3. Material und Methoden

Porphyrine bestehen aus vier Porphyrinringen mit unterschiedlichen Metallen als Zentralion. Die Wirkung der jeweiligen Porphyrine hängt, wie in Kapitel 1.4.2 bereits erläutert, maßgeblich von seinem Zentralion ab.

Zur Induktion der HO-1 Expression wurde hauptsächlich das synthetisch hergestellte Cobalt-Protoporphyrin IX (CoPP) verwendet. CoPP wird als sehr potenter HO-1 Induktor beschrieben und kommt in zahlreichen Tiermodellstudien zum Einsatz. Neben CoPP wurde zudem das Porphyrin Hämin verwendet (verdünnt im verwendeten Medium (RPMI komplett)).

In der Klinik wird Hämin bei der Behandlung von akuten Porphyrie-Schüben verwendet. Porphyrie ist eine erbliche Stoffwechselkrankheit, bei der die Synthese von Hämprotein gestört ist und es zu einer Anreicherung von verschiedenen Vorstufen kommen kann. Durch den Einsatz von Hämin kommt es zu einer Feedback-Reaktion bei der die Neusynthese von Hämproteinen gehemmt wird.

Tab. 1 Funktion der verwendeten Stimulantien

Die zur Analyse der unterschiedlichen intrazellulären Signalwege verwendeten Inhibitoren werden im Folgenden kurz erläutert.

Tab. 2 Die verwendeten Inhibitoren und ihre Funktion

Vollblut besteht, wie in Abb. 9 dargestellt, zu ~56% aus Plasma und zu ~44% aus den zellulären Bestandteilen. Diese setzen sich auch Leukozyten, Erythrozyten und Thrombozyten zusammen. Während die Erythrozyten hauptsächlich für den Sauerstofftransport und die Thrombozyten die bei der Blutgerinnung eine wichtige Rolle spielen, sind die Leukozyten maßgeblich für die Immunabwehr von Bedeutung.

	Abb. 9 Zusammensetzung Vollblut

Für die Aufreinigung humaner PBMCs (Peripheral Blood Mononuclear Cell) wurden frisch isolierte humane Leukozyten verwendet. Zur Gewinnung der Primärzellen wurde gesunden Probanden mittels Monovetten (0,105M Tri-Natriumacetat als Gerinnungshemmer, Sarstedt) oder Vacutainern (0,105M Tri-Natriumacetat als Gerinnungshemmer, BD Bioscience) venöses, peripheres Vollblut entnommen und aufgearbeitet.

Für die Separation von Monozyten wurde sowohl frisches Vollblut als auch Buffy Coats aus der Eigenblutspende der Charité verwendet.

Als Buffy Coat bezeichnet man die Fraktion der Vollblutspende, welche nach Zentrifugation des Vollblutbeutels (Komponententrennung, Vollblutbeutel enthält als gerinnungshemmende und stabilisierende Wirkstoffe 26,3 g Natriumcitrat-Dihydrat, 3,27 g Citronensäure-Monohydrat, 25,8 g Glucose-Monohydrat, 2,51 g Natrium-Dihydrogenphosphat-Dihydrat) und Abnahme des Plasma- und Erythrozytenanteils übrig bleibt. Der Buffy Coat beinhaltet demnach Leukozyten, Thrombozyten und einen Teil der Erythrozyten.

Sowohl die Entnahme des venösen, peripheren Vollblutes mittels 3-fach-Beutelsystem als auch die Präparation der Buffy Coats wurde von den Schwestern der Eigenblutspende durchgeführt.

Für die anschließende Präparation der Zellen und der Zellkultur wurden ausschließlich endotoxinfreie Medien und Reagenzien verwendet.

Zur Auftrennung der PBMCs  von den restlichen Blutkomponenten wurden 15ml Biocoll in ein 50ml Falkonröhrchen vorgelegt, vorsichtig mit verdünntem (1:3 mit PBS) Vollblut bzw. Buffy Coat überschichtet und 20min bei 900g bei minimaler Beschleunigung und ohne Bremse zentrifugiert. Durch die Zentrifugation trennen sich die mononukleären Zellen (MNC) vom Plasma, von den Erythrozyten und von den Granulozyten. Die MNCs, zu denen Monozyten, B-Zellen, T-Zellen und NK-Zellen gehören, sind nach der Zentrifugation als dünne intermediäre Schicht zwischen Plasma und Biocoll sichtbar und können mittels einer Pasteurpipette separiert werden. Um eventuelle Biocoll- und Plasmarückstände zu entfernen, wurden die Zellen anschließend zweimal mit PBS gewaschen (Zentrifugation: 300g 10min). Nach dem 2. Waschschritt wurde das Pellet mit Medium (25-50ml) resuspendiert, ein weiteres mal zentrifugiert (10min, 270g) und je nach Zellzahl in 1-5ml Medium (RMPI komplett) aufgenommen.

Es wurden zwei verschiedene Aufreinigungsmethoden verwendet. Zum einen die Positivseparation mittels magnetisch-markierter Antikörper und zum anderen die Negativseparation mit einem Antikörpergemisch, durch den es zu einer Rosettenbildung zwischen markierten Zellen und Erythrozyten kommt, welche mittels Dichtegradientenzentrifugation entfernt werden können. Die magnetische Positivseparation bietet eine hohe Reinheit der Zellen (Monozyten: mind. 90% Reinheit [73] ), jedoch sind die gewonnenen Zellen mit einem Antikörper markiert. Die Reinheit der durch Negativseparation gewonnen Zellen war etwas niedriger (Monozyten: durchschnittlich 86% Reinheit), es zeigte sich jedoch, dass die langfristige Viabilität der unmarkierten Zellen tendenziell besser war. Daher wechselten wir bei längeren Inkubationdauern von der anfänglich verwendeten Positivseparation mittels magnetisch-markierten Antikörper zu der Negativseparation mit Hilfe des RosetteSep Monocyte Enrichment Cocktails.

Mit Hilfe von magnetisch markierten spezifischen Antikörpern (Beads), ferromagnetischen Säulen und einem Magneten können die jeweiligen Zellpopulationen der aufgereinigten MNCs von einander getrennt werden. Für die Isolation der Monozyten wurden CD14-spezifische Beads, für die Isolation von B-Zellen CD19-spezifische Beads und für die Isolation von T-Zellen CD3-spezifische Beads verwendet.

