansatz einem Wert von 0,01. Pro Zeitpunkt wurden zwei bzw. drei Parallelwerte koinfiziert. Die Probenentnahme erfolgte nach 0, 24, 48 und 72 Stunden, wobei 100µl abgenommen, der Inkubationszeit entsprechend verdünnt und 50µl zur Ermittlung der Bakterienzahl auf BCYEα-Agarplatten in logarithmisch abnehmender Menge ausplattiert wurden. Dies erfolgte unter Verwendung des „Whitley Spiral Plater“ der Firma Meintrup DWS. Anhand der Zählung der koloniebildenden Einheiten CFU (colony forming units) auf Platte mit Hilfe des Acolyte-Koloniezählgerätes konnte die Entwicklung der Zellzahl jedes getesteten Klons rekonstruiert werden. Dieses ist als Maßstab für die intrazelluläre Vermehrung der Legionellen anzusehen.
Neben der Gewinnung von Zelllysaten zur Überprüfung der phospholipolytischen Aktivität (s. 3.2.12.2) wurde auch die Vermehrung der Stämme in U937 Makrophagenzellen dokumentiert. Hierzu wurden die passagierten Monozyten (s. 3.2.2) 1 Tag vor der Infektion durch Zugabe von 50ng/ml Phorbol-Ester (Phorbol-12-Myristat-13-Azetat, PMA) zu phagozytierenden Makrophagen ausdifferenziert. Der nun adhärente Zellrasen konnte durch die Inkubation in 10ml 0,2% EDTA in 1×PBS für 5min bei 37°C und durch zusätzliches Klopfen vom Kulturschalenboden gelöst werden. Nach der Überführung in ein Plastikröhrchen wurde die Flasche mit RPMI-Medium ohne FKS-Zusatz gespült und das Zellvolumen auf 50ml aufgefüllt. Die Zellen wurden dann durch 2 Zentrifugationsschritte bei 800rpm für 10min in der Labofuge400 gewaschen. Nach erfolgter Zellzählung in einer Neubauer-Kammer wurden die Zellen mit einer Endkonzentration von 1×106 Zellen/ml in die jeweiligen Wells gegeben und zur erneuten Zelladhäsion für 2h bei 37°C/ 5% CO2 inkubiert.
Für die U937 Infektion wurden die Legionellen ähnlich vorbereit, wie es bereits beschrieben wurde (s. 3.2.14.1). Von der verdünnten Legionellen-Suspension (~2×106/ml) wurden 0,5 ml entnommen und zu den adhärenten U937 Zellen gegeben (MOI=1). Nach gemeinsamer Inkubation (2h/ 37°C/ 5 % CO2) wurden die Legionellen, die bis dahin nicht in die Wirtszellen eingedrungen oder an diese adhäriert waren, durch dreimaliges Waschen mit RPMI ohne FKS-Zusatz abgespült. Anschließend wurde 1ml RPMI mit 10% FKS zugegeben und die Infektion bis zu 96h inkubiert. Um zu überprüfen, wie sich die Bakterien intrazellulär vermehren, wurde die Koinfektion bei den angegebenen Zeitpunkten mit 10μl Saponin [Stocklösung: 10% (w/v) in PBS] versetzt und 5min bei 37°C/ 5%CO2 inkubiert. Dies führte zur Lyse der U937 Zellen und zur Freisetzung der Bakterien. Ein entsprechend verdünntes Aliquot konnte dann, wie bereits in 3.2.14.1 beschriebener Vorgehensweise, auf BCYEα-Agar ausplattiert werden.
↓65 |
Für die Bestimmung der Zytokinsekretion nach Legionelleninfektion von A549 Lungenkarzinom-Epithelzellen wurden die passagierten Zellen (s. 3.2.2) 1× mit PBS-Puffer gespült und anschließend durch das Einwirken von 1× Trypsin/EDTA vom Boden der Zellkulturflasche gelöst. Die Zellen wurden 2× mit RPMI ohne FKS-Zusatz bei 800rpm für 5min gewaschen, deren Zahl auf 1×105 Zellen/ml in Vollmedium (RPMI mit 10% FKS) eingestellt und je 1ml in die Löcher einer 24-Well-Platte gegeben. Nach 24h Inkubation wurden das Medium vom konfluenten Zellrasen entfernt und den Zellen durch Zugabe von 1ml RPMI ohne Zusätze wichtige Wachstumsfaktoren entzogen, damit sie besonders suszeptibel für die nachfolgende Infektion waren. Nach weiteren 20h Inkubation erfolgte die Infektion der A549 Zellen mit Legionellen mit einer MOI zwischen 10-100 (Vorgehensweise s. 3.2.14.1). Die Bakterien wurden für 15min bei 800rpm auf die Zellen zentrifugiert und für die angegebenen Zeiträume, 30min bis 23h, bei 37°C / 5% CO2 inkubiert. Anschließend wurde die Koinkubation erneut bei 200 × g für 10min sedimentiert, der Infektionsüberstand für die Messung der Zytokinsekretion abgenommen und mittels ELISA quantifiziert oder bei -20°C für weitere Experimente gelagert.
