4. Ergebnisse

↓64

4.1 HO-1-Expression in humanen Monozyten

↓65

Zur Induktion der HO-1-Expression wurden frisch isolierte PBMCs mit dem HO-1 Induktor Cobalt-Protoporphyrin (CoPP) behandelt. Die verwendeten 30µM CoPP entsprachen dabei der höchstmöglichen, nicht toxischen Konzentration (Zellviabilität überprüft mittels Trypanblau-Färbung), bei der eine maximale HO-1-Induktion zu beobachten war. Nach der 15stündigen CoPP-Inkubation wurde ein Teil der Zellen für die spätere Western Blot Analyse lysiert und bis zur weiteren Verwendung eingefroren. Die restlichen Zellen wurden mit Medium (RPMI komplett) gewaschen und weitere 12h bzw. 24h mit Medium (RPMI komplett) inkubiert. Bei der anschließenden Western Blot Analyse wurde die konstitutive HO-1-Proteinexpression mit der CoPP-induzierten HO-1-Proteinexpression verglichen.

Abb. 14 CoPP-induzierte HO-1 Proteinexpression in humanen PBMCs

Frisch isolierte PBMCs wurden 15h mit 30µM CoPP vorinkubiert und gewaschen. Die Zellen wurden entweder direkt nach der CoPP-Behandlung (0h) oder nach weiteren 12h bzw. 24h Inkubation lysiert und mittels Western Blot analysiert. Dargestellt ist das Ergebnis eines repräsentativen Versuches von drei unabhängigen Exprimenten.

Die Proteinanalyse zeigt, dass PBMCs konstitutiv kein HO-1 exprimieren. Jedoch resultiert eine Präinkubation von PBMCs mit CoPP in einer Hochregulation der HO-1-Expression. Diese HO-1-Überexpression ist nach Entfernen des HO-1-Induktors für mindestens weitere 24h nachweisbar (Abb. 14). 

↓66

Im nächsten Schritt wurden die in PBMCs enthaltenden einzelnen Zellpopulationen voneinander separiert und im Hinblick auf ihre HO-1-Expression untersucht. Monozyten, T-Zellen und B-Zellen wurden 15h mit 30µM CoPP inkubiert und anschließend die Proteinexpression mittels Western Blot analysiert.

Abb. 15 CoPP-induzierte HO-1 Proteinexpression in verschiedenen Immunzellen

Monos = Monozyten; Die verschiedenen Leukozytensubpopulationen wurden 15h +/- 30µM CoPP inkubiert, lysiert und im Western Blot analysiert. Dargestellt ist das Ergebnis eines repräsentativen Versuches von drei unabhängigen Exprimenten.

Die Western Blot Analyse der einzelnen Zelltypen zeigt, dass in keiner der untersuchten Zellpopulationen eine konstitutive HO-1-Expression nachzuweisen ist. Durch eine Behandlung mit CoPP lässt sich die HO-1-Expression in Monozyten, nicht jedoch in Lymphozyten induzieren. Dies deutet darauf hin, dass HO-1-vermittelte Effekte hauptsächlich in Monozyten zu erwarten sind. Da gerade ein Funktionsverlust von Monozyten zu den wesentlichen Charakteristika einer Immundepression gehört, fokussierten sich die weiteren Untersuchung auf die Effekte einer Porphyrin-induzierten HO-1-Hochregulation auf die antigenpräsentierenden Eigenschaften von Monozyten.

4.2 Effekte von HO-1-Induktoren auf den Phänotyp von humanen Monozyten

4.2.1 Beeinflussung der monozytären HLA-DR-Expression

↓67

Eine wesentliche funktionelle Eigenschaft von Monozyten ist die Präsentation von Antigenen mittels MHC-II Molekülen. Diese Fähigkeit ist bei einer Immundepression stark vermindert. Im nachfolgenden Versuch sollte deshalb untersucht werden, ob eine CoPP-induzierte HO-1-Hochregulation einen Einfluss auf die konstitutive HLA-DR-Expression in humanen Monozyten hat. Dabei wurde die Synthese von HLA-DR von der mRNA-Expression über die intrazelluläre bis zur oberflächlichen HLA-DR-Expression verfolgt.

Separierte Monozyten (für die mRNA-Analyse) bzw. PBMC (für die Analyse der intrazellulären und der oberflächlichen HLA-DR-Expression) wurden für 15h mit 30µM CoPP präinkubiert und anschließend die HLA-DR-Expression mittels Durchflusszytometrie (intrazelluläres und oberflächliches HLA-DR) oder RT-PCR (mRNA-Analyse) zu verschiedenen Zeitpunkten analysiert.

Die Ergebnisse der HLA-DR-Messung zeigen, dass es in kultivierten Monozyten zeitabhängig zu einer Hochregulation der HLA-DR Expression kommt. Dies zeigt sich sowohl auf der Zelloberfläche (Abb. 16A) als auch auf intrazellulärem Niveau (Abb. 16B). Auch die Expression der HLA-DR mRNA steigt zeitabhängig leicht an, allerdings erreicht sie im Vergleich zu den 0h-Werten kein signifikantes Niveau (Abb. 16C). Eine CoPP-Behandlung hemmt die konstitutive HLA-DR Expression. Bereits nach einer 15-stündigen CoPP-Vorbehandlung, während der es zu einer starken Induktion der HO-1 Expression kommt (siehe Abb. 14), ist die Expression der HLA-DR mRNA im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollzellen signifikant gehemmt (Abb. 16C). Diese Suppression zeigt sich auch in einer signifikant verminderten Expression von intrazellulärem HLA-DR Protein (Abb. 16B). Die HLA-DR-Expression auf der Zelloberfläche (Abb. 16A) nimmt dagegen langsamer ab. In allen drei Fällen ist jedoch 24h nach CoPP-Behandlung die HLA-DR-Expression signifikant gegenüber den unbehandelten Kontrollzellen gehemmt.

↓68

Abb. 16 HLA-DR Expression in Monozyten nach CoPP-induzierter HO-1 Hochregulation

Die Zellen wurden 15h +/- 30µM CoPP inkubiert. Ein Teil der Zellen wurde anschließend sofort analysiert (0h). Der andere Teil der Zellen wurde mit Medium gewaschen und weitere 12h bzw. 24h mit Medium inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Expression der HLA-DR mRNA (A), der intrazellulären HLA-DR Expression (B) und die HLA-DR Expression auf der Oberfläche (C) analysiert. (A) Separierte Monozyten wurden zum angegebenen Zeitpunkt in entsprechendem RNA-Lysepuffer aufgenommen und bis zur weiteren Analyse bei -80°C eingefroren. Die HLA-DR mRNA wurde mittels RT-PCR detektiert. (B) + (C) Die PBMCs wurden zum angegebenen Zeitpunkt mittels Durchflusszytometrie analysiert und die HLA-DR Expression der CD14-positiven Monozyten dargestellt. Gezeigt sind die Mittelwerte mit Standardabweichung von vier bis fünf (außer +0h, +24h Oberflächen HLA-DR: n=28) unabhängigen Experimenten als prozentuale Abweichung von den unbehandelten Kontrollzellen zum Zeitpunkt t=0h. *=p<0,05, #=0,068.