Die jeweiligen Beads wurden nach Herstellerangaben (Miltenyi Biotec) mit 20µl / 10⁷ Zellen / 100µl MACS-Puffer (PBS + 2% FCS) eingesetzt und der Ansatz für 15min bei 4-8°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit ~40ml kaltem (4-8°C) MACS-Puffer gewaschen und das durch Zentrifugation (10min, 250g, 4°C) gewonnene Zellpellet in 500µl kaltem MACS-Puffer resuspendiert. Das Volumen richtet sich hierbei nach der Zellzahl, wobei maximal ~ 5x10⁸ Zellen in 500µl MACS-Puffer pro LS-Säule eingesetzt wurden. Zur Vorbereitung der verwendeten LS-Säulen wurden diese in den Magneten gehängt und mit 3ml kaltem MACS-Puffer äquilibriert. Anschließend wurde die Zellsuspension mittig auf die Säule pipettiert und dreimal mit 3ml kalten MACS-Puffer gewaschen. Dabei bleiben die markierten Zellen auf der Säule hängen, während alle nicht markierten Zellen durchlaufen. Um die markierten Zellen zu eluieren wurde die Säule aus dem Magneten entfernt, über ein 15ml Falkonröhrchen platziert und die Zellen mit 5ml kaltem MACS-Puffer und mit Hilfe des Stempels aus der Säule gedrückt, in Medium (RPMI komplett) aufgenommen und gezählt.

Mit Hilfe eines Antikörpergemisches (RosetteSep Monocyte Enrichment Cocktail, Stem Cell Technologie) können die Monozyten direkt aus dem Vollblut gewonnen werden. Der kommerziell erhältliche Cocktail enthält einen Mix aus monoclonalen Antikörpern, welche spezifisch gegen die Zelloberflächenantigene der unerwünschten Zellen (CD2, CD3, CD8, CD19, CD56, CD66b), sowie gegen Glycophorin A auf Erythrozyten sind. Durch den Antikörpercocktail werden die nicht benötigten Zellen mit den Erythrozyten vernetzt, so dass sich sogenannte Immunrosetten bilden, die mittels Dichtegradientenzentrifugation von den unmarkierten Monozyten getrennt werden können.

Pro ml Vollblut wurden 20µl Antikörpercocktail direkt zum Vollblut gegeben und nach 20minütiger Inkubation bei RT das Blut 1:3 mit Rosette-Puffer (PBS + 2% FCS + 1mM EDTA) verdünnt. Anschließend wurden die Monozyten mittels Dichtegradientenzentrifugation (20min, 1200g, minimale Beschleunigung und ohne Bremse) isoliert. Die so gewonnenen Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen (Zentrifugation 10min, bei 300g), in Medium (RPMI komplett) aufgenommen und gezählt. 

Um die Zellzahl zu bestimmen wurden die Zellen mit Hilfe einer Neubauerzählkammer unter dem Lichtmikroskop ausgezählt. Es wurden die an den Ecken des Zählfeldes gelegenen vier Großquadrate, bestehend aus 16 kleineren Quadraten, ausgezählt.

Zur Zählung wurden aus der Gesamtzellsuspension 10µl entnommen, in ein 0,5ml-Eppendorfgefäß überführt und mit 3% Essigsäure so verdünnt, dass die zu zählende Zellzahl über 1x10⁶ Zellen/ml lag. Die zur Zählung verwendete Essigsäure degradiert die Zellmembran von Erythrozyten, so dass diese platzen und bei der Zellzählung nicht stören.

Die Formel zur Berechnung der Zellzahl pro ml lautet wie folgt:

Das Einstellen der gewünschten Zellzahl erfolgte, wenn nicht anders angegeben, mit Medium (RPMI komplett).

Die aufgereinigten Zellen wurden in Medium (RPMI komplett) aufgenommen und mit einer Endkonzentration von 2x10⁶ Zellen/ml in die jeweilige Zellkulturplatte überführt. In 48-Loch-Zellkulturplatten wurde pro Vertiefung ein Endvolumen von 500µl Zellsuspension (inkl. Stimulus) verwendet, was einer Zellzahl von 1X10⁶ Zellen/Ansatz entsprach. In 96-Loch-Zellkulturplatten wurde ein Endvolumen von 200µl pro Vertiefung verwendet (0,4x10⁶ Zellen/Ansatz).

Bei allen Ansätzen wurden ausschließlich endotoxinfreie Medien und Lösungen verwendet.

Zur Induktion der HO-1 Expression wurden die Zellen 15h mit 30µM CoPP, bzw. mit 30µM Hämin bei 37°C, 5% CO₂ und 95% Luftfeuchtigkeit inkubiert. Die Stocklösungen von CoPP [2mM] und Hämin [20mM] wurden in Medium (RPMI komplett) verdünnt. Die Kontrollen enthielten nur Medium (RPMI komplett). Die eingesetzte Konzentration von CoPP entsprach der höchstmöglichen, nicht toxischen Konzentration (Zellviabilität überprüft mittels Trypanblau-Färbung), bei der eine maximale HO-1 Expression zu detektieren war. Wenn nicht anders angegeben, wurden die Versuche mit den oben genannten CoPP- und Hämin-Konzentrationen und einer 15-stündigen Präinkubation durchgeführt. Bei Abweichungen wird dies in der Legende des jeweiligen Experimentes beschrieben.

Um die verwendeten Porphyrine nach der Präinkubation wieder zu entfernen, wurden die Zellen drei Mal mit Medium (RPMI komplett) gewaschen. Bei einer Inkubation in einer 96-Loch-Zellkulturplatte wurde das Volumen entsprechend reduziert und die Waschschritte auf fünf Wiederholungen erhöht (Zentrifugation 5min bei 250g). Anschließend wurde das Volumen wieder auf die ursprüngliche Menge aufgefüllt und die Zellen weitere 24h mit dem jeweiligen Stimulus bei 37°C, 5 % CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit inkubiert.

Die verwendeten Inhibitoren wurden in der Regel zusammen mit CoPP und Hämin zu den Zellen gegeben.

Zum Blockieren von CD163 (Hämoglobin-scavenger Rezeptor) wurde der anti-CD163 Antikörperklon EDHu-1 verwendet. Um ein optimales Blockieren des Rezeptors zu gewährleisten wurden die Zellen (4,4x10⁵ Zellen/200µl) 30min mit dem Antikörper im Brutschrank (37°C, 5% CO₂, 95% Luftfeuchtigkeit) vorinkubiert, bevor sie für 15h mit CoPP bzw. Hämin inkubiert wurden.

Die verschiedenen Stimulantien und Inhibitoren wurden mit den in Tab. 3 aufgelisteten Endkonzentrationen eingesetzt. Dabei erfolgte die Verdünnung immer in Medium (RPMI komplett). Die eingesetzten Konzentrationen sind zudem in der jeweiligen Legende des Experimentes aufgeführt.

Tab. 3 Die verwendete Stimulantien und Inhibitoren

Die Durchflusszytometrie (FACS = Fluorescence associated cell sorter) ermöglicht die Unterscheidung verschiedener Zellpopulationen in einer wässrigen Lösung. Die Messung erfolgte am FACS-Calibur (BD Biosciences, Heidelberg) mit der zugehörigen Cellquest-Software.