Männliche Meerschweinchen des Stammes Hartley (s. Tabelle 3.11), mit einem Gewicht von ca. 300g, wurden bis zur Infektionsoperation im Tierstall unter Quarantänebedingungen gehalten. Je drei Tiere wurden intratracheal mit einer Bakterienlast von 1-3×106 Legionellen der Stämme L. pneumophila Corby Wildtyp (pBCKS), der plaB Mutante plaB1 (pBCKS) und der Komplementante plaB1 (pJB04) infiziert. Die Bakterien wurden zuvor in BYE-Bouillon bis zur exponentiellen Phase kultiviert und auf die entsprechende Zellzahl in PBS-Puffer eingestellt. Ein zehntes Tier erhielt PBS ohne Bakterien und wurde fortan als Saline-Kontrolltier bezeichnet. Zur Bestimmung der Bakterienlast nach Infektion wurden die Meerschweinchen nach 48h mittels Kohlenstoffdioxid euthanasiert, die Lunge und die Milz entnommen, die Organe gewogen und in entsprechenden Mengen (100µl/100mg) an PBS-Puffer aufgenommen und homogenisiert (Homogenisator Ultra-Turrax T25). Anschließend wurden verschiedene Verdünnungen auf BCYE-Agarplatten ausplattiert, um die koloniebildenden Einheiten (CFU) zu zählen. Um zu überprüfen, ob die Legionellen die enthaltenen Plasmide verloren hatten, wurden einige Klone von den Platten gepickt und auf BCYE und BCYE/Cm-Agarplatten im Vergleich ausgestrichen und das Wachstum dokumentiert (s. Dissertation Schunder).
Für die Detektion und Quantifizierung der Zytokinsekretion von mit Legionellen infizierten A549 Lungenepithelzellen wurden Infektionsüberstände gewonnen (s. 3.2.14.3) und mit Hilfe der folgenden Verfahren auf das Vorhandensein von verschiedenen Immunstimulatoren untersucht.
↓66 |
Mit Hilfe des „Human Inflammation Antibody Array 3“ der Firma RayBio® wurde ein Screen auf 40 verschiedene Entzündungsfaktoren durchgeführt, der, nach Angaben des Herstellers, mit einem Minimum von z. B. 4pg/ml für MCP-1 entsprechende Faktoren detektieren kann. Antikörper gegen die verschiedenen Mediatoren waren jeweils in 2-fach Bestimmung auf der Membran enthalten und konnten nach dem Prinzip des „Sandwich-ELISA“ und einem Chemilumineszenzsignal am Chemiesmart3000-Gerät detektiert werden. Eine Übersicht der Faktoren ist in Abbildung 3.1 gezeigt. Die Durchführung richtete sich nach der Anleitung des Herstellers, wobei der gewonnene Infektionsüberstand (s. 3.2.14.3) unverdünnt oder in einer Verdünnung von 1:2 in Blockierungspuffer auf die vorher abgesättigte Membran gegeben und für 2h bei RT unter leichtem Schwenken inkubiert wurde.
Abbildung 3.1: Übersicht der 40, auf der Membran des „Human Inflammation Antibody Array 3“ der Firma RayBio®, enthaltenen Entzündungsfaktoren. | ||
Nach fünfmaligem Waschen mit 2 unterschiedlichen Puffern wurde die Primärantikörperlösung mit biotinkonjugierten Zytokinantikörpern für 2h bei RT geschwenkt. Es folgte ein weiterer Waschzyklus, dem sich eine Inkubation (2h RT) der Membran mit HRP-fusioniertem Streptavidin anschloss. Nach erneutem Waschen wurde die Membran umgehend mit Substratlösung inkubiert und die entstandene Chemilumineszenz mit einer CCD-Kamera aufgenommen. Mit der Bio1D Software (s. Tabelle 3.19) wurden die Spots anschließend densitometrisch und mit Hilfe der an den Assay angepassten „Human Inflammation Antibody Array III and 3.1 Analysis Tool“ Software rechnerisch ausgewertet.
