Jennifer Bender: Biochemische und funktionelle Charakterisierung der zell-assoziierten Phospholipase A, PlaB, von Legionella pneumophila
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Biochemische und funktionelle Charakterisierung der zell-assoziierten Phospholipase A, PlaB,
von Legionella pneumophila
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie
eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin
Von
Dipl.-Biol. Jennifer Bender
4.8.1979, Nürnberg
Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Dr. h.c. Christoph Markschies
Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Lutz-Helmut Schön
Gutachter:
1. Prof. Dr. Erwin Schneider, Humboldt-Universität zu Berlin
2. PD Dr. Antje Flieger, Robert Koch-Institut, Wernigerode
3. PD Dr. Klaus Heuner, Robert Koch-Institut, Berlin
Tag der mündlichen Prüfung: 10. 12. 2009
Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit vom 1.12.2005 bis zum 30.09.2009 unter Anleitung von Herrn Prof. Dr. Erwin Schneider am Institut für Biologie der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Humboldt-Universität zu Berlin und im Labor von Frau PD Dr. Antje Flieger am Robert Koch-Institut durchgeführt.
Inhaltsverzeichnis
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1 Zusammenfassung
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2 Einleitung
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2.1 Die Rolle von Legionella pneumophila als Krankheitserreger
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2.1.1 Entdeckung von L. pneumophila
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2.1.2 Mikrobiologie und Ökologie
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2.1.3 Legionellose – Pathogenese, Diagnostik und Therapie
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2.1.4 Epidemiologie und Prävention
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2.2 Lebenszyklus und Virulenzfaktoren von Legionella Bakterien
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2.3 Phospholipasen und Pathogenität
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2.3.1 Eigenschaften und Klassifizierung von Phospholipasen
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2.3.2 Faltung und Wirkmechanismus von Phospholipasen
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2.3.3 Phospholipasen als bakterielle Virulenzfaktoren
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2.3.3.1 Phospholipasen als Virulenzfaktoren von extrazellulären Bakterien
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2.3.3.2 Phospholipasen als Virulenzfaktoren von intrazellulären Bakterien
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2.4 Immunabwehr einer Legionelleninfektion
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2.5 Ziel der Arbeit
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3 Material und Methoden
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3.1 Material
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3.1.1 Laborausstattung
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3.1.2 Spezielle Materialien
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3.1.3 Chemikalien
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3.1.4 Lipidsubstrate
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3.1.5 Puffer und Lösungen
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3.1.6 Enzyme, Standards, Antikörper
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3.1.7 Analyse-Kits
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3.1.8 Plasmide, Oligonukleotide, Bakterienstämme und Zellen
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3.1.8.1 Verwendete Plasmide
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3.1.8.2 Verwendete Oligonukleotide und Sonden
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3.1.8.3 Verwendete Bakterien, Zellen und Versuchstiere
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3.1.9 Verwendete und erzeugte gentechnisch veränderte Organismen (GVO)
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3.1.10 Kulturmedien für Bakterien und Zellen
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3.1.11 Verwendete Software
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3.2 Methoden
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3.2.1 Anzucht von Bakterien und Hefen
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3.2.2 Anzucht von A549 Lungenepithelzell-, U937 Makrophagen- und Acanthamoeba- Zellkulturen
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3.2.3 Isolierung von Nukleinsäuren
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3.2.3.1 Isolierung von chromosomaler DNA aus Lungengewebe
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3.2.3.2 Isolierung von chromosomaler DNA aus P. pastoris
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3.2.3.3 Isolierung von extrachromosomaler DNA
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3.2.3.4 RNA-Isolierung
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3.2.4 Fällung von Nukleinsäuren mittels EtOH
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3.2.5 Nukleinsäure-Gelelektrophorese
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3.2.6 Modifikation von Nukleinsäuren
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3.2.6.1 Verdau mit Restriktionsendonukleasen/Dephosphorylierung
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3.2.6.2 Ligation von DNA Fragmenten
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3.2.6.3 Polymerase Kettenreaktion (PCR)
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3.2.6.4 Einfügen von Punktmutationen mittels „Combined Chain Reaction“ (CCR)
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3.2.6.5 Real-time Polymerase Kettenreaktion
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3.2.6.6 Reverse Transkriptase –Polymerase Kettenreaktion
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3.2.6.7 Sequenzierung-Polymerase Kettenreaktion
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3.2.7 Herstellung und Transformation von elektrokompetenten Zellen
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3.2.7.1 Herstellung elektrokompetenter E. coli
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3.2.7.2 Herstellung elektrokompetenter L. pneumophila
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3.2.7.3 Herstellung elektrokompetenter P. pastoris
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3.2.7.4 Transformation von DNA
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3.2.8 Transfektion von A549 Zellen
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3.2.9 Test auf bakterizide Eigenschaften von PlaB
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3.2.10 Proteinanalytik
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3.2.10.1 Fällung von Proteinen mittels TCA-EtOH
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3.2.10.2 Bestimmung der Proteinkonzentration
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3.2.10.3 Eindimensionale (1D) - SDS-PAGE
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3.2.10.4 Western Blot und Immundetektion
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3.2.11 Expression und Reinigung von Proteinen
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3.2.11.1 Proteinexpression in E. coli
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3.2.11.2 Proteinexpression in P. pastoris
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3.2.11.3
In vitro Translation
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3.2.11.4 Reinigung mittels Ionentausch- und Affinitätschromatographie