Das Prinzip der Durchflusszytometrie beruht auf der Messung unterschiedlicher optischer Signale (Lichtstreuung und Fluoreszenzsignale) einzelner Zellen bzw. Partikel. Monochromatisches Licht, welches auf ein Partikel oder eine Zelle trifft, wird in Vorwärts- und Seitwärtsrichtung gestreut. Das Ausmaß der Vorwärtsstreuung (FCS; Lichtbeugung) gibt dabei Aufschluss über die Granularität der Zelle und die Seitwärtsstreuung (SSC; Lichtbrechung) über die Zellgröße. Das zweite messbare optische Signal ist die Fluoreszenz. Diese entsteht wenn ein Atom oder Molekül ein Photon höherer Energie absorbiert und später ein Photon niederer Energie emittiert. Verbindungen, die dazu in der Lage sind, nennt man Fluorochrome. Der Frequenzbereich, der eine fluoreszierende Verbindung anregen kann, entspricht dem Absorptionsspektrum und die abgegebene Fluoreszenz dem Emissionsspektrum des jeweiligen Fluoreszenzfarbstoffs.

Das FACS-Calibur besitzt zwei luftgekühlte Laser, welche monochromatisches Licht mit 488nm und 633nm Wellenlänge aussenden. Die Anordnung der Laser und Fluoreszenzdetektoren ist in Abb. 10 dargestellt. Die “Light Scatter Diode” detektiert das Vorwärtsstreulicht (FCS) und der „90 degree Light Scatter“ das Seitwärtsstreulicht (SSC). Die vier Fluoreszenzdetektoren (FL1-FL4) detektieren die, von den angeregten Farbstoffen (Fluorochrome) ausgesendeten verschiedenen Emissionswellenlängen. Die aufgenommenen Signale werden von der Cellquest-Software in einem X-Y-Graphen visualisiert, so dass Zellunterschiede auf Grund ihrer Größe, Granularität und Antikörpermarkierung (Fluoreszenz) sichtbar werden.

	Abb. 10 Anordnung der Laser und Fluoreszenzdetektoren im FACSCalibur
	FACSCalibur optical Pathway, www.niaid.nih.gov

Zur genauen Unterscheidung verschiedener Zellpopulationen wurden die Zellen mit spezifischen Antikörpern gegen Oberflächenantigene oder intrazelluläre Proteine markiert. Die Antikörper sind dabei mit verschiedenen Fluorochromen markiert und können so durch ihre Fluoreszenz detektiert und unterschieden werden.

Die verwendeten Fluorochrome mit ihren entsprechenden Emissionsspektren sind in folgender Tabelle aufgeführt:

Tab. 4 Die verwendeten Fluorochrome und ihr jeweiliges Emissionsspektrum

Bei der Unterscheidung verschiedener Zellpopulationen macht man sich zu Nutze, dass diese jeweils spezifische Oberflächenmarker aufweisen, mit denen die einzelnen Zelltypen unterschieden werden können. So lassen sich Monozyten durch ihre Größe und ihre Granularität, aber auch durch die Expression des PRR CD14 differenzieren. T-Zellen unterscheiden sich von den anderen Zelltypen durch die Expression des T-Zell-Corezeptors CD3, welcher sowohl von CD4-positiven als auch CD8-positiven T-Zellen exprimiert wird. Der für B-Zellen typische Oberflächenmarker ist CD19, ein Corezeptor des B-Zell-Rezeptors.

Mit Hilfe eines Antikörpergemisches (Diff-Mix), welcher spezifische Antikörper gegen die jeweiligen Oberflächenmarker der verschiedenen Zelltypen enthält, lassen sich die unterschiedlichen Zellpopulationen von einander diskriminieren.

Für die Markierung (Färbung) der Zellsubtypen wurden 50µl Zellsuspension [1x10⁶ Zellen/ml] mit 10µl Antikörper-Mix für 30min bei 4-8°C im Dunkeln in einem Micronic-Röhrchen inkubiert. Um ungebundene Antikörper zu entfernen wurde die Zellsuspension in 1ml FACS-Puffer resupendiert und anschließend zentrifugiert (5min, 250g, RT). Der Überstand wurde, bis auf ein Restvolumen von ca. 100µl, abgesaugt und die Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert.

In folgender Tabelle findet sich eine Auflistung der im Antikörper-Mix (Diff-Mix) zur Differenzierung verschiedener Zellpopulationen enthaltenen Antikörper.

Tab. 5 Antikörper-Mix (Diff-Mix) zur Differenzierung verschiedener Zellpopulationen

Die Leukozyten wurden zunächst an hand ihrer CD45-Expression identifiziert und anschließend die Zellsubtypen mittels CD3, CD19, CD2 und CD16 diskriminiert. In Abb. 11A sind die verschiedenen PBMC-Zellpopulationen zu erkennen. Die CD19 positiven, aber CD2 und CD16 negativen B-Zellen lassen sich dabei gut von den CD3 und CD2 positiven T-Zellen unterscheiden. Zudem können die CD2 und CD16 positiven NK-Zellen diskriminiert werden, die im Gegensatz zu T-Zellen, kein CD3 exprimieren. Monozyten sind negativ für CD3, CD19 und CD2 und exprimieren wenig CD16 und lassen sich daher in dieser Darstellung schwieriger abgrenzen. Nach der Monozyten-Aufreinigung können jedoch eventuelle Verunreinigungen mit anderen Zelltypen erkannt werden (Abb. 11B). Eine eindeutige Diskriminierung der Monozyten ist mit Hilfe ihrer CD14-Expression und ihrer Granularität möglich. In der Abb. 8C sind PBMC dargestellt, wobei die untere Population alle CD14 negativen Zellen (B-Zellen, T-Zellen, NK-Zellen) zeigt. Von diesen Zellen lassen sich gut die granuläreren CD14-positiven Monozyten unterscheiden, die in der oberen Bildhälfte zu erkennen sind. Vor der Separation enthalten PBMC ca. 5-10% Monozyten (Abb. 11C). Nach der Aufreinigung mit MACS oder RosetteSep bleiben, wie in Abb. 8D gut zu erkennen, die CD14-positiven Monozyten (Abb. 11D) übrig.

In allen mit aufgereinigten Monozyten durchgeführten Experimenten lag die Reinheit der Monozyten bei durchschnittlich 86%. (Verunreinigung mit B-Zellen unter 1%).

	Abb. 11 FACS-Färbung von PBMCs (A) und separierten Monozyten (B)
	1x106 PBMCs bzw. Monozyten in einem Volumen von 50µl wurden 30min mit 10µl Diff-Mix bei 4-8°C inkubiert, anschließend mit FACS-Puffer gewaschen und mittels Durchflusszytometrie analysiert.