↓67 |
Zur quantitativen Bestimmung der IL-8 Sekretion wurde ein „Enzyme-l inked Immunosorbent Assay“ (ELISA) der Firma BD Bioscience verwendet. Hierfür wurde hochreiner IL-8 Antikörper („Capture Antibody“) für ca. 24h an spezielle Immunomikrotiterplatten (s. Tabelle 3.2) gebunden. Nach Blockierung der freien Bindungsstellen mit im Kit enthaltenem Tierserum (1h RT) und dreimaligem Waschen mit detergenzhaltigem Waschpuffer erfolgte die Inkubation mit 100µl verdünnten Infektionsüberständen für 2h bei RT. Je nach MOI oder Molarität der Lysophospholipide mussten die Überstände 1:200 bis 1:400 in Tierserum verdünnt werden, die uninfizierte A549 Kontrolle wurde grundsätzlich 1:20 eingesetzt. Gereinigtes IL-8 Protein wurde als Standard zur Quantifizierung bei jedem Experiment mitgeführt. Anschließend wurden die Überstände abgenommen, die Wells 5× mit Waschpuffer gewaschen und je 100µl der Detektionslösung, biotinhaltiger Detektionsantikörper mit Strepavidin-HRP-Konjugat, zu den Ansätzen gegeben. Nach 1h Inkubation bei RT erfolgten 7 Waschschritte und die Farbentwicklung nach Zugabe der Substratreagenzien. Je nach Intensität wurde die Reaktion nach 10 – 30min durch Zugabe von 50µl phosphorsäurehaltiger Stopplösung terminiert und die Absorption der Wells bei einer Wellenlänge von 450nm ausgelesen.
Die Stämme L. pneumophila Corby (pBCKS), die plaB Mutante plaB1 (pBCKS) und die Komplementante plaB1 (pJB04) wurden auf BCYE-Agarplatten für 7 Tage bei 30°C kultiviert. Anschließend wurde eine Bakteriensuspension in PBS auf eine finale OD660 von 0,3 eingestellt und 500µl dieser Suspension für 5min bei 5.000rpm sedimentiert. Das Pellet wurde in 250µl einer 3%igen PFA-Lösung suspendiert und nach 10-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur mit 250µl PBS-Puffer vermischt und bei 4°C gelagert. Zur Immunfärbung wurden 30µl der Suspension auf einem Poly-L-Lysin beschichteten Objektträger angetrocknet und in PBS gewaschen. Die anschließende Absättigung unspezifischer Bindungsstellen erfolgte für 30min bei 37°C mittels 3% BSA in PBS, supplementiert mit 0,2% Tween 20 (PBS-T). Nach einem Waschschritt (10min) in PBS-T wurde der primäre Antikörper (anti-FlaA aus Kaninchen) in einer Konzentration von 1:500 (in PBS-T) für 30min bei 37°C zugegeben. Nach erneutem Waschen (3×5min), der Inkubation mit dem sekundären Antikörper anti-Kaninchen-Alexa488 (1:300 in PBS-T), und letzten Waschschritten (3×5min) wurde der Objektträger erneut getrocknet. Die Versiegelung erfolgte mit dem ProLong Antifade Reagenz, welches zusätzlich den Farbstoff DAPI enthielt. Nach Trocknung der Proben über Nacht bei Raumtemperatur wurden die Ansätze am Fluoreszenzmikroskop ausgewertet.
Für die Untersuchung der Membranzusammensetzung mittels FT-IR Spektroskopie wurden L. pneumophila Corby und die plaB Mutante plaB1 entweder in Flüssigkultur (OD660 1,0) oder auf Platte (48 – 144h) kultiviert. Hierzu wurde 1 Impföse Bakterienmaterial von den Mutterplatten entnommen und in 1ml H2Obidest suspendiert. 500µl der Suspension wurden dann auf frische BCYEα-Agarplatten ausplattiert und bei 37°C inkubiert. Nach den angegebenen Zeitpunkten (s. Ergebnisteil) wurde etwas Zellmaterial in 80µl steriles H2O eingerieben und 35µl der Suspension auf ein infrarottransperables Probenrad aus Zinkselenid aufgetragen. Durch das Anlegen eines Vakuums von 66mbar im Exikator erfolgte über dem Trocknungsmittel Sicapent die Lyophilisierung der Proben. Der getrocknete Bakterienfilm auf dem Probenrad wurde dann mit einer Deckscheibe aus KBr (wasserlöslich) verschlossen und in das Spektrometer eingesetzt. Die verschiedenen Probenpositionen wurden jeweils gegen eine Negativkontrolle (Probenradposition ohne Bakterien) gemessen. Die Aufzeichnung des Interferogramms unter Verwendung des IF28/B-Spektrometer und des Programmes Opus erfolgte in einem Frequenzbereich von 3000 – 500 cm-1 und wurde anschließend durch Fourier-Transformation in das dargestellte Spektrum umgewandelt. Diese stellen so den negativen dekadischen Logarithmus des Absorptionsspektrums in absorbance units dar, der gegen die Messwellenlänge aufgetragen wurde.
© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme. | ||
DiML DTD Version 4.0 | Zertifizierter Dokumentenserver der Humboldt-Universität zu Berlin | HTML-Version erstellt am: 25.08.2010 |