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3.2.11.5 Reinigung und Solubilisierung von „inclusion bodies“
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3.2.11.6 Rückfaltung von PlaB
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3.2.12 Nachweis von Phospholipaseaktivität
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3.2.12.1 Gewinnung von Zellpelletlysaten und Kulturüberständen
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3.2.12.2 Gewinnung von U937 Zelllysaten und Überständen
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3.2.12.3 Verdau von Lipidsubstraten
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3.2.12.4 Bestimmung der Menge an freien Fettsäuren
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3.2.12.5 Lipidextraktion und Dünnschichtchromatographie
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3.2.12.6 Hämolyseassay
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3.2.13 Extraktion von Lipopolysaccharid (LPS)
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3.2.14 Koinfektion von A. castellanii Amöben, A549 Lungenepithelzellen und U937 Makrophagen mit L. pneumophila
Corby
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3.2.14.1 Test der intrazellulären Vermehrungsfähigkeit in A. castellanii
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3.2.14.2 Infektion von U937 Makrophagenzellen
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3.2.14.3 Infektion von A549 Lungenepithelzellen zur Bestimmung der Zytokinsekretion
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3.2.15 Infektion von Meerschweinchenlungen
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3.2.16 Bestimmung der Zytokinsekretion von infizierten A549 Zellen
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3.2.16.1
Screening auf Zytokinsekretion mittels des „Human I
nflammation Antibody Array 3“
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3.2.16.2 Quantifizierung der Zytokinsekretion mittels ELISA
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3.2.17 Immunfluoreszenzmikroskopie
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3.2.18 FT-IR Spektroskopie
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4 Ergebnisse
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4.1 Biochemische Analyse von L. pneumophila PlaB
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4.1.1 Biochemische Eigenschaften von PlaB
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4.1.1.1 Das PlaB-Protein
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4.1.1.2 Konstruktion des Komplementationsvektors pJB04
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4.1.1.3 Lipidhydrolyse-Profil von PlaB
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4.1.1.4 Selektivität gegenüber Variationen in der Fettsäurekettenlänge
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4.1.2 Sequenzhomologie von PlaB und PlaB-ähnlichen Proteinen
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4.1.3 Bestimmung der katalytisch relevanten Aminosäuren von PlaB
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4.1.3.1 ‚Site-directed mutagenesis’ von PlaB
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4.1.3.2 Lipolytische Aktivität von PlaB-Mutanten
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4.1.3.3 Hämolytische Aktivität von PlaB-Mutanten
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4.1.4 Relevanz des C-Terminus
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4.1.5 Expression und Reinigung von PlaB
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4.1.5.1 Expression in L. pneumophila
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4.1.5.2 Expression in E.coli
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4.1.5.3 Expression in P. pastoris
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4.1.5.4
In vitro Translation und Transfektion
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4.2 Verbreitung von PlaB
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4.2.1 Lipolytische Aktivität klinischer Isolate von L.
pneumophila
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4.2.2 Vorkommen von PlaB-Enzymen in nicht-pneumophila Legionellenstämmen
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4.2.2.1
plaB-Gene im Genom von L. gormanii und L. spiritensis
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4.2.2.2 Lipolytische und hämolytische Aktivität von L. spiritensis PlaB
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4.3 Funktionelle Analyse von PlaB
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4.3.1 Beeinflussung der Viabilität von L. pneumophila durch PlaB-Aktivität
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4.3.2 Untersuchungen zur LPS-Zusammensetzung
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4.3.3 PlaB als Bakteriozin
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4.3.4 Untersuchung der intrazellulären Vermehrung und lipolytischer Aktivität von L.
pneumophila plaB Mutanten in Zellkultur
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4.3.5 Untersuchung zur intrazellulären Vermehrung der L.
pneumophila plaB Mutante nach Meerschweincheninfektion
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4.3.5.1 Bestimmung der Bakterienlast in Meerschweinchenlungen und Milz
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4.3.5.2 Untersuchungen zur veränderten Lipidzusammensetzung der Lungenproben nach Legionelleninfektion
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4.3.6 Beeinflussung der Zytokinexpression durch PlaB
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4.3.6.1
„
Screening
“ auf veränderte Zytokinexpression nach Infektion von A549 Lungenepithelzellen
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4.3.6.2 Quantifizierung der Zytokinsekretion mittels „Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)“
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4.3.6.3 Untersuchung zum Einfluss von PlaB auf die Flagellenexpression
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5 Diskussion
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5.1 Identifizierung wichtiger Aminosäuren und Proteindomänen für die lipolytische Aktivität von PlaB
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5.1.1 PlaB und Homologe, eine neue Familie von Phospholipasen
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5.1.2 Hydrolyse von Phosphatidylcholin als wichtiger Bestandteil der Virulenz
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5.2 Die Bedeutung von PlaB für Legionella pneumophila
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5.2.1 PlaB als Werkzeug für verbesserte Umgebungs- und/oder Wirtsadaptation
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5.2.2 Veränderung der zellulären Immunantwort als Mechanismus für gesteigerte Virulenz
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5.2.3 PlaB als Bakteriozin?
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6 Ausblick
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Selbstständigkeitserklärung
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Danksagung
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Abkürzungsverzeichnis
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7 Literaturverzeichnis
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8 Anhang
Tabellen
Bilder
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DiML DTD Version 4.0 | Zertifizierter Dokumentenserver der Humboldt-Universität zu Berlin | HTML-Version erstellt am: 25.08.2010 |