Zunächst wurden die kultivierten Zellen mittels kaltem PBS aus der Zellkulturplatte gelöst und in ein Micronic-Röhrchen überführt. Um sicherzustellen, dass alle Zellen abgelöst wurden (Kontrolle mittels Mikroskop), wurde jede Vertiefung mindestens 3x mit eiskaltem PBS gespült. Anschließend wurden die Zellen 5min bei 250g und RT abzentrifugiert und der Überstand bis auf ca. 50μl abgenommen.

Die aus den Zellkulturplatten gelösten und in Micronic-Röhrchen überführten Zellen (96-Loch-Zellkulturplatte: 0,4x10⁶ Zellen; 48-Loch-Zellkulturplatte: 1x10⁶ Zellen) wurden abzentrifugiert (5min, 250g, RT) und der Überstand bis auf ca. 50µl abgesaugt. Anschließend wurden die Zellen in dem verbleibenden Volumen resuspendiert und mit einem Antikörpermix aus 5µl anti-CD14-APC/Ansatz und 5µl anti-HLA-DR-PE/Ansatz gemischt. Der Färbeansatz wurde 30min im Dunkeln bei 4-8°C inkubiert. Um überschüssige Antikörper zu entfernen wurden die Zellen anschließend mit 1ml FACS-Puffer gewaschen, abzentrifugiert (5min, 250g, RT) und der Überstand bis auf ~100µl Restvolumen abgesaugt. Sofort im Anschluss wurden die gefärbten Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert.

Um die intrazelluläre HLA-DR Expression zu analysieren, mussten zunächst die oberflächlichen HLA-DR Moleküle mit einem unmarkierten anti-HLA-DR Antikörper blockiert werden. Dazu wurden die Zellen mit 100µl unmarkiertem anti-HLA-DR Antikörper (Klon L243) [Stockkonzentration 25µg/ml] 20min bei 4°C inkubiert, anschließend zweimal mit BSA-Puffer gewaschen (jeweils 1ml BSA-Puffer, Zentrifugation 5min, 250g, 4°C) und für 15min mit 500µl Perm2-Puffer bei RT inkubiert. Perm2 fixiert und permeabilisiert die Zellen, so dass im nachfolgenden Schritt das intrazelluläre HLA-DR angefärbt werden kann. Dazu wurden die Zellen mit 1ml Saponin-Puffer gewaschen, abzentrifugiert (5min, 250g, 4°C), in 100µl Saponin-Puffer resuspendiert und mit 3µl anti-HLA-DR-PE (Klon L243) und 5µl anti-CD14-APC 20min bei 4°C im Dunkeln inkubiert. Nach der Inkubation wurden überschüssiger Antikörper durch einen weiteren Waschschritt mit 1ml Saponin-Puffer entfernt (Zentrifugation 5min, 250g, 4°C). Als Kontrolle wurde in zwei weiteren Ansätzen das Blockieren der oberflächlichen HLA-DR-Moleküle überprüft und die HLA-DR-Expression auf der Zelloberfläche analysiert. Die Zellen wurden nach der 20minütigen Inkubation mit dem unmarkierten anti-HLA-DR Antikörper 15min bei RT mit 500µl 2%igen PFA (Paraformaldehyd)-Lösung fixiert und anschließend 20min bei 4°C mit 3µl anti-HLA-DR-PE und 5µl anti-CD14-APC inkubiert. Bei optimaler Blockierung der oberflächlichen HLA-DR-Moleküle waren die Zellen bei der anschließenden FACS-Analyse negativ für HLA-DR, da die Bindung des markierten HLA-DR-Antikörpers durch den unmarkierten Antikörper blockiert wurde. Für die Oberflächenfärbung wurden die Zellen 15min mit 500µl 2%iger PFA-Lösung (RT) fixiert, anschließend mit 3µl anti-HLA-DR-PE und 5µl anti-CD14-APC 20min bei 4°C im Dunkeln inkubiert. Am Ende wurde das Zellpellet jeweils in 200µl FACS-Puffer resuspendiert und mittels Durchflusszytometrie analysiert.

Unbehandelte oder mit CoPP vorbehandelte Zellen [1x10⁶] wurden, wie in Kapitel 3.9.6 erläutert, in Micronic-Röhrchen überführt, abzentrifugiert (5min, 250g, RT) und anschließend der gesamte Überstand abgesaugt. Zur Stimulation der STAT-1-Phosphorylierung wurde das Zellpellet in 50µl IFN-γ-enthaltendes Medium (RPMI komplett + 0,1ng/ml IFN-γ) resuspendiert und 15min bei 37°C, 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit inkubiert. Zur Monozytendifferenzierung wurde 10µl anti-CD14-PerCP-Antikörper zu jedem Ansatz pipettiert. Nach der Stimulation wurde 1ml 1xBD-Lyse-Puffer (enthält PFA zur Fixierung der Zellen) zu den Zellen gegeben und diese 10min bei 37°C, 5% CO₂ und 95% Luftfeuchtigkeit inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit 1ml FACS-Puffer gewaschen (Zentrifugation 5min, 300g, 4°C), in 500µl eiskaltem Methanol [90%ig] resuspendiert und 30min auf Eis inkubiert. Danach wurden die Zellen abzentrifugiert (5min, 250g, 4°C), in 1ml 1xFACS-Perm-Lösung resuspendiert und 10min im Dunkeln bei RT inkubiert. Beide Schritte dienen der Permeabilisierung der Zelloberfläche, so dass anschließend intrazelluläre Proteine mit Antikörpern markiert werden können. Für die intrazelluläre Färbung wurde das durch Zentrifugation (5min, 300g, 4°C) gewonnene Pellet in einer Antikörperlösung aus 10µl STAT-1-Alexa 488 und 40µl FACS-Puffer resuspendiert und 1h im Dunkeln bei RT inkubiert. Um überschüssige Antikörper zu entfernen wurden die Zellen nach der Inkubation zweimal mit 1ml FACS-Puffer gewaschen (Zentrifugation 5min, 300g, 4°C), das Pellet in 200µl FACS-Puffer resuspendiert und mittels Durchflusszytometrie analysiert.

Die Färbung wurde nach Herstellerangaben (BD Biosciences, Heidelberg) wie im Phosflow-Protokoll III angegeben durchgeführt.

1x10⁶ Zellen wurden in ein Micronic-Röhrchen überführt, abzentrifugiert (5min, 250g, RT), möglichst der gesamte Überstand abgesaugt und das Pellet in 1ml vorgewärmten BD Cytofix Puffer für 10min bei 37°C, 5% CO₂  und 95% Luftfeuchtigkeit inkubiert. Anschließend wurden die Zellen 5min bei 250g und RT zentrifugiert und das Pellet für die anschließende Permeabilisierung in 1ml BD Phosflow Perm Puffer III resuspendiert und 30min auf Eis inkubiert. Danach wurden die Zellen abzentrifugiert, mit 3µl anti-Phospho-STAT3-PE Antikörper resupendiert und 30min im Dunkeln bei RT inkubiert. Um überschüssige, nicht gebundene Antikörper zu entfernen, wurden die Zellen zweimal mit 1ml FACS-Puffer gewaschen (Zentrifugation 5min, 250g, RT) und anschließend mittels Durchflusszytometrie analysiert.

