Identifikation von SNARE-Proteinen im Urothel der Ratte

Abstract

Die Deckzellen des Urothels sind die einzigen Zellen, die mit dem Urin über einen längeren Zeitraum in direktem Kontakt stehen. Ihre apikale Plasmamembran weist ein facettiertes Aussehen auf und hat dicht gepackte Uroplakin III Moleküle eingelagert, die durch Ausbildung von hexagonalen Proteinkomplexen entscheidend sind für die hohe chemische Resistenz, gegen die zum Teil zellschädigende Zusammensetztung des Urins. Unterhalb der apikalen Plasmamembran befinden sich zahlreiche diskuide Vesikel. Diese entsprechen in ihrem molekularen Membranaufbau der apikalen Membran und können als präapikale Reservemembran angesehen werden, die bei Bedarf in die apikale Plasmamembran eingebaut werden kann. In der vorliegenden Arbeit ist untersucht worden, in wieweit SNARE-Proteine für die Fusion zwischen den diskuiden Vesikeln und der apikalen Plasmamembran von Bedeutung sind. In Immunoblotanalysen wurde das Vorkommen von Synaptobrevin, Syntaxin, SNAP23, NSF und alpha,beta-SNAP gezeigt und es konnte in Immunopräzipitationen die Ausbildung des SNARE-Haftkomplexes nachgewiesen werden. Immunfluoreszenzuntersuchungen und Immunogoldmarkierungen bestätigten das Vorhandensein von SNARE-Proteinen und wiesen durch das subzelluläre Verteilungsmuster der Proteine auf einen kombinierten homotypischen und heterotypischen Fusionsmechanismus hin. Hinweise auf eine mit der Fusion der Vesikel gleichgeschaltete Endozytose wurden nicht gefunden, das Abknospen von Membranbestandteilen der apikalen Zellmembran konnte jedoch ultrastrukturell gezeigt werden. Ein weiterer Hinweis auf eine möglicherweise kontinuierliche Erneuerung der apikalen Zellmembran der Deckzellen konnte durch den Nachweis von Uroplakin III im Urin von gesunden Probanden gebracht werden. In einem Zentrifugationsexperiment wurde Uroplakin III in Fraktionen von Membranaggregaten sehr unterschiedlicher Größe nachgewiesen, was die ultrastrukturellen Befunde, die das Abknospen sowohl von einzelnen Vesikeln, wie auch von größeren Membranbestandteilen zeigten, bestätigt.

The luminal surface of the bladder epitehlium is continuously exposed to the urine that differs in ionic composition and osmolarlity from blodd. The apical plasma membrane of facet cells, facing the urine, is covered with rigid-looking plaques consisting of hexagonal uroplakin-particles. Together with tight junctions these plaques form a specialized membrane compartment that represents one of the tightest and most impermeable barrier of the body. Plaques also occur in the membrane of cytoplasmic discuid vesicles. Here we show that synaptobrevin, SNAP23, syntaxin, NSF and alpha/beta-SNAP are perfectly colocalized with uroplakin III at the apical plasma membrane and with the membrane of discuid vesicles. This distribution suggest that discuid vesicles of a homotypic and heterotypic fusion events. Furthermore we detected uroplakin III containing membranes of different size in the urine of healthy humans and rats. probably facet cells maintain their permeability barrier by a process of membrane renewal where pieces of the apical membrane are continuously taken off by freshly fused discuid vesicles.