4.2.2 Einfluss von CoPP auf die MHC-II-Expression von B-Zellen und die MHC-I-Expression von Monozyten

Im folgenden Versuch wurden die MHC- und Zellspezifität der CoPP-vermittelten Effekte untersucht. Dazu wurde die Beeinflussung der MHC-I Expression von Monozyten und der HLA-DR Expression von B-Zellen analysiert.

Abb. 17   MHC-I Expression auf Monozyten (A) und HLA-DR Expression auf B-Zellen (B) nach CoPP-induzierter HO-1 Hochregulation

PBMCs wurden 15h +/- 30µM CoPP behandelt. Anschließend wurden die Zellen mit Medium gewaschen und weitere 24h inkubiert. Die Analyse der Oberflächenproteine erfolgte mittels Durchflusszytometrie. Detektiert wurde das MHC-I A1 Molekül auf CD14-positiven Monozyten und die HLA-DR Expression auf CD19-positiven B-Zellen. Gezeigt sind die Mittelwerte mit Standardabweichung von vier unabhängigen Experimenten als prozentuale Abweichung von den unbehandelten Kontrollzellen.

↓69

Weder die MHC-I-Expression auf Monozyten (Abb. 17A) noch die HLA-DR-Expression von B-Zellen (Abb. 17B) werden durch eine 15stündige CoPP Behandlung beeinflusst.

Folglich lässt dieses Ergebnis den Rückschluss zu, dass eine CoPP-Behandlung spezifisch die HLA-DR-Expression auf Monozyten beeinflusst, während sowohl die MHC-I-Expression auf Monozyten, als auch die MHC-II-Expression auf B-Zellen unbeeinflusst bleibt. Dies korreliert mit der CoPP-vermittelten selektiven HO-1-Hochregulation, welche ausschließlich in Monozyten jedoch nicht in B-Zellen zu beobachten ist (Abb. 15).

4.2.3 Genexpression der MHC-II-regulierenden costimulatorischen Moleküle nach CoPP-induzierter HO-1 Hochregulation

Um die Auswirkung einer CoPP-induzierten HO-1-Überexpression auf die MHC-II-Expression von Monozyten genauer zu untersuchen, wurden im Folgenden weitere Moleküle analysiert, welche für eine optimale Antigenbeladung der MHC-II Moleküle wichtig sind. Insbesondere interessierte die Genexpression von CD86, der Cystein-Protease Cathepsin S, sowie die Expression von CD74 (invariant chain) und HLA-DM. Während CD74 das neu synthetisierte HLA-DR-Molekül stabilisiert und zudem als CLIP-Protein die leere Bindetasche des MHC-II Moleküls blockiert, katalysiert HLA-DM den Austausch von CLIP gegen das zu präsentierende Antigen.

↓70

Für die Analyse wurden separierte Monozyten 15h mit 30µM CoPP vorbehandelt und die mRNA Expression der verschiedenen Moleküle zu unterschiedlichen Zeitpunkten mittels RT-PCR detektiert.

Die Ergebnisse der Genexpressionsanalyse zeigen, dass eine Induktion von HO-1 mit einer signifikant verminderten Expression von CD74 (Abb. 18A) und HLA-DMa (Abb. 18B) assoziiert ist. Diese Suppression ist bis zu 24h nach Entfernen des HO-1-Induktors signifikant gegenüber den unbehandelten Kontrollzellen. Im Gegensatz dazu bleibt die konstitutive Expression des Comoleküls CD86 unbeeinflusst von der HO-1-Induktion (Abb. 18C), auch wenn 24h nach der CoPP-Behandlung die CD86-Expression im Vergleich zu den Kontrollzellen tendenziell leicht vermindert scheint. Die mRNA-Expression der Protease Cathepsin S ist direkt nach der CoPP-Behandlung vermindert, steigt jedoch nach Entfernen des HO-1-Induktors innerhalb von 24h wieder auf Kontrollniveau an (Abb. 18D).

Abb. 18  Genexpression von CD74 (A), HLA-DM (B), CD86 (C) und Cathepsin S (D) nach CoPP-induzierter HO-1 Hochregulation

Separierte Monozyten wurden 15h +/- 30µM CoPP inkubier, mit Medium gewaschen und entweder sofort nach der Präinkubation oder nach weiteren 12h bzw. 24h Inkubation in entsprechendem RNA-Lysepuffer lysiert und bis zur weiteren Analyse bei -80°C eingefroren. Mittels RT-PCR wurde die Genexpression von CD74 (A), HLA-DMa (B), CD86 (C) und Cathepsin S (D) analysiert. Gezeigt sind die Mittelwerte mit Standardabweichung von fünf unabhängigen Experimenten als prozentuale Abweichung von den unbehandelten Kontrollzellen zum Zeitpunkt t=0h.*=p<0,05.

↓71

Die Analyse der Genexpression der vier Moleküle zeigt, dass hauptsächlich die Expression von Proteinen, welche unter der Kontrolle des MHC-II-Masterregulators Klasse-II-Transaktivator (CIITA) stehen, in CoPP-behandelten Monozyten beeinträchtigt sind. Zu diesen Proteinen gehören sowohl HLA-DR als auch CD74 und HLA-DM. Eine Hemmung dieser Proteine kann auf eine Suppression der CIITA-Expression hindeuten. Die Ergebnisse führten also zu der Vermutung, dass eine Porphyrin-Behandlung die Expression oder Funktionalität des MHC-II Masterregulators beeinflusst.

4.2.4 Beeinflussung der konstitutiven CIITA-Expression

Für die Analyse der CIITA-Genexpression wurden separierte Monozyten 15h mit 30µM CoPP behandelt und die CIITA Expression zu verschiedenen Zeitpunkten mittels RT-PCR untersucht.

Abb. 19 CIITA mRNA Expression nach CoPP-induzierter HO-1 Hochregulation

Separierte Monozyten wurden 15h +/- 30µM CoPP inkubiert und anschließend mit Medium gewaschen. Sofort nach der Präinkubation oder nach weiteren 12h bzw. 24h Inkubation wurden die Zellen lysiert und bis zur weiteren Analyse bei -80°C eingefroren. Die CIITA Genexpression wurde mittels RT-PCR analysiert. Gezeigt sind die Mittelwerte mit Standardabweichung von fünf unabhängigen Experimenten, als prozentuale Abweichung von den unbehandelten Kontrollzellen zum Zeitpunkt t=0h. *=p<0,05. 

↓72

Das Ergebnis zeigt, dass eine HO-1-Induktion in Monozyten mit einer signifikant verminderten konstitutiven Expression von CIITA korreliert. Diese Hemmung ist bis zu 24h nach Entfernen des HO-1-Induktors signifikant gegenüber den unbehandelten Kontrollzellen (Abb. 19).

Das hier gezeigte Ergebnis korreliert zudem mit der unter Kapitel 4.2.3 gezeigten verminderten Expression von HLA-DR (Abb. 16), CD74 und HLA-DM (Abb. 18). Die Hemmung der CIITA-Expression durch eine CoPP-Behandlung könnte demzufolge die verminderte Expression von HLA-DR, CD74 und HLA-DM erklären.