Die Stabilität der verwendeten Antikörper wird u.a. von den verwendeten Fixierungs- und Permeabilisierungs-Puffern beeinflusst. Bei der Markierung der intrazellulären STAT-3-Phosphorylierung war eine direkte Färbung der Monozyten mit CD14 Antikörpern nicht möglich, da kein CD14-Antikörper-Klon zur Verfügung stand, der bei Verwendung der notwendigen Puffer stabil genug für die anschließende Analyse mittels Durchflusszytometrie war. Aus diesem Grund wurden die Monozyten ausschließlich an Hand ihrer Größe (FSC) und Granularität (SSC) identifiziert.

Small interference RNAs (siRNA) sind kurze doppelsträngige RNA-Stücke, welche eine Inhibierung der Genomexpression auslösen können. Dieser Vorgang wird als RNA Interferenz (RNAi) bezeichnet und dient ursprünglich dem Abwehren von Viren, welche, je nach Virus, doppelsträngige RNA (dsRNA) in die Zielzelle bringen.

Die dsRNA wird in der Zielzelle erkannt und zunächst durch Dicer (RNAse III-ähnliche Moleküle) in kurze doppelsträngige RNA-Stücke (siRNA) zerschnitten. Als nächstes wird der Doppelstrang der siRNA durch den RNA-inducing-silencing-complex (RISC) gespalten und der Antisense-Strang an den Komplex gebunden. Der RISC-Antisense-Strang-Komplex bindet anschließend komplementär an die passende mRNA der Zelle. Die so markierte mRNA wird gespalten und durch natürliche Verdauungsprozesse der Zelle abgebaut, so dass kein Genprodukt mehr entstehen kann (Abb. 12).

	Abb. 12 Schema des RNAi-Mechanismus
	http://nobelprize.org

Innerhalb molekularbiologischer Methoden ist der Einsatz von langer dsRNA jedoch ungeeignet, da diese in den meisten Zellen zu einer unspezifischen Toxizität durch Induktion von IFN-γ führt. Dieses Problem umgeht man durch die Verwendung synthetisch hergestellter 21-23 bp langer siRNA. Diese haben den gleichen inhibitorischen Effekt, führen aber nicht zu einer IFN-γ Induktion.

Mit Hilfe dieses physikalischen Verfahrens wird die Zellmembran durch Elektroschocks für DNA und RNA durchlässig gemacht. Durch das Anlegen einer elektrischen Spannung kommt es zu einer Polarisierung der Membran. Erreicht die dadurch entstehende transmembrane Spannung einen kritischen Wert von 0,4–1V, kommt es zu einer lokalen Zerstörung der Membranintegrität und damit zu einer Erhöhung der Leitfähigkeit. So entstandene hydrophobe Poren verwandeln sich bei Erreichen eines kritischen Radius in relativ stabile (wenige Sekunden bis einige Stunden), hydrophile Poren mit einem Durchmesser von 0,7 –1nm [119] . Durch diese Poren diffundiert dann die siRNA in die Zelle.

Die Nucleofektion wurde nach Protokoll des Herstellers (Amaxa biosystems, Köln) durchgeführt. Verwendet wurde der Amaxa Nucleofector® II und das Programm Y-001. Die zu transfizierenden, frisch isolierten PBMCs bzw. separierten Monozyten wurden in der im Protokoll angegebenen Höchstkonzentration von 2x10⁷ Zellen/Ansatz eingesetzt. 

Verwendet wurden zwei verschiedene HO-1 siRNAs, welche sich in ihrer Sense-Sequenze unterscheiden. Dadurch wurde gewährleistet, dass es zu einer optimalen Inhibierung der HO-1 Expression kommt. Von der HO-1-spezifischen siRNA wurde jeweils 1µl und von der unspezifischen Kontroll-siRNA 2µl eingesetzt. Für die Transfektion wurden die Zellen abzentrifugiert und pro Ansatz 2x10⁷ Zellen in 100µl NFS (Nucleofector solution) aufgenommen. Die Zellsuspension wurde mit der jeweiligen Menge an siRNA gemischt, in die speziellen Transfektionsgefäße pipettiert und mit dem Programm Y-001 transfiziert. Anschließend war wichtig, dass die Zellen zügig im mitgelieferten Medium aufgenommen wurden. Dieses wurde vorher für eine halbe Stunde bei 37°C, 5% CO₂ und 95% Luftfeuchtigkeit äquilibriert. Bei zu langsamem Arbeiten kann es zu einem massiven Zellsterben kommen.

Die transfizierten Zellen wurden mit 2x10⁶ Zellen pro Vertiefung einer 48-Loch-Zellkulturplatte ausgesät (Volumen 450µl). Bevor weiter Stimulantien zugegeben wurden, wurden die Zellen zwei Stunden bei 37°C, 5% CO₂ und 95% Luftfeuchtigkeit ruhen gelassen.

Bei dieser Methode werden Proteine in einem Acrylamid-Gel ihrer Größe nach aufgetrennt, auf eine Nitrocellulose-Membran transferiert und anschließend mit spezifischen Antikörpern nachgewiesen.

Um intrazelluläre Proteine zu analysieren müssen die Zellen zunächst lysiert werden. Dazu wurden die Zellen mit eiskaltem PBS aus der Zellkulturplatte gelöst, in ein 1,5ml Eppendorfgefäß überführt, abzentrifugiert (5min, 1500 U/min) und das Pellet in 50µl Extraktpuffer, welcher 10µl Protease-Inhibitor enthält, lysiert. Um eine eventuelle Proteindegradation zu verhindern, wurden die lysierten Zellen sofort bei -80°C eingefroren und dort bis zur Weiterverarbeitung aufbewahrt.

Für die Auftrennung wurden die Proteine denaturiert. Durch hohe Temperaturen (95°C) und Zugabe von Thiolverbindungen (z.B β-Mercaptoethanol) werden die Disulfidbrücken der Quartärstruktur aufgebrochen und damit die Tertiär- und Sekundärstruktur der Proteine aufgehoben. Die lysierten Zellen wurden dazu mit 10µl 6x SDS-Probenpuffer gemischt und 5min bei 95°C denaturiert. Durch die Beladung mit SDS bekommen die denaturierten Proteine eine negative Außenladung und laufen im elektrischen Feld vom Minus- (Anode) zum Plus- (Kathode) Pol. Die Auftrennung der Proteine ist nach ihrer Denaturierung ausschließlich von ihrer Größe und von der Porenweite des verwendeten Gels abhängig. Die Porenweite hängt dabei von der Menge an eingesetztem Acrylamid und vom Vernetzungsgrad des Gels ab. Je mehr Acrylamid verwendet wird, umso kleiner sind die Poren.

