Nukleärer Import von 19S regulatorischen Komplexen in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Das 26S Proteasom führt die letzen Schritte des essentiellen, Ubiquitin abhängigen Proteinabbaus durch, indem es ubiquitinierte und fehlgefaltete Proteine erkennt und eliminiert. Da es in S. cerevisiae während allen Stadien der Zellteilung vornehmlich im Zellkern lokalisiert ist, ist der Importweg dieses 2,5 MDa umfassenden proteolytischen Komplexes in den Zellkern von besonderem Interesse. Das 26S Proteasom unterteilt sich in das katalytisch aktive 20S Proteasom sowie den 19S Regulatorkomplex. Für 20S Proteasomen konnten Lehmann und Mitarbeitende (2002, JMB, 317, 401) zeigen, dass Vorläuferkomplexe über den Karyopherin alpha/beta abhängigen Importweg in den Zellkern gelangen und dort zu 20S Proteasomen heranreifen. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass die nukleäre Lokalisation der 19S Regulatorkomplexe ebenfalls von Karyopherin alpha/beta abhängt. Die Untersuchung der potentiellen klassischen Kernlokalisationssequenzen (cNLS) in den Untereinheiten des 19S Base Subkomplex ergab, dass Rpn2 und Rpt2, eine non-ATPase Untereinheit sowie eine ATPase Untereinheit des Base Komplex, funktionelle cNLS beherbergen. Die Deletion der Rpt2 NLS führte zur wt Lokalisation der proteasomalen Subkomplexe. Die Deletion der NLS in Rpn2 dagegen bewirkte eine verschlechterte proteasomale Funktion und eine Mislokalisation der Komplexe. Unsere Daten unterstützen ein Modell wonach die nukleären 26S Proteasomen aus Subkomplexen zusammengelagert werden, die durch Karyopherin alpha/beta in den Zellkern gelangen.

26S proteasomes fulfil final steps in the ubiquitin-dependent degradation pathway by recognising and hydrolysing ubiquitylated proteins. As the 26S proteasome mainly localises to the nucleus in yeast, we addressed the question how this 2 MDa multisubunit complex is imported into the nucleus. 26S proteasomes consist of 20S proteolytically active core and 19S regulatory particles, the latter composed of two subcomplexes, namely the base and lid complexes. We have shown that 20S core particles are translocated into the nucleus as inactive precursor complexes via the classical karyopherin alpha/beta import pathway (Lehmann et al. 2002; JMB, 317, 401). Here, we provide evidence that nuclear import of base and lid complexes also depends on karyopherin alpha/beta. Potential classical nuclear localisation sequences (NLS) of base subunits were analysed. Rpn2 and Rpt2, a non-ATPase and an ATPase subunit of the base complex, harbour functional NLS. The Rpt2 NLS deletion yielded wild type localisation. However, the deletion of the Rpn2 NLS resulted in improper nuclear proteasome localisation and impaired proteasome function. Our data support the model by which nuclear 26S proteasomes are assembled from subcomplexes imported by karyopherin alpha/beta.