4.2.5 Einfluss einer CoPP-Behandlung auf die IFN-γ -induzierte MHC-II-Expression

Die Expression von CIITA wird durch das proinflammatorische Zytokin IFN-γ  stark induziert. Eine gesteigerte CIITA-Expression führt wiederum zu einer gesteigerten HLA-DR Expression. Eigene Vorarbeiten zeigten, dass eine CoPP-Präinkubation die IFN-γ-induzierte Oberflächenexpression von HLA-DR signifikant vermindert [48,73] . Um diese Daten zu bestätigen, wurde in der folgenden Versuchsreihe die Beeinflussung der IFN-γ-induzierten monozytären HLA-DR- (Abb.20B) und CIITA- (Abb.20C) Expression durch eine CoPP-Vorbehandlung untersucht.

↓73

Abb. 20 Beeinflussung der IFN-γ  -induzierten HLA-DR und CIITA Expression durch CoPP

(A) PBMCs wurden 15h +/- 30µM CoPP inkubiert, anschließend mit Medium gewaschen und weitere 24h mit 10ng/ml IFN-γ stimuliert. Nach der Inkubation wurde die Oberflächenexpression von HLA-DR auf CD14-positiven Monozyten mittels Durchflusszytometrie analysiert. Gezeigt sind die Mittelwerte mit Standardabweichung von 6 unabhängigen Experimenten als prozentuale Abweichung von den Kontrollzellen. *=p<0,05. (B) und (C) Separierte Monozyten wurden 15h +/- 30µM CoPP inkubiert, anschließend mit Medium gewaschen und weitere 24h mit 10ng/ml IFN-γ stimuliert. Nach der Inkubation wurden die Zellen mit entsprechendem Lysepuffer lysiert und die HLA-DR- und CIITA- Genexpression mittels RT-PCR analysiert. Gezeigt sind die Mittelwerte mit Standardabweichung von 3 unabhängigen Experimenten als prozentuale Abweichung von den Kontrollzellen

Eine CoPP-Vorbehandlung hemmt signifikant die IFN-γ-induzierte HLA-DR-Expression auf der Oberfläche von Monozyten (Abb.20A). Die Analyse der HLA-DR-mRNA zeigt jedoch nur eine leichte Verminderung der IFN-γ-induzierten Expression (Abb.20B), während die CIITA Genexpression durch eine CoPP-Vorbehandlung um ca 20% reduziert ist. Auf Grund der Resultate der HLA-DR Proteinexpression, wo eine signifikante Hemmung der IFN-γ-induzierten HLA-DR Oberflächenexpression um ca. 40% in Folge einer CoPP-Präinkubation zu detektieren war, und der eindeutig verminderten CIITA mRNA-Expression, wurde ebenfalls eine stärkere Hemmung der HLA-DR mRNA-Expression erwartet. Diese Diskrepanz lässt sich möglicherweise mit Probanden-spezifischen Unterschieden erklären, da die Zellen für die Oberflächenanalyse in diesem Fall nicht von den gleichen Probanden stammten, wie die Zellen für die mRNA-Analyse. Eine weitere Überlegung ist, dass die IFN-γ-induzierte HLA-DR-Hochregulation durch CoPP, im Gegensatz zur konstitutiven HLA-DR-Expression, eventuell erst posttranskriptional beeinflusst wird.

4.3 Nachweis der HO-1-Spezifität

Die bisherigen Versuche wurden unter der Annahme durchgeführt, dass die Porphyrin-induzierte Überexpression von HO-1 Ursache für die Hemmung der HLA-DR-Expression ist. Wenn sich diese Hypothese bestätigt, sollten andere HO-1-Induktoren, wie z.B. Hämin, ähnliche Effekte haben und zudem sollte eine Hemmung von HO-1 die supprimierende Wirkung von CoPP aufheben.

4.3.1 HO-1-Proteinexpression im Vergleich nach CoPP- und Hämin-Behandlung

↓74

Zunächst wurde die HO-1-Induktion durch CoPP und Hämin verglichen. Dazu wurden PBMCs 15h mit 30µM CoPP bzw. mit 30µM Hämin vorbehandelt und anschließend die HO-1-Proteinexpression zu den angegebene Zeitpunkten mittels Western Blot analysiert.

Abb. 21  HO-1-Expression in humanen PBMCs nach Porphyrin-Behandlung

Frisch isolierte PBMCs wurden 15h +/- 30µM CoPP bzw. +/- 30µM Hämin inkubiert und anschließend mit Medium gewaschen. Für die Analyse wurden die Zellen entweder sofort nach der Präinkubation oder nach weiteren 24h Inkubation mit entsprechendem Western Blot-Lysepuffer lysiert und bis zur weiteren Analyse bei -80°C eingefroren. Die HO-1-Proteinexpression wurde mittels Western Blot analysiert. Dargestellt ist das Ergebnis eines repräsentativen Versuches von drei unabhängigen Exprimenten.

Die HO-1-Proteinanalyse bestätigte zum einen, dass konstitutiv keine HO-1-Expression nachzuweisen ist, und zum anderen, dass eine 15-stündige CoPP-Behandlung zu einer starken HO-1-Hochregulation führt, welche bis zu 24h nach Entfernen von CoPP sehr gut zu detektieren ist. Eine Behandlung mit Hämin resultiert dagegen in einer schwächeren HO-1-Expression nach 15h Inkubationszeit, welche 24h nach Entfernen von Hämin jedoch nicht mehr detektierbar war (Abb. 21).

4.3.2 Kinetik der HO-1-Expression in Monozyten nach CoPP- und Hämin-Behandlung

↓75

Um die Unterschiede in der durch CoPP und Hämin induzierten HO-1-Expression genauer zu analysieren, wurde die Proteinexpression nach 1h, 4h und 8h analysiert.

Da die HO-1 hauptsächlich in Monozyten induzierbar ist, wurden für die Kinetik diese Zellen aus den PBMCs isoliert, mit 30µm CoPP und 30µM Hämin inkubiert und anschließend sowohl die HO-1 Proteinexpression (Abb. 22) als auch der HO-1 mRNA-Level (Abb. ) analysiert.

Abb. 22 Kinetik der HO-1 Proteinexpression in humanen Monozyten nach Porphyrinbehandlung

Separierte Monozyten wurden über den angegebenen Zeitraum +/- 30µM CoPP bzw. +/- 30µM Hämin inkubiert, anschließend lysiert und die HO-1 Proteinexpression im Western Blot analysiert. Dargestellt ist das Ergebnis eines repräsentativen Versuches von drei unabhängigen Exprimenten.

↓76

Die Kinetik zeigt, dass Hämin schneller zu einer nachweisbaren Induktion von HO-1 führt als CoPP. Schon 4h nach der Behandlung mit Hämin ist HO-1 gut detektierbar, während die durch CoPP-induzierte HO-1-Expression marginal ist. Nach 8h wird durch beide Porphyrine eine gut nachweisbare HO-1-Proteinmenge induziert, wobei auf Grund der Bandenstärke quantitativ mehr HO-1 nach Hämin-Behandlung als nach CoPP-Behandlung produziert wurde. Die Hämin-vermittelte Induktion von HO-1 nimmt jedoch 15h nach der Behandlung wieder stark ab, während CoPP zu einer längeren HO-1-Induktion führt (Abb. 21).