Zur Herstellung eines Gels wurden folgende Reagenzien benötigt:

Tab. 6 Reagenzien für ein SDS-Polyacrylamidgel

Für ein 12,5%iges SDS-Polyacrylamid-Trenngel wurden 2,5ml Stammlösung, 1,2ml 1,88M Tris/HCL, 1,2ml 0,5%iges SDS, 1,1ml bidest. H₂O, 5µl TEMED und 30µl 10%ige Ammoniumpersulfatlösung gemischt und luftblasenfrei in eine entsprechend vorbereitete Gelkammer gegossen. Um eine gerade Abschlusskante zu erhalten, wurde das Gel mit Isopropanol überschichtet und zur Aushärtung bei RT stehen gelassen. Für ein 5%iges Sammelgels wurden 330µl Stammlösung, 400µl 0,625M Tris/HCL, 400µl 0,5%iges SDS, 870µl bidest. H₂O, 2µl TEMED und 10µl 10%ige Ammoniumpersulfatlösung gemischt. Nach Aushärtung des Trenngels wurde das Isopropanol komplett abgenommen und das Sammelgel eingefüllt. Solange dieses noch flüssig war wurde ein Kamm mit 12 Probentaschen luftblasenfrei in die Kammer gesteckt. Nach dem Aushärten wurde das Gel in die Elektrophorese-Kammer gespannt, mit SDS-Laufpuffer geflutet und der Kamm entfernt. Anschließend wurden die Taschen mit dem Laufpuffer gespült und mittels einer dünnen Spritze jeweils 20µl der denaturierten Proben eingefüllt. Um die Proteinbanden eindeutig diskriminieren zu können, wurde zudem ein Proteinmarker aufgetragen, welcher Banden definierter Größe zeigt. Die Auftrennung lief, bis die Proben das Trenngel erreicht hatten, mit ~80V und anschließend für ca. 1-1½ Stunden, bis die einzelnen Markerbanden gut voneinander getrennt waren, bei 120V.

Nach der Auftrennung im SDS-Gel wurden die Proteine mittels Semi-Dry-Blotting auf eine Nitrocellulosemembran transferiert.

Dazu wurden insgesamt 6 Filterpapiere und die Nitrocellulosemembran für ca. 10min in Transferpuffer äquilibriert und anschließend ein „Sandwich“ nach folgendem Schema aufgebaut: 3 Filterpapiere, Nitrocellulosemembran, Gel, 3 Filterpapiere (Abb. 13). Transferiert wurde für eine Stunde bei 100mA.

	Abb. 13 Schema eines Semi-dry-blotting „sandwich“
	Georgia Institute of Technologie School of Biomedical Engineering

Zur Kontrolle des Transfers und der gleichmäßigen Beladung wurde die Membran reversibel mit Ponceau gefärbt. Der saure Diazofarbstoff färbt unspezifisch Proteine und lässt sich durch Waschen mit TBS-T leicht wieder entfernen.

Für die Ponceau-Färbung wurde die Membran komplett mit dem Ponceau-Farbstoff benetzt, nach 2-3 min Färbezeit der Farbstoff wieder entfernt und die Membran mit dest. H₂O gespült bis die Hintergrundfärbung soweit entfernt war, dass sich die Proteinbanden gut von dem Hintergrund abheben. Zur Dokumentation wurde die Membran eingescannt und anschließend durch mehrmaliges Spülen mit TBS-T wieder komplett entfärbt.

Verwendet wurden zwei unterschiedliche Visualisierungsmethoden. Zum einen die klassische Visualisierung mittels ECL (Enhanced ChemiLuminescence)-Reagenz und Photofilm und zum andern die Visualisierung mit dem ODYSSE Infrared Imaging System von LiCor-Biosciences.

In der folgenden Tabelle sind die verwendeten Antikörper mit ihrer jeweiligen Verdünnung aufgelistet.

Tab. 7 Verdünnungen der verwendeten Western Blot-Antikörper

Zum Blockieren der freien Bindestellen auf der Membran wurde diese 1h mit 5%iger Milch- bzw. BSA-Lösung bei RT auf dem Schüttler inkubiert. Die Wahl der Blockierungslösung richtet sich dabei nach dem Primär-Antikörper. Die Inkubation mit dem ebenfalls in 5%iger Milch- bzw. BSA-Lösung verdünntem Primär-Antikörper erfolgte bei 4°C über Nacht auf dem Schüttler. Nach der Inkubation wurde die Membran 4x 10min mit TBS-T gewaschen und anschließend für 1h bei RT mit dem in 5%iger Milch- bzw. BSA-Lösung verdünntem Sekundär-Antikörper auf dem Schüttler inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt (4x 10min mit TBS-T) wurden die markierten Proteinbanden mit Hilfe des ECL Western Blotting Detection Reagens Kit der Firma Amersham Biosciences detektiert. 

Bei der ECL-Visualisierung ist der Sekundär-Antikörper mit HRP- (Horseradish Peroxydase)-Enzym markiert, wodurch es nach Zugabe des entsprechenden Substrats zu einer detektierbaren Lumineszenz kommt. Lumineszenz entsteht, wenn angeregte Moleküle wieder in ihren stabilen Zustand zurückkehren, und dabei die freiwerdende Energie in Form von Licht abgeben. Chemilumineszenz ist ein chemischer Prozess, bei dem energiereiche, instabile Zwischenprodukte entstehen, die unter Lichtemission zerfallen (z.B. Luminol und Dioxethanen). Der Unterschied zur Fluoreszenz besteht im Wesentlichen darin, dass bei der Lumineszenz keine Wärme freigesetzt wird. Die Peroxydase HRP katalysiert die Umsetzung des Substrats Luminol in seine oxidierte Form. Die entstehende Chemilumineszenz wird verstärkt indem ein HRP-Molekül sehr viel Substrat umsetzen kann. Die dadurch sichtbar werdenden Banden werden mit Hilfe von Photofilmen detektiert. 

Die Visualisierung der Banden auf dem Photofilm erfolgte nach dem mitgelieferten Protokoll des Herstellers, wobei 2ml Lösung A mit 50µl Lösung B (Substrat) gemischt und anschließend gleichmäßig auf die Membran gegeben und 5min, im Dunkeln, bei RT inkubiert wurden. Anschließend wurde die Membran auf einen Photofilm (High perfomance chemiluminescence film) aufgelegt und in einer Filmkassette mind. 10sec inkubiert. Die Dauer richtete sich dabei nach der erwarteten Bandenstärke. Die anschließende Entwicklung des Films erfolgte nach Herstellerprotokoll (Kodak) mittels einer kommerziell erhältlichen Entwickler- und Fixierlösung (GBX fixer and replenisher; GBX developer and replenisher).

