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2004-04-20Dissertation DOI: 10.18452/15102
Prozessierung des pp89 MCMV MHC Klasse I Epitops durch das Proteasom
Voigt, Antje
Medizinische Fakultät - Universitätsklinikum Charité
Das Proteasom ist eine ATP- abhängige Protease, die sich aus vielen Untereinheiten zusammensetzt. Es ist für die Generierung der MHC Klasse I- restringierten Peptide verantwortlich, die im Folgenden auf der Zelloberfläche präsentiert werden. Nicht-funktionelle Proteine, die als so genannte defective ribosomal products (DRIP) bezeichnet werden, stellen eine wichtige Quelle für die Generierung von antigenen Peptiden, insbesondere jedoch von viralen Peptiden dar. Generell wird die Lehrmeinung vertreten, dass der Abbau von polyubiquitinierten Proteinen durch das 26S Proteasom zur Generierung von MHC Klasse I- Liganden führt. Allerdings ist weiterhin unklar, ob virale Proteine Ubiquitin- abhängig vom Proteasom abgebaut werden. Demnach sollte im Rahmen dieser Arbeit der Proteasom- abhängige Abbau des mCMV ie pp89 Proteins vor allem hinsichtlich einer Ubiquitinierung untersucht werden. Folglich wurden Konstrukte sowohl für ein rekombinantes pp89 (rek pp89) als auch für ein ODCpp89 Fusionsprotein entworfen. Somit konnten sowohl der in vitro Abbau dieser Proteine als auch die Prozessierung des spezifischen MHC Klasse I H2-Ld Epitops verfolgt werden. Experimente zum Nachweis von Ubiquitin- Protein- Konjugaten wurden in vivo mit stabil transfizierten Mausfibroblasten (B8 Zellen) durchgeführt. Die experimentellen Daten sprechen für einen schnellen in vitro Abbau des rek pp89 durch das 20S Proteasom. Das MHC Klasse I pp89 Epitop bzw. dessen 11mer Precursorpeptid wurden dabei mit hoher Präzision generiert. Spezifische CTL Assays weisen auf die Generierung des korrekten Epitops bzw. des Precursors hin. Nach Verdau des ODCpp89 Fusionsproteins durch 26S Proteasomen in Anwesenheit von Antizym konnten mit diesem Test ebenfalls das 9mer Epitop respektive das 11mer des pp89 nachgewiesen werden. Eine potentielle Ubiquitinierung des pp89 wurde in vivo in Zellkulturen untersucht. Nach Gabe von Proteasomeninhibitoren zu Mausfibroblasten konnte eine starke Akkumulierung von Ubiquitin- Konjugaten beobachtet werden. Allerdings konnte in den verschiedenen Versuchsansätzen kein Nachweis von pp89- Ubiquitin- Konjugaten erbracht werden. Demzufolge ist für die Generierung von viralen Epitopen ein Proteasom- abhängiger, aber Ubiquitin- unabhängiger Abbauweg denkbar.
 
The proteasome, an ATP-dependent, multisubunit protease, is responsible for the generation of most MHC class I restricted epitopes presented on the cell surface. Non-functional proteins, also known as defectice ribosomal products (DRiP), represent an important source for the generation of antigenic peptides in general and of viral epitopes in particular. It is widely accepted that the degradation of polyubiquitinated proteins by the 26S proteasome is a prerequisite for the generation of MHC class I ligands. However, the ubiquitin dependence for the proteasomal degradation of viral proteins is an issue so far unresolved. Therefore, the aim of this study was to analyze the proteasomal degradation of the mCMV ie pp89 in respect to an anticipated ubiquitinylation. Thus, a recombinant pp89 (recpp89) as well as an ODCpp89 fusion protein were generated. The in vitro processing of these proteins and the generation of a MHC class I H2-Ld epitope by proteasomes was further studied. Murine fibroblast cell lines (B8 cells) were used to analyze any in vivo evidence for potentially existing ubiquitin-protein conjugates. The experiments show that the recpp89 protein is rapidly degraded in vitro by the 20S proteasomes and that the correct MHC class I pp89 epitope or its 11mer precursor are generated with high fidelity. Furthermore, CTL assays, indicating the generation of the specific pp89 epitope or the 11mer precursor, also suggested a 26S proteasome-dependent degradation of the mCMV pp89-ODC fusion protein in the presence of antizyme. Treating cell cultures with proteasome inhibitors resulted in a significant accumulation of ubiquitin-conjugates in vivo. However, higher molecular weight pp89-ubiquitin conjugates were not detectable throughout the entire experimental set-up. Consequently, a proteasome-dependent, but ubiquitin-independent pathway can be postulated for the generation of viral epitopes.
 
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10.18452/15102
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