Durch eine HO-1-mRNA-Analyse soll im nächsten Schritt ein genaueres Verständnis über die Kinetik der CoPP- und Hämin-induzierten HO-1-Expression erlangt werden.

Dazu wurden separierte Monozyten über den angegebenen Zeitraum mit 30µM CoPP bzw. 30µM Hämin inkubiert und die HO-1-Genexpression nach verschiedenen Zeitpunkten mittels RT-PCR analysiert.

↓77

Abb. 23 Kinetik der HO-1 Genexpression in humanen Monozyten nach CoPP- und Hämin-Behandlung

Separierte Monozyten wurden für 2h, 4h, 8h und 18h +/- 30µM CoPP bzw. +/- 30µM Hämin stimuliert. Nach 18h Stimulation wurde ein Teil der Zellen gewaschen und für weitere 12h, 24h bzw. 48h mit Medium inkubiert. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden die jeweiligen Zellen mit speziellem RNA-Lysepuffer lysiert und bis zur weiteren Analyse bei -80°C eingefroren. Die HO-1 Genexpression wurde mittels RT-PCR analysiert. Dargestellt ist das Ergebnis eines repräsentativen Versuches von drei unabhängigen Exprimenten.

Die Analyse der mRNA-Expression ergab, dass Monozyten konstitutiv nur wenig HO-1 mRNA exprimieren. Während einer Behandlung mit 30µM CoPP und 30µM Hämin steigt die HO-1 mRNA-Expression jedoch stark an. Allerdings zeigt sich eine verschobene Kinetik im Vergleich von CoPP- und Hämin-induzierter HO-1-Expression. Während es durch Hämin zu einer sehr schnellen HO-1 Induktion kommt, die bereits nach 2h Inkubation ihr Maximum erreicht und nach 18h wieder auf Kontrollniveau abgesunken ist, steigt die CoPP-induzierte HO-1-Expression langsamer an und erreicht erst nach 4h Inkubation ihr Maximum. Nach 8h nimmt auch die CoPP-induzierte HO-1-Expression langsam wieder ab, bleibt jedoch auch 48h nach Entfernen des Induktors deutlich über dem Niveau der unbehandelten Kontrollzellen (Abb. 23).

Sowohl die RNA-Analyse, als auch die Proteinanalyse (Abb. 21 und Abb. 22) zeigen, dass beide Porphyrine die Expression von HO-1 induzieren.

4.3.3 Einfluss von Hämin auf die monozytäre HLA-DR-Expression

↓78

Die oben dargestellten Daten zeigten eine langanhaltendere Induktion der HO-1-Expression durch das synthetische Protoporphyrin CoPP im Vergleich zu Hämin. Unter der Annahme, dass die verminderte HLA-DR-Expression von der induzierten HO-1-Expression abhängt, sollte die in Folge einer CoPP-Behandlung beobachtete Hemmung der HLA-DR-Expression ebenfalls stärker ausfallen als nach Hämin-Behandlung.

Um diese Vermutung zu untersuchen, wurde die monozytäre HLA-DR-Expression in CoPP- bzw. Hämin-behandelten PBMCs verglichen.

Abb. 24 HLA-DR-Expression von Monozyten nach Porphyrinbehandlung

Die Zellen wurden 15h +/- 30µM CoPP bzw. +/- 30µM Hämin inkubiert, anschließend mit Medium gewaschen und für weitere 24h inkubiert. Mittels Durchflusszytometrie wurde die HLA-DR Expression der CD14+ Monozyten analysiert. Gezeigt sind die Mittelwerte mit Standardabweichung von 28 (CoPP-Behandlung) bzw. 8 (Hämin-Behandlung) unabhängigen Experimenten als prozentuale Abweichung von den unbehandelten Kontrollzellen. *=p<0,01

↓79

24h nach Präinkubation zeigte sich sowohl in CoPP- als auch in Hämin-behandelten Monozyten eine signifikant Hemmung der konstitutiven HLA-DR-Expression. Die im Vergleich zu Hämin-behandelten Zellen tendentiell stärkere HLA-DR-Hemmung nach CoPP-Präinkubation ist möglicherweise auf die stärker HO-1-Induktion durch CoPP zurück zu führen (Kapitel 4.3.1 und 4.3.2).

4.3.4 Hemmung der HO-1-Expression mittels siRNA

Im nächsten Schritt sollte mittels spezifischer Hemmung der HO-1-mRNA gezeigt werden, dass die beobachteten Porphyrin-Effekte tatsächlich HO-1-abhängig sind. In diesem Fall sollte eine Hemmung der HO-1-Induktion mittels spezifischer siRNA die CoPP- und Hämin-vermittelten Effekte aufheben.

Zunächst wurde die Effizienz der HO-1-spezifischen siRNA hinsichtlich ihrer Hemmung der HO-1-Expression untersucht. Dazu wurden Monozyten mit HO-1-spezifischer siRNA, unspezifischer Kontroll-siRNA oder ohne jegliche siRNA transfiziert. Die transfizierten Zellen wurden anschließend 15h mit 30µM CoPP behandelt und danach die HO-1-Proteinexpression mittels Western Blot analysiert.

↓80

Abb. 25 HO-1 Proteinexpression von Monozyten nach Transfektion von siRNA

Separierte Monozyten wurden mit HO-1-spezifischer siRNA bzw. mit unspezifischer Kontroll-siRNA transfiziert und anschließend für 15h +/- 30µM CoPP inkubiert. Die HO-1- Proteinexpression wurde mittels Western Blot detektiert. Dargestellt ist das Ergebnis eines repräsentativen Versuches von drei unabhängigen Exprimenten

Es zeigte sich, dass die Transfektion alleine keinen Effekt auf die Expression des Hitzeschockproteins (HO-1) hat. Eine CoPP-Behandlung führt jedoch sowohl in den ohne siRNA transfizierten Monozyten als auch in den mit der unspezifischen siRNA transfizierten Zellen zu einer massiven HO-1-Proteinexpression. Nach Transfektion mit HO-1-spezifischer siRNA ist die CoPP-induzierte HO-1-Expression jedoch nahezu vollständig gehemmt.

Die Proteinanalyse der transfizierten Zellen zeigte demnach eine optimale Hemmung der HO-1-Expression nach Transfektion mit HO-1-spezifischer siRNA.

↓81

Wenn die CoPP- und Hämin-vermittelten Effekte ausschließlich HO-1-abhängig sind, sollte eine Hemmung der HO-1-Expression die Inhibition der HLA-DR-Expression aufheben.

Zur Untersuchung dieser Annahme wurde daher die HLA-DR-Expression in siRNA-transfizierten Monozyten nach 24h nach CoPP- bzw. Hämin-Präinkubation (15h mit 30µM CoPP bzw. 30µM Hämin) mittels Durchflusszytometrie analysiert.