Das ODYSSE-System basiert auf der Messung von Fluoreszenzen im Nahinfrarotbereich. Nahinfrarot (NIR) liegt im Spektralbereich von 780nm bis 3000nm und schließt sich direkt an den sichtbaren Spektralbereich des Lichtes (380-750nm) an. Die Detektion von Fluoreszenzen erlaubt eine quantitative Analyse, da die Fluoreszenz linear mit der Menge des Fluorochrom-markierten Antikörpers ansteigt und nicht, wie bei der Chemilumineszenz, von der umgesetzten Substratmenge abhängt. Ein weiterer Vorteil liegt darin, dass zwei unterschiedliche Fluoreszenzen (700nm und 800nm) detektiert und zwei Proteine gleichzeitig analysiert werden können.

Das Blockieren der freien Bindestellen auf der Membran erfolgte mittels speziellem Blockingpuffer (Li-Cor Blocking Solution, 1:2 mit PBS verdünnt) 1h bei RT auf dem Schüttler. Anschließend wurde die Membran über Nacht bei 4°C mit dem, in Li-Cor Blocking Solution verdünnten primären Antikörper (Tab. 7) inkubiert. Nach einem Waschschritt (4x 10min mit TBS-T) erfolgte die Inkubation mit dem Sekundär-Antikörper. Während man bei beiden Visualisierungsmethoden (ECL und ODYSSE) denselben primären Antikörper verwenden kann, benötigt man bei der ODYSSE-Methode einen speziellen Sekundär-Antikörper. Diese sind mit zwei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert und erlauben somit eine einfache Diskriminierung auch nah beieinander liegender Proteinbanden. Der Sekundär-Antikörper wurde in Li-Cor Blocking Solution verdünnt und die Membran damit 1h bei RT auf dem Schüttler inkubiert. Um ungebundene Antikörper zu entfernen wurde die Membran im letzten Schritt noch mal 4x 10min mit TBS-T gewaschen und anschließend am ODYSSE Infrared Imaging Reader analysiert. Die Auswertung erfolgte mittels der dazugehörigen Quantifizierungsoftware.

Verwendet wurde das Absolutely RNA^® miniprep Kit der Firma Stratagen. 

Die Methode macht sich zu Nutze, dass RNA in der Anwesenheit einer chaotropen^{3 [120]}  Salzlösung an eine Quarzglasfaser bindet und so von andern Zellkomponenten getrennt werden kann. 

Zur Präparation wurde das Protokoll für Gewebekulturzellen des Herstellers benutzt.

Das Zelllysat wurde zunächst mit einer Ethanollösung gemischt und anschließend auf eine RNA-bindende Säule gegeben. Nach einem Waschschritt mit einer Salzlösung erfolgte der DNase-Verdau. Hier zeigte sich, dass eine 30minütige Inkubation mit der DNase bei 37°C effektiver war, als die angegebene 15minütige Inkubation. Anschließend wurde die immobilisierte RNA zweimal mit de mitgelieferten Salzlösung gewaschen und anschließend in zwei Schritten von der Säule eluiert. Dazu wurde die gebundene RNA zweimal 7min mit 30µl 60°C warmem Elutionspuffer inkubiert und anschließend durch Zentrifugation von der Säule gelöst.

Mit Hilfe reverser Transkriptase wird die isolierte mRNA (messenger RNA) in cDNA (complementary DNA) umgeschrieben. 

Die Präparation der cDNA läuft generell in drei Schritten ab.

Im ersten Schritt wird oligo dT (oligodesoxythymidylic acid) komplementär an den Poly(A)-Schwanz ^{4 [121]} der RNA gebunden. Dieses dient der folgenden Transkription als Anfangssequenz. Im zweiten Schritt wird durch Zugabe von DNase evtl. vorhandene DNA degradiert und somit verhindert, dass bei der folgenden cDNA-Synthese eine eventuelle DNA-Amplifikation das Ergebnis verfälscht. Im letzten Schritt, der Inkubation mit reverser Transkriptase, wird die RNA in cDNA umgeschrieben.

Für die cDNA Synthese wurden 18µl RNA mit 2µl oligo dT durch vortexen gemischt, kurz abzentrifugiert und 10min bei 75°C inkubiert. Um die Reaktion zu stoppen wurden die Proben anschließend auf Eis gestellt (mind. 2min). Zur Herstellung des ´dNTP´-Mixes wurden pro Probe 8µl 5x-Puffer, 4µl DTT (Dithiothreitol) und 4µl dNTP (Desoxynukleotide-Triphosphat) durch vortexen gemischt und 2µl DNase sowie 0,5µl RNase Inhibitor zugegeben. Anschießend wurden 18,5µl des ´dNTP´-Mixes zu der auf Eis stehenden Probe gegeben, das Ganze mittels Pipette gemischt und für 30min bei 37°C inkubiert. Direkt im Anschluss folgte eine 5minütige Inkubation bei 75°C bevor die Proben wieder auf Eis gestellt (mind. 2min) wurden. Anschließend wurde 1µl reverse Transkriptase und 1µl RNase Inhibitor zu jeder Probe pipettiert und der Ansatz 60min bei 42°C und anschließend 5min bei 94°C inkubiert. Die fertige cDNA wurde bis zur weiteren Analyse bei 4°C gelagert und anschließend bei –80°C eingefroren.

Die Polymerase Kettenreaktion (PCR) wird verwendet um kurze (bis zu 10kbp) DNA-Sequenzen zu amplifizieren. Während der PCR werden die beiden Stränge der DNA durch hohe Temperaturen voneinander getrennt und mittels eines Primerpaares der Anfangs- und Endpunkt des zu amplifizierenden Stückes festgelegt. Dieser DNA-Abschnitt wird dann mit Hilfe einer DNA-Polymerase repliziert. Um qualitative Aussagen über die amplifizierten DNA-Abschnitte zu machen, werden diese anschließend in ein Agarosegel pipettiert und durch Anlegen einer elektrischen Spannung ihrer Größe nach aufgetrennt.

Zur Amplifizierung des gewünschten DNA-Abschnitts wurden der Go Tag ® DNA Polymerase Kit der Firma Promega verwendet. Es wurden pro Ansatz 5µl 5x Reaktionspuffer, 2µl Nukleotide, 1µl Vorwärts-, 1µl Rückwärtsprimer, 0,25µl Go TaqDNA-Polymerase, 14,75µl DEPC (Diethylpyrocarbonat)-Wasser und 1µl cDNA gemischt und mit dem in Tab. 8 angegebenen Programm im Thermocycler amplifiziert. Für eine optimale Amplifizierung wurden die Schritte 2-4 32-mal wiederholt.

Zur Analyse der amplifizierten DNA wurde die Größe des DNA-Amplikates mit Hilfe eines 1,5%igen Agarosegels bestimmt. Zur Herstellung des Agarosegels wurden 4,5g Agarose in 300ml TAE (Tri-Acetat-EDTA)-Puffer unter Erhitzen gelöst und nach Abkühlung (Handwarm) 10µl Ethidiumbromid (ein roter Phenanthridin-Farbstoff) dazu gegeben. Die handwarme Gelmasse wurde in eine vorbereitete Kammer gegossen, ein Kamm mit 22 Taschen eingehängt und bis zur vollständigen Polymerisierung stehen gelassen. Nachdem das Gel ausgehärtet war, wurde die Kammer mit TAE-Puffer geflutet und der Kamm entfernt. Die DNA-Amplikate wurden in die Taschen im Gel pipettiert und unter Anlegen einer Spannung (100V für 30-40min) aufgetrennt. Das im Gel enthaltene Ethidiumbromid lagert sich während der Auftrennung zwischen den Basen der DNA an und verändert dadurch sein Anregungsspektrum, wodurch die DNA-Banden unter ultraviolettem Licht sichtbar werden. Um die Größe der Banden zu qualifizieren wurden bei jedem Gel ein 1kb-Marker aufgetragen, welcher Banden definierter Größe zeigt.

Tab. 8 Schema der konventionellen PCR

Die real time PCR (RT-PCR) ermöglicht die Amplifikation der cDNA quantitativ über die Zeit zu verfolgen. Um dies zu ermöglichen sind zusätzlich zu den Primern sogenannte Sonden notwendig, welche für die jeweilige Zielsequenz spezifisch sind. An diesen Sonden ist ein fluoreszierender Reporterfarbstoff sowie ein Quencherfarbstoff gebunden. Solange beide Farbstoffe in räumlicher Nähe zueinander sind unterdrückt der Quencherfarbstoff die Fluoreszenz des Reporterfarbstoffs. Die eingesetzte Taq-Polymerase, die neben ihrer Fähigkeit DNA zu synthetisieren auch eine DNA-spaltende (5´Endonukleaseaktivität) Funktion besitzt, trennt den Reporterfarbstoff von der Sonde ab. Der Quencherfarbstoff verliert seinen Einfluss und der Reporterfarbstoff fluoresziert. Der Anstieg der Fluoreszenz ist dabei direkt proportional zu der Amplifikation des PCR-Produktes.

Verwendet wurde der TaqMan Universal PCR Mastermix der Firma Applied Biosystem, welcher die zur Reaktion benötigte AmpliTaq Gold ® DNA Polymerase, dNTP´s und dUTP (Deoxyuridine-Triphosphat) enthält.

Zum Ansetzen des RT-PCR-Mixes wurden pro Probe 1,5µl dest H₂0, 12,5µl Mastermix, 6µl Primer und 1µl Sonde gemischt. Anschließend wurde 12µl Mix und 1µl cDNA in ein PCR-Gefäß pipettiert. Nachdem die Proben in den Thermal Cycler (ABI PRISM^TM 7700) gestellt und in das Gerät eingezogen wurden, wurde das RT-PCR-Programm gestartet. Die standardmäßig verwendete TaqMan-PCR bestand aus 4 Segmenten (1 Zyklus) welche 30-mal wiederholt wurden.

Tab. 9 Schema der RT-PCR

Nach Beendigung des Laufes wurden die Daten mit der Sequence Detection Software analysiert und man erhielt die entsprechenden ct-Werte (cycle threshold). Der ct-Wert ist der Zyklus, in dem die Fluoreszenz des Reporterfarbstoffes einen festgelegten Schwellenwert überschreitet. Je mehr cDNA eines Genes in der Probe war, umso niedriger ist der ct-Wert, d.h. umso früher erreicht die Fluoreszenz den Schwellenwert. Zum Auswerten wurden die erhaltenen ct-Werte eines housekeeping Gens (HRPT; Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase) zu den ct-Werten des zu untersuchenden Gens ins Verhältnis gesetzt, so dass man Aussagen über die jeweilige relative RNA-Menge machen kann. Das dimensionslose Ergebnis der Expression wurde nach folgender Formel berechnet. Dabei wurde angenommen, dass die Effizienz der beiden Primer gleich war und diese somit gleich eins gesetzt.

Die Zytokinmessung am Immulite (ein Chemilumineszenz-Immunoassay-System der Firma Siemens) beruht auf einem Sandwich-Prinzip ähnlich dem ELISA (Enzym-linked Immunsorbent Assay). Das System erlaubt die Messung verschiedener Parameter (z.B Zytokine) innerhalb kurzer Zeit und weist eine sehr große Sensitivität und einen großen Messbereich auf.

Im Gegensatz zum ELISA verwendet das System des Immulite Polystyrolkugeln als Träger für die Zytokinspezifischen-Antikörper. Zum Nachweis des immobilisierten Zytokin wird alkalische Phosphatase, welche mit einem zytokinspezifischen Antikörper konjugiert ist, verwendet. Als Substrat wird AMPPD (Adamanthyldioethanphosphat) eingesetzt, welches durch die alkalische Phosphatase in ein instabiles Anionzwischenprodukt dephosphoryliert wird. Dieses setzt beim Zerfall ein Photon frei, welches mittels Photomultiplier detektiert wird. Da ein Enzymmolekül viele Substratmoleküle umsetzen kann, wird das Signal verstärkt, so dass eine hohe Empfindlichkeit der Methode gegeben ist. 

Wenn nicht anders angegeben, wurden die Ergebnisse als prozentualer Mittelwert mit jeweiliger Standardabweichung graphisch dargestellt. Die prozentualen Werte beziehen sich immer auf die jeweiligen Kontrollwerte. Für die statistische Auswertung wurden die Experimente 4-7-mal wiederholt. Verwendet wurde der nichtparametrische Wilcoxon-Rangsummentest, bei dem zwei verbundene Stichproben auf einen signifikanten Unterschied in ihrer zentralen Tendenz hin untersucht werden. Signifikante Unterschiede, definiert als p < 0,05, wobei ´p´ die Irrtumswahrscheinlichkeit angibt, wurden in den Graphiken jeweils mit (*) gekennzeichnet. Die Bedeutung der verwendeten Zeichen ist in der jeweiligen Legende erklärt. 

Für die statistische Auswertung wurde das Statistikprogramm SPSS.16 verwendet.

Fußnoten und Endnoten

³  Chaotrope Salzlösungen haben die Eigenschaft Wasserstoffbrückenbindungen aufzulösen und somit denaturierend auf Proteine zu wirken. Zudem sättigen die Kationen der Salzlösung die negativen Ladungen der Glasfasern und machen sie somit positiv, so dass die negativ geladene Nukleinsäure binden kann.

⁴  Der Poly(A)-Schwanz besteht aus mehreren, aneinander geknüpften Adenin-Nukleotiden und ist essentiel für die Initiation der Translation. Diese Polyadenylierung ist nicht von der DNA kodiert, sondern wird während der Prozessierung der mRNA mittels Poly(A)-Polymerase an das 3´-Ende der prä-mRNA gebunden.