Abb. 26 HLA-DR-Expression nach Hemmung der HO-1-Expression mittels siRNA

Separierte Monozyten wurden mit HO-1 spezifischer siRNA bzw. mit unspezifischer Kontroll-siRNA transfiziert, 2h ruhen gelassen und dann 15h +/- 30µM CoPP bzw. +/- 30µM Hämin inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit Medium gewaschen und weitere 24h inkubiert. Mittels Durchflusszytometrie wurde dann die HLA-DR-Expression analysiert. Gezeigt sind die Mittelwerte mit Standardabweichung von 3 (CoPP-Behandlung) bzw. die Werte von einem (Hämin-Behandlung) unabhängigen Experiment(en) als prozentualer Wert der Kontrollzellen. 

↓82

Die Analyse der HLA-DR-Expression zeigt, dass die Suppression der HO-1-Expression nicht die CoPP- bzw. Hämin-vermittelte Hemmung der MHC-II-Expression aufheben kann (Abb. 26), woraus geschlussfolgert wurde, dass die verwendeten Porphyrine CoPP und Hämin die monozytäre HLA-DR-Expression über HO-1-unabhängige Mechanismen hemmen.

4.4 Rolle des Hämoglobin-Scavenger Rezeptors in der Porphyrin-vermittelten Hemmung der HLA-DR-Expression

Die strukturelle Ähnlichkeit der verwendeten Protoporphyrine CoPP und Hämin mit dem natürlichen Substrat der HO-1, dem Hämprotein, führte zu der Annahme, dass die drei Moleküle über den selben Mechanismus in die Zelle gelangen und damit auch eine ähnliche Wirkung auf die Zielzelle haben. Die Aufnahme des aus vier Hämproteinen aufgebauten Hämoglobins wird über den Hämoglobin-Scavenger Rezeptor CD163 initiiert. Unter Berücksichtigung der oben aufgestellten Hypothese sollte eine Behandlung der Zellen mit Hämoglobin (Hb) bzw. Hämoglobin-Haptoglobin-Komplexen (HbHg), ähnlich wie CoPP und Hämin, zu einer Hemmung der konstitutiven HLA-DR-Expression führen. Sofern die Effekte CD163-abhängig sind, sollte zudem ein Blockieren des Hämoglobin-scavenger Rezeptors mittels spezifischer Antikörper die Porphyrin-vermittelte HLA-DR-Hemmung aufheben.

4.4.1 Einfluss einer HbHg-Behandlung auf die konstitutive HLA-DR-Expression in Monozyten

Zunächst wurde kontrolliert, ob in humanen Monozyten eine konstitutive CD163-Expression zu detektieren ist. Dazu wurden frisch isolierte PBMC in Kultur genommen und die CD163-Expression der Monozyten direkt nach Präparation, sowie nach weiteren 15h bzw. 40h Inkubation detektiert.

↓83

Zudem wurde die Beeinflussung der monozytären HLA-DR-Expression durch eine Hb- bzw. HbHg-Behandlung untersucht. Für die Analyse der MHC-II-Expression wurden die Zellen 15h mit CoPP, Hämin und HbHg inkubiert, gewaschen, weitere 24h inkubiert und anschließend die HLA-DR-Expression der Monozyten mittels Durchflusszytometrie analysiert.

Abb. 27 Konstitutive Expression von CD163 (A) und HLA-DR (B) auf Monozyten nach Porphyrin-Behandlung

(A) Die CD163-Expression der CD14-positive Monozyten wurde direkt nach PBMC-Präparation (0h), sowie 15h und 40h nach der Präparation mittels Durchflusszytometrie analysiert. Gezeigt ist das Ergebnis eines repräsentativen Versuches von drei unabhängigen Experimenten. (B) PBMCs wurden 15h mit 30µM CoPP, 30µM Hämin und 1mg/ml HbHg stimuliert, anschließend mit Medium gewaschen und weitere 24h inkubiert. Nach der Inkubation wurde die HLA-DR Expression der CD14-positiven Monozyten mittels Durchflusszytometrie analysiert. Gezeigt sind die Mittelwerte mit Standardabweichung von 11 unabhängigen Experimenten als prozentualer Wert der unbehandelten Kontrollzellen. *=p<0,05

Das Ergebnis der CD163-Messung bestätigt die Literaturdaten [122] und zeigt, dass kultivierte genommene Monozyten ihre CD163-Expression hoch regulieren (Abb. 27A).

↓84

Eine Präinkubation mit HbHg-Komplexen resultiert zudem ebenso wie für Porphyrine gezeigt in einer signifikanten Hemmung der konstitutiven MHC-II-Expression (Abb. 27B). Gleiche Hemmeffekte auf die HLA-DR-Expression wie für HbHg-Komplexe wurden ebenfalls für eine Präinkubation mit Hämoglobin alleine beobachtet (Daten nicht gezeigt, siehe auch 7.4.3).

Die Bindung von HbHg-Komplexen an den Hämoglobin-Scavenger Rezeptor induziert die Synthese des antiinflammatorischen Zytokins IL-10 [87] , welches in der Lage ist, die HLA-DR-Expression in Monozyten und Makrophagen zu inhibieren [123] .

Im nächsten Versuch sollte daher geklärt werden, ob die Protoporphyrin-vermittelte Hemmung der HLA-DR-Expression IL-10 abhängig ist.

4.4.2 Einfluss von IL-10 auf die Porphyrin-Effekte

↓85

Zunächst wurde die IL-10-Konzentration im Kulturüberstand nach einer 15stündigen Präinkubation von PBMC mit CoPP, Hämin und HbHg gemessen. Anschließend wurde die Wirkung des Zytokins durch einen IL-10-neutralisierender Antikörper (anti IL-10) blockiert und die Effekte einer Porphyrin-Behandlung auf die monozytäre HLA-DR-Expression mit und ohne anti-IL-10 Antikörper mittels Durchflusszytometrie verglichen.

Abb. 28 IL-10-Expression (A) und HLA-DR-Expression nach Neutralisierung von IL-10 (B) nach Behandlung mit CoPP, Hämin und HbHg

(A) PBMCs wurden 15h mit 30µM CoPP, 30µM Hämin und 1mg/ml HbHg-Komplexen inkubiert und anschließend die IL-10 Konzentration im Überstand am Immulite gemessen. Gezeigt ist das Ergebnis eines repräsentativen Versuches von zwei unabhängigen Experimenten. (B) PBMCs wurden 15h mit 10µg/ml anti IL-10 und mit 30µM CoPP, 30µM Hämin und 1mg/ml HbHg-Komplexen stimuliert. Anschließend wurden Zellen mit Medium (RPMI komplett) gewaschen, weitere 24h inkubiert und nach der Inkubation die HLA-DR Expression der CD14-positiven Monozyten mittels Durchflusszytometrie analysiert. Gezeigt sind die Mittelwerte mit Standardabweichung von 6 unabhängigen Experimenten als prozentualer Wert der unbehandelten Kontrollzellen. *=p<0,05

Das Ergebnis der IL-10 Messung zeigt, dass Monozyten sowohl konstitutiv als auch nach CoPP-Behandlung kaum IL-10 produzieren. Im Gegensatz dazu induziert eine Behandlung mit Hämin und HbHg die Synthese von IL-10, so dass große Mengen des antiinflammatorischen Zytokins im Überstand zu detektiert sind (Abb. 28A). Die Abb. 28 B zeigt jedoch, dass die gesteigerte IL-10-Produktion nicht für die Porphyrin-induzierte Hemmung der HLA-DR-Expression verantwortlich ist, da eine Neutralisation von IL-10 den hemmenden Effekt von Hämin und HbHg nicht aufheben kann (Abb. 28B). Für eine Unabhängigkeit von IL-10 spricht zudem, dass eine CoPP-Behandlung kein IL-10 induziert, aber dennoch zu einer signifikanten Hemmung der HLA-DR-Expression führt.

4.4.3 Beeinflussung der Porphyrin-Effekte durch Blockieren von CD163 (Hämoglobin-Scavenger-Rezeptor)

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Die bisherigen Befunde zeigten, dass eine Behandlung sowohl mit den Porphyrinen CoPP und Hämin, als auch mit Hb und HbHg-Komplexen zu einer Hemmung der monozytären HLA-DR-Expression führt. Dies und die strukturelle Ähnlichkeit der verwendeten Porphyrine lässt die Hypothese zu, dass die vermittelten Effekte durch einen CD163-abhängigen Mechanismus initiiert werden. Daher sollte durch Blockieren des Hämoglobin-Scavenger Rezeptors die Porphyrin- bzw. Hb/Hg-induzierten Effekte aufgehoben werden.

Zum Blockieren des Rezeptors wurde der CD163-spezifische Antikörperklon EDHu-1 verwendet. Dieser bindet an die SRCR Domäne 3 des Rezeptors und blockiert somit die Bindung von HbHg an CD163 [124] .

Erste Austestungen von EDHu-1 ergaben jedoch, dass der Antikörper Endotoxin-kontaminiert war (EDHu-1: 263pg Endotoxin/ml), so dass dieser zunächst mittels EndoTrap-Red-System aufgereinigt werden musste.

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Der aufgereinigte, endotoxinfreie Antikörperklon EDHu-1 (Frak.2A) wurde dann zum Blockieren des Hämoglobin-Scavenger Rezeptors verwendet. Die eingesetzten EDHu-1-Konzentrationen ergaben sich aus einer veröffentlichten Studie, bei der die HbHg-induzierte IL-10-Sythese in humanen Monozyten mit einem CD163-Antikörper (Klon RM3/1) gehemmt werden konnte [87] . Der Antikörperklon RM3/1 wurde in dieser Arbeit jedoch auf Grund seiner sehr starken Endotoxinkontamination (RM3/1: 20ng Endotoxin/ml) nicht verwendet.

Vorversuche zeigten, dass auch Hämoglobin (Hb) alleine die konstitutive Expression von HLA-DR vermindert (siehe 7.4.1). Für den Versuch wurden PBMCs 30min mit 10ng/ml – 50ng/ml Frak.2A (Endotoxin-freier EDHu-1) vorbehandelt, bevor sie zusätzlich 15h mit 1mg/ml Hb inkubiert wurden. Anschließend wurden die Zellen weitere 24h mit Medium inkubiert und die HLA-DR-Expression der Monozyten mittels Durchflusszytometrie analysiert.

Abb. 29 HLA-DR-Expression nach Blockieren von CD163

PBMCs wurden 30min mit 10ng/ml, 1µg/ml, 20mg/ml und 50µg/ml Frak.2A (Endotoxin-freier EDHu-1) vorinkubiert und dann für weitere 15h zusätzlich +/- 1mg/ml Hb stimuliert. Anschließend wurden die Zellen mit Medium (RPMI komplett) gewaschen und weitere 24h inkubiert. Nach der Inkubation wurden die HLA-DR-Expression der CD14-positiven Monozyten mittels Durchflusszytometrie analysiert. Gezeigt sind die Mittelwerte mit Standardabweichung von 9 unabhängigen Experimenten als prozentualer Wert der unbehandelten Kontrollzellen. *=p<0,05.

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Die Ergebnisse zeigen zum einen, dass der endotoxinfreie Antikörperklon EDHu-1 die konstitutive HLA-DR-Expression nicht beeinflusst und zum anderen, dass eine Stimulation mit Hämoglobin (Hb) signifikant die Expression von HLA-DR hemmt. Allerdings kann ein Blockieren des Hämoglobin-Scavenger Rezeptors mittels EDHu-1 den hemmenden Effekt von Hb nicht aufheben. Ein Blockieren der SRCR Domäne 3 von CD163 durch EDHu-1 hob zudem nicht die Hb-induzierte IL-10 Expression auf (Daten nicht gezeigt). Dies kann darauf hindeuten, dass die SRCR Domäne 3 nicht für die Hb-induzierte IL-10-Expression verantwortlich ist oder dass die eingesetzte Antikörperkonzentration nicht ausreichend für eine optimale Blockierung von CD163 war. Unter der Annahme, dass die verwendeten Porphyrine über den selben Mechanismus die konstitutive Expression von HLA-DR vermindern, können die Daten aber ebenfalls dafür sprechen, dass die durch CoPP, Hämin und HbHg-Komplexen vermittelte Hemmung der HLA-DR-Expression unabhängig von einer Interaktion mit dem Hämoglobin-Scavenger Rezeptor CD163 ist.

4.5 Welche intrazellulären Signalwege werden durch Protoporphyrine beeinflusst ?

Ausgangspunkt dieser Arbeit war die These, dass die Porphyrin-induzierte Überexpression von HO-1 zu einer Hemmung der MHC-II-Expression auf Monozyten führt. Allerdings zeigen die im Kapitel 4.3.4 präsentierten Ergebnisse, dass die durch CoPP und Hämin-induzierte Hemmung der HLA-DR-Expression über HO-1-unabhängige Mechanismus vermittelt wird. Mittels spezifischer siRNA wurde die Porphyrin-induzierte Expression von HO-1 zwar effektiv gehemmt (Abb. 25), allerdings blieb die CoPP- und Hämin-vermittelte Hemmung der HLA-DR-Expression davon unbeeinflusst. Die Mechanismen der Porphyrin-vermittelten intrazellulären Signaltransduktion sind bis heute weitgehend unklar. Im Folgenden wurden daher verschiedene molekulare Mechanismen untersucht, die an der Regulation der HLA-DR-Expression beteiligt sind und daher von den Porphyrinen beeinflusst sein könnten.

4.5.1 Einfluss von CoPP auf die IFN-γ-induzierte STAT-1-Phosphorylierung

Wie in Kapitel 4.2.5 gezeigt, vermindert eine CoPP-Vorbehandlung die IFN-γ-induzierte Expression von CIITA. Durch die Interaktion von IFN-γ mit seinem Rezeptor (IFN-γ-R) wird eine intrazelluläre Signaltransduktionskaskade initiiert, in deren Folge durch Phosphorylierung der Transkriptionsfaktor STAT-1 aktiviert wird, welcher dann die Expression von CIITA induziert (siehe Kapitel 1.6).

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Im folgenden Versuch wurde untersucht, inwiefern eine CoPP-Präinkubation die IFN-γ-induzierte STAT-1-Phosphorylierung beeinflusst. Da intrazelluläre Phosphorylierungskaskaden nach Rezeptor/Ligand-Wechselwirkung in der Regel sehr schnell aktiviert werden, wurden PBMCs nach einer 15h Vorbehandlung mit 30µM CoPP 15min mit IFN-γ stimuliert und direkt anschließend die STAT-1-Phosphorylierung mittels Durchflusszytometrie analysiert.

Abb. 30 Auswirkung einer CoPP Vorbehandlung auf die IFN-γ-induzierte STAT-1 Phosphorylierung

PBMCs wurden 15h +/- 30µM CoPP vorbehandelt, gewaschen und anschließend für 15min mit 10ng/ml IFN-γ stimuliert. Zur Analyse der intrazellulären STAT-1-Phosphorylierung wurden die Zellen sofort nach der Stimulation fixiert, wie unter Kapitel 3.9.7 angegeben gefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert. Gezeigt sind die Mittelwerte mit Standardabweichung von 5 unabhängigen Experimenten als prozentualr Wert der Kontrollzellen. *=p<0,05.

Die Analyse zeigt, dass eine CoPP-Behandlung die IFN-γ-induzierte Phosphorylierung von STAT-1 signifikant hemmt, so dass die Hemmung der IFN-γ-induzierten HLA-DR-Expression (siehe 7.2.5) mit einer verminderten Phosphorylierung von STAT-1 erklärt werden kann. Im Gegensatz dazu hat CoPP jedoch keinen Einfluss auf die kaum vorhandene konstitutive STAT-1 Phosphorylierung (Daten nicht gezeigt). Die Porphyrin-induzierte Hemmung der konsitutitven monozytären HLA-DR-Expression ist daher eher unabhängig von STAT-1.

4.5.2 Einfluss von CoPP auf die STAT-3-Phosphorylierung in humanen Monozyten

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Kürzlich veröffentlichte Ergebnisse aus der eigenen Arbeitsgruppe zeigten, dass im Mausmodell die CoPP-vermittelte Hemmung der LPS-induzierten DC-Reifung von einer Aktivierung des STAT-3 Signalweges abhängt und unabhängig von der CoPP-induzierten HO-1-Hochregulation ist. Durch Blockieren der STAT-3-Aktivität mittels siRNA und einem STAT-3/JAK-2 Inhibitor (JSI124) wurde die CoPP-vermittelte Hemmung der LPS-induzierten MHC-II-Expression in murinen DC aufgehoben [125] .

Wenn die CoPP-vermittelte Hemmung der HLA-DR-Expression auch im Menschen von STAT-3 abhängt, sollte auch hier eine Hemmung des STAT-3-Signalweges die CoPP-induzierte Hemmung der HLA-DR-Expression aufheben.

Um diese Hypothese zu untersuchen wurde die Auswirkung einer STAT-3-Hemmung mittels JSI 124 auf die CoPP- bzw. Hämin-vermittelte Hemmung der HLA-DR-Expression in Monozyten untersucht.

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Abb. 31 HLA-DR-Expression nach Hemmung des STAT3/JAK Signalweges

PBMCs wurden 15h +/- 30µM CoPP bzw. +/- 30µM Hämin in An- oder Abwesenheit von 2,5µM JSI-124 inkubiert. Dann wurden die Zellen mit Medium gewaschen und anschließend weitere 24h inkubiert. Die HLA-DR-Expression der CD14-positiven Monozyten wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert. Gezeigt sind die Mittelwerte mit Standardabweichung von 5 (CoPP-Behandlung) bzw. 3 (Hämin-Behandlung) unabhängigen Experimenten als prozentualer Wert der unbehandelten Kontrollzellen. Signifikanzen gegenüber den unbehandelten Kontrollzellen: *=p<0,05; #=p=0,109

Die Daten zeigen, dass eine pharmakologische Hemmung der STAT-3-Phosphorylierung nicht zu einer Aufhebung der CoPP-vermittelten Hemmung der HLA-DR-Expression führte. Vielmehr scheint JSI124 die Porphyrin-vermittelte Hemmung der HLA-DR-Expression zu verstärken. Diese Daten sprechen gegen die im Mausmodell gezeigte STAT3-Abhängigkeit der inhibitorischen CoPP-Effekte auf die HLA-DR-Expression in humanen Monozyten.

Auf einen STAT-3 unabhängigen Mechanismus deutet auch die Analyse der STAT-3-Phosphorylierung mittels Western Blot und durchflusszytometrischer Analyse. Als Positivkontrolle diente jeweils die Stimulation mit IL-6 und IL-10. Beide Zytokine induzieren eine STAT-3-abhängige Signalweiterleitung [126,127,128] , so dass schon nach 15 Minuten Inkubation eine Phosphorylierung von STAT-3 nachweisbar ist.

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Abb. 32 STAT-3 Tyrosin-Phosphorylierung nach Porphyrinbehandlung

Separierte Monozyten wurden 15min mit 10ng/ml IL10 und 500pg/ml IL-6, sowie 15min bzw. 30min +/- 30µM CoPP bzw. +/- 30µM Hämin inkubiert, anschließend sofort im entsprechenden Lysepuffer lysiert und bis zur Analyse bei -80°C eingefroren. Mittels Western Blot wurde die STAT-3 Tyr705 Phosphorylierung analysiert. Dargestellt ist das Ergebnis eines repräsentativen Versuches von drei unabhängigen Exprimenten.

Die Proteinanalyse der STAT-3-Phosphorylierung mittels Western Blot zeigt, dass unbehandelte Monozyten konstitutiv keine STAT-3-Phosphorylierung aufweisen. Auch in den CoPP- und Hämin-behandelten Zellen ist keine STAT-3-Phosphorylierung zu detektieren, während in den mit IL-10 und IL-6 behandelten Positivkontrollen nach 15min eine gute STAT-3-Phosphorylierung messbar ist. 

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Ähnliche Ergebnisse zeigten sich bei der Messung der intrazellulären STAT-3-Phosphorylierung mittels Durchflusszytometrie (Abb. 33). Weder nach 15min (Abb. 32, Abb. 33A+B) noch nach 15h (Abb. 33B) Inkubation ist eine konstitutive Phosphorylierung von STAT-3 zu detektieren. In der mit IL-10 behandelten Positivkontrolle ist jedoch eindeutig eine STAT-3 Phosphorylierung zu messen.

Da in den unbehandelten Kontrollzellen keine Hinweise auf eine konstitutiv erhöhte STAT-3 Phosphorylierung zu finden sind, deuten diese Ergebnisse zudem darauf hin, dass die inhibitorische Wirkung von JSI124 ein STAT-3-unabhängiger Effekt ist.

 

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Abb. 33 STAT-3 Tyrosin-Phosphorylierung nach CoPP-Behandlung

(A)+ (B) PBMCs wurden mit Medium (schwarze Linie, Kontrolle), 15min (rote Linie) bzw. 15h (nicht gezeigt) mit 30µM CoPP, sowie 15min mit 10ng/ml IL-10 (grüne Linie; Positivkontrolle) inkubiert und anschließend sofort die intrazelluläre STAT-3-Tyr705 Phosphorylierung in Monozyten,mittels Durchflusszytometrie, wie in Kapitel 3.9.8 angegeben, analysiert. In Abb. (B) ist die STAT-3 Phosphorylierung in Monozyten als Mittelwert mit Standardabweichung von 5 unabhängigen Experimenten als prozentualer Wert der unbehandelten Kontrollzellen gezeigt. Signifikanz gegenüber den unbahandelten Kontrollzellen: *=p<0,05.

4.5.3 Beeinflussung der CoPP-Effekte durch Hemmung der Histondeacetylierung

Die im Kapitel 4.2 präsentierten Befunde zeigen, dass eine Präinkubation mit CoPP zu einer Beeinträchtigung der Genexpression von CIITA und HLA-DR führt. Ursache dafür kann eine Beeinflussung der Histonacetylierung/Deacetylierung sein. Mit Hilfe des HDAC-Inhibitors Trichostatin A (TSA) wurde deshalb untersucht, ob bei der CoPP-induzierten Hemmung der konstitutiven HLA-DR-Expression in Monozyten eine verstärkte Deacetylierung eine Rolle spielt.

Dazu wurden PBMCs 15h synchron mit 100ng/ml TSA und 30µM CoPP behandelt, anschließend weitere 24h mit Medium inkubiert und die monozytäre HLA-DR-Expression mittels Durchflusszytometrie analysiert. Die eingesetzte TSA-Konzentration entsprach dabei der höchstmöglichen nichttoxischen Konzentration (Zellviabilität überprüft mittels Trypanblau-Färbung), welche auch in publizierten Studien verwendet wird [129] .

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Abb. 34 HLA-DR Expression nach HDAC-Hemmung

PBMCs wurden 15h +/- 100ng/ml TSA, sowie +/- 30µM CoPP inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit Medium (RPMI komplett) gewaschen und weitere 24h inkubiert. Die Analyse der HLA-DR Expression auf CD14-positiven Monozyten erfolgte mittels Durchflusszytometrie. Gezeigt sind die Mittelwerte mit Standardabweichung von 3 unabhängigen Experimenten als prozentualer Wert der unbehandelten Kontrollzellen. #=p=0,068 

Das Ergebnis zeigt, dass eine Hemmung der Deacetylierung mittels TSA weder einen Einfluss auf die konstitutive MHC-II-Expression hat, noch die CoPP-vermittelte Hemmung der HLA-DR Expression aufheben kann. Eine verstärkte HDAC-Aktivität scheint demnach nicht an den CoPP- vermittelten Effekten auf die HLA-DR-Expression beteiligt zu sein.

4.5.4 Beeinflussung der Porphyrin-Effekte durch Hemmung von Protein Kinase A

Die cAMP-abhängige Proteinkinase A (PKA) überträgt nach Aktivierung Phosphatgruppen und ist so in der Lage andere Moleküle zu beeinflussen. Literaturdaten deuten u.a. auf eine Beteiligung von PKA an der Regulation von MHC-II hin (Kapitel 1.6.2). Aus diesem Grund wurde im folgenden Versuch untersucht, ob eine Beeinflussung der PKA-Aktivität eine Auswirkung auf die konstitutive und CoPP-vermittelte Hemmung der monozytären HLA-DR-Expression hat. Eine Erhöhung der intrazellulären cAMP-Konzentration mittels Forskolin steigert die PKA-Aktivität, während der Einsatz des cAMP-Antagonisten Rp-8-Br cAMP die Aktivität von PKA hemmt. Rp-8-Br cAMP ist ein membrangängiges cAMP-Analog, welches irreversibel an die regulatorische Untereinheit des PKA R2C2-Komplexes bindet, dadurch die cAMP-Bindestelle blockiert und die Dissoziation der Untereinheiten verhindert.

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Abb. 35 HLA-DR Expression nach Hemmung von PKA

PBMCs wurden 15h mit 100µM Rp-8-Br cAMP, 30µM CoPP, 30µM Hämin bzw. 100µM Forskolin inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit Medium gewaschen und weitere 24h +/- 100µM Rp-8-Br cAMP und 100µM Forskolin inkubiert. Die Analyse der HLA-DR Expression der CD14-positiven Monozyten erfolgte mittels Durchflusszytometrie. Gezeigt sind die Mittelwerte mit Standardabweichung von 4 (bzw. 2 [Hämin]) unabhängigen Experimenten als prozentualer Wert der unbehandelten Kontrollzellen. #=p=0,068

Weder eine Behandlung mit Forskolin noch eine Hemmung der PKA-Aktivität mittels Rp-8-Br cAMP beeinflusst die konstitutive HLA-DR-Expression in humanen Monozyten. Zudem hebt eine PKA-Hemmung die CoPP- und Hämin-vermittelte Hemmung der HLA-DR Expression nicht auf. Die Porphyrin-vermittelte MHC-II-Hemmung ist demnach unabhängig von einer PKA-Aktivierung.

4.5.5 Beeinflussung der konstitutiven HLA-DR-Expression durch MAPK

Bei der intrazellulären Signalweiterleitung spielen Mitogen-Aktivierte-Protein-Kinasen (MAPK) in der Regel eine wichtige Rolle. Da für keinen der bisher getesteten Signalwege eindeutig eine Beteiligung an der Porphyrin-vermittelten Hemmung der monozytären HLA-DR-Expression gezeigt werden konnte, wurde im nächsten Versuch eine mögliche Beteiligung der MAPK p38 und JNK an der konstitutiven HLA-DR-Expression in Monozyten untersucht.

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PBMC wurden 15h mit dem p38-Inhibitor SB203580 und dem JNK-Inhibitor SP600125 inkubiert und anschließend die HLA-DR-Expression im Vergleich zu unbehandelten und Porphyrin-behandelten Zellen analysiert.

Abb. 36 HLA-DR Expression nach Hemmung von p38 und JNK

PBMCs wurden 15h mit 30µM CoPP, 30µM Hämin, 10µg/ml SB203580 (p38-Inhibitor) und 10µM SP600125 (JNK-Inibitor) behandelt. Anschließend wurden die Zellen mit Medium gewaschen und weitere 24h in An- und Abwesenheit der beiden Inhibitoren inkubiert. Nach der Inkubation wurde die HLA-DR Expression der CD14-positiven Monozyten mittels Durchflusszytometrie analysiert. Gezeigt sind die Mittelwerte mit Standardabweichung von 3 unabhängigen Experimenten (außer Hämin, da n=1) als prozentualer Wert der unbehandelten Kontrollzellen.

Eine Hemmung von p38 mittels SB203580 hatte keinen Effekt auf die konstitutive HLA-DR-Expression, wohingegen eine Behandlung mit dem JNK-Inhibitor SP600125 zu einer verminderten MHC-II-Expression führte. Dies kann auf eine Beteiligung des JNK-Signalweges an der konstitutiven HLA-DR-Expression hindeuten. Eine Western Blot Analyse der JNK-Phosphorylierung in unbehandelten oder Porphyrin-behandelten Monozyten zeigte jedoch keine Phosphorylierung von JNK (Daten nicht gezeigt), so dass auch unspezifische Inhibitoreffekte für die Hemmung der HLA-DR-Expression in SP600125-behandelten Monozyten verantwortlich sein könnten. Um hier eine eindeutige Aussage zu treffen, wären weitere Versuche mit anderen JNK-Inhibitoren sinnvoll.


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29.10.2014